JP3718896B2 - クラミジア・ニューモニエ抗原、その製造法、それを用いた抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法及び抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬 - Google Patents
クラミジア・ニューモニエ抗原、その製造法、それを用いた抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法及び抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クラミジア・ニューモニエ感染症を診断するために有用なクラミジア・ニューモニエ抗原、その製造法、それを用いた抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法及び抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
クラミジア(Chlamydia)は、宿主の細胞内でのみ生存可能な偏性細胞内寄生体である。その増殖サイクルは特殊で、形態学的には細胞外にあるクラミジア基本小体(elementary body、以下ＥＢと略す)が食菌作用により細胞内に取り込まれて空胞封入体を形成し、網様体(reticulate body、以下ＲＢと略す)に変化する 。ＲＢは増殖力はあるが感染力を欠いており、細胞内で増殖したＲＢはやがてＥＢに変化し、封入体を破り細胞壁を破壊して細胞外に出る。ＥＢは増殖力を欠くが感染力を持つ。クラミジア属には、現在４つの種（トラコマティス、シタシ、ニューモニエ及びペコラム）が確認されているが、クラミジア・ニューモニエ （Chlamidia pneumoniae）は空気感染によってヒトに感染することが知られている
【０００３】
近年、肺炎、気管支炎、急性上気道炎などの呼吸器感染症の原因微生物の１つとしてこのクラミジア・ニューモニエが注目を集めており、世界各地で行われた血清学的疫学調査によると、クラミジア・ニューモニエに対する抗体保有率が、欧米諸国では４０〜５０％、台湾、パナマ、イランなどでは６０％以上、日本国内でも５０〜６０％と報告され、クラミジア・ニューモニエ感染症の実態が徐々に明らかにされるにつれて関心が高まってきている。
【０００４】
クラミジア感染症の最も感度の高い血清診断法はワン(Wang)及びグレイストン(Grayston)の間接ミクロ免疫蛍光抗体測定法（マイクロ-IF法）である（トラコーマ・アンド・リレーティッド・ディスオーダーズ・コーズド・バイ・クラミジアル・エージェンツ、エクセルプタ・メディカ、アムステルタム、273-288頁、1971年）(Trachoma and related disorders caused by chlamydial agents, Excerpta Medica, Amsterdam, pp.273-288, 1971)。しかしながら、マイクロ-IF法はその試験手技が困難なため、臨床検査室では診断法としては採用されていない。また、標準的なマイクロ-IF法はクラミジアの精製ＥＢを必要とする。さらに、このマイクロ-IF法は、免疫蛍光反応を行うために同定用微生物の完全な形態又は構造を必要とする。従って、形態又は構造を変えたＥＢや破壊したＥＢを使用することができない。ところが、このＥＢは伝染性があり、かつ毒性をもっているため、そのまま抗原材料として使用するためには感染防禦を施した特別な施設を必要とする。従って、通常はホルムアルデヒドやアセトンなどの固定化剤で処理したＥＢを抗原として用いている。
【０００５】
一方、近年開発された酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)は、簡便かつ迅速に多数検体の処理ができる利点を有している。このＥＬＩＳＡを用いた抗クラミジア抗体の測定に関する報告がなされているが、そのほとんどがクラミジアのＥＢをそのまま抗原材料として用いている。そのため、精製純度の低い抗原を用いることによる非特異的反応の存在が知られている。これは、主としてクラミジアの複雑な抗原性に起因している。クラミジアの抗原性には、属(genus)特異的抗原、種(species)特異的抗原および血清型(biobar)特異的抗原があると考えられている。代表的なクラミジア属特異的抗原として、リポポリサッカライド(lipopolysaccharide、以下ＬＰＳと略す)が知られており、これは一部腸内細菌のＲｅミュータントＬＰＳと共通抗原性を有している。
【０００６】
また、代表的な種特異的抗原又は血清型特異的抗原としては、クラミジア主要外膜タンパク質（以下、ＭＯＭＰと略す）が知られており、クラミジア外膜タンパク質の約６０％を占めるといわれている。しかしながら、このＭＯＭＰにも属特異的抗原性の存在が知られている（コレットら、アニュアル・ミーティング・アメリカン・ソサイエティー・オブ・ミクロバイオロジー、ワシントン ディーシー、アブストラクト、No.D-159、1986年）（Collett et al., Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol.,Washington.D.C., Abstract No.D-159, 1986）。
【０００７】
ところで、ＭＯＭＰ以外のクラミジア外膜抗原は主として属特異的抗原であるが、同時に種特異的抗原性の存在するものもある。例えば、飯嶋らは、クラミジア・ニューモニエのＥＢを用いたイムノブロット法により、クラミジア・ニューモニエの分子量４０ＫダルトンのＭＯＭＰが属特異的であり、分子量４３Ｋダルトン、４６Ｋダルトン及び５３Ｋダルトンのタンパク質が種特異的であり、さらに、分子量９８Ｋダルトンのタンパク質もおそらく種特異的であることを報告している（飯嶋ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ミクロバイオロジー、583-588頁、1994年）（Y. Iijima et al., Journal of Clinical Microbiology,p.583-588(1994)）。
【０００８】
上述したように、クラミジアのもつ抗原性は非常に複雑であり、クラミジア属として共通であっても、異なった種間ではかなり異なった抗原性を示す。従って、これまでにクラミジア・トラコマティス抗体を測定する方法が知られているが（特開平４−２９７８７１号公報）、クラミジア・ニューモニエとクラミジア・トラコマティスで抗原性がかなり異なるため、クラミジア・ニューモニエを種特異的に測定するために単にその方法を利用することはできない。また、クラミジア・ニューモニエ感染者が有する抗クラミジア抗体は、クラミジアの複雑な抗原性に対応した多様性を示し、感染者によってそのパターンは異なるが、抗原としてＥＢ自体を用いる場合、非特異的反応が生じ、特異的で高精度な測定は困難である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
請求項１記載の発明は、種特異性が高く、臨床上問題となる疑陰性がほとんどなく、疑陽性も低いクラミジア・ニューモニエ抗原を提供するものである。
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明の効果に加え、臨床上問題となる疑陰性及び疑陽性が極めて少ないクラミジア・ニューモニエ抗原を提供するものである。
請求項３記載の発明は、請求項１又は２に記載の発明の効果に加え、種特異性が極めて高いクラミジア・ニューモニエ抗原を提供するものである。
請求項４記載の発明は、請求項１〜３のいずれかに記載の発明の効果に加え、再現性に優れるクラミジア・ニューモニエ抗原を提供するものである。
請求項５記載の発明は、種特異性が高く、臨床上問題となる疑陰性がほとんどなく、疑陽性も低いクラミジア・ニューモニエ抗原の製造法を提供するものである。
【００１０】
請求項６記載の発明は、種特異性が高く、臨床上問題となる疑陰性がほとんどなく、疑陽性も低い抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法を提供するものである。
請求項７記載の発明は、請求項６記載の発明の効果に加え、測定が簡易である抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法を提供するものである。
請求項８記載の発明は、請求項７記載の発明の効果に加え、簡易に検体を採集できる抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法を提供するものである。
請求項９記載の発明は、請求項７又は８に記載の発明の効果に加え、検体提供者の臨床像が反映される抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法を提供するものである。
請求項１０記載の発明は、請求項７〜９のいずれかに記載の発明の効果に加え、高感度である抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法を提供するものである。
【００１１】
請求項１１記載の発明は、種特異性が高く、臨床上問題となる疑陰性がほとんどなく、疑陽性も低い抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬を提供するものである。
請求項１２記載の発明は、請求項１１記載の発明の効果に加え、測定が簡易である抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬を提供するものである。
請求項１３記載の発明は、請求項１２記載の発明の効果に加え、より簡易に測定できる抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬を提供するものである。
請求項１４記載の発明は、請求項１２又は１３に記載の発明の効果に加え、高感度である抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬を提供するものである。
請求項１５記載の発明は、請求項１４記載の発明の効果に加え、極めて高感度に測定できる抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬を提供するものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、下記（１）〜（１５）に関する。
（１）クラミジア・ニューモニエ外膜由来のタンパク質を含有してなるクラミジア・ニューモニエ抗原。
（２）抗クラミジア・トラコマティス抗体及び抗クラミジア・シタシ抗体との間で実質的に非特異的な反応が生じない前記（１）記載のクラミジア・ニューモニエ抗原。
（３）クラミジア・ニューモニエ外膜由来のタンパク質が、分子量約４３Ｋダルトン、約４６Ｋダルトン及び約５３Ｋダルトンの３種類のタンパク質の中の少なくとも１種類を含むものである前記（１）又は（２）に記載のクラミジア・ニューモニエ抗原。
（４）クラミジア・ニューモニエ外膜由来のタンパク質が、分子量約４３Ｋダルトン、約４６Ｋダルトン及び約５３Ｋダルトンの３種類のタンパク質を含むものである前記（１）〜（３）のいずれかに記載のクラミジア・ニューモニエ抗原。
（５）クラミジア・ニューモニエ基本小体の細胞質及び細胞質膜をイオン性界面活性剤を用いて可溶化し、その可溶化部分を除いた残渣成分を取得することを特徴とするクラミジア・ニューモニエ抗原の製造法。
【００１３】
（６）前記（１）〜（４）のいずれかに記載のクラミジア・ニューモニエ抗原を用いることを特徴とする抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
（７）前記（１）〜（４）のいずれかに記載のクラミジア・ニューモニエ抗原を固相担体に固定化し、これを検体試料と接触させ、生成した抗原抗体複合体を検体試料中の抗体に対する標識抗体と接触させ、結合した又は結合しない標識抗体上の標識物量を測定し、その値から検体試料中の抗クラミジア・ニューモニエ抗体を測定する工程を含む前記（６）記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
（８）検体試料がヒト涙、ヒト咽頭ぬぐい液又はヒト血清である前記（７）記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
（９）標識抗体が、標識化抗ヒトＩｇＧ抗体、標識化抗ヒトＩｇＡ抗体又は標識化抗ヒトＩｇＭ抗体である前記（７）又は（８）に記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
