JP2677897B2 - クラミジアに対する抗体の免疫学的検出方法 - Google Patents
クラミジアに対する抗体の免疫学的検出方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、微生物に対する特異抗体の検出方法に関
し、さらに詳しくは、クラミジア感染患者の血液，尿、
その他の体液中に出現する抗体の特異的な免疫学的検出
方法に関する。
し、さらに詳しくは、クラミジア感染患者の血液，尿、
その他の体液中に出現する抗体の特異的な免疫学的検出
方法に関する。
従来、微生物体やその膜成分等を抗原試薬として、微
生物感染患者の血液，尿、その他の体液中に出現する抗
体を抗原抗体反応に基づく免疫学的手段により検出する
方法が知られている。主な免疫学的検出方法として、放
射免疫測定法（RIA），酵素免疫測定法（ELISA），蛍光
免疫測定法（FIA），ラテツクス免疫比濁法，間接蛍光
抗体法，補体結合反応，血球凝集抑制反応等が用いられ
ている。これら免疫学的検出方法は、広く臨床検査分野
で行われている。
生物感染患者の血液，尿、その他の体液中に出現する抗
体を抗原抗体反応に基づく免疫学的手段により検出する
方法が知られている。主な免疫学的検出方法として、放
射免疫測定法（RIA），酵素免疫測定法（ELISA），蛍光
免疫測定法（FIA），ラテツクス免疫比濁法，間接蛍光
抗体法，補体結合反応，血球凝集抑制反応等が用いられ
ている。これら免疫学的検出方法は、広く臨床検査分野
で行われている。
しかし、従来開発された免疫学的検出方法においても
しばしば、分類学上近縁で類似の微生物等との交差反応
等、目的の検出すべき抗体との反応とは別の非特異的反
応をさけられなかつた。かかる非特異的反応に対して
は、試薬に用いる微生物の膜成分又は更に高度に精製し
た特異抗原を用いることが行われている。例えば、クラ
ミジアの場合は、分類学上、１目〔クラミジア目（Chla
mydiales）〕,1科〔クラミジア科（Chlamydiaceae）〕,
1属〔クラミジア属（Chlamydiagenus）〕,3種〔クラミ
ジア トラコマテイス種（Chlamydia trachomatis），
クラミジア シタシ種（Chlamydia psittaci），クラミ
ジア ニユーモニエ種（Chlamydia pneumoniae）〕と分
類されており、コールドウエル（Caldwell）,H.D.らの
文献Infect.Immun.1981,31,1161−1176及び米国特許240
223号明細書には、クラミジアトラコマテイス種の検出
においては同属異種のクラミジアシタシ種とも交差反応
する特異性の問題に対し、種特異抗原又は主要外側膜蛋
白〔MOMP（Majorouter membrane protein）〕まで精製
することが示されている。又、クラミジア感染症の基礎
と臨床（金原出版社，熊本悦明，橋介壮一編集 昭和63
年２月20日，第１版発行,P.82）には、クラミジアトラ
コマティス種に対する血清抗体を測定するには、MOMPを
抗原とすべきであると報告されている。
しばしば、分類学上近縁で類似の微生物等との交差反応
等、目的の検出すべき抗体との反応とは別の非特異的反
応をさけられなかつた。かかる非特異的反応に対して
は、試薬に用いる微生物の膜成分又は更に高度に精製し
た特異抗原を用いることが行われている。例えば、クラ
ミジアの場合は、分類学上、１目〔クラミジア目（Chla
mydiales）〕,1科〔クラミジア科（Chlamydiaceae）〕,
1属〔クラミジア属（Chlamydiagenus）〕,3種〔クラミ
ジア トラコマテイス種（Chlamydia trachomatis），
クラミジア シタシ種（Chlamydia psittaci），クラミ
ジア ニユーモニエ種（Chlamydia pneumoniae）〕と分
類されており、コールドウエル（Caldwell）,H.D.らの
文献Infect.Immun.1981,31,1161−1176及び米国特許240
