JPS63266356A - 交差反応の影響を抑えた免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、免疫学的凝集阻止反応による物質の測定方法
に関する。更に詳しくは、免疫学的凝集阻止反応におけ
る交差反応を抑えた免疫学的な測定法に関する。

［従来技術］ 免疫学的凝集阻止反応は、現在ハプテン性の各種薬剤や
ホルモン、あるいは微生物由来抗原等の測定に広く応用
されている反応である。

一般に免疫学的反応を利用した測定法においては、使用
する抗体の有する交差反応性が測定を妨害する一つの要
因となっている。交差反応とは、・抗体が反応を期待さ
れている抗原以外の抗原と反応することを指す。

抗体の作製には、特定の抗原を免疫原として接種した動
物の血清よりコンベンショナルな抗体を得る方法と、細
胞融合法を利用してモノクローナル抗体を得る方法があ
る。後者は抗体の均一性で優れた点を有し、モノクロー
ナル抗体を適当に選択することにより比較的交差反応性
の低い抗体を得ることは可能である。しかし交差反応性
の点で多少劣るものであっても、経済的理由および免疫
動物の選択のｉｌが広いという点から前者のコンベンシ
ョナルな抗体作製法にも捨てがたいものがある。前者の
コンベンショナルな抗体の交差反応性を抑えるためには
、以下の二つの方法が行われている。

■交差が予測される物質に対して免疫寛容とした動物に
所望の物質による免疫を行って、交差反応性を示す抗体
の産生自体を抑えてしまう。

■交差反応が予測される物質を用いたイムノアフィニテ
ィーカラムクロマトグラフィー等の操作により交差及耐
性を示す抗体を吸収除去してしまう。

しかし、■の方法では得られる抗血清の力価を上げるこ
とが困難である。又■の方法は、どの程度の交差反応性
抗体を取り除くのかを決定することが困難であり、余分
な操作を必要とするうえ収率も悪く、又得られた抗体の
力価も満足できないことが多い、したがっていずれの方
法も経済的に問題を有するものであり、そのうえ均一な
試薬による高精度な測定は期待し難いものであった。

［発明の目的］ 本発明は、免疫学的凝集阻止反応における交差反応を経
済的に抑えることが可能な測定法の提供を目的としてい
る。

［発明の構１＆］ 本発明は、免疫学的凝集阻止反応に基づく測定法におい
て、試料中に混在することが予測される交差反応性物質
、又は該交差反応性物質の交差反応性抗原決定基を有す
る物質を添加して免疫学的反応を行わせることを特徴と
する交差反応の影響を抑えた免疫学的測定法である。

本発明の免疫学的凝集阻止反応で測定される物質と、そ
れに対応する交差反応性物質の例としては、テオフィリ
ン測定におけるカフェイン、プリミドン測定におけるフ
ェノバルビタール、並びに免疫学的に互いに類似する生
体内の各種ステロイドホルモン同志等が挙げられる。

本発明においては、交差反応性物質にかえて該交差反応
性物質の交差反応性抗原決定基を有する物質（以下交差
反応性類似物質と略す）を使用することも可能である。

交差反応性物質又は交差反応性類似物質は、最終的に免
疫学的凝集反応を生起させるときに存在していればよい
ものである。したがって任意の試薬中に予め混合した形
で試薬セットとして提供すれば便利である１例えばハプ
テン抗原の免疫学的凝集阻止反応に使用される合成多価
抗原試薬に予め混合しておくと、従来の測定法と全く同
一の操作で測定を行うことができる。

本発明における交差反応性物質又は交差反応性類似物質
の添加量は、交差率や試料中に混在する交差反応性物質
の推測される濃度範囲によって変動するものである。い
くつかの例を挙げてその添加量を示せば、次のようなも
のになる。

テオフィリン測定時の交差反応性物質カフェインの添加
量は反応液１１当り　０．０１〜０．２ＪＩｇ程度が、
プリミドン測定時の交差反応性物質フェノバルビタール
の添加量は反応液１１当り０．５〜１０．Ｏｐｇ程度が
好ましい。

