JPH03138565A - 仮性狂犬病抗体に関する受動的凝集アツセイ - Google Patents
仮性狂犬病抗体に関する受動的凝集アツセイInfo
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- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229940117986 sulfobetaine Drugs 0.000 description 1
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- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
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Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は一般的に抗体の検出に有用な物質及び方法に関
し、特に本発明は血清サンプル中における仮性狂犬病抗
体の検出のための免疫試薬及び免疫診断試験に関する。
し、特に本発明は血清サンプル中における仮性狂犬病抗
体の検出のための免疫試薬及び免疫診断試験に関する。
仮性狂犬病とは、発狂的そう痒症又はアウジェスキー(
Aujeszky)病としても知られる感染性延髄麻痺
である。その原因物質は、ヘルペスビリダニ(Herp
esviridae)科に属するヘルペスウィルス・ス
イス(suis)たる仮性狂犬病ウィルスである。仮性
狂犬病は主にブタ及びウシの疾患である。
Aujeszky)病としても知られる感染性延髄麻痺
である。その原因物質は、ヘルペスビリダニ(Herp
esviridae)科に属するヘルペスウィルス・ス
イス(suis)たる仮性狂犬病ウィルスである。仮性
狂犬病は主にブタ及びウシの疾患である。
仮性狂犬病に感染したおそらく天然宿主保有者であるブ
タは、普通症状を示さない。しかしながらまれに、成熟
ブタは発熱及び神経学的症状を現す。多くの感染ブタは
症状を示さないが、ウィルス感染は潜伏するようになり
、動物の生存期間中留まっている。
タは、普通症状を示さない。しかしながらまれに、成熟
ブタは発熱及び神経学的症状を現す。多くの感染ブタは
症状を示さないが、ウィルス感染は潜伏するようになり
、動物の生存期間中留まっている。
ウシの場合、仮性狂犬病は強度のそう痒及び自己断節に
よって特徴付けられる急速な致死的非化膿性脳を髄炎で
ある。冒されたウシは、臨床的徴候の開始後3日以内で
通常死亡する。
よって特徴付けられる急速な致死的非化膿性脳を髄炎で
ある。冒されたウシは、臨床的徴候の開始後3日以内で
通常死亡する。
ブタが仮性狂犬病ウィルスの天然宿主及び通常の保有者
として通常みなされることから、ブタがウシと混じり合
う前にブタにおいて仮性狂犬病を診断することは不可避
的である。ウシ仮性狂犬病は、ブタをウシから分けてお
くことによってのみ防止される。ブタに有効なワクチン
は開発されたけれども、ウシにとって有効なワクチンは
存在しない。
として通常みなされることから、ブタがウシと混じり合
う前にブタにおいて仮性狂犬病を診断することは不可避
的である。ウシ仮性狂犬病は、ブタをウシから分けてお
くことによってのみ防止される。ブタに有効なワクチン
は開発されたけれども、ウシにとって有効なワクチンは
存在しない。
仮性狂犬病ウィルスに対する抗体検出用の血清学的試験
は、感染したブタを永続的に確認する上で貴重な助けに
なる。しかしながら、仮性狂犬病の抗体検出用の現在の
方法は、時間がかかつて、非常に低レベルの抗体を検出
しうるほど多くの場合に十分感度が高くない。ブタを試
験する場合、微量滴定中和(SVN)試験が普通用いら
れる方法である〔ヒルら、プロシーデインゲス・オブ・
ザーアメリカン・アソシエーション・オブ・ベティナリ
ー・ラボラトリ−・シアグツシス、第20巻、第375
−390頁、1977年(Hlll etal、Pro
ceedings of the American
As5ociationof Vetinary La
boratory Diagnosis、20.375
−390(1977)))。重要な欠点がSVN試験に
はある。
は、感染したブタを永続的に確認する上で貴重な助けに
なる。しかしながら、仮性狂犬病の抗体検出用の現在の
方法は、時間がかかつて、非常に低レベルの抗体を検出
しうるほど多くの場合に十分感度が高くない。ブタを試
験する場合、微量滴定中和(SVN)試験が普通用いら
れる方法である〔ヒルら、プロシーデインゲス・オブ・
ザーアメリカン・アソシエーション・オブ・ベティナリ
ー・ラボラトリ−・シアグツシス、第20巻、第375
−390頁、1977年(Hlll etal、Pro
ceedings of the American
As5ociationof Vetinary La
boratory Diagnosis、20.375
−390(1977)))。重要な欠点がSVN試験に
はある。
SVN試験では3〜4時間の準備時間と48時間のイン
ギュベ−1・時間とを要する。SVN試験のもう1つの
深刻な欠点は、それが感染性ウィルスの使用に伴う生物
学的危険を含むことである。
ギュベ−1・時間とを要する。SVN試験のもう1つの
深刻な欠点は、それが感染性ウィルスの使用に伴う生物
学的危険を含むことである。
したかって、仮性狂犬病ウィルス抗体に関する改善され
た免疫診断試験についての必要性が存在しているのであ
る。本発明は、血清仮性狂犬病ウィルス抗体の検出に関
して安全で、信頼しうる、効果的な、再現性のあるかつ
感度の良いアッセイを提供するものである。
た免疫診断試験についての必要性が存在しているのであ