（１０）標識抗体が酵素標識抗体である前記（７）〜（９）のいずれかに記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
【００１４】
（１１）前記（１）〜（４）のいずれかに記載のクラミジア・ニューモニエ抗原を含有してなる抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬。
（１２）固相担体に固定された固定化抗原と測定しようとする抗体に反応する標識抗体が含有されてなる前記（１１）記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬。
（１３）固相担体がポリスチレンビーズ又はポリスチレンマイクロタイタープレートである前記（１２）記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬。
（１４）標識抗体が酵素標識抗体である前記（１２）又は（１３）に記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬。
（１５）酵素標識抗体がアルカリフォスファターゼ標識抗体又は西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗体である前記（１４）記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
クラミジア・ニューモニエ外膜は、クラミジア・ニューモニエＥＢから細胞質（cytoplasm）と細胞質膜（cytoplasmic membrane）が欠落した細胞壁（cell wall）であり、これは主としてタンパク質と脂質から構成される。
本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原は、前記クラミジア・ニューモニエ外膜由来のタンパク質を含有してなるものである。
このクラミジア・ニューモニエ抗原の中では、臨床上問題となる疑陰性及び疑陽性が極めて少ない点から、抗クラミジア・トラコマティス抗体及び抗クラミジア・シタシ抗体との間で実質的に非特異的な反応が生じないものが好ましい。ここで、実質的に非特異的な反応が生じないとは、非特異的な反応が全く生じないか又は非特異的な反応がほとんど生じないことをいう。
【００１６】
クラミジア・ニューモニエ外膜由来のタンパク質としては、例えば、分子量約３０Ｋダルトン、約３７Ｋダルトン、約４０Ｋダルトン、約４３Ｋダルトン、約４６Ｋダルトン、約５３Ｋダルトン、約６０Ｋダルトン、約９８Ｋダルトンのタンパク質がある。
【００１７】
本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原としては、前記クラミジア・ニューモニエ外膜由来のタンパク質のうち、クラミジア・ニューモニエの種特異的である分子量約４３Ｋダルトン、約４６Ｋダルトン及び約５３Ｋダルトンの３種類のタンパク質の中の少なくとも１種類を含むものであることが好ましい。
また、クラミジア・ニューモニエ感染者が有する抗クラミジア抗体の多様性に対して優れた対応能力を有する点から、本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原としては、前記クラミジア・ニューモニエ外膜由来のタンパク質のうち、分子量約４３Ｋダルトン、約４６Ｋダルトン及び約５３Ｋダルトンの３種類のタンパク質を含むものであることがより好ましい。
さらに、前記多様性に対してより優れた対応能力を有する点から、本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原としては、前記クラミジア・ニューモニエ外膜由来のタンパク質のうち、分子量約４３Ｋダルトン、約４６Ｋダルトン及び約５３Ｋダルトンの３種類のタンパク質の中の少なくとも１種類に加え、さらに、分子量約９８Ｋダルトンのタンパク質を含むものであることがより好ましい。
【００１８】
次に、本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原の製造法について説明する。
本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原は、クラミジア・ニューモニエ菌体から得ることができるが、良好な特性を示す抗原が得られることから、クラミジア・ニューモニエ菌体のうちＥＢを原料として用いことが好ましい。
クラミジア・ニューモニエＥＢから本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原を得る方法としては、例えば、クラミジア・ニューモニエＥＢの細胞質及び細胞質膜をイオン性界面活性剤を用いて可溶化し、その可溶化部分を除いた残渣成分を取得する方法が挙げられる。この方法は、抗原を容易に製造でき、かつ、得られる抗原が良好な抗原性を示す点から好ましい。前記イオン性界面活性剤としては、得られる抗原が良好な抗原性を示す点から、アニオンサルコシン界面活性剤が好ましく、サルコシル（Sarcosyl、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム）が特に好ましい。なお、クラミジア・ニューモニエＥＢの細胞質及び細胞質膜をイオン性界面活性剤を用いて可溶化する際に、デオキシリボ核酸分解酵素（ＤＮａｓｅ）及びリボ核酸分解酵素（ＲＮａｓｅ）等のヌクレアーゼを反応させ、核酸を可溶化して除去することが好ましい。
【００１９】
クラミジア・ニューモニエＥＢの細胞質及び細胞質膜をイオン性界面活性剤を用いて可溶化し、その可溶化部分を除去して得られた残渣成分は、クラミジア・ニューモニエＥＢから細胞質と細胞質膜が欠落した細胞壁、即ち、クラミジア・ニューモニエ外膜を中心成分としている。このクラミジア・ニューモニエ外膜には、前記分子量約３０Ｋダルトン、約３７Ｋダルトン、約４０Ｋダルトン、約４３Ｋダルトン、約４６Ｋダルトン、約５３Ｋダルトン、約６０Ｋダルトン、約９８Ｋダルトンのタンパク質及びその他の微量のタンパク質が含有される。
本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原としては、クラミジア・ニューモニエ外膜を中心成分とする前記残渣成分をそのまま用いることができる。
【００２０】
また、本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原としては、このクラミジア・ニューモニエ外膜の一部分、即ち、クラミジア・ニューモニエ外膜複合体（Chlamydia outer membrane complex、以下、ＣＯＭＣという）を用いることもできる。
さらに、本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原としては、この残渣成分に可溶化剤を反応させて得られた反応物を用いることもできる。前記可溶化剤としては、例えば、前記イオン性界面活性剤とは異なった界面活性剤等が挙げられ、このような界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。得られた反応物には、前記残渣成分の可溶化物又は分解物が含有される。
これらのクラミジア・ニューモニエ抗原は、種特異性が高く、臨床上問題となる疑陰性がほとんどなく、疑陽性も低い。
これらのクラミジア・ニューモニエ抗原の中では、これらの効果が顕著に優れ、再現性にも優れる点から、クラミジア・ニューモニエ外膜を中心成分とする前記残渣成分自体を使用することが好ましい。
【００２１】
本発明の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法は、前記クラミジア・ニューモニエ抗原を抗原の一部又は全部として用いる限り、特に制限されない。
抗体の測定法としては、例えば、各種標識抗体を用いたサンドイッチ型免疫測定法、ラテックス担体粒子を用いたラテックス凝集法、免疫比濁法等が好ましい方法として挙げられる。
【００２２】
以下、サンドイッチ型免疫測定法について詳しく説明する。
本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原を用い、サンドイッチ型免疫測定法を利用して抗クラミジア・ニューモニエ抗体を測定する方法としては、例えば、上記抗原を物理的又は化学的に固相担体に固定化して固定化抗原を作成し、この固定化抗原を検体試料と接触させて一定時間保温し、これにより、検体試料中に抗クラミジア・ニューモニエ抗体が存在する場合はその抗体が前記固定化抗原と結合して抗原抗体複合体が固相担体上に形成され、必要により一旦洗浄し、次いで検体試料中の抗体に対する標識抗体を接触させる（場合により、検体試料と標識抗体を同時に接触させても良い）方法を使用することができる。
前記抗原抗体複合体が形成されていると、これにさらに標識抗体が結合し、固相担体上に固定化されることとなる。その後、固相担体上に結合した標識抗体又は結合しない標識抗体上の標識物量を標識物に応じた測定方法により測定し、その値から検体試料中の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の存在又はその量を求めることができる。
【００２３】
固相担体としては、例えば、ポリスチレン、塩化ビニール等のプラスチック材料、ニトロセルロース、ナイロン等の繊維材料、ガラス、シリカゲル等の無機材料などを用いることができ、その形状は、タイタープレート、ビーズ、磁性ビーズ、ペーパーディスク、糸などのあらゆる形が可能であるが、ポリスチレンビース又はポリスチレンマイクロタイタープレートが簡便で好ましく、ポリスチレンマイクロタイタープレートが特に簡便で好ましい。
また、上記固相担体への抗原の固定方法は、物理的吸着に基づく方法、ＢｒＣＮ2等を用いた共有結合法などを用いることができる。
検体試料としては、例えば、ヒトの各種液体成分が挙げられるが、検体提供者の臨床像が反映される点から、ヒト涙、ヒト咽頭ぬぐい液又はヒト血清が好ましく、一般的にはヒト血清が用いられる。
【００２４】
標識抗体としては、検体試料中の抗体（例えば、ヒト抗体）に対する抗体を各種標識物質で標識したものが挙げられる。標識される抗体としては、例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体等又はこれらの部分分解物（Ｆ(ａｂ′)2、Ｆａｂ等）等が挙げられ、これらは測定対象とする抗体の種類に応じて適宜使い分けられる。
クラミジア・ニューモニエによる表面への感染によりＩｇＭ抗体は感染後１〜２週間で出現し、ＩｇＧ抗体も比較的早期に認められ時間とともに減少するが長時間持続すると考えられている。一方、分泌型のＩｇＡ抗体は細胞性免疫と同様に再感染防禦に役立っていると考えられている。
従って、前記検体試料中の抗体に対する標識抗体を接触させる工程において、検体提供者の臨床像が反映される点から、一つの検体試料に対して、異なった種類の抗体を標識して得られた標識抗体を別々に反応させて測定することが好ましい。異なった種類の抗体を標識して得られた標識抗体としては、例えば、標識化抗ヒトＩｇＧ抗体、標識化抗ヒトＩｇＡ抗体、標識化抗ヒトＩｇＭ抗体等が挙げられる。
【００２５】
標識抗体に用いる標識物質としては、例えば、酵素、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質等が利用できるが、感度、安全性、簡便性等の点から、酵素を用いることが好ましい。酵素としては、例えば、マレートデヒドロゲナーゼ（酵素番号1.1.1.37）、グルコース-6-リン酸脱水素酵素（酵素番号1.1.1.49）、グルコースオキシダーゼ（酵素番号1.1.3.4）、西洋ワサビパーオキシダーゼ（酵素番号1.11.1.7）、アセチルコリンエステラーゼ（酵素番号3.1.1.7）、アルカリフォスファターゼ（酵素番号3.1.3.1）、グルコアミラーゼ（酵素番号3.2.1.3）、リゾチーム（酵素番号3.2.1.17）、β-ガラクトシダーゼ（酵素番号3.2.1.23）などが挙げられる。
酵素標識抗体としては、簡易で高感度な測定が可能であることから、アルカリフォスファターゼ標識抗体又は西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗体を用いることが好ましく、これらの酵素標識抗体は市販されている。
【００２６】
本発明の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法は、後述する実施例から明らかなように、従来のクラミジアのＥＢを用いる間接マイクロ−ＩＦ法を用いた測定結果と相関関係がよく、種特異性が高く、臨床上問題となる疑陰性がほとんどなく、疑陽性も低い。
【００２７】