223号明細書には、クラミジアトラコマテイス種の検出
においては同属異種のクラミジアシタシ種とも交差反応
する特異性の問題に対し、種特異抗原又は主要外側膜蛋
白〔MOMP（Majorouter membrane protein）〕まで精製
することが示されている。又、クラミジア感染症の基礎
と臨床（金原出版社，熊本悦明，橋介壮一編集 昭和63
年２月20日，第１版発行,P.82）には、クラミジアトラ
コマティス種に対する血清抗体を測定するには、MOMPを
抗原とすべきであると報告されている。
しかし、このように特異抗原にまで完全に精製し試薬
化する方法では、非常に多くの抗原と精製に関する多く
の労力と時間を必要とする問題があった。本発明は、こ
れらの点を改善すべく種々検討した結果完成されたもの
であり、交差反応しうる他の種のクラミジアに対する抗
体による影響を受けることなく簡易に特異性を向上させ
るものである。
化する方法では、非常に多くの抗原と精製に関する多く
の労力と時間を必要とする問題があった。本発明は、こ
れらの点を改善すべく種々検討した結果完成されたもの
であり、交差反応しうる他の種のクラミジアに対する抗
体による影響を受けることなく簡易に特異性を向上させ
るものである。
すなわち、本発明はある種のクラミジアの表面抗原と
その反応相手である検体中の抗体とを抗原抗体反応させ
るクラミジアに対する抗体の免疫学的検出方法におい
て、あらかじめ抗体を他の種のクラミジア基体小体と反
応させ、非特異反応性の抗体活性を除去又は減少させ、
次いで目的の、ある種のクラミジアの表面抗原と反応さ
せることを特徴とするクラミジアに対する抗体の免疫学
的検出方法に関する。
その反応相手である検体中の抗体とを抗原抗体反応させ
るクラミジアに対する抗体の免疫学的検出方法におい
て、あらかじめ抗体を他の種のクラミジア基体小体と反
応させ、非特異反応性の抗体活性を除去又は減少させ、
次いで目的の、ある種のクラミジアの表面抗原と反応さ
せることを特徴とするクラミジアに対する抗体の免疫学
的検出方法に関する。
以下、本発明を詳細に説明する。「ある種のクラミジ
アの表面抗原」としては、ある種のクラミジアそのもの
やその膜の抽出物及び精製抗原が挙げられる。クラミジ
ア種の場合、大きく３種（クラミジア トラコマテイス
種，クラミジア シタシ種，クラミジア ニユーモニエ
種）が知られており、各々の種により抗原性や感染性等
を異にしている。これらの種どうしの間では、互いに抗
原性の共通性が存在し、これが交差反応や非特異反応の
原因になつている。
アの表面抗原」としては、ある種のクラミジアそのもの
やその膜の抽出物及び精製抗原が挙げられる。クラミジ
ア種の場合、大きく３種（クラミジア トラコマテイス
種，クラミジア シタシ種，クラミジア ニユーモニエ
種）が知られており、各々の種により抗原性や感染性等
を異にしている。これらの種どうしの間では、互いに抗
原性の共通性が存在し、これが交差反応や非特異反応の
原因になつている。
本発明において、「反応の相手」とは、検出されるべ
き検体、即ち検出目的のある種のクラミジアに感染した
と思われる宿主や患者の血液，血清，組織液等の体液中
に存在する特異抗体である。
き検体、即ち検出目的のある種のクラミジアに感染した
と思われる宿主や患者の血液，血清，組織液等の体液中
に存在する特異抗体である。
本発明において、あらかじめ抗体を反応させる他の種
のクラミジア抗原としては、該他の種のクラミジア基体
小体（EB）を用いる。又、他の種のクラミジアEBは、一
種類のものでも、複数のものでも使用できる。使用する
他の種のクラミジアEBの量は、その種類や検定に使用す
る検体中の抗体含量等の測定系の条件により異なるため
に、あらかじめ、実験系に用いる検体中の抗体量の上限
を結合しうる十分な量を設定しておく必要がある。他の
種のクラミジアEBをそれに対する検体中の抗体と反応さ
せ、非特異反応性の抗体活性を除去又は減少させた後、