［発明の作用］ 本発明における交差反応性物質あるいは交差反応性類似
物質は、免疫学的凝集阻止反応における交差反応を抑え
る作用を有する。交差反応性物質が交差反応を抑えるの
は矛盾しているようにも思えるが１本発明者は交差反応
率は交差反応性物質濃度が低いほど大きく、高濃度であ
る場合には比較的小さいという事実に着目して、鋭意研
究の結果本発明を完成した。

以下実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。

［実施例］ １、テオフィリン測定時におけるカフェインによる交差
反応の抑制 テオフィリン（以下ＴＨＰと略す）を０．０．６．１．
３．２．５．５．１０．２０　、及び４０ｐｇ／ｍｌ含
む標準試料、カフェイン（以下ＣＡＦと略す）を０．７
．８．１５．６．３１．３．６２．５．１２５．２５０
．５００及び　１１０００ｐ／ｍｌ含む標準試料、並び
にＴＨＰを含まないと思われる１０例の血清サンプルを
検体として１本発明による測定法を行い従来の方法との
比較をした。

本発明による測定法では、合成多価抗原液中にＣＡＦを
ＩＪＩｇ／■Ｉとなるように添加した試薬を用いた。測
定操作は、下記フローチャートのとおりである。

■抗ＴＨＰ抗体感作ラテックス試薬３０（ｌｐ１分注息
ｌＯ秒後 ■１００倍希釈検体８０３ｉ１分注 目０秒後 ■攪拌 暮９０秒後 ■合成多価抗原液２ＯＪＪＩ分注 １１０秒後 ■攪拌 ８３０秒後 ■吸光度測定（測定波長５８５！ＩＩ＋）１１００秒後 ■吸光度測定（測定波長は■に同じ） 尚試薬としては以下のものを使用した。

抗ＴＨＰ抗体感作ラテックス試薬：常法により平均粒径
（１，１０９μ層のポリスチレンラテックス（ダウ　ケ
ミカル社製）に、抗ＴＨＰウサギ抗体を物理的吸着によ
り感作させた後、１％牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと
略す）を含む生理食塩水・アンモニウム緩衝液（以下Ｓ
ＡＢと略す）中に０．１％となるように分散させて抗Ｔ
ＨＰ抗体感作ラテックス試薬とした。

合成多価抗原液：常法によりウサギアルブミン（以下Ｒ
３Ａと略す）にＴＨＰを結合させて得られたＴＨＰ結合
Ｒ５Ａを、０．１％ＢＳＡ含有ＳＡＢに５μｇ／ｍｌと
なるように溶解させて合成多価抗原液とした０本発明に
よる方法に用いるものには更にＣＡＦを　１μｇ／ｍｌ
添加した。

ＴＩ（ＰとＣＡＦの標準試料について、■で得られる吸
光度（ＯＳ＾）から■で得られる吸光度（Ｏ３ａ）を引
いて差吸光度（ＤＯ５）を求め、検量線を作成した。（
従来法は第１図に、本発明法は第２図に示す） 第１図中ＣＡＦ標準試料から得られたＤＯ３をＴＩ（Ｐ
の検量線にあてはめＴＨＰ濃度に換算していくと、第１
表に示すようなデータが得られた。

又本発明法についても同様の処理を行い、第２表に示す
ようなデータが得られた。

更に、１０例の血清サンプルを検体として同様の操作に
従ってＤＯ５を求め、前記検量線（第１図又は第２図）
にあてはめてＴＨＰ濃度を決定した。結果は第３表に示
すとおりである。

以下余白 第１表 番交差率：　（ＴＩ（Ｐ！！！！算濃度／ＣＡＦ濃度）
Ｘ１００　（％）第２表 一交ａ率：　（ＴＨＰ換３ｆｆｅ度／ＣＡＦｉｅｌｆｔ
）　Ｘ　１００　（％）第３表 ２、プリミドン測定時におけるフェノバルビタールによ
る交差反応の抑制 プリミドン（以下ＰＲＭと略す）を０　、１．０．２．
０．４．０．８．０．１６．Ｏ、及び２４．Ｏｐｇ／ｓ
ｌ含む標準試料、並びにフェノバルビタール（以下ＰＢ
と略す）を　０．１．２．４．９．１９．５．７８．１
．３１２．５．１２５０．５０００、及び２００００ｐ
ｇ／■ｌ含む標準試料を検体として本発明による測定法
を行い、従来の方法との比較をした。