本発明の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬は、本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原を抗原の一部又は全部として用いる限り、特に制限されない。
測定方法により試薬の構成要素は異なるが、上記サンドイッチ免疫測定法に用いられる抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬としては、例えば、固相担体に固定された固定化抗原と、測定しようとする抗体に反応する標識抗体とが別々に含まれる試薬が挙げられる。
固相担体や標識抗体としては前記したものが挙げられる。
標識抗体は緩衝液等に分散させておくことができる。
【００２８】
本発明の試薬としては、検体提供者の臨床像が反映される点から、一つの検体試料に対して、標識化抗ヒトＩｇＧ抗体、標識化抗ヒトＩｇＡ抗体及び標識化抗ヒトＩｇＭ抗体が別々の標識抗体として用意されているものが好ましい。
本発明の試薬には、必要に応じてその他の成分が組み合わされる。例えば、サンドイッチ免疫測定法に用いられる測定試薬の場合、その他の成分としては、例えば、陰性対照試料、陽性対照試料、洗浄液、標識物質が酵素等の場合における反応基質、希釈液、反応停止液などが挙げられ、これらは単独で又は組み合わせて用いられる。この試薬は、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に極めて有用である。
【００２９】
本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原は、前述したように、クラミジア・ニューモニエ外膜由来のタンパク質を含有してなるものであり、このタンパク質には、通常、クラミジア・ニューモニエ非特異的成分が比較的多量に又はかなり多量に含有される。しかし、本発明によれば、このようなクラミジア・ニューモニエ抗原を使用しても、抗クラミジア・ニューモニエ抗体を定量的に測定することができる。
このことから、本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原は、抗クラミジア・トラコマティス抗体及び抗クラミジア・シタシ抗体との間で実質的に非特異的な反応がなく、種特異性も高く、従って、臨床上問題となる疑陰性がほとんどなく、疑陽性も低いと考えられる。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
Ａ）クラミジア・ニューモニエＥＢの精製
クラミジアとして、クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株（金本ら、感染症学雑誌、66巻、第5号、637-641頁(1992年)）を用いた。
予めＹＫ−４１株を吸着させてあるＨＬ細胞（ポリスチレン製組織培養プレート（６ウェル）中に設置）に、ＳＰＧ液（ショ糖７５．０ｇ、リン酸１カリウム０．５２ｇ、リン酸２カリウム１．２２ｇ及びグルタミン酸０．７２ｇを水１リットルに溶解した水溶液、pH７．４〜７．６）を１ml／ウェルの割合で加え、シリコンゴム片を用いてプレートからＨＬ細胞を剥離させ、ＨＬ細胞含有ＳＰＧ液を回収した。
回収した液をＳＰＧ液で４８倍に希釈し、ポリプロピレン製遠心チューブに入れ、これに１秒間隔で３０回超音波を照射し、遠心チューブを１，５００×ｇで３分間遠心分離し、上清を取得し、ＹＫ−４１株浮遊液（１０5IFU/ml）とした 。
【００３１】
一方、１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清（ＦＢＳ)添加イーグルＭＥＭ培地中で増殖したＨＬ細胞の約８×１０4cells/ml浮遊液４mlを６穴培養プレートに分注後 、細胞の単層形成のため３６℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2インキュベーター内で３日間培養した。これに前記ＹＫ−４１株浮遊液（１０5IFU/ml）２mlを接種し、遠心吸着（９００×ｇ、６０分）を行った。吸着後、接種液を吸引除去し、シクロヘキシミド（１μg/ml）添加１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ添加イーグルＭＥＭ培地４mlを加え、さらに３６℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2インキュベーター内で４日間培養した。その後、感染細胞をプレートからシリコンゴム片を用いて剥離し、感染細胞懸濁液を回収した。また、この際、６穴培養プレートに１３mm径カバーグラスを入れておき、感染細胞を剥離する直前に取り出し、カルチャーセットにより染色し、感染率を確認した。
【００３２】
上記感染培養細胞懸濁液をホモジナイザーにかけて細胞を破砕した後、２０℃１０分間遠心し上清液を回収した。この上清液２容を、５０％（ｗ／ｖ）ショ糖を含む０．０３３Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（pH７．２）１容に３０％ウログラフィン(diatrizoate meglumine and trizatesodium)（ｗ／ｖ）を含む０．０３３Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液(pH７．２)２容を重層した上にさらに重層し、４３，０００×ｇ、２０℃で６０分間遠心した。この沈渣を粗精製ＥＢとした。
さらに上記粗精製ＥＢの懸濁液１容を、ウログラフィン３５〜５０（ｗ／ｖ）濃度勾配をもつ０．０３３Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（pH７．２）３容の上に重層し、４３，０００×ｇ、２０℃で６０分間遠心した。遠心後の中間層の濁った部分を回収し、精製ＥＢとした。
【００３３】
Ｂ）サルコシル不溶性のクラミジア外膜画分の取得
得られた精製ＥＢを２％（ｗ／ｖ）サルコシル、１．５ｍＭ ＥＤＴＡ(ethylene diamine tetraacetic acid)及び０．１４Ｍ食塩を含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（サルコシル緩衝液）(pH８．０)に懸濁し、２０kHz、６０秒間超音波処理し、３７℃で１時間反応後、１００，０００×ｇ、２０℃で６０分間遠心した。遠心後、沈渣を再度少量の上記サルコシル緩衝液に懸濁し、１００，０００×ｇ、２０℃で６０分間遠心した。遠心後、上清を可溶画分として再び回収した。沈渣は、過剰のサルコシルを除くため、ＰＢＳ(pH８．０)で２回洗浄した。次に、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅを各々２．５μg/mlに溶解した１０ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH８．０）に上記沈渣を懸濁し３７℃で２時間反応後、１００，０００×ｇ、４℃で６０分間遠心した。残渣中に残存するＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅを除くためＰＢＳ（pH８．０）で２回洗浄し、残渣成分（サルコシル不溶性のクラミジア外膜画分）を得た。
【００３４】
得られた残渣成分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動させ、残渣成分に含まれる各タンパク質の分子量を測定した。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、「ラエムリ、ユーケー、ネーチャー、227巻、680-685頁、1970年」（Laemuli,U.K.Nature,227,680〜685,1970）の方法に準じ、４〜２０％（ｗ／ｖ）濃度勾配アクリルアミドゲル中で行なった。泳動バッファーは１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．２Ｍグリシン含有０．０２５Ｍトリスバッファーを用いた。泳動試料は、あらかじめ残渣成分（タンパク質濃度約５００μg/ml）６０μｌにサンプル処理液（４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＰＢ含有０．１２５Ｍトリスバッファー(pH６．８)）６０μｌと還元剤として２−メルカプトエタノール１２μｌを加えて９５℃で５分処理したものを、１ウエル当り１０μｌ用いた。また、電気泳動条件は４０ｍＡで約１時間行なった。分子量マーカーには、カレイドスコープ・プレステインド・スタンダード(Kaleidoscope Prestained Standard）（バイオラッド社製商品名)を用い、前記と同じ条件で泳動し、その移動度から各試料のタンパク質の分子量を決定した。
【００３５】
また、染色は、銀染色キットワコー（商品名、和光純薬工業(株)製）を用いて銀染色により行なった。
図１にこのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動のパターン図を示す。図１中、各矢印はそれぞれ、１：約９８Ｋダルトン、２：約６０Ｋダルトン、３：約５３Ｋダルトン、４：約４６Ｋダルトン、５：約４３Ｋダルトン、６：約４０Ｋダルトン、７：約３７Ｋダルトン、８：約３０Ｋダルトンの分子量のタンパク質を示す。
【００３６】
Ｃ）抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定
上記により得られた残渣成分を抗原として、担体固定用緩衝液（１リットル中にＮａＨＣＯ3２．９３ｇ及びＮａ2ＣＯ3１．５９ｇを含む）でタンパク質濃度５μg/mlに調整し９６穴ポリスチレンマイクロタイタープレートの各ウエルに１００μｌずつ分注し４℃で１晩反応した。０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（pH７．２）（以下０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳと略す）３００μｌで３回洗浄し未吸着抗原を除去した。次に、５％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むブロッキング緩衝液（ＫＰＬ社製）（ブロッキング及び検体希釈用緩衝液）２５０μｌを各ウエルに加え３７℃で１時間反応し、抗原固定化プレートを作成した。０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ ２５０μｌで２回洗浄し、次いでブロッキング及び検体希釈用緩衝液で希釈した希釈検体血清１００μｌを上記抗原固定化プレートに加えて３７℃で１時間反応させた後、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ ２５０μｌで３回洗浄した。次いで、アルカリフォスファターゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（標識抗体）を０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで１μg/mlに希釈して各ウエルに１００μｌずつ分注し、３７℃で１時間反応させた後、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ ２５０μｌで３回洗浄した。次に、アルカリフォスファターゼの基質ｐ−ＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルホスフェート）ジエタノールアミン溶液（酵素反応基質、濃度１mg/ml）１００μｌを各ウエルに加え、室温で１０分間反応させた後、３Ｎ ＮａＯＨ溶液２５μｌ（反応停止液）を加えて反応を停止し、マイクロタイタープレートリーダー（コロナ電気(株)製、商品名ＭＴＰ−１２０形）で吸光度（４０５nm）を測定した。
【００３７】
Ｄ）ヒト血清に対する感度及び特異性
対照試験法として行った間接マイクロ−ＩＦ法により特定した、クラミジア・ニューモニエ抗体陽性者血清５５検体及び陰性ヒト血清６６検体を用いて感度及び特異性試験を行った。ヒト血清は０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで２００倍に希釈し、クラミジア抗体測定用検体試料液とした。間接マイクロ−ＩＦ法については後述する。
また本発明の効果をより一層に明らかにするために、クラミジア・ニューモニエ抗体測定のための抗原としてクラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株の精製ＥＢを用いた以外は本発明の方法と同様の方法で測定し、本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原と感度及び特異性を比較した。結果を表１及び図２に示す。