る。本発明は、血清仮性狂犬病ウィルス抗体の検出に関
して安全で、信頼しうる、効果的な、再現性のあるかつ
感度の良いアッセイを提供するものである。
本発明は、生物学的サンプル中における仮性狂犬病ウィ
ルス抗体の存在を検出するためのラテックス組成物及び
その使用方法を提供する。
ルス抗体の存在を検出するためのラテックス組成物及び
その使用方法を提供する。
本発明のラテックス組成物は、個々のラテックス粒子上
に物理的に吸着され又はそれに共有結合された仮性狂犬
病ウィルス抗原からなる。仮性狂犬病ウィルス抗原は、
全体破壊かつ可溶化された仮性狂犬病ウィルスの産物で
ある。破壊された仮性狂犬病ウィルス産物は、仮性狂犬
病ウィルス抗体と選択的に免疫反応する様々な仮性狂犬
病ウィルス抗原を提供する。特に、破壊されたウィルス
の使用で、感染性ウィルスに伴う生物学的危険を避ける
ことができる。しかも、ラテックス粒子に対する破壊か
つ可溶化されたウィルス抗原の吸着の結果、完全無処理
ウィルスの吸着後に起きる集合化凝集ラテックス粒子と
は異なり均一なラテックス分散を生じる。
に物理的に吸着され又はそれに共有結合された仮性狂犬
病ウィルス抗原からなる。仮性狂犬病ウィルス抗原は、
全体破壊かつ可溶化された仮性狂犬病ウィルスの産物で
ある。破壊された仮性狂犬病ウィルス産物は、仮性狂犬
病ウィルス抗体と選択的に免疫反応する様々な仮性狂犬
病ウィルス抗原を提供する。特に、破壊されたウィルス
の使用で、感染性ウィルスに伴う生物学的危険を避ける
ことができる。しかも、ラテックス粒子に対する破壊か
つ可溶化されたウィルス抗原の吸着の結果、完全無処理
ウィルスの吸着後に起きる集合化凝集ラテックス粒子と
は異なり均一なラテックス分散を生じる。
本発明の方法において、ラテックス組成物は生物学的サ
ンプル中における仮性狂犬病ウィルス抗体の存在を検出
するため直接的凝集アッセイで用いられる。本試験では
、血清のような生物学的サンプルをラテックス組成物と
混合する。混合物は免疫反応にとって好ましい条件下で
インキュベートされる。しかる後、混合物はラテックス
粒子の凝集又は集合化に関して肉眼で調べられる。凝集
は、生物学的サンプル中における仮性狂犬病ウィルス抗
体の存在を示す。
ンプル中における仮性狂犬病ウィルス抗体の存在を検出
するため直接的凝集アッセイで用いられる。本試験では
、血清のような生物学的サンプルをラテックス組成物と
混合する。混合物は免疫反応にとって好ましい条件下で
インキュベートされる。しかる後、混合物はラテックス
粒子の凝集又は集合化に関して肉眼で調べられる。凝集
は、生物学的サンプル中における仮性狂犬病ウィルス抗
体の存在を示す。
下記説明は本発明の好ましい態様に関するもので、これ
は本出願の時点で本出願人らに知られているベストモー
ドを表している。
は本出願の時点で本出願人らに知られているベストモー
ドを表している。
本発明によれば、仮性狂犬病ウィルス抗体に関する直接
的凝集アッセイで特に価値のあるラテックス組成物が提
供される。本発明のラテックス組成物は、ラテックスキ
ャリア粒子上に担持された破壊かつ可溶化された仮性狂
犬病ウィルス産物から本質的になる。
的凝集アッセイで特に価値のあるラテックス組成物が提
供される。本発明のラテックス組成物は、ラテックスキ
ャリア粒子上に担持された破壊かつ可溶化された仮性狂
犬病ウィルス産物から本質的になる。
ラテックス
本発明に関係して用いられるラテックスキャリア粒子と
しては、非水溶性であって、0.05〜約2.0ミクロ
ンの範囲内の粒径を有し、それらが水性懸濁状態で留ま
るよう水の場合に近い比重を有しかつ免疫学的反応に関
して不活性であるラテックスポリマーがある。更に、ラ
テックス粒子は、免疫学的反応の不存在時にそれらの凝
集を妨げうるように仮性狂犬病ウィルス抗原の吸着後十
分な斥力を有していなければならない。
しては、非水溶性であって、0.05〜約2.0ミクロ
ンの範囲内の粒径を有し、それらが水性懸濁状態で留ま
るよう水の場合に近い比重を有しかつ免疫学的反応に関
して不活性であるラテックスポリマーがある。更に、ラ
テックス粒子は、免疫学的反応の不存在時にそれらの凝
集を妨げうるように仮性狂犬病ウィルス抗原の吸着後十
分な斥力を有していなければならない。
適切な典型的ラテックスキャリア粒子は、水性ラテック
ス懸濁液として通常約20〜約60%の固体濃度で市販
されているものである。多くのタイプのラテックスは、
それらが上記基準に合致する限り本発明での使用に適し
ている。
ス懸濁液として通常約20〜約60%の固体濃度で市販
されているものである。多くのタイプのラテックスは、
それらが上記基準に合致する限り本発明での使用に適し
ている。
適切な典型的ラテックスキャリアポリマーは、カルボキ
シル化ポリスチレン類、アクリル酸ポリマー類、メタク
リル酸ポリマー類、アクリロニトリルブタジェンスチレ
ン類、ポリビニルアセテートアクリレート類、ポリビニ
ルピリジン類、ビニルクロリドアクリレート類等である
。本発明用に適した一部の市販ラテックスとしては、A
MSCORe54150、AMSCORes3011
Cアメリカン・ミネラルやスピリッツ社(Americ
an Mineral 5pirits Co、))
;ダウ・ラテックス(Dov l、atex) 81
5.816.620及び859〔ダウ・ケミカル社(D
owChemical Co、):l ; ハイカー
(Hyear) 1512、ハイカー1877X8、ハ
イカー2600X120〔グツドリッチ・ケミカル社(
GoodrichChemical Co、) )
;ゲルバ(Gelva) 900、ライトロン(Lyt
rorf) 612、ライトロン624〔モンサンド(
Monsanto)) ; oブレックス(Rhop
lex)LC403216、アンバーライトφウルトラ