特異抗体の検出のための検体とする。その検体（他の種
のクラミジアEBとそれに対する検体中の抗体との反応の
結果得た試料）としては、生じた抗原抗体結合物を共存
したままで使用しても良いが、好ましくは、遠心分離
（例えば、3,000×g,15分）により該結合物を除去した
ものを使用する。更に、操作の簡便化のために、必要が
あれば、あらかじめ、他の種のクラミジアEBをラテツク
ス粒子の様な担体粒子や試験管（採血管）に公知の方法
で物理的または化学的に固定化したものを用いることに
より交差反応の原因となる近縁の微生物抗原に対する検
体中の抗体を取り除くこともできる。
のクラミジア抗原としては、該他の種のクラミジア基体
小体（EB）を用いる。又、他の種のクラミジアEBは、一
種類のものでも、複数のものでも使用できる。使用する
他の種のクラミジアEBの量は、その種類や検定に使用す
る検体中の抗体含量等の測定系の条件により異なるため
に、あらかじめ、実験系に用いる検体中の抗体量の上限
を結合しうる十分な量を設定しておく必要がある。他の
種のクラミジアEBをそれに対する検体中の抗体と反応さ
せ、非特異反応性の抗体活性を除去又は減少させた後、
特異抗体の検出のための検体とする。その検体（他の種
のクラミジアEBとそれに対する検体中の抗体との反応の
結果得た試料）としては、生じた抗原抗体結合物を共存
したままで使用しても良いが、好ましくは、遠心分離
（例えば、3,000×g,15分）により該結合物を除去した
ものを使用する。更に、操作の簡便化のために、必要が
あれば、あらかじめ、他の種のクラミジアEBをラテツク
ス粒子の様な担体粒子や試験管（採血管）に公知の方法
で物理的または化学的に固定化したものを用いることに
より交差反応の原因となる近縁の微生物抗原に対する検
体中の抗体を取り除くこともできる。
次いで検体を、目的のある種のクラミジアの表面抗原
試薬と抗原抗体反応させる。
試薬と抗原抗体反応させる。
この抗原抗体反応による、目的のある種のクラミジア
に対する抗体の検出方法としては、一般に免疫学的検出
方法として用いられている、高感度な放射免疫測定法
（RIA），酵素免疫測定法（ELISA），蛍光免疫測定法
（FIA），ラテツクス免疫比濁法、また、間接蛍光抗体
法，補体結合反応，血球凝集抑制反応等があげられる。
免疫学的検出方法とその詳細な測定手技は、当業者に周
知の方法を使用することができる。
に対する抗体の検出方法としては、一般に免疫学的検出
方法として用いられている、高感度な放射免疫測定法
（RIA），酵素免疫測定法（ELISA），蛍光免疫測定法
（FIA），ラテツクス免疫比濁法、また、間接蛍光抗体
法，補体結合反応，血球凝集抑制反応等があげられる。
免疫学的検出方法とその詳細な測定手技は、当業者に周
知の方法を使用することができる。
また、当然、上記の検出方法に限らず本発明を適用で
きる。
きる。
以下に、他種の感染抗体に影響を受けないクラミジア
種の特異的抗体の検出の実例（クラミジア トラコマ
テイス種感染抗体の検出に対するクラミジア シタシ種
感染抗体の交差反応の除去による方法、及びクラミジ
ア シタシ種感染抗体の検出に対するクラミジア トラ
コマテイス種感染抗体の交差反応の除去）を挙げるが、
本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
種の特異的抗体の検出の実例（クラミジア トラコマ
テイス種感染抗体の検出に対するクラミジア シタシ種
感染抗体の交差反応の除去による方法、及びクラミジ
ア シタシ種感染抗体の検出に対するクラミジア トラ
コマテイス種感染抗体の交差反応の除去）を挙げるが、
本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
ａ）クラミジア トラコマテイス基本小体（EB）の調整 クラミジア トラコマテイス種の菌株はL2/434/Bu株
（以下、L2株と略す）を用いた。感染宿主細胞として、