図２は、本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）と、マイクロ−ＩＦ法との相関を比較したグラフであり、縦軸は酵素免疫測定法の４０５nmの吸光度、横軸はマイクロ−ＩＦ法の血清希釈倍数（力価）を示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
なお、各試験のカットオフ値は陰性ヒト血清６６検体の吸光度の平均値に標準偏差を加えた値とした。
図２の結果は、本発明による測定法によって得られた結果が、従来のマイクロ−ＩＦ法との相関が極めて良好であることを示している。
また、表１の結果は本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原が対照抗原として試験した精製ＥＢに比して、マイクロ−ＩＦ法との一致率が優れていることを示している。特に、臨床上問題になる疑陰性がなく、臨床的有用性が高いことを示している。
【００４０】
Ｅ）クラミジア・トラコマティス抗体及びクラミジア・シタシ抗体との交差反応性の検討
クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマティス及びクラミジア・シタシとの反応性を間接マイクロ−ＩＦ法を用いて検定した。検定は「クラミジア感染症の基礎と臨床」第62〜91頁（昭和６３年２月２０日に金原出版から発行）に記載された方法に従い、次のようにして行った。
クラミジア・ニューモニエ ＴＷ−１８３株、クラミジア・トラコマティス Ｌ２株、クラミジア・シタシ バドゲリガー１(Budgerigar-1)株を用い、上記Ａ）と同様にしてＥＢを取得した。得られたＥＢを、それぞれ、３％ノーマルヨークサック(Normal York Sac)と混合し、スライドグラス上に近接させて点置した 。点置した３種類のＥＢを１グループとして、スライドグラス上に縦４グループ、横４グループの合計１６グループのＥＢを点置した。点置後、スライドグラスにアセトンを添加し、ＥＢを固定した。
【００４１】
ヒト血清試料を０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで２倍、４倍、８倍等と２倍ずつ希釈し、試料溶液を得た。この試料溶液を順に前記各グループのＥＢに添加し、３７℃で３０分間保温した後、試料溶液を除去し、Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳでスライドグラスを洗浄した。
抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣコンジュゲート（シグマイムノケミカルズ社製蛍光抗体）を前記各グループのＥＢに添加し、３７℃で３０分間保温した後、試料溶液を除去し、Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳでスライドグラスを洗浄した。得られたスライドグラスを蛍光顕微鏡で観察し、蛍光の有無を調べ、蛍光が確認された最大の希釈倍率を求め、これを力価とし、力価１６をカットオフ値とした。
【００４２】
間接マイクロ−ＩＦ法の結果から、検体を、クラミジア・ニューモニエ抗体保有検体、クラミジア・トラコマティス抗体保有検体、クラミジア・シタシ抗体保有検体に分類して表２〜４に示した。
間接マイクロ−ＩＦ法によって検定されたヒト血清試料（前記クラミジア抗体測定用検体試料液と同様にして調製した試料液）について、前記Ｃ）記載の本発明の方法によって抗体を検出し、表２〜４にまとめた。
この結果によれば、本発明の測定法では、クラミジア・トラコマティス及びクラミジア・シタシとの交差反応がないことが示される。
【００４３】
【表２】
【００４４】
【表３】
【００４５】
【表４】
【００４６】
表２〜４中、Ａはニューモニエに対する抗体を保有する検体試料、Ｂはトラコマティスに対する抗体を保有する検体試料、Ｃはシタシに対する抗体を保有する検体試料である（マイクロ−ＩＦ法による検査結果）。
なお、本発明測定法の実施例におけるカットオフ値は０．１７１であった。
【００４７】
【発明の効果】
請求項１記載のクラミジア・ニューモニエ抗原は、種特異性が高く、臨床上問題となる疑陰性がほとんどなく、疑陽性も低い抗原であり、抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定に有用である。
請求項２記載のクラミジア・ニューモニエ抗原は、請求項１記載のクラミジア・ニューモニエ抗原の効果を奏し、さらに、臨床上問題となる疑陰性及び疑陽性が極めて少なく、抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定に有用である。
請求項３記載のクラミジア・ニューモニエ抗原は、請求項１又は２に記載のクラミジア・ニューモニエ抗原の効果を奏し、さらに、種特異性が極めて高く、抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定に有用である。
請求項４記載のクラミジア・ニューモニエ抗原は、請求項１〜３のいずれかに記載のクラミジア・ニューモニエ抗原の効果を奏し、さらに、再現性に優れ、抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定に有用である。
請求項５記載のクラミジア・ニューモニエ抗原の製造法は、種特異性が高く、臨床上問題となる疑陰性がほとんどなく、疑陽性も低い抗原の製造に有用である。
【００４８】
請求項６記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法は、種特異性が高く、臨床上問題となる疑陰性がほとんどなく、疑陽性も低く、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に有用である。
請求項７記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法は、請求項６記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法の効果を奏し、さらに、測定が簡易であり、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に有用である。
請求項８記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法は、請求項７記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法の効果を奏し、さらに、検体の採集が簡易であり、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に有用である。
請求項９記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法は、請求項７又は８に記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法の効果を奏し、さらに、検体提供者の臨床像が反映され、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に有用である。
請求項１０記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法は、請求項７〜９のいずれかに記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法の効果を奏し、さらに、高感度であり、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に有用である。
【００４９】
請求項１１記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬は、種特異性が高く、臨床上問題となる疑陰性がほとんどなく、疑陽性も低く、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に有用である。
請求項１２記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬は、請求項１１記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬の効果を奏し、さらに、測定が簡易であり、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に有用である。
請求項１３記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬は、請求項１２記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬の効果を奏し、さらに、測定が極めて簡易であり、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に有用である。
請求項１４記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬は、請求項１２又は１３に記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬の効果を奏し、さらに、高感度であり、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に有用である。
請求項１５記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬は、請求項１４記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬の効果を奏し、さらに、極めて高感度であり、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】サルコシル不溶性のクラミジア外膜画分のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（４〜２０％濃度勾配アクリルアミドスラブゲル）パターン図であり、各矢印はそれぞれ、１：分子量約９８Ｋダルトン、２：分子量約６０Ｋダルトン、３：分子量約５３Ｋダルトン、４：分子量約４６Ｋダルトン、５：分子量約４３Ｋダルトン、６：分子量約４０Ｋダルトン、７：分子量約３７Ｋダルトン、８：分子量約３０Ｋダルトンのタンパク質を示す。
【図２】本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）と、クラミジア・ニューモニエＥＢを用いたマイクロ−ＩＦ法との相関を比較したグラフであり、縦軸は酵素免疫測定法の４０５nmの吸光度、横軸はマイクロ−ＩＦ法の血清希釈倍数（力価）を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、クラミジア・ニューモニエ感染症を診断するために有用なクラミジア・ニューモニエ抗原、その製造法、それを用いた抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法及び抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
クラミジア(Chlamydia)は、宿主の細胞内でのみ生存可能な偏性細胞内寄生体である。その増殖サイクルは特殊で、形態学的には細胞外にあるクラミジア基本小体(elementary body、以下ＥＢと略す)が食菌作用により細胞内に取り込まれて空胞封入体を形成し、網様体(reticulate body、以下ＲＢと略す)に変化する 。ＲＢは増殖力はあるが感染力を欠いており、細胞内で増殖したＲＢはやがてＥＢに変化し、封入体を破り細胞壁を破壊して細胞外に出る。ＥＢは増殖力を欠くが感染力を持つ。クラミジア属には、現在４つの種（トラコマティス、シタシ、ニューモニエ及びペコラム）が確認されているが、クラミジア・ニューモニエ （Chlamidia pneumoniae）は空気感染によってヒトに感染することが知られている
【０００３】
近年、肺炎、気管支炎、急性上気道炎などの呼吸器感染症の原因微生物の１つとしてこのクラミジア・ニューモニエが注目を集めており、世界各地で行われた血清学的疫学調査によると、クラミジア・ニューモニエに対する抗体保有率が、欧米諸国では４０〜５０％、台湾、パナマ、イランなどでは６０％以上、日本国内でも５０〜６０％と報告され、クラミジア・ニューモニエ感染症の実態が徐々に明らかにされるにつれて関心が高まってきている。