ファイン(Amberlite Ultrafine)
(ローンやアンド・ハース(Rohm and 1
(ass) :l ;及びバクトーラテックス(Ba
cto−1atex) 0. 81 [ジフコ・ラボラ
トリーズ(Difco Laboratories)]
がある。
シル化ポリスチレン類、アクリル酸ポリマー類、メタク
リル酸ポリマー類、アクリロニトリルブタジェンスチレ
ン類、ポリビニルアセテートアクリレート類、ポリビニ
ルピリジン類、ビニルクロリドアクリレート類等である
。本発明用に適した一部の市販ラテックスとしては、A
MSCORe54150、AMSCORes3011
Cアメリカン・ミネラルやスピリッツ社(Americ
an Mineral 5pirits Co、))
;ダウ・ラテックス(Dov l、atex) 81
5.816.620及び859〔ダウ・ケミカル社(D
owChemical Co、):l ; ハイカー
(Hyear) 1512、ハイカー1877X8、ハ
イカー2600X120〔グツドリッチ・ケミカル社(
GoodrichChemical Co、) )
;ゲルバ(Gelva) 900、ライトロン(Lyt
rorf) 612、ライトロン624〔モンサンド(
Monsanto)) ; oブレックス(Rhop
lex)LC403216、アンバーライトφウルトラ
ファイン(Amberlite Ultrafine)
(ローンやアンド・ハース(Rohm and 1
(ass) :l ;及びバクトーラテックス(Ba
cto−1atex) 0. 81 [ジフコ・ラボラ
トリーズ(Difco Laboratories)]
がある。
仮性狂犬病ウィルス抗原
更に本発明によれば、部分的に精製された仮性狂犬病ウ
ィルス抗原が吸着又は共有結合によるラテックス粒子へ
の付着のために用意される。仮性狂犬病ウィルス抗原は
、破壊かつ可溶化された全仮性狂犬病ウィルスの産物で
ある。
ィルス抗原が吸着又は共有結合によるラテックス粒子へ
の付着のために用意される。仮性狂犬病ウィルス抗原は
、破壊かつ可溶化された全仮性狂犬病ウィルスの産物で
ある。
仮性狂犬病全ウィルスは、当業界で公知の操作により組
織培養で最初に得られる。特に、仮性狂犬病ウィルスは
、ブタ精巣細胞、−次ブタ腎臓細胞、PK−15細胞系
、−次ウサギ腎臓細胞及びブタ繊維芽細胞系MDBK中
で増殖させることができる。
織培養で最初に得られる。特に、仮性狂犬病ウィルスは
、ブタ精巣細胞、−次ブタ腎臓細胞、PK−15細胞系
、−次ウサギ腎臓細胞及びブタ繊維芽細胞系MDBK中
で増殖させることができる。
細胞培養物から得られた仮性狂犬病ウィルス含有液の濾
過及び濃縮の後、仮性狂犬病ウィルスが精製される。更
に詳しくは、濾過及び濃縮の後、ウィルスはゲルによる
ウィルスの吸着を最少化又は妨げうるほど十分高くかつ
非ウィルス性タンパク質の一部をヒドロキシルアパタイ
トゲルで吸着させうるほど十分低いイオン強度を有する
水性懸濁液中においてヒドロキシルアパタイトスラリと
接触せしめられる。イオン強度はリン酸緩衝液の使用で
維持されるが、その際にリン酸イオンは約0.OOIM
のモル濃度で存在する。このイオン強度の場合には、ウ
ィルスのさほどの吸着もなく非ウィルス性タンパク質及
び核酸を効果的に吸着させることができる。大半の場合
のリン酸モル濃度は、0.001〜0.005Mである
。
過及び濃縮の後、仮性狂犬病ウィルスが精製される。更
に詳しくは、濾過及び濃縮の後、ウィルスはゲルによる
ウィルスの吸着を最少化又は妨げうるほど十分高くかつ
非ウィルス性タンパク質の一部をヒドロキシルアパタイ
トゲルで吸着させうるほど十分低いイオン強度を有する
水性懸濁液中においてヒドロキシルアパタイトスラリと
接触せしめられる。イオン強度はリン酸緩衝液の使用で
維持されるが、その際にリン酸イオンは約0.OOIM
のモル濃度で存在する。このイオン強度の場合には、ウ
ィルスのさほどの吸着もなく非ウィルス性タンパク質及
び核酸を効果的に吸着させることができる。大半の場合
のリン酸モル濃度は、0.001〜0.005Mである
。
更に、吸着は6〜10程度、最も一般的には8〜9程度
のpnで行われる。溶液のpHは適切な緩衝液の使用で
維持される。吸着は0.01〜0、OOOIMの濃度で
EDTAの存在下において行ってもよい。EDTA及び
他のキレート化剤は、非ウィルス性タンパク質及び核酸
の吸着を増加させ、ウィルス性タンパク質の吸着を最少
に抑制する上で役立つ。
のpnで行われる。溶液のpHは適切な緩衝液の使用で
維持される。吸着は0.01〜0、OOOIMの濃度で
EDTAの存在下において行ってもよい。EDTA及び
他のキレート化剤は、非ウィルス性タンパク質及び核酸
の吸着を増加させ、ウィルス性タンパク質の吸着を最少
に抑制する上で役立つ。
精製の進行に関して、高分子量タンパク質及び核酸がゲ
ルに吸着され、それによってウィルス性タンパク質を同
様の分子量の非ウィルス性タンパク質から分離すること
ができる。
ルに吸着され、それによってウィルス性タンパク質を同
様の分子量の非ウィルス性タンパク質から分離すること
ができる。
このような吸着の後、液体中に依然残留する低分子量タ
ンパク質は常法に従い分離される。例えば、更なる分離
は当業界で公知のようにバリヤー層又は緩衝物を介する
遠心により行われる。特に、ウィルス性タンパク質はス
クロース、グリセロール、塩化セシウム、硫酸セシウム
等のような適切なバリヤー層を介して遠心され、その場
合に低分子量タンパク質はバリヤー上に残留し、ウィル
スは分離層としてバリヤーを介して遠心される。次いで
、低分子量タンパク質及びバリヤー層を含む液体は除去
され、非ウィルス性タンパク質、核酸、脂質等を本質的
に含まないウィルス性タンパク質を残留させる。一般に
、精製されたウィルスは1%以下、最も一般的には0.