HeLa229細胞を用い、HeLa229細胞は10％牛胎児血清（FC
S）加EagleMEMにシクロヘキシミド（Cycloheximide）を
１μg/mlの濃度で添加した培養液を用い３日ごとに６倍
に希釈し継代した。通常の継代には200mlプラスチツク
製中角ビン（培養ビン）を用いる静置培養で行つた。
（以下、L2株と略す）を用いた。感染宿主細胞として、
HeLa229細胞を用い、HeLa229細胞は10％牛胎児血清（FC
S）加EagleMEMにシクロヘキシミド（Cycloheximide）を
１μg/mlの濃度で添加した培養液を用い３日ごとに６倍
に希釈し継代した。通常の継代には200mlプラスチツク
製中角ビン（培養ビン）を用いる静置培養で行つた。
培養ビン中で単層に増殖したHeLa229細胞にL2株を接
種後約２日目で、感染させたほとんどのHeLa229細胞は
封入体を形成した。その培養液の上清を捨て、残つた細
胞をラバーポリスマンで剥し取り、Hanks'BSSの10mlに
懸濁してプールし、超音波処理（20KHz,60sec;（株）日
本精機製作所US−300）した。ここで、感染防御の為紫
外線照射によりクラミジア トラコマテイスを不活性化
した。この懸濁細胞液を遠心分離（500×g,15分,4℃）
し、上清をコールドウエル（Caldwell）,H.D.らの文献
であるInfect.Immun.1981,31,1161−1176に記載の方法
により、レノグラフイン（ジアトリゾエートメグルミン
及びジアトリゾエートナトリウム,76％注射用；日本シ
エーリング社）の不連続密度勾配遠心法によりクラミジ
アトラコマテイスEBを精製した。即ち、遠心上清を0.15
MNaClを含有する10mM HEPES（Ｎ−２−hydroxyethylpip
erazine−Ｎ′−２−ethanesulfonic acid）により希釈
した35％（v/v）レノグラフインの8ml上に重層し、超遠
心用ロータ（SPR28SA−536形，日立工機（株）製）で４
℃,45,000×ｇで１時間遠心した。沈渣を0.25Mシヨ糖及
び5mML−グルタミン酸を含有する10mMリン酸ナトリウム
緩衝液（SPG,pH7.2）中に再懸濁し集め、レノグラフイ
ン不連続密度勾配（Renografin40％ 15ml,44％ 10ml,
52％ 5ml）に重層し、超遠心用ロータ（SPR28SA−536
形，日立工機（株）製）で４℃,45,000×ｇで１時間遠
心した。レノグラフイン不連続密度勾配濃度の44％と52
％の間の界面に位置する白濁物を集め、３容量のSPGで
希釈し、30,000×ｇで30分間の遠心を繰り返すことによ
り残留するレノグラフインを除去してクラミジア トラ
コマテイスの精製EBとした。
種後約２日目で、感染させたほとんどのHeLa229細胞は
封入体を形成した。その培養液の上清を捨て、残つた細
胞をラバーポリスマンで剥し取り、Hanks'BSSの10mlに
懸濁してプールし、超音波処理（20KHz,60sec;（株）日
本精機製作所US−300）した。ここで、感染防御の為紫
外線照射によりクラミジア トラコマテイスを不活性化
した。この懸濁細胞液を遠心分離（500×g,15分,4℃）
し、上清をコールドウエル（Caldwell）,H.D.らの文献
であるInfect.Immun.1981,31,1161−1176に記載の方法
により、レノグラフイン（ジアトリゾエートメグルミン
及びジアトリゾエートナトリウム,76％注射用；日本シ
エーリング社）の不連続密度勾配遠心法によりクラミジ
アトラコマテイスEBを精製した。即ち、遠心上清を0.15
MNaClを含有する10mM HEPES（Ｎ−２−hydroxyethylpip
erazine−Ｎ′−２−ethanesulfonic acid）により希釈
した35％（v/v）レノグラフインの8ml上に重層し、超遠
心用ロータ（SPR28SA−536形，日立工機（株）製）で４
℃,45,000×ｇで１時間遠心した。沈渣を0.25Mシヨ糖及