【０００４】
クラミジア感染症の最も感度の高い血清診断法はワン(Wang)及びグレイストン(Grayston)の間接ミクロ免疫蛍光抗体測定法（マイクロ-IF法）である（トラコーマ・アンド・リレーティッド・ディスオーダーズ・コーズド・バイ・クラミジアル・エージェンツ、エクセルプタ・メディカ、アムステルタム、273-288頁、1971年）(Trachoma and related disorders caused by chlamydial agents, Excerpta Medica, Amsterdam, pp.273-288, 1971)。しかしながら、マイクロ-IF法はその試験手技が困難なため、臨床検査室では診断法としては採用されていない。また、標準的なマイクロ-IF法はクラミジアの精製ＥＢを必要とする。さらに、このマイクロ-IF法は、免疫蛍光反応を行うために同定用微生物の完全な形態又は構造を必要とする。従って、形態又は構造を変えたＥＢや破壊したＥＢを使用することができない。ところが、このＥＢは伝染性があり、かつ毒性をもっているため、そのまま抗原材料として使用するためには感染防禦を施した特別な施設を必要とする。従って、通常はホルムアルデヒドやアセトンなどの固定化剤で処理したＥＢを抗原として用いている。
【０００５】
一方、近年開発された酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)は、簡便かつ迅速に多数検体の処理ができる利点を有している。このＥＬＩＳＡを用いた抗クラミジア抗体の測定に関する報告がなされているが、そのほとんどがクラミジアのＥＢをそのまま抗原材料として用いている。そのため、精製純度の低い抗原を用いることによる非特異的反応の存在が知られている。これは、主としてクラミジアの複雑な抗原性に起因している。クラミジアの抗原性には、属(genus)特異的抗原、種(species)特異的抗原および血清型(biobar)特異的抗原があると考えられている。代表的なクラミジア属特異的抗原として、リポポリサッカライド(lipopolysaccharide、以下ＬＰＳと略す)が知られており、これは一部腸内細菌のＲｅミュータントＬＰＳと共通抗原性を有している。
【０００６】
また、代表的な種特異的抗原又は血清型特異的抗原としては、クラミジア主要外膜タンパク質（以下、ＭＯＭＰと略す）が知られており、クラミジア外膜タンパク質の約６０％を占めるといわれている。しかしながら、このＭＯＭＰにも属特異的抗原性の存在が知られている（コレットら、アニュアル・ミーティング・アメリカン・ソサイエティー・オブ・ミクロバイオロジー、ワシントン ディーシー、アブストラクト、No.D-159、1986年）（Collett et al., Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol.,Washington.D.C., Abstract No.D-159, 1986）。
【０００７】
ところで、ＭＯＭＰ以外のクラミジア外膜抗原は主として属特異的抗原であるが、同時に種特異的抗原性の存在するものもある。例えば、飯嶋らは、クラミジア・ニューモニエのＥＢを用いたイムノブロット法により、クラミジア・ニューモニエの分子量４０ＫダルトンのＭＯＭＰが属特異的であり、分子量４３Ｋダルトン、４６Ｋダルトン及び５３Ｋダルトンのタンパク質が種特異的であり、さらに、分子量９８Ｋダルトンのタンパク質もおそらく種特異的であることを報告している（飯嶋ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ミクロバイオロジー、583-588頁、1994年）（Y. Iijima et al., Journal of Clinical Microbiology,p.583-588(1994)）。
【０００８】
上述したように、クラミジアのもつ抗原性は非常に複雑であり、クラミジア属として共通であっても、異なった種間ではかなり異なった抗原性を示す。従って、これまでにクラミジア・トラコマティス抗体を測定する方法が知られているが（特開平４−２９７８７１号公報）、クラミジア・ニューモニエとクラミジア・トラコマティスで抗原性がかなり異なるため、クラミジア・ニューモニエを種特異的に測定するために単にその方法を利用することはできない。また、クラミジア・ニューモニエ感染者が有する抗クラミジア抗体は、クラミジアの複雑な抗原性に対応した多様性を示し、感染者によってそのパターンは異なるが、抗原としてＥＢ自体を用いる場合、非特異的反応が生じ、特異的で高精度な測定は困難である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
請求項１記載の発明は、種特異性が高く、臨床上問題となる疑陰性がほとんどなく、疑陽性も低いクラミジア・ニューモニエ抗原を提供するものである。
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明の効果に加え、臨床上問題となる疑陰性及び疑陽性が極めて少ないクラミジア・ニューモニエ抗原を提供するものである。
請求項３記載の発明は、請求項１又は２に記載の発明の効果に加え、種特異性が極めて高いクラミジア・ニューモニエ抗原を提供するものである。
請求項４記載の発明は、請求項１〜３のいずれかに記載の発明の効果に加え、再現性に優れるクラミジア・ニューモニエ抗原を提供するものである。
請求項５記載の発明は、種特異性が高く、臨床上問題となる疑陰性がほとんどなく、疑陽性も低いクラミジア・ニューモニエ抗原の製造法を提供するものである。
【００１０】
請求項６記載の発明は、種特異性が高く、臨床上問題となる疑陰性がほとんどなく、疑陽性も低い抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法を提供するものである。
請求項７記載の発明は、請求項６記載の発明の効果に加え、測定が簡易である抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法を提供するものである。
請求項８記載の発明は、請求項７記載の発明の効果に加え、簡易に検体を採集できる抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法を提供するものである。
請求項９記載の発明は、請求項７又は８に記載の発明の効果に加え、検体提供者の臨床像が反映される抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法を提供するものである。
請求項１０記載の発明は、請求項７〜９のいずれかに記載の発明の効果に加え、高感度である抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法を提供するものである。
【００１１】
請求項１１記載の発明は、種特異性が高く、臨床上問題となる疑陰性がほとんどなく、疑陽性も低い抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬を提供するものである。
請求項１２記載の発明は、請求項１１記載の発明の効果に加え、測定が簡易である抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬を提供するものである。
請求項１３記載の発明は、請求項１２記載の発明の効果に加え、より簡易に測定できる抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬を提供するものである。
請求項１４記載の発明は、請求項１２又は１３に記載の発明の効果に加え、高感度である抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬を提供するものである。
請求項１５記載の発明は、請求項１４記載の発明の効果に加え、極めて高感度に測定できる抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬を提供するものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、下記（１）〜（１５）に関する。
（１）クラミジア・ニューモニエ外膜由来のタンパク質を含有してなるクラミジア・ニューモニエ抗原。
（２）抗クラミジア・トラコマティス抗体及び抗クラミジア・シタシ抗体との間で実質的に非特異的な反応が生じない前記（１）記載のクラミジア・ニューモニエ抗原。
（３）クラミジア・ニューモニエ外膜由来のタンパク質が、分子量約４３Ｋダルトン、約４６Ｋダルトン及び約５３Ｋダルトンの３種類のタンパク質の中の少なくとも１種類を含むものである前記（１）又は（２）に記載のクラミジア・ニューモニエ抗原。
（４）クラミジア・ニューモニエ外膜由来のタンパク質が、分子量約４３Ｋダルトン、約４６Ｋダルトン及び約５３Ｋダルトンの３種類のタンパク質を含むものである前記（１）〜（３）のいずれかに記載のクラミジア・ニューモニエ抗原。
（５）クラミジア・ニューモニエ基本小体の細胞質及び細胞質膜をイオン性界面活性剤を用いて可溶化し、その可溶化部分を除いた残渣成分を取得することを特徴とするクラミジア・ニューモニエ抗原の製造法。
【００１３】
（６）前記（１）〜（４）のいずれかに記載のクラミジア・ニューモニエ抗原を用いることを特徴とする抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
（７）前記（１）〜（４）のいずれかに記載のクラミジア・ニューモニエ抗原を固相担体に固定化し、これを検体試料と接触させ、生成した抗原抗体複合体を検体試料中の抗体に対する標識抗体と接触させ、結合した又は結合しない標識抗体上の標識物量を測定し、その値から検体試料中の抗クラミジア・ニューモニエ抗体を測定する工程を含む前記（６）記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
（８）検体試料がヒト涙、ヒト咽頭ぬぐい液又はヒト血清である前記（７）記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
（９）標識抗体が、標識化抗ヒトＩｇＧ抗体、標識化抗ヒトＩｇＡ抗体又は標識化抗ヒトＩｇＭ抗体である前記（７）又は（８）に記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
（１０）標識抗体が酵素標識抗体である前記（７）〜（９）のいずれかに記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
【００１４】
（１１）前記（１）〜（４）のいずれかに記載のクラミジア・ニューモニエ抗原を含有してなる抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬。
（１２）固相担体に固定された固定化抗原と測定しようとする抗体に反応する標識抗体が含有されてなる前記（１１）記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬。
（１３）固相担体がポリスチレンビーズ又はポリスチレンマイクロタイタープレートである前記（１２）記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬。
（１４）標識抗体が酵素標識抗体である前記（１２）又は（１３）に記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬。
（１５）酵素標識抗体がアルカリフォスファターゼ標識抗体又は西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗体である前記（１４）記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
クラミジア・ニューモニエ外膜は、クラミジア・ニューモニエＥＢから細胞質（cytoplasm）と細胞質膜（cytoplasmic membrane）が欠落した細胞壁（cell wall）であり、これは主としてタンパク質と脂質から構成される。
本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原は、前記クラミジア・ニューモニエ外膜由来のタンパク質を含有してなるものである。
このクラミジア・ニューモニエ抗原の中では、臨床上問題となる疑陰性及び疑陽性が極めて少ない点から、抗クラミジア・トラコマティス抗体及び抗クラミジア・シタシ抗体との間で実質的に非特異的な反応が生じないものが好ましい。ここで、実質的に非特異的な反応が生じないとは、非特異的な反応が全く生じないか又は非特異的な反応がほとんど生じないことをいう。