1%以下の非ウィルス性脂質、核酸及びタンパク質しか
含有していない。
ンパク質は常法に従い分離される。例えば、更なる分離
は当業界で公知のようにバリヤー層又は緩衝物を介する
遠心により行われる。特に、ウィルス性タンパク質はス
クロース、グリセロール、塩化セシウム、硫酸セシウム
等のような適切なバリヤー層を介して遠心され、その場
合に低分子量タンパク質はバリヤー上に残留し、ウィル
スは分離層としてバリヤーを介して遠心される。次いで
、低分子量タンパク質及びバリヤー層を含む液体は除去
され、非ウィルス性タンパク質、核酸、脂質等を本質的
に含まないウィルス性タンパク質を残留させる。一般に
、精製されたウィルスは1%以下、最も一般的には0.
1%以下の非ウィルス性脂質、核酸及びタンパク質しか
含有していない。
次いでこのような精製ウィルスは、ウィルスを破壊し可
溶化させて可溶性ウィルス抗原を得るため界面活性剤で
処理される。
溶化させて可溶性ウィルス抗原を得るため界面活性剤で
処理される。
仮性狂犬病ウィルス抗原は、その抗原特性を破壊せずに
可溶性仮性狂犬病ウィルス抗原を得られるようウィルス
を破壊する界面活性剤又は洗浄剤で精製全仮性狂犬病ウ
ィルスを処理することによって完全仮性狂犬病ウィルス
から得られる。洗浄剤は、抗原性を破壊せずに全ウィル
スを破壊かつ可溶化させうる十分な量で用いられる。一
般に、界面活性剤対ウィルスの重量比は、0.2:1〜
約5:1、好ましくは約0.4:1〜約1=1である。
可溶性仮性狂犬病ウィルス抗原を得られるようウィルス
を破壊する界面活性剤又は洗浄剤で精製全仮性狂犬病ウ
ィルスを処理することによって完全仮性狂犬病ウィルス
から得られる。洗浄剤は、抗原性を破壊せずに全ウィル
スを破壊かつ可溶化させうる十分な量で用いられる。一
般に、界面活性剤対ウィルスの重量比は、0.2:1〜
約5:1、好ましくは約0.4:1〜約1=1である。
全仮性狂犬病ウィルスを破壊するために用いられる界面
活性剤又は洗浄剤は、カチオン系、アニオン系及び非イ
オン系界面活性剤を含めて様々な界面活性剤又は洗浄剤
のうちいずれであってもよい。このような界面活性剤は
当業界で周知であり、代表例としてサルフェートのアル
カリ金属塩、石鹸、サルフェート化又はスルホネート化
油類、様々なアミン類、四級塩類、エチレンオキシドと
の縮合生成物等が挙げられる。この様な使用に好ましい
洗浄剤は、ドデシル硫酸アルカリ(リチウム又はナトリ
ウム)、スルホベタイン、デオキシコレート及びラウロ
リルザルコシン(サルコシル)である。
活性剤又は洗浄剤は、カチオン系、アニオン系及び非イ
オン系界面活性剤を含めて様々な界面活性剤又は洗浄剤
のうちいずれであってもよい。このような界面活性剤は
当業界で周知であり、代表例としてサルフェートのアル
カリ金属塩、石鹸、サルフェート化又はスルホネート化
油類、様々なアミン類、四級塩類、エチレンオキシドと
の縮合生成物等が挙げられる。この様な使用に好ましい
洗浄剤は、ドデシル硫酸アルカリ(リチウム又はナトリ
ウム)、スルホベタイン、デオキシコレート及びラウロ
リルザルコシン(サルコシル)である。
精製ウィルスの処理はウィルスタンパク質を変性しない
温度で行われるが、このような温度は通常約37℃を超
えず、20〜37°Cの温度か最も都合よい。同様にp
Hは安定性を維持しうるように選択され、p Hは通常
8.5であって、至適pHは通常8.0〜約9.0程度
である。
温度で行われるが、このような温度は通常約37℃を超
えず、20〜37°Cの温度か最も都合よい。同様にp
Hは安定性を維持しうるように選択され、p Hは通常
8.5であって、至適pHは通常8.0〜約9.0程度
である。
界面活性剤による精製ウィルスの処理には、ウィルスを
破壊しかつその可溶化を行うために十分な時間がかけら
れる。一般に、このような破壊及び可溶化は5〜120
分間の時間にわたり行われるが、しかしながら一部の場
合には更に長い又は短い時間であってもよい。
破壊しかつその可溶化を行うために十分な時間がかけら
れる。一般に、このような破壊及び可溶化は5〜120
分間の時間にわたり行われるが、しかしながら一部の場
合には更に長い又は短い時間であってもよい。
ラテックス担持板性狂犬病ウィルス抗原組成物破壊され
た仮性狂犬病ウィルス産物を回収した後、それらはラテ
ックスキャリア粒子への受動的吸着によって付着される
。抗原は、凝集アッセイを促進する上で有効な量である
が但し単一粒子上における抗体の架橋を妨げる上から十
分に低い量でラテックスに吸着される。一般に、可溶性
抗原対支持体の重量比は1:30〜1:200であり、
1:50〜1:100が好ましい範囲である。
た仮性狂犬病ウィルス産物を回収した後、それらはラテ
ックスキャリア粒子への受動的吸着によって付着される
。抗原は、凝集アッセイを促進する上で有効な量である
が但し単一粒子上における抗体の架橋を妨げる上から十
分に低い量でラテックスに吸着される。一般に、可溶性
抗原対支持体の重量比は1:30〜1:200であり、
1:50〜1:100が好ましい範囲である。
受動吸着技術に加えて、破壊された仮性狂犬病ウィルス
産物はラテックスキャリアに共有結合させることもでき