び5mML−グルタミン酸を含有する10mMリン酸ナトリウム
緩衝液（SPG,pH7.2）中に再懸濁し集め、レノグラフイ
ン不連続密度勾配（Renografin40％ 15ml,44％ 10ml,
52％ 5ml）に重層し、超遠心用ロータ（SPR28SA−536
形，日立工機（株）製）で４℃,45,000×ｇで１時間遠
心した。レノグラフイン不連続密度勾配濃度の44％と52
％の間の界面に位置する白濁物を集め、３容量のSPGで
希釈し、30,000×ｇで30分間の遠心を繰り返すことによ
り残留するレノグラフインを除去してクラミジア トラ
コマテイスの精製EBとした。
ｂ）クラミジア シタシ基本小体（EB）の調製 クラミジア シタシ種の菌株はBudgerigar−１株（以
下Bud株と略す）を用いた。又、培養の宿主細胞として
Ｌ細胞を用いた。Ｌ細胞は、10％牛胎児血清（FCS）加E
agleMEMを用い３日ごとに６倍に希釈し継代した。通常
の継代には200mlプラスチツク製中角ビンを用いる静置
培養で行つた。
下Bud株と略す）を用いた。又、培養の宿主細胞として
Ｌ細胞を用いた。Ｌ細胞は、10％牛胎児血清（FCS）加E
agleMEMを用い３日ごとに６倍に希釈し継代した。通常
の継代には200mlプラスチツク製中角ビンを用いる静置
培養で行つた。
クラミジア シタシの接種には培養３日目の細胞を用
い、細胞を150×g,5分間の遠心分離で収集しHanks'BSS
で３回遠心洗浄した。吸着はMOI10、細胞濃度107/mlで3
7℃２時間、温水中で振盪しつつ行つた。吸着後、FCS加
培地に細胞濃度が５〜７×105/mlに再浮遊させ37℃で２
日間培養した。培養後、一部採取し、遠心により感染細
胞を集め、塗抹標本を作成し、ギムザ（Gimesa）染色に
よりEBが十分に増殖していることを確認した。次いで、
感染細胞を超音波破砕しレノグラフインの密度勾配遠心
法によりクラミジア シタシEBを精製した。即ち、感染
細胞懸濁液をプールし、超音波破砕（20KHz,60sec;
（株）日本精機製作所US−300）した。この懸濁液を700
×ｇで10分間遠心し感染培養上清を得た。該上清液を0.
15MNaClを含む10mM HEPES（Ｎ−２−hydroxyethylpiper
azine−Ｎ′−２−ethanesulfonic acid）により、注射
用76％レノグラフイン液体を35％レノグラフインを含有
するように調製した溶液の8mlの上に重層し、超遠心用
ロータ（SRP28SA−536形，日立工機（株））で４℃,45,
000×ｇで１時間遠心した。沈渣を0.25Mシヨ糖及び5mML
−グルタミン酸を含有する10mMリン酸ナトリウム緩衝液
（SPG,pH7.2）中に再懸濁してプールし、レノグラフイ
ン不連続密度勾配（レノグラフイン40％ 15ml,45％ 1
0ml,52％ 5ml）に重層して作成し、超遠心用ロータ（S
RP28SA−536形，日立工機（株））で４℃,45,000×ｇで
１時間遠心した。レノグラフイン不連続密度勾配濃度の
45％と52％の間の界面に位置する白濁物を集め、３容量
のSPGで希釈し、3,000×ｇで30分間の遠心を繰り返すこ
とにより残留するレノグラフインを除去して精製EBとし
た。
い、細胞を150×g,5分間の遠心分離で収集しHanks'BSS
で３回遠心洗浄した。吸着はMOI10、細胞濃度107/mlで3
7℃２時間、温水中で振盪しつつ行つた。吸着後、FCS加
培地に細胞濃度が５〜７×105/mlに再浮遊させ37℃で２
日間培養した。培養後、一部採取し、遠心により感染細
胞を集め、塗抹標本を作成し、ギムザ（Gimesa）染色に
よりEBが十分に増殖していることを確認した。次いで、
感染細胞を超音波破砕しレノグラフインの密度勾配遠心
法によりクラミジア シタシEBを精製した。即ち、感染
細胞懸濁液をプールし、超音波破砕（20KHz,60sec;
（株）日本精機製作所US−300）した。この懸濁液を700
×ｇで10分間遠心し感染培養上清を得た。該上清液を0.