【００１６】
クラミジア・ニューモニエ外膜由来のタンパク質としては、例えば、分子量約３０Ｋダルトン、約３７Ｋダルトン、約４０Ｋダルトン、約４３Ｋダルトン、約４６Ｋダルトン、約５３Ｋダルトン、約６０Ｋダルトン、約９８Ｋダルトンのタンパク質がある。
【００１７】
本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原としては、前記クラミジア・ニューモニエ外膜由来のタンパク質のうち、クラミジア・ニューモニエの種特異的である分子量約４３Ｋダルトン、約４６Ｋダルトン及び約５３Ｋダルトンの３種類のタンパク質の中の少なくとも１種類を含むものであることが好ましい。
また、クラミジア・ニューモニエ感染者が有する抗クラミジア抗体の多様性に対して優れた対応能力を有する点から、本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原としては、前記クラミジア・ニューモニエ外膜由来のタンパク質のうち、分子量約４３Ｋダルトン、約４６Ｋダルトン及び約５３Ｋダルトンの３種類のタンパク質を含むものであることがより好ましい。
さらに、前記多様性に対してより優れた対応能力を有する点から、本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原としては、前記クラミジア・ニューモニエ外膜由来のタンパク質のうち、分子量約４３Ｋダルトン、約４６Ｋダルトン及び約５３Ｋダルトンの３種類のタンパク質の中の少なくとも１種類に加え、さらに、分子量約９８Ｋダルトンのタンパク質を含むものであることがより好ましい。
【００１８】
次に、本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原の製造法について説明する。
本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原は、クラミジア・ニューモニエ菌体から得ることができるが、良好な特性を示す抗原が得られることから、クラミジア・ニューモニエ菌体のうちＥＢを原料として用いことが好ましい。
クラミジア・ニューモニエＥＢから本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原を得る方法としては、例えば、クラミジア・ニューモニエＥＢの細胞質及び細胞質膜をイオン性界面活性剤を用いて可溶化し、その可溶化部分を除いた残渣成分を取得する方法が挙げられる。この方法は、抗原を容易に製造でき、かつ、得られる抗原が良好な抗原性を示す点から好ましい。前記イオン性界面活性剤としては、得られる抗原が良好な抗原性を示す点から、アニオンサルコシン界面活性剤が好ましく、サルコシル（Sarcosyl、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム）が特に好ましい。なお、クラミジア・ニューモニエＥＢの細胞質及び細胞質膜をイオン性界面活性剤を用いて可溶化する際に、デオキシリボ核酸分解酵素（ＤＮａｓｅ）及びリボ核酸分解酵素（ＲＮａｓｅ）等のヌクレアーゼを反応させ、核酸を可溶化して除去することが好ましい。
【００１９】
クラミジア・ニューモニエＥＢの細胞質及び細胞質膜をイオン性界面活性剤を用いて可溶化し、その可溶化部分を除去して得られた残渣成分は、クラミジア・ニューモニエＥＢから細胞質と細胞質膜が欠落した細胞壁、即ち、クラミジア・ニューモニエ外膜を中心成分としている。このクラミジア・ニューモニエ外膜には、前記分子量約３０Ｋダルトン、約３７Ｋダルトン、約４０Ｋダルトン、約４３Ｋダルトン、約４６Ｋダルトン、約５３Ｋダルトン、約６０Ｋダルトン、約９８Ｋダルトンのタンパク質及びその他の微量のタンパク質が含有される。
本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原としては、クラミジア・ニューモニエ外膜を中心成分とする前記残渣成分をそのまま用いることができる。
【００２０】
また、本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原としては、このクラミジア・ニューモニエ外膜の一部分、即ち、クラミジア・ニューモニエ外膜複合体（Chlamydia outer membrane complex、以下、ＣＯＭＣという）を用いることもできる。
さらに、本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原としては、この残渣成分に可溶化剤を反応させて得られた反応物を用いることもできる。前記可溶化剤としては、例えば、前記イオン性界面活性剤とは異なった界面活性剤等が挙げられ、このような界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。得られた反応物には、前記残渣成分の可溶化物又は分解物が含有される。
これらのクラミジア・ニューモニエ抗原は、種特異性が高く、臨床上問題となる疑陰性がほとんどなく、疑陽性も低い。
これらのクラミジア・ニューモニエ抗原の中では、これらの効果が顕著に優れ、再現性にも優れる点から、クラミジア・ニューモニエ外膜を中心成分とする前記残渣成分自体を使用することが好ましい。
【００２１】
本発明の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法は、前記クラミジア・ニューモニエ抗原を抗原の一部又は全部として用いる限り、特に制限されない。
抗体の測定法としては、例えば、各種標識抗体を用いたサンドイッチ型免疫測定法、ラテックス担体粒子を用いたラテックス凝集法、免疫比濁法等が好ましい方法として挙げられる。
【００２２】
以下、サンドイッチ型免疫測定法について詳しく説明する。
本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原を用い、サンドイッチ型免疫測定法を利用して抗クラミジア・ニューモニエ抗体を測定する方法としては、例えば、上記抗原を物理的又は化学的に固相担体に固定化して固定化抗原を作成し、この固定化抗原を検体試料と接触させて一定時間保温し、これにより、検体試料中に抗クラミジア・ニューモニエ抗体が存在する場合はその抗体が前記固定化抗原と結合して抗原抗体複合体が固相担体上に形成され、必要により一旦洗浄し、次いで検体試料中の抗体に対する標識抗体を接触させる（場合により、検体試料と標識抗体を同時に接触させても良い）方法を使用することができる。
前記抗原抗体複合体が形成されていると、これにさらに標識抗体が結合し、固相担体上に固定化されることとなる。その後、固相担体上に結合した標識抗体又は結合しない標識抗体上の標識物量を標識物に応じた測定方法により測定し、その値から検体試料中の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の存在又はその量を求めることができる。
【００２３】
固相担体としては、例えば、ポリスチレン、塩化ビニール等のプラスチック材料、ニトロセルロース、ナイロン等の繊維材料、ガラス、シリカゲル等の無機材料などを用いることができ、その形状は、タイタープレート、ビーズ、磁性ビーズ、ペーパーディスク、糸などのあらゆる形が可能であるが、ポリスチレンビース又はポリスチレンマイクロタイタープレートが簡便で好ましく、ポリスチレンマイクロタイタープレートが特に簡便で好ましい。
また、上記固相担体への抗原の固定方法は、物理的吸着に基づく方法、ＢｒＣＮ2等を用いた共有結合法などを用いることができる。
検体試料としては、例えば、ヒトの各種液体成分が挙げられるが、検体提供者の臨床像が反映される点から、ヒト涙、ヒト咽頭ぬぐい液又はヒト血清が好ましく、一般的にはヒト血清が用いられる。
【００２４】
標識抗体としては、検体試料中の抗体（例えば、ヒト抗体）に対する抗体を各種標識物質で標識したものが挙げられる。標識される抗体としては、例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体等又はこれらの部分分解物（Ｆ(ａｂ′)2、Ｆａｂ等）等が挙げられ、これらは測定対象とする抗体の種類に応じて適宜使い分けられる。
クラミジア・ニューモニエによる表面への感染によりＩｇＭ抗体は感染後１〜２週間で出現し、ＩｇＧ抗体も比較的早期に認められ時間とともに減少するが長時間持続すると考えられている。一方、分泌型のＩｇＡ抗体は細胞性免疫と同様に再感染防禦に役立っていると考えられている。
従って、前記検体試料中の抗体に対する標識抗体を接触させる工程において、検体提供者の臨床像が反映される点から、一つの検体試料に対して、異なった種類の抗体を標識して得られた標識抗体を別々に反応させて測定することが好ましい。異なった種類の抗体を標識して得られた標識抗体としては、例えば、標識化抗ヒトＩｇＧ抗体、標識化抗ヒトＩｇＡ抗体、標識化抗ヒトＩｇＭ抗体等が挙げられる。
【００２５】
標識抗体に用いる標識物質としては、例えば、酵素、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質等が利用できるが、感度、安全性、簡便性等の点から、酵素を用いることが好ましい。酵素としては、例えば、マレートデヒドロゲナーゼ（酵素番号1.1.1.37）、グルコース-6-リン酸脱水素酵素（酵素番号1.1.1.49）、グルコースオキシダーゼ（酵素番号1.1.3.4）、西洋ワサビパーオキシダーゼ（酵素番号1.11.1.7）、アセチルコリンエステラーゼ（酵素番号3.1.1.7）、アルカリフォスファターゼ（酵素番号3.1.3.1）、グルコアミラーゼ（酵素番号3.2.1.3）、リゾチーム（酵素番号3.2.1.17）、β-ガラクトシダーゼ（酵素番号3.2.1.23）などが挙げられる。
酵素標識抗体としては、簡易で高感度な測定が可能であることから、アルカリフォスファターゼ標識抗体又は西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗体を用いることが好ましく、これらの酵素標識抗体は市販されている。
【００２６】
本発明の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法は、後述する実施例から明らかなように、従来のクラミジアのＥＢを用いる間接マイクロ−ＩＦ法を用いた測定結果と相関関係がよく、種特異性が高く、臨床上問題となる疑陰性がほとんどなく、疑陽性も低い。
【００２７】
本発明の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬は、本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原を抗原の一部又は全部として用いる限り、特に制限されない。
測定方法により試薬の構成要素は異なるが、上記サンドイッチ免疫測定法に用いられる抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬としては、例えば、固相担体に固定された固定化抗原と、測定しようとする抗体に反応する標識抗体とが別々に含まれる試薬が挙げられる。
固相担体や標識抗体としては前記したものが挙げられる。
標識抗体は緩衝液等に分散させておくことができる。
【００２８】
本発明の試薬としては、検体提供者の臨床像が反映される点から、一つの検体試料に対して、標識化抗ヒトＩｇＧ抗体、標識化抗ヒトＩｇＡ抗体及び標識化抗ヒトＩｇＭ抗体が別々の標識抗体として用意されているものが好ましい。
本発明の試薬には、必要に応じてその他の成分が組み合わされる。例えば、サンドイッチ免疫測定法に用いられる測定試薬の場合、その他の成分としては、例えば、陰性対照試料、陽性対照試料、洗浄液、標識物質が酵素等の場合における反応基質、希釈液、反応停止液などが挙げられ、これらは単独で又は組み合わせて用いられる。この試薬は、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に極めて有用である。
【００２９】
本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原は、前述したように、クラミジア・ニューモニエ外膜由来のタンパク質を含有してなるものであり、このタンパク質には、通常、クラミジア・ニューモニエ非特異的成分が比較的多量に又はかなり多量に含有される。しかし、本発明によれば、このようなクラミジア・ニューモニエ抗原を使用しても、抗クラミジア・ニューモニエ抗体を定量的に測定することができる。