る。特に、参考のため本明細書に組み込まれる米国特許
節4,264,766号及び第4.21.0.723号
の各明細書では、本発明の破壊された仮性狂犬病ウィル
ス抗原産物のような免疫学的活性物質と共有結合を形成
しうる活性基を有した多数のラテックス粒子について開
示している。
産物はラテックスキャリアに共有結合させることもでき
る。特に、参考のため本明細書に組み込まれる米国特許
節4,264,766号及び第4.21.0.723号
の各明細書では、本発明の破壊された仮性狂犬病ウィル
ス抗原産物のような免疫学的活性物質と共有結合を形成
しうる活性基を有した多数のラテックス粒子について開
示している。
本発明の更にもう1つの態様によれば、抗原がラテック
ス粒子に吸着された後、支持体は吸着された抗原を含め
て、仮性狂犬病抗原と反応しないか又は後で抗体との免
疫化学反応に悪影響を与えない牛血清アルブミン又はオ
ボアルブミンのような免疫学的不活性タンパク質で更に
コーティングされる。
ス粒子に吸着された後、支持体は吸着された抗原を含め
て、仮性狂犬病抗原と反応しないか又は後で抗体との免
疫化学反応に悪影響を与えない牛血清アルブミン又はオ
ボアルブミンのような免疫学的不活性タンパク質で更に
コーティングされる。
本発明で得られた仮性狂犬病ウィルス抗原感作粒子は、
直接的凝集操作による仮性狂犬病ウィルス抗体に関する
キット及びアッセイ用に適している。このようなキット
は、適切な容器中の感作仮性狂犬病ウィルス粒子に加え
て、仮性狂犬病抗体含有反応性血清コントロール及び非
反応性血清コントロールをそのために適した容器中に含
んでいる。好ましい態様によれば、試薬に加えて、アッ
セイがその上で行われる試験スライドも用意される。試
験スライドは平坦な試験用表面を有しており、そこでは
調べられるべき1種以上のサンプルをおくため適切にマ
ークされた領域(例えば、試験用)及び各々の血清コン
トロールのために適切にマークされた領域を含んでいる
。試験スライド及び試薬は単一のキットパッケージに入
れてもよい。
直接的凝集操作による仮性狂犬病ウィルス抗体に関する
キット及びアッセイ用に適している。このようなキット
は、適切な容器中の感作仮性狂犬病ウィルス粒子に加え
て、仮性狂犬病抗体含有反応性血清コントロール及び非
反応性血清コントロールをそのために適した容器中に含
んでいる。好ましい態様によれば、試薬に加えて、アッ
セイがその上で行われる試験スライドも用意される。試
験スライドは平坦な試験用表面を有しており、そこでは
調べられるべき1種以上のサンプルをおくため適切にマ
ークされた領域(例えば、試験用)及び各々の血清コン
トロールのために適切にマークされた領域を含んでいる
。試験スライド及び試薬は単一のキットパッケージに入
れてもよい。
直接的凝集アッセイ
抗原−抗体反応は、すべての免疫学的アッセイのための
基礎である。抗体は、抗原と呼ばれる外来物質、通常タ
ンパク質の存在に応答して哺乳動物により産生される。
基礎である。抗体は、抗原と呼ばれる外来物質、通常タ
ンパク質の存在に応答して哺乳動物により産生される。
細菌及びウィルスを含めた外来タンパク質に対するこの
正常体応答で、哺乳動物感染又は疾患を診断するために
有用ないくつかの技術を開発するに至った。
正常体応答で、哺乳動物感染又は疾患を診断するために
有用ないくつかの技術を開発するに至った。
生物学的サンプル中における抗体を検出するためのイン
ビトロ試験は、抗原を生物学的サンプルと接触させるこ
とにより通常行われる。推測される抗体が存在する場合
、生じる抗原−抗体反応は抗原−抗体複合体の沈降又は
凝集によって明らかにすることができる。この抗原−抗
体反応は、視覚的に検出することが通常非常に困難であ
る。ラテックスのような粒子キャリアに試験抗原を結合
させることにより、後の抗原−抗体凝集反応は容易に視
覚化されるようになる。凝集は、それがなければ均一な
懸濁状態からラテックス粒子の肉眼で見える集合化への
移行によって特徴付けられる。
ビトロ試験は、抗原を生物学的サンプルと接触させるこ
とにより通常行われる。推測される抗体が存在する場合
、生じる抗原−抗体反応は抗原−抗体複合体の沈降又は
凝集によって明らかにすることができる。この抗原−抗
体反応は、視覚的に検出することが通常非常に困難であ
る。ラテックスのような粒子キャリアに試験抗原を結合
させることにより、後の抗原−抗体凝集反応は容易に視
覚化されるようになる。凝集は、それがなければ均一な
懸濁状態からラテックス粒子の肉眼で見える集合化への
移行によって特徴付けられる。
ブタ血清のような生物学的サンプル中における仮性狂犬
病抗体の検出のための直接的ラテックス凝集試験におい
ては、生物学的サンプルはラテックス担持板性狂犬病抗
原の懸濁液と混合される。
病抗体の検出のための直接的ラテックス凝集試験におい
ては、生物学的サンプルはラテックス担持板性狂犬病抗
原の懸濁液と混合される。
仮性狂犬病抗体が生物学的サンプル中に存在している場
合には、それは抗原と反応してラテックス粒子の沈降物
又は凝集物を形成するようになる。
合には、それは抗原と反応してラテックス粒子の沈降物
又は凝集物を形成するようになる。