15MNaClを含む10mM HEPES（Ｎ−２−hydroxyethylpiper
azine−Ｎ′−２−ethanesulfonic acid）により、注射
用76％レノグラフイン液体を35％レノグラフインを含有
するように調製した溶液の8mlの上に重層し、超遠心用
ロータ（SRP28SA−536形，日立工機（株））で４℃,45,
000×ｇで１時間遠心した。沈渣を0.25Mシヨ糖及び5mML
−グルタミン酸を含有する10mMリン酸ナトリウム緩衝液
（SPG,pH7.2）中に再懸濁してプールし、レノグラフイ
ン不連続密度勾配（レノグラフイン40％ 15ml,45％ 1
0ml,52％ 5ml）に重層して作成し、超遠心用ロータ（S
RP28SA−536形，日立工機（株））で４℃,45,000×ｇで
１時間遠心した。レノグラフイン不連続密度勾配濃度の
45％と52％の間の界面に位置する白濁物を集め、３容量
のSPGで希釈し、3,000×ｇで30分間の遠心を繰り返すこ
とにより残留するレノグラフインを除去して精製EBとし
た。
ｃ）EB固定化ELISA用プレートの作成方法 ELISA法のマイクロプレート（96穴）上へのEBの固定
は、上記のようにして精製したEBを抗原としてCoating
緩衝液、pH9.6（蒸留水11中に、Na2CO31.59g,NaHCO32.9
3g,NaN30.2gを含有する）に透析し、EBの蛋白濃度５μg
/mlの濃度に調製したものを、マイクロタイタープレー
ト上の各穴に250μｌずつ加え４℃で一晩静置した。こ
のEBを固定したプレートをPBS−Tween,pH7.4（蒸留水１
中、NaCl8.0g,KH2PO40.2g,KCl0.2g,Tween200.5ml,NaN
30.2gを含有する）により３回洗浄し、１％BSA・PBS液
を各穴に100μずつ加え４℃で一夜静置することによ
り、プレート表面上のEB未吸着部分をブロツクした。さ
らに、PBS−Tween,pH7.4を用いて３回洗浄してEB固定化
ELISAプレートとした。
は、上記のようにして精製したEBを抗原としてCoating
緩衝液、pH9.6（蒸留水11中に、Na2CO31.59g,NaHCO32.9
3g,NaN30.2gを含有する）に透析し、EBの蛋白濃度５μg
/mlの濃度に調製したものを、マイクロタイタープレー
ト上の各穴に250μｌずつ加え４℃で一晩静置した。こ
のEBを固定したプレートをPBS−Tween,pH7.4（蒸留水１
中、NaCl8.0g,KH2PO40.2g,KCl0.2g,Tween200.5ml,NaN
30.2gを含有する）により３回洗浄し、１％BSA・PBS液
を各穴に100μずつ加え４℃で一夜静置することによ
り、プレート表面上のEB未吸着部分をブロツクした。さ
らに、PBS−Tween,pH7.4を用いて３回洗浄してEB固定化
ELISAプレートとした。
ｄ）検体中の非特異反応抗体の活性除去方法 クラミジア トラコマテイスの種特異抗体の検出のた
め、特に、クラミジア シタシ種に対する抗体の活性を
除去した。
め、特に、クラミジア シタシ種に対する抗体の活性を
除去した。
クラミジア トラコマテイスに対する類似の微生物抗
原として、クラミジア シタシBudgerigar−１株のEBを
使用した。又、クラミジア シタシに対する類似の微生
物抗原として、クラミジア トラコマテイスL2株のEBを
使用した。以下に使用した検体及びその非特異反応抗体
の活性除去方法を示す。
原として、クラミジア シタシBudgerigar−１株のEBを
使用した。又、クラミジア シタシに対する類似の微生
物抗原として、クラミジア トラコマテイスL2株のEBを
使用した。以下に使用した検体及びその非特異反応抗体
の活性除去方法を示す。
検体 別所敞子ら、医学のあゆみ,1984,128,571−572に記載
される間接蛍光抗体法（MFA）によりIgG抗体を検査した
以下の患者検体を用いた。
される間接蛍光抗体法（MFA）によりIgG抗体を検査した
以下の患者検体を用いた。
（１）クラミジア シタシ感染患者血清（C.P） タイター；クラミジア シタシ ×512 クラミジア トラコマテイス ×４ （２）クラミジア トラコマテイス感染患者血清（C.