末完１１による測定法では、合成多価抗原液中にＦＢを
７８．１）＋ｇ／ｍｌとなるように加えた試薬を用いた
。

測定操作は、抗ＴＨＰ抗体感作ラテックス試薬にかえて
抗ＰＲＭ抗体感作ラテックス試薬を用いる他は、実施例
１で述べた方法に従った。尚試薬としては、以下のもの
を使用した。

抗ＰＲＭ抗体感作うテックス試薬：抗ＴＨＰウサギ抗体
にかえて抗ＰＲＭウサギ抗体を用いた他は、実施例１と
同様の操作により抗ＰＲＭ抗体感作ラテックス試薬を得
た。

合成多価抗原液：ＴＨＰ結合Ｒ３ＡをＰＲＭ結合Ｒ３Ａ
とする他は、実施例１と同様の操作により合成多価抗原
液を得た０本発明による方法に用いるものには、更にＰ
Ｂを７８．１７＋ｇ／ｍｌ添加した。

又検量線も実施例１と同様の方法で作成した。

（従来法は第３図に、本発明法は第４図に示す）ＦＢ標
準試料の測定における凝集阻止率と交差率の関係は、第
３表に示すとおりであった。

第３表 ［発明の効果］ 実施例からも明らかなように、本発明法によれば免疫学
的凝集阻止反応における交差反応の影響が効果的に抑え
られている。具体的に述べると。

実施例１中で従来法によればＣＡ　Ｆ　７．８ｐｇ／ｍ
ｌ含有試料では２０．５％という大きな交差率を示すこ
とが観察された。又、ＴＩＰを含まないと思われる血清
サンプルを測定して得られたＤＯＳは、ＴＨＰＷ度０，
５〜２．２ｐｇ／ｍｌに対応する値を示すことが観察さ
れた。一方合成多値抗原液にＣＡＦをＬｐｇ／■ｌ加え
た本発明法によれば、第２図及び第２表から明らかなよ
うに、ＴＨＰ標準試料の測定結果には同等影響を与える
ことなく交差反応を効果的に抑えていることがわかる。

実施例２でも同様のことはいえ、最終的に凝集反応を生
起させるときにＦＢを試薬成分として共存させることに
より、試料由来のＰＢに起因する交差反応の影響を効果
的に抑えている。

以上のように、本発明によれば経済的な負担が少なく、
かつ均一な試薬による非常に高精度な測定を期待しうる
交差反応を抑えた免疫学的凝集阻止反応による測定が可
能となる。

中でも実施例１で交差反応性物質として取り挙げたＣＡ
Ｆは、各種嗜好飲料中に含まれており一般的なヒト血清
中に混在する可能性は高く、その交差反応の抑制は大き
な意義を有するものと思われる。

【図面の簡単な説明】

第１図はテオフィリンとカフェインの標準試料の従来法
による測定結果をもとに作成した検量線を、第２図はテ
オフィリンとカフェインの標準試料の本発明法による測
定結果をもとに作成した検量線を、第３図はプリミドン
とフェノバルビタールの標準試料の従来法による測定結
果をもとに作成した検量線を、第４図はプリミドンと７
エノバルビタールの標準試料の本発明法による測定結果
をもとに作成した検量線を示す、第１図及び第２図の縦
軸には差吸光度（ＤＯＳ）を、横軸にはＴＨＰ又はＣＡ
Ｆの濃度をとった。又第３図及び第４図の縦軸にはＰＲ
Ｍ又はＦＢ濃度がＯの時のＤＯＳで各濃度におけるＤＯ
Ｓを除して求めた％値（Ｄ　ＯＳ　／　Ｄ　ＯＳ　ＭＪ
Ｘ　）を、横軸にはＰＲＭ又はＦＢの濃度をとった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）免疫学的凝集阻止反応に基づく測定法において、試
   料中に混在することが予測される交差反応性物質、又は
   該交差反応性物質の交差反応性抗原決定基を有する物質
   を添加して免疫学的反応を行わせることを特徴とする交
   差反応の影響を抑えた免疫学的測定法 ２）添加すべき交差反応性物質、又は該交差反応性物質
   の交差反応性抗原決定基を有する物質が、予め試薬成分
   として混合されていることを特徴とする特許請求の範囲
   第一項に記載の免疫学的測定法