仮性狂犬病抗体が存在していない場合には、ラテックス
懸濁液は均一な懸濁液としてその外観を保っている。
懸濁液は均一な懸濁液としてその外観を保っている。
特異的抗原−抗体反応を促進するため、ブタ血清はアッ
セイ前にカオリン、ベントナイト、アパタイト、タルク
又は活性炭で吸着されてその脂質容量及び非特異的結合
剤を減少させることができる。一方、血清はほとんどの
非特異的反応を消失させるため1:4〜1:10希釈で
用いることもできる。
セイ前にカオリン、ベントナイト、アパタイト、タルク
又は活性炭で吸着されてその脂質容量及び非特異的結合
剤を減少させることができる。一方、血清はほとんどの
非特異的反応を消失させるため1:4〜1:10希釈で
用いることもできる。
例1
仮性狂犬病ウィルスの産生及び精製:
サリバン(Su I l i van)株仮性狂犬病ウ
ィルスは、インジアナ州カムデン(CaIIlden)
におけるブタの天然感染から最初に単離された。そのウ
ィルスは、パードウ−(Purdue)大学のり、
P、ガスタフソン(Gustafson)博士から得た
。ウィスコンシン州立大学において、そのウィルスは成
熟ブタ甲状腺細胞単層で一度継代された。しかる後、そ
れは連続培養ブタ精巣細胞で3回プラーク精製された。
ィルスは、インジアナ州カムデン(CaIIlden)
におけるブタの天然感染から最初に単離された。そのウ
ィルスは、パードウ−(Purdue)大学のり、
P、ガスタフソン(Gustafson)博士から得た
。ウィスコンシン州立大学において、そのウィルスは成
熟ブタ甲状腺細胞単層で一度継代された。しかる後、そ
れは連続培養ブタ精巣細胞で3回プラーク精製された。
ブタ精巣細胞における継代4回目のプラーク精製ウィル
スがこれらの実験で用いられた。
スがこれらの実験で用いられた。
ブタ精巣細胞の集密的ローラー培養物(680d)を1
細胞当たり約0.0IPFUの仮性狂犬病ウィルスで播
種し、pH7,6の0.025MHEPES緩衝液及び
5%(v/v)リン酸トリプトースブロス含有の標準培
地(培地199)で維持した。細胞を36±1℃で48
〜96時間インキュベートした。−70℃で凍結するこ
とにより回収した後、細胞を解凍して残留細胞を破壊し
た。
細胞当たり約0.0IPFUの仮性狂犬病ウィルスで播
種し、pH7,6の0.025MHEPES緩衝液及び
5%(v/v)リン酸トリプトースブロス含有の標準培
地(培地199)で維持した。細胞を36±1℃で48
〜96時間インキュベートした。−70℃で凍結するこ
とにより回収した後、細胞を解凍して残留細胞を破壊し
た。
次いで、解凍された物質を最初4000XgLかる後1
6.oooxgで各々15〜20分間別々に遠心した。
6.oooxgで各々15〜20分間別々に遠心した。
上澄をアミコン(Amicon)中空ファイバー透析器
−濃縮器で原容量の1/6に濃縮した。
−濃縮器で原容量の1/6に濃縮した。
5000Xgで清澄化後、濃縮物に0.OOIMEDT
Aを含有させ、pHを室温22℃で8.5に調整し、濃
縮物を16,000Xgで清澄化した。次いで、1/1
0容量のヒドロキシルアパタイト懸濁液を加え、スラリ
ーを1時間ミックスしながら4℃でインキニベートした
。ヒドロキシルアパタイトを16,000Xgで15分
間の遠心により除去し、しかる後濃縮物30m1をベッ
クマン(Beckman) S W 28チユーブ中の
69%(v/w)グリセロール9ml上に積層した。ウ
ィルスを82、OOOXgで16時間4℃で沈降させ、
得られたペレットをNTE緩衝液、即ち0.12MNa
C1及び0.OOIM EDTA含有のpH8,5の
0.OIM)リス、に再懸濁した。精製されたウィルス
を一70℃で貯蔵した。
Aを含有させ、pHを室温22℃で8.5に調整し、濃
縮物を16,000Xgで清澄化した。次いで、1/1
0容量のヒドロキシルアパタイト懸濁液を加え、スラリ
ーを1時間ミックスしながら4℃でインキニベートした
。ヒドロキシルアパタイトを16,000Xgで15分
間の遠心により除去し、しかる後濃縮物30m1をベッ
クマン(Beckman) S W 28チユーブ中の
69%(v/w)グリセロール9ml上に積層した。ウ
ィルスを82、OOOXgで16時間4℃で沈降させ、
得られたペレットをNTE緩衝液、即ち0.12MNa
C1及び0.OOIM EDTA含有のpH8,5の
0.OIM)リス、に再懸濁した。精製されたウィルス
を一70℃で貯蔵した。
例2
精製されたウィルスの可溶化:
精製されたウィルスを1xNTE緩衝液に溶解し、タン
パク質含有量を0.D、260/28OnIIl比から
調べた。ウィルスを36〜37℃で30分間にわたりド
デシル硫酸ナトリウム(S D S)によりウィルスタ
ンパク質1mg当たり5DS0、 5mg(v/ν)の
濃度で処理することにより破壊かつ可溶化させた。
パク質含有量を0.D、260/28OnIIl比から
調べた。ウィルスを36〜37℃で30分間にわたりド
デシル硫酸ナトリウム(S D S)によりウィルスタ
ンパク質1mg当たり5DS0、 5mg(v/ν)の
濃度で処理することにより破壊かつ可溶化させた。
例3
感作ラテツクスの調製:
ポリスチレンラテックス(0,9ミクロン径粒子)の市
販懸濁液をpH9,5の0.04M炭酸塩緩衝液各5O
倍容量で4回洗浄し、炭酸塩緩衝液に再懸濁して3%(
v/v)固体物を得た。可溶化されたウィルスを3%ラ
テックス1ml当たり精製タンパク質0.4mgの比率
でラテックスに直接加えミックスした。懸濁液を4℃で
16時間タンプリングすることによりミックスした。感
作されたラテックスを等容量のリン酸緩衝液で希釈した
。
販懸濁液をpH9,5の0.04M炭酸塩緩衝液各5O
倍容量で4回洗浄し、炭酸塩緩衝液に再懸濁して3%(
v/v)固体物を得た。可溶化されたウィルスを3%ラ
テックス1ml当たり精製タンパク質0.4mgの比率
でラテックスに直接加えミックスした。懸濁液を4℃で
16時間タンプリングすることによりミックスした。感
作されたラテックスを等容量のリン酸緩衝液で希釈した
。
ラテックスを8000Xgで10分間の遠心により集め
、ペレットを0.05%ポリオキシエチレンソルビタン
モノラウレート界面活性剤(ツイーン20)及び0.0
2%ゲンタミシン含有リン酸緩衝液中1%牛血清アルブ
ミン(BSA−PBS)に0.6%で再懸濁した。感作
されたラテックスをブロンソンモデルS75ソニファイ
ア(Bronson Model S755oniri
cr)で5mlずつ1秒間フルパワーで超音波処理した
。
、ペレットを0.05%ポリオキシエチレンソルビタン
モノラウレート界面活性剤(ツイーン20)及び0.0
2%ゲンタミシン含有リン酸緩衝液中1%牛血清アルブ
ミン(BSA−PBS)に0.6%で再懸濁した。感作
されたラテックスをブロンソンモデルS75ソニファイ
ア(Bronson Model S755oniri
cr)で5mlずつ1秒間フルパワーで超音波処理した
。
例4
仮性狂犬病ウィルス抗体に関するラテックス凝集試験:
1.4cm融合円のあるガラス板を用いた。血清の連続
的2倍希釈液をツイーン20含有1%BSA−PBSで
調製し、各希釈液50μgを別々の円内におき、広げて
円を覆った。感作ラテツクス15〜20 ltρ (1
滴)を加えた後、血清及びラテックス懸濁液を手でミッ
クスし、1100rpで5〜8分間回転させた。スライ
ドを湿潤状態で肉眼により読んだ。仮性狂犬病ウィルス
に対する抗体の存在は、可視的な凝集により明らかとさ
れた。
的2倍希釈液をツイーン20含有1%BSA−PBSで
調製し、各希釈液50μgを別々の円内におき、広げて
円を覆った。感作ラテツクス15〜20 ltρ (1
滴)を加えた後、血清及びラテックス懸濁液を手でミッ
クスし、1100rpで5〜8分間回転させた。スライ
ドを湿潤状態で肉眼により読んだ。仮性狂犬病ウィルス
に対する抗体の存在は、可視的な凝集により明らかとさ
れた。
例5
血清サンプルを等容量の25%カオリン懸濁液とミック
スした。混合物を室温で20分間放置した。カオリンを
200 Orpmで10分間の遠心により除去した。得
られた上澄液は血清の]:2希釈液であった。マイクロ
ピペットで上澄液25μgをガラススライド上の融合円
内においた。次いで、マイクロピペットで感作ラテツク
ス試薬25μΩを同一円内に加えた。スライドを保湿カ
バー下においてローチーター」二約10 Orpmで8
分間回転させた。回転直後、スライドを湿潤状態で高強
度白熱灯上肉眼で読んだ。陽性試験はラテックスの集合
化として認められる。陰性試験の場合、ラテックスは均
一な懸濁液のままであった。
スした。混合物を室温で20分間放置した。カオリンを
200 Orpmで10分間の遠心により除去した。得
られた上澄液は血清の]:2希釈液であった。マイクロ
ピペットで上澄液25μgをガラススライド上の融合円
内においた。次いで、マイクロピペットで感作ラテツク
ス試薬25μΩを同一円内に加えた。スライドを保湿カ
バー下においてローチーター」二約10 Orpmで8
分間回転させた。回転直後、スライドを湿潤状態で高強
度白熱灯上肉眼で読んだ。陽性試験はラテックスの集合
化として認められる。陰性試験の場合、ラテックスは均
一な懸濁液のままであった。
本発明の組成物及び方法は好ましい態様に関して記載さ
れてきたが、請求の範囲により規定される本発明の範囲
から逸脱しない限り様々な変更が開示された組成物及び
方法について行いうることは当業者であれば明らかであ
ろう。
れてきたが、請求の範囲により規定される本発明の範囲
から逸脱しない限り様々な変更が開示された組成物及び
方法について行いうることは当業者であれば明らかであ
ろう。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、破壊かつ可溶化された仮性狂犬病ウィルスを上に付
着させた個々のラテックス粒子から本質的になり、仮性
狂犬病ウィルス抗体と選択的に免疫反応する抗原を提供
することを特徴とするラテックス組成物。 2、液体懸濁液中に分散された、請求項1に記載のラテ
ックス組成物。 3、水性懸濁液中に分散された、請求項1に記載のラテ
ックス組成物。 4、破壊かつ可溶化された仮性狂犬病ウィルス産物対ラ
テックス粒子の重量比が約1:30〜約1:200であ
る、請求項1に記載のラテックス組成物。 5、ラテックス粒子に吸着された免疫学的不活性タンパ
ク質を更に含む、請求項1に記載のラテックス組成物。 6、ラテックス粒子に吸着された不活性タンパク質が牛
血清アルブミン又はオボアルブミンである、請求項5に
記載のラテックス組成物。 7、ラテックスがポリスチレンラテックスである、請求
項1に記載のラテックス組成物。8、ラテックス粒子が
約0.05〜約2.0ミクロン径の範囲内である、請求
項1に記載のラテックス組成物。 9、ラテックス粒子が約0.9ミクロン径である、請求
項1に記載のラテックス組成物。10、破壊された仮性
狂犬病ウィルス産物がラテックス粒子に受動的に吸着さ
れている、請求項1に記載のラテックス組成物。 11、破壊かつ可溶化されたウィルスがラテックス粒子
に共有結合されている、請求項1に記載のラテックス組
成物。 12、破壊かつ可溶化された仮性狂犬病ウィルスが界面
活性剤で破壊かつ可溶化された仮性狂犬病ウィルスから
得られる、請求項1に記載のラテックス組成物。 13、生物学的サンプル中における仮性狂犬病ウィルス
抗体の存在を検出するための方法であって、 ラテックス粒子に付着された破壊かつ可溶化された仮性
狂犬病ウィルスから本質的になるラテックス組成物を準
備し(ラテックス粒子は液体懸濁液中に分散されている
); 反応混合物を形成するため生物学的サンプルをラテック
ス組成物と混合し; 免疫反応を生じさせるために十分な時間にわたり反応混
合物をインキュベートし;及び 凝集が生じる否かを調べ、それによって凝集が生物学的
サンプル中における仮性狂犬病ウィルス抗体の存在を示
すことを特徴とする方法。 14、生物学的サンプルが血清又は血漿である、請求項
13に記載の方法。 15、生物学的サンプルがブタの血清又は血漿である、
請求項13に記載の方法。 16、ラテックス組成物と混合する前に、非特異的アグ
ルチニンを除去するため生物学的サンプルがカオリン、
タルク、活性炭又はアパタイトで前処理される、請求項
13に記載の方法。 17、生物学的サンプルがラテックス組成物と混合する
前に最初に免疫学的不活性希釈剤で希釈される、請求項
13に記載の方法。 18、ラテックス組成物がラテックス粒子に受動的に吸
着された破壊かつ可溶化された仮性狂犬病ウィルスから
本質的になる、請求項13に記載の方法。 19、ラテックス組成物がラテックス粒子に共有結合さ
れた全体破壊かつ可溶化された仮性狂犬病ウィルスから
本質的になる、請求項13に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP27139889A JPH03138565A (ja) | 1989-10-18 | 1989-10-18 | 仮性狂犬病抗体に関する受動的凝集アツセイ |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP27139889A JPH03138565A (ja) | 1989-10-18 | 1989-10-18 | 仮性狂犬病抗体に関する受動的凝集アツセイ |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03138565A true JPH03138565A (ja) | 1991-06-12 |
Family
ID=17499508
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP27139889A Pending JPH03138565A (ja) | 1989-10-18 | 1989-10-18 | 仮性狂犬病抗体に関する受動的凝集アツセイ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH03138565A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR200482428Y1 (ko) * | 2016-08-25 | 2017-01-20 | 김연국 | 낚시용 인조미끼 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6151571A (ja) * | 1984-08-21 | 1986-03-14 | Nippon Seibutsu Kagaku Kenkyusho | オ−エスキ−病診断用抗原の単離・精製法 |
-
1989
- 1989-10-18 JP JP27139889A patent/JPH03138565A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6151571A (ja) * | 1984-08-21 | 1986-03-14 | Nippon Seibutsu Kagaku Kenkyusho | オ−エスキ−病診断用抗原の単離・精製法 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR200482428Y1 (ko) * | 2016-08-25 | 2017-01-20 | 김연국 | 낚시용 인조미끼 |
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