T） タイター；クラミジア トラコマテイス ×1024 クラミジア シタシ ×４ （３）複合感染患者血清（C.P＋C.T） タイター；クラミジア トラコマテイス ×1024 クラミジア シタシ ×512 （４）健常人血清（N.S.） タイター；クラミジア トラコマテイス ×４ クラミジア シタシ ×４ 検体中の非特異反応抗体の活性除去 に示した（１）〜（４）の患者検体を100倍に希釈
した検体100μと類似の微生物抗原（EB）（蛋白含量
約10mg/ml）の100μとを混合し反応させ37℃で３時間
インキユベートし遠心分離（3,000×g,15分）した上清
を処理検体とした。尚、非特異反応抗体の活性除去処理
に対する未処理の検体（対照）としてはに示した
（１）〜（４）の患者検体を同様に100倍に希釈した各
々の検体100μとSPGの100μと混合し反応させ37℃
で３時間インキユベートし、遠心分離（3,000×g,15
分）した上清を未処理検体とした。
T） タイター；クラミジア トラコマテイス ×1024 クラミジア シタシ ×４ （３）複合感染患者血清（C.P＋C.T） タイター；クラミジア トラコマテイス ×1024 クラミジア シタシ ×512 （４）健常人血清（N.S.） タイター；クラミジア トラコマテイス ×４ クラミジア シタシ ×４ 検体中の非特異反応抗体の活性除去 に示した（１）〜（４）の患者検体を100倍に希釈
した検体100μと類似の微生物抗原（EB）（蛋白含量
約10mg/ml）の100μとを混合し反応させ37℃で３時間
インキユベートし遠心分離（3,000×g,15分）した上清
を処理検体とした。尚、非特異反応抗体の活性除去処理
に対する未処理の検体（対照）としてはに示した
（１）〜（４）の患者検体を同様に100倍に希釈した各
々の検体100μとSPGの100μと混合し反応させ37℃
で３時間インキユベートし、遠心分離（3,000×g,15
分）した上清を未処理検体とした。
ｅ）クラミジア種特異抗体の検出法とその評価 クラミジア トラコマテイス種及びクラミジア シタ
シ種の特異抗体の検出を目的にｄ）で得られた検体を、
ｃ）で作成したEB固定化（クラミジア トラコマテイス
種及びクラミジア シタシ種を各々別々に固定化した）
ELISA用プレートを用いて評価した。ELISA法による検出
操作は、広く当業者に知られているように、ｃ）で作成
したプレートに、ｄ）で得た検体を各々100μずつ全
く同一に（duplicate）で添加し、室温で２時間静置し
た。PBS−Tweenで３回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗
ヒトIgG抗体（KPL社製）を100μずつ添加して室温で
２時間反応させた。PBS−Tweenで３回洗浄後、オルトフ
エニレンジアミン40mg,30％H2O240μを基質用緩衝液
（蒸留水1.01中に0.1Mクエン酸35ml,0.1Mクエン酸ナト
リウム65mlを含有する）100μに溶解して添加した。
発色後（通常は基質添加後20〜30分間反応させた後）1N
NaOH又は1NH2SO4を加えて反応を停止させ、コロナ電気
（株）製MTP−22で492nmでの吸光度を反応停止後１時間
以内に測定した。得られた測定結果を表２及び表３に示
した。
シ種の特異抗体の検出を目的にｄ）で得られた検体を、
ｃ）で作成したEB固定化（クラミジア トラコマテイス
種及びクラミジア シタシ種を各々別々に固定化した）
ELISA用プレートを用いて評価した。ELISA法による検出
操作は、広く当業者に知られているように、ｃ）で作成
したプレートに、ｄ）で得た検体を各々100μずつ全
く同一に（duplicate）で添加し、室温で２時間静置し
た。PBS−Tweenで３回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗
ヒトIgG抗体（KPL社製）を100μずつ添加して室温で
２時間反応させた。PBS−Tweenで３回洗浄後、オルトフ
エニレンジアミン40mg,30％H2O240μを基質用緩衝液
（蒸留水1.01中に0.1Mクエン酸35ml,0.1Mクエン酸ナト
リウム65mlを含有する）100μに溶解して添加した。
発色後（通常は基質添加後20〜30分間反応させた後）1N
NaOH又は1NH2SO4を加えて反応を停止させ、コロナ電気
（株）製MTP−22で492nmでの吸光度を反応停止後１時間
以内に測定した。得られた測定結果を表２及び表３に示
した。
尚、表２において、MOMPと示した実験は、多くの労力
をかけ高度に精製した特異抗原を試薬化した場合の対照
として示した。即ち、クラミジア トラコマテイス種L2
株の菌体をコールドウエルH.D.ら、Infect.Immun.1981,
31,1161−1176に記載の方法に従つて精製した主要外側
蛋白（Major Outer Membrane Protein）をEB固定化プレ
ートと同様にしてELISA用プレートを作成し（Ｃ））、
検体としてSPGで倍に希釈した患者物検体を用いた以外
は前記と同様、ELISA法で測定した。なお、クラミジア
シタシ種についても同様に行なつた。
をかけ高度に精製した特異抗原を試薬化した場合の対照
として示した。即ち、クラミジア トラコマテイス種L2
株の菌体をコールドウエルH.D.ら、Infect.Immun.1981,
31,1161−1176に記載の方法に従つて精製した主要外側