このことから、本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原は、抗クラミジア・トラコマティス抗体及び抗クラミジア・シタシ抗体との間で実質的に非特異的な反応がなく、種特異性も高く、従って、臨床上問題となる疑陰性がほとんどなく、疑陽性も低いと考えられる。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
Ａ）クラミジア・ニューモニエＥＢの精製
クラミジアとして、クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株（金本ら、感染症学雑誌、66巻、第5号、637-641頁(1992年)）を用いた。
予めＹＫ−４１株を吸着させてあるＨＬ細胞（ポリスチレン製組織培養プレート（６ウェル）中に設置）に、ＳＰＧ液（ショ糖７５．０ｇ、リン酸１カリウム０．５２ｇ、リン酸２カリウム１．２２ｇ及びグルタミン酸０．７２ｇを水１リットルに溶解した水溶液、pH７．４〜７．６）を１ml／ウェルの割合で加え、シリコンゴム片を用いてプレートからＨＬ細胞を剥離させ、ＨＬ細胞含有ＳＰＧ液を回収した。
回収した液をＳＰＧ液で４８倍に希釈し、ポリプロピレン製遠心チューブに入れ、これに１秒間隔で３０回超音波を照射し、遠心チューブを１，５００×ｇで３分間遠心分離し、上清を取得し、ＹＫ−４１株浮遊液（１０5IFU/ml）とした 。
【００３１】
一方、１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清（ＦＢＳ)添加イーグルＭＥＭ培地中で増殖したＨＬ細胞の約８×１０4cells/ml浮遊液４mlを６穴培養プレートに分注後 、細胞の単層形成のため３６℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2インキュベーター内で３日間培養した。これに前記ＹＫ−４１株浮遊液（１０5IFU/ml）２mlを接種し、遠心吸着（９００×ｇ、６０分）を行った。吸着後、接種液を吸引除去し、シクロヘキシミド（１μg/ml）添加１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ添加イーグルＭＥＭ培地４mlを加え、さらに３６℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2インキュベーター内で４日間培養した。その後、感染細胞をプレートからシリコンゴム片を用いて剥離し、感染細胞懸濁液を回収した。また、この際、６穴培養プレートに１３mm径カバーグラスを入れておき、感染細胞を剥離する直前に取り出し、カルチャーセットにより染色し、感染率を確認した。
【００３２】
上記感染培養細胞懸濁液をホモジナイザーにかけて細胞を破砕した後、２０℃１０分間遠心し上清液を回収した。この上清液２容を、５０％（ｗ／ｖ）ショ糖を含む０．０３３Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（pH７．２）１容に３０％ウログラフィン(diatrizoate meglumine and trizatesodium)（ｗ／ｖ）を含む０．０３３Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液(pH７．２)２容を重層した上にさらに重層し、４３，０００×ｇ、２０℃で６０分間遠心した。この沈渣を粗精製ＥＢとした。
さらに上記粗精製ＥＢの懸濁液１容を、ウログラフィン３５〜５０（ｗ／ｖ）濃度勾配をもつ０．０３３Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（pH７．２）３容の上に重層し、４３，０００×ｇ、２０℃で６０分間遠心した。遠心後の中間層の濁った部分を回収し、精製ＥＢとした。
【００３３】
Ｂ）サルコシル不溶性のクラミジア外膜画分の取得
得られた精製ＥＢを２％（ｗ／ｖ）サルコシル、１．５ｍＭ ＥＤＴＡ(ethylene diamine tetraacetic acid)及び０．１４Ｍ食塩を含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（サルコシル緩衝液）(pH８．０)に懸濁し、２０kHz、６０秒間超音波処理し、３７℃で１時間反応後、１００，０００×ｇ、２０℃で６０分間遠心した。遠心後、沈渣を再度少量の上記サルコシル緩衝液に懸濁し、１００，０００×ｇ、２０℃で６０分間遠心した。遠心後、上清を可溶画分として再び回収した。沈渣は、過剰のサルコシルを除くため、ＰＢＳ(pH８．０)で２回洗浄した。次に、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅを各々２．５μg/mlに溶解した１０ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH８．０）に上記沈渣を懸濁し３７℃で２時間反応後、１００，０００×ｇ、４℃で６０分間遠心した。残渣中に残存するＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅを除くためＰＢＳ（pH８．０）で２回洗浄し、残渣成分（サルコシル不溶性のクラミジア外膜画分）を得た。
【００３４】
得られた残渣成分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動させ、残渣成分に含まれる各タンパク質の分子量を測定した。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、「ラエムリ、ユーケー、ネーチャー、227巻、680-685頁、1970年」（Laemuli,U.K.Nature,227,680〜685,1970）の方法に準じ、４〜２０％（ｗ／ｖ）濃度勾配アクリルアミドゲル中で行なった。泳動バッファーは１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．２Ｍグリシン含有０．０２５Ｍトリスバッファーを用いた。泳動試料は、あらかじめ残渣成分（タンパク質濃度約５００μg/ml）６０μｌにサンプル処理液（４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＰＢ含有０．１２５Ｍトリスバッファー(pH６．８)）６０μｌと還元剤として２−メルカプトエタノール１２μｌを加えて９５℃で５分処理したものを、１ウエル当り１０μｌ用いた。また、電気泳動条件は４０ｍＡで約１時間行なった。分子量マーカーには、カレイドスコープ・プレステインド・スタンダード(Kaleidoscope Prestained Standard）（バイオラッド社製商品名)を用い、前記と同じ条件で泳動し、その移動度から各試料のタンパク質の分子量を決定した。
【００３５】
また、染色は、銀染色キットワコー（商品名、和光純薬工業(株)製）を用いて銀染色により行なった。
図１にこのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動のパターン図を示す。図１中、各矢印はそれぞれ、１：約９８Ｋダルトン、２：約６０Ｋダルトン、３：約５３Ｋダルトン、４：約４６Ｋダルトン、５：約４３Ｋダルトン、６：約４０Ｋダルトン、７：約３７Ｋダルトン、８：約３０Ｋダルトンの分子量のタンパク質を示す。
【００３６】
Ｃ）抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定
上記により得られた残渣成分を抗原として、担体固定用緩衝液（１リットル中にＮａＨＣＯ3２．９３ｇ及びＮａ2ＣＯ3１．５９ｇを含む）でタンパク質濃度５μg/mlに調整し９６穴ポリスチレンマイクロタイタープレートの各ウエルに１００μｌずつ分注し４℃で１晩反応した。０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（pH７．２）（以下０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳと略す）３００μｌで３回洗浄し未吸着抗原を除去した。次に、５％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むブロッキング緩衝液（ＫＰＬ社製）（ブロッキング及び検体希釈用緩衝液）２５０μｌを各ウエルに加え３７℃で１時間反応し、抗原固定化プレートを作成した。０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ ２５０μｌで２回洗浄し、次いでブロッキング及び検体希釈用緩衝液で希釈した希釈検体血清１００μｌを上記抗原固定化プレートに加えて３７℃で１時間反応させた後、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ ２５０μｌで３回洗浄した。次いで、アルカリフォスファターゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（標識抗体）を０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで１μg/mlに希釈して各ウエルに１００μｌずつ分注し、３７℃で１時間反応させた後、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ ２５０μｌで３回洗浄した。次に、アルカリフォスファターゼの基質ｐ−ＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルホスフェート）ジエタノールアミン溶液（酵素反応基質、濃度１mg/ml）１００μｌを各ウエルに加え、室温で１０分間反応させた後、３Ｎ ＮａＯＨ溶液２５μｌ（反応停止液）を加えて反応を停止し、マイクロタイタープレートリーダー（コロナ電気(株)製、商品名ＭＴＰ−１２０形）で吸光度（４０５nm）を測定した。
【００３７】
Ｄ）ヒト血清に対する感度及び特異性
対照試験法として行った間接マイクロ−ＩＦ法により特定した、クラミジア・ニューモニエ抗体陽性者血清５５検体及び陰性ヒト血清６６検体を用いて感度及び特異性試験を行った。ヒト血清は０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで２００倍に希釈し、クラミジア抗体測定用検体試料液とした。間接マイクロ−ＩＦ法については後述する。
また本発明の効果をより一層に明らかにするために、クラミジア・ニューモニエ抗体測定のための抗原としてクラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株の精製ＥＢを用いた以外は本発明の方法と同様の方法で測定し、本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原と感度及び特異性を比較した。結果を表１及び図２に示す。
図２は、本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）と、マイクロ−ＩＦ法との相関を比較したグラフであり、縦軸は酵素免疫測定法の４０５nmの吸光度、横軸はマイクロ−ＩＦ法の血清希釈倍数（力価）を示す。
【００３８】
【表１】
なお、各試験のカットオフ値は陰性ヒト血清６６検体の吸光度の平均値に標準偏差を加えた値とした。
図２の結果は、本発明による測定法によって得られた結果が、従来のマイクロ−ＩＦ法との相関が極めて良好であることを示している。
また、表１の結果は本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原が対照抗原として試験した精製ＥＢに比して、マイクロ−ＩＦ法との一致率が優れていることを示している。特に、臨床上問題になる疑陰性がなく、臨床的有用性が高いことを示している。
【００４０】
Ｅ）クラミジア・トラコマティス抗体及びクラミジア・シタシ抗体との交差反応性の検討
クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマティス及びクラミジア・シタシとの反応性を間接マイクロ−ＩＦ法を用いて検定した。検定は「クラミジア感染症の基礎と臨床」第62〜91頁（昭和６３年２月２０日に金原出版から発行）に記載された方法に従い、次のようにして行った。
クラミジア・ニューモニエ ＴＷ−１８３株、クラミジア・トラコマティス Ｌ２株、クラミジア・シタシ バドゲリガー１(Budgerigar-1)株を用い、上記Ａ）と同様にしてＥＢを取得した。得られたＥＢを、それぞれ、３％ノーマルヨークサック(Normal York Sac)と混合し、スライドグラス上に近接させて点置した 。点置した３種類のＥＢを１グループとして、スライドグラス上に縦４グループ、横４グループの合計１６グループのＥＢを点置した。点置後、スライドグラスにアセトンを添加し、ＥＢを固定した。
【００４１】
ヒト血清試料を０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで２倍、４倍、８倍等と２倍ずつ希釈し、試料溶液を得た。この試料溶液を順に前記各グループのＥＢに添加し、３７℃で３０分間保温した後、試料溶液を除去し、Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳでスライドグラスを洗浄した。
抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣコンジュゲート（シグマイムノケミカルズ社製蛍光抗体）を前記各グループのＥＢに添加し、３７℃で３０分間保温した後、試料溶液を除去し、Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳでスライドグラスを洗浄した。得られたスライドグラスを蛍光顕微鏡で観察し、蛍光の有無を調べ、蛍光が確認された最大の希釈倍率を求め、これを力価とし、力価１６をカットオフ値とした。
【００４２】
間接マイクロ−ＩＦ法の結果から、検体を、クラミジア・ニューモニエ抗体保有検体、クラミジア・トラコマティス抗体保有検体、クラミジア・シタシ抗体保有検体に分類して表２〜４に示した。
間接マイクロ−ＩＦ法によって検定されたヒト血清試料（前記クラミジア抗体測定用検体試料液と同様にして調製した試料液）について、前記Ｃ）記載の本発明の方法によって抗体を検出し、表２〜４にまとめた。
この結果によれば、本発明の測定法では、クラミジア・トラコマティス及びクラミジア・シタシとの交差反応がないことが示される。
【００４３】
【表２】
【表３】
【表４】
表２〜４中、Ａはニューモニエに対する抗体を保有する検体試料、Ｂはトラコマティスに対する抗体を保有する検体試料、Ｃはシタシに対する抗体を保有する検体試料である（マイクロ−ＩＦ法による検査結果）。
なお、本発明測定法の実施例におけるカットオフ値は０．１７１であった。
【００４７】
【発明の効果】
請求項１記載のクラミジア・ニューモニエ抗原は、種特異性が高く、臨床上問題となる疑陰性がほとんどなく、疑陽性も低い抗原であり、抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定に有用である。
請求項２記載のクラミジア・ニューモニエ抗原は、請求項１記載のクラミジア・ニューモニエ抗原の効果を奏し、さらに、臨床上問題となる疑陰性及び疑陽性が極めて少なく、抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定に有用である。
請求項３記載のクラミジア・ニューモニエ抗原は、請求項１又は２に記載のクラミジア・ニューモニエ抗原の効果を奏し、さらに、種特異性が極めて高く、抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定に有用である。
請求項４記載のクラミジア・ニューモニエ抗原は、請求項１〜３のいずれかに記載のクラミジア・ニューモニエ抗原の効果を奏し、さらに、再現性に優れ、抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定に有用である。
請求項５記載のクラミジア・ニューモニエ抗原の製造法は、種特異性が高く、臨床上問題となる疑陰性がほとんどなく、疑陽性も低い抗原の製造に有用である。
【００４８】
請求項６記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法は、種特異性が高く、臨床上問題となる疑陰性がほとんどなく、疑陽性も低く、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に有用である。
請求項７記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法は、請求項６記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法の効果を奏し、さらに、測定が簡易であり、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に有用である。
請求項８記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法は、請求項７記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法の効果を奏し、さらに、検体の採集が簡易であり、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に有用である。
請求項９記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法は、請求項７又は８に記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法の効果を奏し、さらに、検体提供者の臨床像が反映され、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に有用である。
請求項１０記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法は、請求項７〜９のいずれかに記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法の効果を奏し、さらに、高感度であり、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に有用である。
【００４９】
請求項１１記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬は、種特異性が高く、臨床上問題となる疑陰性がほとんどなく、疑陽性も低く、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に有用である。
請求項１２記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬は、請求項１１記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬の効果を奏し、さらに、測定が簡易であり、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に有用である。
請求項１３記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬は、請求項１２記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬の効果を奏し、さらに、測定が極めて簡易であり、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に有用である。
請求項１４記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬は、請求項１２又は１３に記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬の効果を奏し、さらに、高感度であり、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に有用である。
請求項１５記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬は、請求項１４記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬の効果を奏し、さらに、極めて高感度であり、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】サルコシル不溶性のクラミジア外膜画分のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（４〜２０％濃度勾配アクリルアミドスラブゲル）パターン図であり、各矢印はそれぞれ、１：分子量約９８Ｋダルトン、２：分子量約６０Ｋダルトン、３：分子量約５３Ｋダルトン、４：分子量約４６Ｋダルトン、５：分子量約４３Ｋダルトン、６：分子量約４０Ｋダルトン、７：分子量約３７Ｋダルトン、８：分子量約３０Ｋダルトンのタンパク質を示す。
【図２】本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）と、クラミジア・ニューモニエＥＢを用いたマイクロ−ＩＦ法との相関を比較したグラフであり、縦軸は酵素免疫測定法の４０５nmの吸光度、横軸はマイクロ−ＩＦ法の血清希釈倍数（力価）を示す。
Claims (16)
- クラミジア・ニューモニエの外膜由来のタンパク質を含有してなり、
クラミジア・ニューモニエ基本小体の細胞質及び細胞膜をアニオンサルコシン界面活性剤で可溶化し、その後、可溶化成分を除去した残渣成分として取得され、
抗クラミジア・トラコマティス抗体及び抗クラミジア・シタシ抗体との間で実質的に非特異的な反応が生じないクラミジア・ニューモニエ抗原。 - クラミジア・ニューモニエ外膜由来のタンパク質が、分子量約４３Ｋダルトン、約４６Ｋダルトン及び約５３Ｋダルトンの３種類のタンパク質の中の少なくとも１種類を含むものである請求項１記載のクラミジア・ニューモニエ抗原。
- クラミジア・ニューモニエ外膜由来のタンパク質が、分子量約４３Ｋダルトン、約４６Ｋダルトン及び約５３Ｋダルトンの３種類のタンパク質を含むものである請求項１記載のクラミジア・ニューモニエ抗原。
- 上記アニオンサルコシン界面活性剤がサルコシルであることを特徴とする請求項１記載のクラミジア・ニューモニエ抗原。
- クラミジア・ニューモニエ基本小体の細胞質及び細胞質膜をアニオンサルコシン界面活性剤を用いて可溶化し、その可溶化部分を除いた残渣成分を取得する、
抗クラミジア・トラコマティス抗体及び抗クラミジア・シタシ抗体との間で実質的に非特異的な反応が生じないクラミジア・ニューモニエ抗原の製造法。 - 上記アニオンサルコシン界面活性剤がサルコシルであることを特徴とする請求項５記載のクラミジア・ニューモニエ抗原の製造法。
- 請求項１〜４のいずれか１項記載のクラミジア・ニューモニエ抗原を用いることを特徴とする抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
- 請求項１〜４のいずれか１項記載のクラミジア・ニューモニエ抗原を固相担体に固定化し、これを検体試料と接触させ、生成した抗原抗体複合体を検体試料中の抗体に対する標識抗体と接触させ、結合した又は結合しない標識抗体上の標識物量を測定し、その値から検体試料中の抗クラミジア・ニューモニエ抗体を測定することを特徴とする請求項７記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
- 検体試料がヒト涙、ヒト咽頭ぬぐい液又はヒト血清である請求項８記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
- 標識抗体が、標識化抗ヒトＩｇＧ抗体、標識化抗ヒトＩｇＡ抗体又は標識化抗ヒトＩｇＭ抗体である請求項８記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
- 標識抗体が酵素標識抗体である請求項８記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
- 請求項１〜４のいずれか１項記載のクラミジア・ニューモニエ抗原を含有してなる抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬。
- 固相担体に固定された固定化抗原と測定しようとする抗体に反応する標識抗体が含有されてなる請求項１２記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬。
- 固相担体がポリスチレンビーズ又はポリスチレンマイクロタイタープレートである請求項１３記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬。
- 標識抗体が酵素標識抗体である請求項１３記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬。
- 酵素標識抗体がアルカリフォスファターゼ標識抗体又は西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗体である請求項１５記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定用試薬。
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