蛋白（Major Outer Membrane Protein）をEB固定化プレ
ートと同様にしてELISA用プレートを作成し（Ｃ））、
検体としてSPGで倍に希釈した患者物検体を用いた以外
は前記と同様、ELISA法で測定した。なお、クラミジア
シタシ種についても同様に行なつた。
〔発明の効果〕 表2,3から明らかなように、本発明によれば、患者検
体を検出する際に、あらかじめ、検出目的のある種のク
ラミジア以外の他の種のクラミジアに対する抗体を過剰
量のその他の種のクラミジアEBと反応させ、除去又は減
少させることにより、未処理の方法に比べ特異抗原を精
製することなく粗精製のクラミジア抗原を試薬として、
簡単に抗体検出の特異性を向上させることが出来る。
体を検出する際に、あらかじめ、検出目的のある種のク
ラミジア以外の他の種のクラミジアに対する抗体を過剰
量のその他の種のクラミジアEBと反応させ、除去又は減
少させることにより、未処理の方法に比べ特異抗原を精
製することなく粗精製のクラミジア抗原を試薬として、
簡単に抗体検出の特異性を向上させることが出来る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 渡辺 博夫 茨城県日立市東町４丁目13番１号 日立 化成工業株式会社茨城研究所内 (56)参考文献 特開 昭63−266356（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−37257（ＪＰ，Ａ)
Claims (4)
- 【請求項１】ある種のクラミジアの表面抗原とその反応
相手である検体中の抗体とを抗原抗体反応させるクラミ
ジアに対する抗体の免疫学的検出方法において、あらか
じめ抗体を他の種のクラミジア基本小体と反応させ、非
特異反応性の抗体活性を除去又は減少させ、次いで目的
の、ある種のクラミジアの表面抗原と反応させることを
特徴とするクラミジアに対する抗体の免疫学的検出方
法。 - 【請求項２】ある種のクラミジアが、クラミジアトラコ
マテイスであり、他の種のクラミジアがクラミジアシタ
シ及び／又はクラミジアニューモニエである請求項１記
載の抗体の免疫学的検出方法。 - 【請求項３】ある種のクラミジアが、クラミジアシタシ
であり、他の種のクラミジアがクラミジアトラコマテイ
ス及び／又はクラミジアニューモニエである請求項１記
載の抗体の免疫学的検出方法。 - 【請求項４】ある種のクラミジアが、クラミジアニュー
モニェであり、他の種のクラミジアがクラミジアトラコ
マティス及び／又はクラミジアシタシである請求項１記
載の抗体の免疫学的検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2142790A JP2677897B2 (ja) | 1990-05-31 | 1990-05-31 | クラミジアに対する抗体の免疫学的検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2142790A JP2677897B2 (ja) | 1990-05-31 | 1990-05-31 | クラミジアに対する抗体の免疫学的検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0434363A JPH0434363A (ja) | 1992-02-05 |
| JP2677897B2 true JP2677897B2 (ja) | 1997-11-17 |
Family
ID=15323671
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2142790A Expired - Fee Related JP2677897B2 (ja) | 1990-05-31 | 1990-05-31 | クラミジアに対する抗体の免疫学的検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2677897B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL107628A0 (en) * | 1992-11-18 | 1994-02-27 | Calypte Inc | Immunoassays for microorganisms associated with sexually transmitted diseases |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6337257A (ja) * | 1986-07-31 | 1988-02-17 | Kyowa Medetsukusu Kk | 抗ヒトｃｅａ血清の精製法 |
| JPS63266356A (ja) * | 1987-04-24 | 1988-11-02 | Eiken Kagaku Kk | 交差反応の影響を抑えた免疫学的測定法 |
-
1990
- 1990-05-31 JP JP2142790A patent/JP2677897B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0434363A (ja) | 1992-02-05 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |