JPS6293663A - 抗原又は抗体濃度の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、抗原又は抗体濃度の測定方法に関する。

（従来の技術及び発明が解決しようとする問題点）従来
、不溶性担体粒子に物理吸着あるいは、共有結合の形成
によシ抗体または抗原を固定化し、該担体粒子に固定化
された抗体又は抗原に抗原又は抗体を反応させ、その反
応の進行に伴う反応混金物の吸光度の増加すなわち透過
率の減少からその抗原、抗体反応の速度を測定し、ある
いは反応の終結時点の反応混合物の吸光度又は透過率と
、反応開始前の抗原又は抗体の吸光度又は透過率との差
を測定し、さらにその速度あるいは反応開始前と反応終
結時点との吸光度又は透過率の差から被検体中の抗原又
は抗体の濃度を定量する方法が知られている。

そして、この方法によれば、抗原又は抗体の濃度を高い
精度で迅速に定量しうる利点を有する。

しかし以下のような欠点が存在する。例えば不溶性担体
粒子に抗体を固定化した場合、抗原分子数が抗体分子数
に比較して少ない領域では抗原抗体反応物が、抗原分子
数の増加に比例して増加し、抗原分子数が抗体分子数よ
シ過剰の領域では、余剰の抗原が本来ならば凝集に寄与
しうる抗体分子を中和し、抗原分子数の増加に対して、
逆に抗原抗体反応物が減少する。前者は一般に抗原（抗
体）過少領域と呼ばれ後者は一般に抗原（抗体）過剰領
域と呼ばれる。この現象により、一般に一つの抗原抗体
反応物濃度に対して、複数の抗原又は抗体濃度が対応す
る。ここで抗体と抗原を入れ替えても同一現象がみられ
る。

臨床検査に於ては、上記抗原過剰領域に属する被検液は
一般にその出現頻度は小さいが、抗原過剰領域に属する
被検液を誤まって抗原過少領域のものと評価した場合は
、臨床上重大な過失となる。

さらには、この様な誤まシが発生する測定方法は臨床上
の有意性が乏しいものとなる。従って従来この様な誤ま
りの発生を防ぐ為に、同一被検液に対して希釈率を変え
た２以上の希釈液について測定を行なう方法又は測定終
了後さらに抗原又は抗体を添加し、抗原抗体反応物濃度
を測定し、抗原又は抗体の添加により抗原抗体反応物濃
度が変化しない場合に被検液が抗原過剰領域又は抗体過
剰領域に属すると判断する方法等が提案されている、い
ずれの方法に於ても同一被検液に対して複数回の測定が
必要である。

しかるに、短時間に多数の被検液を測定しうる自動測定
機が近年出現するに及び、単−測定操作内に抗原過剰領
域又は抗体過剰領域に属するか否か判別しうる測定方法
の開発が望まれて来た。

（問題を解決するための手段） 本発明者らは、自動測定機による短時間に多数の被検液
を測定しうるに好適な測定方法を確立する目的で鋭意研
究して来た。

その結果本発明者らは、詳しくは後述するが、第１図に
示す如く、抗体を固定化したポリスチレンラテックス懸
濁液に抗原過少領域に属する抗原濃度を持つ血清及び抗
原過剰領域に属する抗原濃度を持つ血清の２種の被検液
を各々別々に添加し、例えば約２秒攪拌した後それぞれ
５秒後と６０秒後との吸光度の差を測定したところ両被
検液の示す吸光度の差が一致した。すなわちこの現象は
、前記した如く、一つの抗原抗体反応物濃度に対し２つ
の異なる抗原濃度が対応している事を示す。

そこで被検液添加後経時時間に対する吸光度の変化を詳
細に検討したところ、被検液添加後５秒と１０秒後及び
１０秒と１５秒後の２ケの特定時間に対する吸光度の差
の比を求めると両被検液の該比の値が大きく異なる事を
見出した。

さらに種々の抗原濃度を示す血清につき各々複数回測定
し、該吸光度の差の比の再現性を検討したところ抗原濃
度を示す被検液に於ては、各特定時間に対する吸光度の
差の比の値の再現性は極めて良好であり、かつ単調増加
又は単調減少することから抗原過剰又は過少領域に属す
るか否かの判別に該吸光度の差の比が有効である事を見
い出し下記本発明を完成さすに到った。なお本発明者ら
は抗原と抗体とを逆にしても上記現象は同一の現象であ
ることも確認した。

即ち、本発明は、不溶性担体粒子に抗体又は抗原を固定
化し、該担体粒子に固定化された抗体又は抗原に既知濃
度の抗原又は抗体を反応させ、２点以上の経時的変化し
た時点で光を照射し、上記反応における反応物の光の吸
光度又は透過率の変化を測定し、一定時間に於ける該吸
光度又は透過率の差と抗原又は抗体濃度との間の対応曲
線（Ａ）を求め、且つ、別に上記反応に於ける２以上の
任意の特定時間に対する光の吸光度又は透過率の差の比
と抗原又は抗体濃度との間の対応曲線（Ｂ）を求め、次
いで未知濃度の試料について一定時間に於ける光の吸光
度又は透過率の差と特定時間に対する光の吸光度又は透
過率の差の比を測定し、眩光の吸光度又は透過率の差の
比が対応曲線■の極大値に相当する値を基準として低濃
度側領域に属するか高濃度側領域に属するかを確認し、
上記確認した濃度領域の対応曲線（Ａ）を使用して上記
光の吸光度又は透過率の差に相当する濃度を決定するこ
とを特徴とする抗原又は抗体濃度の測定方法である。

本発明においては不溶性担体粒子に抗体又は抗原を固定
化し、該担体粒子に固定化された抗体又は抗原に抗原又
は抗体を反応させ、２点以上の経時的変化した時点で光
を照射し、上記反応における反応物の光の吸光度又は透
過率の変化を測定し、一定時間に於ける該吸光度又は透
過率の差を求めることを行う。

一般に上記不溶性担体粒子は抗原・抗体反応に使用され
る公知のものが特に限定されず使用される。例えばその
平均粒子径は１．０μｍ程度以下、好ましくけ０．０５
〜０．４μｍの不溶性担体粒子が好適に用いられる。こ
れに抗体又は抗原を固定化し、次いで被検液中の抗原又
は抗体を反応させ、その反応混合物の吸光度又は透過率
を例えば４００〜１０００　ｎｍ好ましくは５００〜９
５０ｎｍの範囲の波長の光線で測定し、その反応速度な
いしは反応開始前と反応終結時点との吸光度又は透過率
の差を求める。上記の方法に於いて被検液中の抗原又拮
抗体はそのいず孔かが含まれるのが一般的であるが抗原
及び抗体の混合物として使用することも出来る。

測定に用いる光線は反応の進行に対する吸光度又は透過
率が比較的大きく感度に優れかっ、被検液中に通常共存
す石乳ビ、ヘモグロビン、ビリルビン等の干渉が比較的
少ない上記波長域が好適である。

不溶性担体粒子の粒子径については、粒子径が大きい場
合凝集に伴う粒子径の変化量は大きいが凝集反応速度が
遅く、粒子径が小さいとブラウン運動性が活発で凝集反
応速度は速いが一次粒子径が小さい為に凝集反応にとも
なう粒子径の変化量は小さい。本発明に於て以上の理由
より上記粒子径と測定波長との組み合せが好適である。

前記不溶性担体粒子としては測定を行なう時に用いられ
る液体媒体に実質的に不溶性で、前記平均粒子径を有す
る物質の粒子が使用される。これらの粒子はすでに抗原
抗体反応に使用されるものが種々知られていて本発明に
あってもこれらの公知の微粒子が特に限定されず使用出
来る。特（支）好適に使用されるものを例示すると例え
ばポリスチレン、スチレン−ツタツエン共Ｘ合体、ス’
Ｆ−Ｌ／ンーメタクリル酸共重合体２ポリグリシジルメ
タクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメ
タクリレート共重合体の様な乳化重合によル得られる有
機高分子ラテックス等の有機高分子物質の微粒子あるい
はシリカ、シリカ−アルミナ、アルミナの様な無機酸化
物又は該無機酸化物等にシランカップリング処理等の操
作で官能基を導入した無機粒子等である。

本発明に於て抗体又は抗原は、特に限定的でなく、公知
のものが使用できる。好適に使用される代表的なものを
例示すれば、例えば、変性ガンマグロブリン、抗咳因子
、ヒトアルブミン、抗ヒトアルブミン抗体、イムノグロ
ブリンＧ　（ＩｇＧ　）　。

抗ヒトＩｇＧ抗体、イムノグログリンＡ　（ＩｇＡ　）
　。

抗ヒトＩｇＡ抗体、イムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）。

抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＥ抗体、ストレグトリジ
１０．ストレクトキナーゼ、ヒアルロニダーゼ。

Ｃ−反応性蛋白（ＣＲＰ　）　、抗ヒトＣＲＰ抗体、ア
ルファーフェトプロティン（ＡＦＰ　）　＋’抗ＡＦＰ
抗体、癌胎児性抗ｉ　（ＣＥＡ　）　、抗ヒ）　ＣＩＡ
抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ　）　、抗Ｈ
ＣＧ抗体、抗ニストロｒン抗体、抗インシュリン抗体、
Ｂ型肝炎表面抗ｆｆ１（ＨＢｓ）、抗ＨＢｓ抗体、梅毒
トレポネマ抗原、風疹抗原、インフルエンザ抗原、補体
ｃ１゜抗Ｃ１，抗体、抗Ｃ５抗体、抗ｃ４抗体、抗トラ
ンスフェリン抗体２等である。

本発明に於てはこの様な不溶性担体粒子に測定対象の被
検液中の抗原又は抗体と反応しうる抗体又は抗原を固定
化する。

この場合上記固定化方法は物理的吸着、化学的共有結合
の形成のいずれでも良いが、物理的吸着能の高い蛋白例
えば抗体や高分子量蛋白の固定には物理的吸着が好適で
あシ、物理的吸着能の低いホルモン類、ハプテン類の固
定化には化学的共有結合の形成が好適に用いられる。固
定化方法についてはすでに多くの方法が提案されており
、固定化する抗体又は抗原の特性に合わせ公知の方法か
ら固定化方法を選択すると良い。一般には分散媒中で抗
体又は抗原を必要に応じて緩衝液又は架橋剤存在下に不
溶性担体粒子を混合すればよい。上記抗体又は抗原を固
定化した不溶性担体粒子の分散媒は特に限定されないが
、不溶性担体粒子の保存中の安定性と、凝集反応時の反
応の再現性の観点からみて、グリシン−水酸化ナトリワ
ム緩衝液。

トリス−塩酸緩衝液、塩化アンモニワムーアンモニア緩
衝液、リン酸緩衝液等の緩衝液が好適に使用される。

上記抗体又は抗原を固定化した不溶性担体粒子濃度は特
に限定されるものではないが一般には該濃度が抗原抗体
反応時点で０．００５重ｉ％以上好ましくは０，０２〜
０．２０重量％となる′６ｐ、に選ぶのが好適である。

該懸濁液を用いて被検液中の抗原又は抗体濃度を測定す
る方法は次の２種の方法が好適に採用される。勿論被検
液中の抗原又は抗体はこれらの混合物の状態で使用して
もよい。

先ず前記２つの方法のうちの一つの方法は、該懸濁液と
被検液とを実質的に一定条件下で反応させ、−反応開始
後一定時間を経過した後の一定時間内に於ける吸光度又
は透過率の差を求める方法である。この方法に於ては該
懸濁液と被検液とを、好ましくは一定条件の攪拌下に混
合し、好ましくは攪拌終了後２〜３秒以後の２以上の時
点で測定するのが望塘しい。

他の１つの方法は、被検液を分散媒で希釈し、反応開始
前、すなわち、抗体又は抗原を固定化した不溶性担体粒
子を添加する前に吸光度又は透過率を測定する。次いで
被検液と抗体又は抗原を固定化した不溶性担体粒子とを
実質的に一定条件下で反応させ、反応終結時点に於ける
吸光度又は透過率を測定し、反応開始前と反応終結時点
との吸光度又は透過率の差を求める方法である。この方
法に於ては不溶性担体粒子濃度が反応時に上記懸濁液中
の濃度となるように希釈倍率を考慮して懸濁液濃度を設
定する必要がある。又実質的な反応終結に要する時間を
あらかじめ設定しておく必要がある。

との様な抗原又は抗体濃度の測定方法は例えば以下の如
〈実施しうる。

まず一定の平均粒子径を有する不溶性担体粒子にある一
定の抗体又は抗原を固定化し、該懸濁液を調製する。次
いで被検液中に含まれる抗原又は抗体と同−又はほぼ同
一の抗原又は抗体を、被検液の媒体と同−又はほぼ同一
の媒体を用いて希釈しあるいは濃縮し、種々の既知濃度
の標準被検液を調製する。次いで一定条件下に於て該懸
濁液と該標準被検液とを混合し、前述の２方法のいずれ
かによシ、反応開始後の一定時間内に於ける吸光度又は
透過率の差、あるいは反応開始前と反応終結時点の吸光
度又は透過率の差を得る。次にこの吸光度又は透過率の
差を例えば縦軸に、標準被検液中の抗原又は抗体濃度を
例えば横軸としたグラフにグロットすると、例えば第２
図に示すような被検液中の抗原又は抗体濃度と反応混合
物の吸光度又は透過率の差の対応曲線（ト）即ち検量曲
線（ＡＭｉ得られる。

次いで標準被検液中の抗原又は抗体と同−又はほぼ同一
の抗原又は抗体を含む濃度未知の被検液につき、上記対
応曲線ＩＡ）を得た条件と同一条件下で吸光度又は透過
率の差を得、上記対応曲線（Ａ）と対比する事により被
検液中に含まれる抗原又は抗体量を測定しうる。しかし
ながら前記した如く一般には一つの抗原抗体反応物濃度
に複数の抗原又は抗体濃度が対応し、抗原又は抗体濃度
が一義的に決定できない。

そのために本発明にあっては次のような操作で対応曲線
の）を作成する。

すなわち、上記対応曲線囚を得たと同一の測定操作内に
於て、反応開始後、好壕しくは該懸濁液と被検液とを攪
拌し、混合した後さらに２〜３秒以上経過し実質的に反
応系が安定化した後の２以上の特定時間に対する反応物
の吸光度又は透過率の差を測定し、次いでそれぞれの特
定時間に対して得られた吸光度又は透過率の差の比を求
める。

上記特定時間の設定は特に限定的ではないが一般には、
上記反応が開始後の基単経過時（１秒後）から更に一定
時間経過後（ｂ秒後）のそれぞれの吸光度又は透過率を
測定し、その差（Δｇ、）を算出し、更に上記す秒後の
吸光度又は透過率を基準値とし更に一定時間経過後（０
秒後）の吸光度又は透過率を測定し該基準時（ｂ秒後）
との差（ΔＥ２）を算出する。この両者の比即ちΔＥ１
／ΔＦ：２を算出し、各既知濃度に於ける対応曲線（Ｂ
）を作成する。上記ΔＥ、又はΔＥ２を算出するための
特定時間の設定の仕方は各既知濃度の資料についての測
定で同一のものを選ぶ限シ限定されるものではない。例
えば吸光度又は透過率の基準値を常に１秒後に設定し、
上記す秒と０秒をそれぞれ２秒後と４秒後に測定するこ
とによりａ秒→ｂ秒（Δｇ、）とａ秒→Ｃ秒（ΔＥ２）
を算出することも出来る。

この場合は前記と同様に少くとも３点の吸光度又は透過
率の測定で前記任意の２つの特定時間に対する光の吸光
度又は透過率の比を算出出来る。勿論経時的に異なる時
間間隔で４点の吸光度又は透過率を測定すればその２点
間の特定時間に対応する吸光度又は透過率の差を算出出
来、この両者の差の比も算出出来る。従って本発明に於
ける前記吸光度又は透過率の比は最低３点の経時変化の
吸光度又は透過率を測定することで求めうる。

標準被検液について得た上記吸光度又は透過率の比を例
えば縦軸に、標準被検液中の抗原又は抗体濃度を例えば
横軸としたグラフにグロットすると、被検液中の抗原又
は抗体濃度と反応混合物の吸光度又は透過率の差の比の
対応曲線０）が得られる。かくして得られた対応曲線（
Ｂ）は被検液中の抗原又は抗体濃度の全変化域に対し単
調増加又は単調減少を示す曲線である。

一方前記対応曲線偽）は免疫血清学でいうところの抗原
抗体量の最適比近傍で極大値を持つ曲線である。本発明
の抗原又は抗体濃度の測定に際してはこの極大値を示す
抗原又は抗体濃度に対応する対応曲線０）の値を基準と
する。即ち濃度未知の被検液の測定につき、上記対応曲
線外）及び対応曲線の）を得た条件と同一条件下で吸光
度又は透過率の差及び吸光度又は透過率の比を得、上記
対応曲線（Ａ）及び対応曲線中）と対比する。次に対応
曲線（Ｂ）との対比よ′り該被検液に於ける吸光度又は
透過率の差の比の値が上記基準に対しいずれの領域に属
するかを判別する。すなわち該被検液中の抗原又は抗体
濃度が対応曲線（ト）に於ける極大値を示す抗原又は抗
体濃度に対していずれの領域に属するかを判別する事に
よシ該被検液中の抗原又は抗体濃度が一義的に決定でき
る。

なお特定時間の設定について、特定時間のうち少くとも
一方は、反応の初期すなわち被検液を添加し次いで攪拌
した後２，３秒後からとする場合に該被検液に於ける吸
光度又は透過率の差の比の値が、該被検液中の抗原又は
抗体濃度に対し鋭敏に対応した。従って特定時間のうち
少くとも一方は測光可能な限シ反応の初期に設定する事
が好ましい。

なお特定時間の間隔及び他の特定時間の設定については
吸光度又は透過率の変化量を勘案して測定する抗原又は
抗体ごとに好適な条件を選択すれば良い。

以上の説明で明らかなように、例えば第１図に示す如く
一定時間に於ける光の吸光度又は透過率の差が同一でか
つ抗原濃度が異なる２種の被検液について特定時間（１
）と特定時間（２）に於ける光の吸光度又は透過率の差
の比を求めると両者は明らかな差を示す。そしてこの比
の値によって被検液が抗原過少領域に属するか抗原過剰
領域に属するかの判定を出来るのである。

この現象の説明として本発明者らは、この現象が以下の
反応過程に従っているものと推定している。すなわち不
溶性担体が凝集に到るまでにまず遊離の抗原と不溶性担
体に固定化された抗体との間の反応（１）が生じ、次い
で不溶性担体と反応した抗原と他の不溶性担体に固定化
された反応に寄与しうる抗体との間の反応（２）とから
成る。各反応はそれぞれの抗原と抗体との衝突頻度すな
わち抗原濃度と抗体濃度の積に依存しておシ、抗原過少
領域に於ては抗原過剰領域に於ける場合と比較して反応
（１）Ｋ於ける遊離抗原濃度が低く反応（１）の速度が
相対的に低いのに対し、反応（２）に於ける反応に寄与
しうる抗体の濃度が高い為に反応（２）の速度が相対的
に高くなる。この為反応初期に於ては反応物の濃度が抗
原過剰領域に属する被検液について高く反応の進行とと
もに抗原過少領域に属する被検液について反応物の濃度
が増し、結果として一定時間に於ける光の吸光度又は透
過率の差が、両波検液で一到したものと考えている。

上記説明において抗原と抗体とを入れ替えても同じであ
り、特定時間を異なる時間間隔としても何ら差しつかえ
ない。

（発明の効果） 本発明による抗原又は抗体濃度の測定方法は単−測定操
作内に於て抗原過剰又は抗体過剰か否かの判別ができ、
かつ判別及び定量に用いる吸光度又は透過率の測定回数
は、一定時間が反応開始後にある場合最低３回あるいは
一定時間が反応開始前抜にまたがる場合最低で反応前１
回反応後３回である。従って本発明による抗原又は抗体
濃度の測定方法は短時間に多数の被検液を処理する自動
測定の場合に特に有用であり、かつ自動測定機の測定方
法ないしは測光部への試料の搬送方法に対する制約も少
なく広く一般の自動測定機への実施が期待できる。この
ような簡単な操作で抗原（抗体）過剰領域か抗原（抗体
）過少領域かの被検液の抗原（抗体）濃度が間違いなく
判断され、測定されうるのである。この効果は本発明の
属する分野では極めて多大な寄与をするものである。

（実施例） 以下、実施例によシさらに本発明の詳細な説明するが本
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１ （１）Ｃ−反応性蛋白質測定試薬のｐｌ裂平均直径０．
１２３μｍのポリスチレンラテックス粒子を塩化アン七
ニワムーアンモニア緩衝１（ｐＨ＝８．０）で希釈しラ
テックス濃度が１重量％の懸濁液をｖ！４製する。次い
でＣ−反応性蛋白質（以下ＣＲＰと略す）をヤギに免疫
して得た抗ＣＲＰ血清よシ塩析処理によシ分画した抗Ｃ
ＲＰヤギＩｇＧ分画を塩化アンモニウム−アンモニア緩
衝液（ｐＨ＝８．０）で希釈し、蛋白濃度２　ｍ９／ｒ
ｒｔｌの溶液を調製する。上記ラテックス懸濁液ｌ容に
抗ＧＲＰヤギＩｇＧ分画の溶液１容を加え３７℃で２時
間反応させた。次いで遠心分離し、上清を除去した後洗
でんをワシ血清アルブミンを０．０５Ｉｉ量−の濃度で
添加し九塩化アンモニクムーアンモニアＩｌ衝液（ＰＨ
＝　ｓ、　ｏ　）で再分散しラテックス濃度を０．０５
重量％に調製し、ＣＲＰ測定試薬を得た。

（２）　　測定方法 日立製作所製Ｕ−３２００型自記分光光度計の測光部に
、温度調節器及びマグネット式攪拌装置を取シ付けた装
置により吸光度を測定した。光路長１０ｍのガラス製光
学セルに円筒状の攪拌子を入れ、次いで（１）で得たＣ
ＲＰ測定用試薬２４５０μｌを分注し、測光部に挿入し
、３７℃に保温した。

次いで該攪拌装置により　ＣＲＰ測定用試薬を攪拌しつ
つ、被検液５０μノを添加した一０添加と同時に吸光度
の測定を開始した。吸光度の測定は、５８０ｎｍの波長
の光線を用いて行なった。なお攪拌は被検液添加後３秒
で停止した。

（３）　　既知試料の測定 ＣＲＰ濃度２２．４　ｍ９７　ｄｉの血清を、塩化アン
モニウム−アンモニア緩衝液（ｐ）１＝ｓ、ｏ）で希釈
し、ＣＲＰ濃度が０．４１　、１．２４　、３．７３　
、７．４６　、１１．２１！９７ｄｌの被検液を得た。

−力士記血清を濃縮し、ＣＲＰ濃度が４４．８　、８９
．６ｍ９／ｄｉ（Ｄ被検液を得た。

（２）の測定条件下で上記７種の被検液及びＣＲＰ濃度
２２．４ｍ９７ｄｌの血清、さらに塩化アンモニウム−
アンモニア緩衝液につき吸光度を各５回測定した。

得られた吸光度のうち、被検液添加後６秒後と１２秒後
、１８秒後、６０秒後の吸光度よシ、一定時間に対する
吸光度差として、被検液添加６０秒後の吸光度よシロ秒
後の吸光度を減じた値を得た。一方２特定時間の吸光度
の差の比として、被検液添加１２秒後と６秒後の吸光度
の差を、被検液添加１８秒後と１２秒後の吸光度の差で
除した値を得た。この結果を表１に示した。

２ノ、ｉ・２４．１〜１ 次に、第１表に示した一定時間に対する吸光度の差の平
均値を縦軸とし、添加被検液中のＣＲＰ　濃度を横軸と
して第２図に示す対厄曲線（Ａｔを得た。

ここに於て収差の値をＸ、該ＣＲＰ濃度をｙダ／ｄｔと
すると対応曲線（んの極大値よりＣＲＰ低濃低濃度−線
はｙ＝０．０８３０＋２７．４３ｘ−７３，６６ｘ２＋
９６．０５ｘ３（式１）で、ＣＲＰ高濃度側は ｙ−１８６，５−６０８，（ｌｃ＋９０７．１ｘ２−６
２５．９ｘ　　（式２）で良好に近似できた。

一方２％定時間に対する吸光度の差の比の平均値を縦軸
とし、添加被検液中のＣＲＰ濃度を横軸として第３図に
示す対応曲線（Ｂ）を得た。第１表に於ける収差の値の
極大値はＣＲＰ濃度が１１．２　ｗ／ａの時に得られ、
このＣＲＰ濃度に於ける収差の比の値１．２５１を対応
曲線（刀の極大値に相当する収差の比の基準値とした。

第１表に示した収差の値に於て各５回の測定値の変動係
数は被検液として塩化アンモニウム−アンモニア緩衝液
を添加した場合以外は５％以下と良好であった為、測定
可能範囲をＣＲＰ　９度０．４１ダ／１２１以上とした
。

一般にＣＲＰ強陽性患者血清中のＣＲＰ　濃度は４０ｍ
９／ｃｔｔ以下であり、既知濃度被検液のうちＣＲＰ最
高濃度であるｓ　９．６　ｍｙ／ｃｔｔは臨床上測定必
要な範囲の上限を越えた値と考えられる。

なおＣＲＰ濃度未知の被検液を測定するに当たっては、
まず収差の値と０．０１２１とを比較し収差の値が０．
０１２１未満であれば測定可能なＣＲＰ　＠度の下限で
あると判断する。収差の値が０．０１２１以上の場合は
、次いで収差の比の値と１．２５１とを比較し、収差の
比の値が１．２５１以下の場合は収差の値をＸとして上
記（式１）により被検液中のＣＲＰ濃度ｙ　ＩＱ　／ｄ
ｌを求める。収差の比の値が１．２５１を越す場合は上
記（式２）によりＣＲＰ　濃度を求めることとした。

（Ａ）未知試料の測定 ＣＲＰ濃度未知の血清を（２）の測定方法で測定したと
ころ収差の値０．５８７２と収差の比の値１．３２２を
得た。対応曲線（Ａ）の極大値に対応する収差の比の基
準値１．２５１に比して、上記収差の比の値が大である
為、収差の値を（式２）に適用してＣＲＰ濃度１５．５
ダ／ａを得た。次いで上記血清を塩化アンモニウム−ア
ンモニア緩衝ｔ（−＝８．０）で１．５倍及び５倍に希
釈し、（２）の測定方法で測定したところ、１．５倍希
釈被検液は収差の値０．５８４４及び収差の比の値１．
２２１を示し５倍希釈被検液は、収差の値０．１７３８
及び収差の比の値０．９４４を示し、これにより１．５
倍希釈被検液中のＣＲＰ濃度は１０．１＃／ｄｔ及び５
倍希釈被検液中のＣＲＰ濃度は３．１３ダ／ｄｌと求ま
った。

さらに５倍希釈被検液をヘキスト社製−元免疫・拡散法
によるＣＲＰ定量試薬であるＬＣパルチｒンＣＲＰによ
りＣＲＰ濃度を測定したところ３．２　Ｗ／ｄｌを示し
、本発明による方法によシ血清中の濃度が広範囲に分布
するＣＲＰの測定に於て抗原過少領域から抗原過剰領域
にわたり良好に測定する事を示した。　　□ 実施例２ （１）リウマチ因子測定試薬の調製 平均直径０．２２０μｍのポリスチレンラテックス粒子
をグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｔａ＝８．３）で希釈し
ラテックス濃度が１重量％の懸濁液をｉｌＪ製した。

次いで６０℃で１０分間加熱処理したヒトイムノグロプ
リｙＧをグリシｙ　−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ＝８．３）
により希釈し蛋白濃度を２Ｗｋｇ’／−に調製した。上
記ラテックス懸濁液１容に上記熱変性したヒトイムノグ
ロブリンＧ希釈液１容を加え、よく混合し室温下２時間
放置した。

次いで遠心分離し、上清を除去した後、沈でんにウシ血
清アルブミンを０．１重ｆ％の濃度で添加したグリシｙ
　−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ＝８．３）を添加し、再分散
し、ラテックス濃度を１重１°悌に調製した。

以上の操作により、リウマチ因子（抗体）に対し抗原性
を有する熱変性ヒトイムノグロブリンＧを固定化した、
リウマチ因子測定試薬を得た。

（２）　　測定方法 実施例１で用いた装置を用い７００　ｎｍの波長の光の
吸光度を測定した。

まず光路長１０醋のガラス製光学セルに円筒状の攪拌子
を入れ、次いでグリシン−ＮａＯＨ緩衝液を２４００μ
１分注し、測光部に挿入し、３７℃に保温した。

次に、被検液５０μｌを添加し、１０秒間攪拌し、被検
液添加後２分経過した時点で試料液の吸光度を測定した
。

次いで試料液を攪拌しつつ（１）で得たりウマチ因子測
定試薬５０μｌを被検液添加後２分３０秒経過した時点
で添加し、リウマチ因子測定試薬添加８秒後に攪拌を停
止した。

特定時間としてリウマチ因子測定試薬添加後１２秒後と
３０秒後及び３０秒後と４８秒後の２特定時間を選び、
被検液添加後２分経過した時点と被検液添加後７分３０
秒経過した時点すなわち、反応開始後５分経過した時点
との間の６分間を一定時間として吸光度を測定した。こ
こに於て反応時のラテックス濃度は０．０２重ｉｔ％で
ある。

（３）既知試料の測定 リウマチ因子濃度５００　ＩＵ／−の血清を、グリシン
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐｉ−１＝８．３）で希釈し、リウ
マチ因子濃度が１０．２０．４０．６０，９０，１２０
，１８０゜２５０．３５０ＩＵ／ｄの被検液を得た。こ
れにグリシン−ＮａＯＨ緩衝液及び上記血清を加えた合
計１１ｍのりウマチ因子濃度既知の被検液につき（２）
の測定条件下で吸光度を各５回測定した。

得られた吸光度より、一定時間に対する吸光度の差とし
て、反応開始５分後の吸光度より、反応開始３０秒前の
吸光度を減じた値を得た。一方２特定時間の吸光度の差
の比として、反応開始４８秒後と３０秒後の吸光度の差
を、反応開始３０秒後と１２秒後の吸光度の差で除した
値を得た。この結果を表２に示した。

なお、反応開始５分後から６分後までの間の吸光度変化
は、いずれも０．００２以下の吸光度増加であり、反応
開始後５分経過した時点で該反応は実質的に終結してい
た。

一定時間に対する吸光度の差の平均値を縦軸とし、添加
被検液中のりウマチ因子濃度を横軸として第４図に示す
対応曲線（Ａ）を得た。ここに於て収差の値をＸ、該リ
ウマチ因子濃度を７　ＩＵ／−とすると対応曲線（Ａｌ
の極大値よりリウマチ因子低濃度側の曲線は、 次多項式 ％式％） （式３） により、リウマチ因子高濃度側の曲線はｙ＝ｅｘｐ　（
１８，５９−１７，６２Ｋ）　　　　　　　　（式４）
により良好に近似できた。但し被検液としてグリシン−
ＮａＯＨ緩衝液を用いた場合の収差の値を（式３）に適
応したところ４．８ＩＵ／−を示した為、（式３）（式
４）の適応範囲をリウマチ因子濃度ｌ。

ＩＵ／ゴ以上とした。

ニス下、）−口 一方２％定時間に対する吸光度の差の比の平均値を縦軸
とし、添加被検液中のりウマチ因子濃度を横軸として第
５図に示す対応曲線（Ｂｌを得た。第２表に於ける抜差
の値の極大値はリウマチ因子濃ｆ　７５１９０　ＩＵ／
ｒｎｔの時に得られ、このリウマチ因子濃度に於ける抜
差の比の値１．８３１を対応曲線（Ａｌの極大値に相当
する抜差の比の基準値とした。

慢性リウマチ関節炎患者の中には櫂に極めて強陽性を示
す者が存在する。この為に、（２）で示した測定条件に
より、リウマチ因子計度が極めて高く。

ＲＡＨＡ法によりＸ４０９６０以上示す患者血清１０例
につき測定し、眼差の値を求めたところ、いずれも０．
６８１５〜０．６９２７の範囲であり、抜差の比の値は
１．５７８〜１．６０１の範囲の値を示し、リウマチ因
子高濃度血清に対し誤オって低濃度と判別しない事を確
認した。

次にリウマチ因子濃度１０　ＩＵ／−の被検液の５回の
測定に於ける抜差の比の値は、１．７５４　、１．８１
６゜２．０１４，２．２３１，２．３３５であり５回中
２回は抜差の比の基準値より低い抜差の比の値を示し、
対応曲線（Ａ）の極大値より高濃度側の値と誤まる場合
がある事がわかった。

従って未知濃度試料を測定するに当たっては、まず抜差
の値と０．６４１０を比較し、誤差の値が０．６４１０
より小ならば検ｘｍ適応下限濃度である１　０　ＩＵ／
−以下と判断する。

次いで収差の値が０．６４１０以上で０．６８１５未満
の場合は被検液中のりウマチ因子濃度が、対応曲線の４
ｉ大値に比して低濃度側にあると判断し、抜差の値を（
式３）に適用して被検液中のりウマチ因子濃度を求める
。

さらに抜差の値が０．６８１５以上の被検液については
本発明による方法により抜差の比の基準値と抜差の比の
値とを比較し、被検血清中のりウマチ因子濃度が対応曲
線囚の極大値を示すリウマチ因子濃度に比較して高低い
ずれの鋲度域にあるかを判別し、低濃度領域にある場合
には抜差の値を（式３）に適応し、高濃度領域にある場
合には抜差の値を（式４）に適応して、被検液中のりウ
マチ因子夢度を求める。

（Ａ）未知試料の測定 リウマチ因子濃度未知の血清を（２）の測定方法で測定
したところ抜差の値として０．７３２２、抜差の比の値
としてｘ、６３４ｆｃ示した。

抜差の値は０．６８１５以上であるので、該差の比の値
１．６３４と抜差の比の基進値１．８３１とを比較し、
該被検液中のりウマチ因子濃度は対応曲線図の極大値を
示す血清のリウマチ因子濃度より高県度領域にある事を
示した。

上記抜差の値を式４に適応しりウマチ因子濃度を求める
と２９５　ＩｔＪ／ｍｔとなった。

次いで上記血清をグリシン−ＮａＯＨ緩衝液で５倍及び
２５倍に希釈し、（２）の測定方法で測定したところ、
５倍希釈被検液は抜差の値０．７６５５及び抜差の比の
値１．６３０より、５倍希釈被検液中のりウマチ因子濃
度は対厄曲線（Ａ）の極大値を示す血清のりウマチ因子
濃度よりも低濃度領域に存在する事を示し、抜差の値を
（式３）に適用してリウマチ因子濃度５９．４　ＩＵ／
−を得た。さらに２５倍希釈被検液は抜差の値０．６４
３３及び抜差の比の値１．８２２を示し、抜差の値が０
．６４１０以上０．６８１５未満である事よりリウマチ
因子濃度１０．７　ＩＵ／ｒｒｔを得た。

実施例３ （１）　　ヒトＩｇＧ測定試薬の調製 平均直径０．１２３μｍのポリスチレンラテックス粒子
を、トリス−塩酸緩衝液（ｐ）ｌ＝７．５）で希釈し、
ラテックス濃度が１重量％の＠濁液を調製する。

次いでヒト血清より得たヒトイムノグログリンＧ（以下
ヒ）ＩｇＧと略す）をトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．
５）で希釈し、蛋白濃度２Ｎｉ／ゴの溶液を調製する。

上記懸濁液１容と溶液１容とを混合し、３７℃で２時間
反応させた。次いで遠心分離し、上清を除去した後、沈
でんをウシ血清アルブミンを０．０５重量％の濃度で添
加したトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）で再分散し
、ラテックス濃度を０．０５重ｆ％に調製し、ヒ）Ｉｇ
Ｇ測定試薬を得たり （２）測定方法 実施例１で用いた装置を用い、５８０　ｎｍの波長の光
の吸光度を測定した。

まず光路長１０ｍｍのガラス製光学セルに円筒状の攪拌
子を入れ、次いでトリス−塩酸緩衝液を２０００μ１分
注し、測光部に挿入し、３７℃に加温した。

次にヒトＩｇＧをウサギに免疫して得た抗ヒ）ＩｇＧウ
サギ血清２００μｌを該セル中に注入し、次いで被検液
５０μｌを加え攪拌し、ヒ）ＩｇＧ測定に供する試料液
を得た。

次に試料液を撹拌しつつ（１）で得たヒ）ＩｇＧ測定試
薬２５０μｌを添加した。添加と同時に吸光度の測定を
開始した。なお反応時のラテックス濃度は０．１０重甘
せであり攪拌は被検液添加後３秒で停止した。

（３）既知試料の測定 ヒト血清より得たヒトＩｇＧ溶液（ヒトＩｇＧ＝ｉｏ、
ｏｏｏ■／ｄｔ）をトリス−塩酸緩衝液（ｐ）ｆ＝７．
５）で希釈し、ヒトＩｇＧ濃度が４０００．２０００．
１２５０　。

１０００．８００，６６７．３３３，１００，３３．１
０〜／ｄｇの被検液を得た。これに上記ヒ）ＩｇＧ溶液
及びトリス−塩酸緩衝液を加えた合計１２種のヒトＩｇ
Ｇ濃度既知被検液に対して、（２）の測定条件下で吸光
度を各５回測定した。得られた吸光度のうち、被検液添
加後６秒後と、１２秒後、１８秒後、６０秒後の吸光度
より、一定時間に対する吸光度差として、被検液添加６
０秒後の吸光度よ！７６秒後の吸光度を減じた値を得穴
。

一方２特定時間の吸光度の差の比として被検液添加１２
秒後と６秒後の吸光度の差を、被検液添加１８秒後と１
２秒後の吸光度の差で除した値を得た。この結果を表３
に示した。

以下余白 実施例１と同様にして対応曲線（Ａ）及び対応曲線（Ｂ
）　ｅ得た。結果を第６図及び第７図に示した。

第６図に示した対応曲線囚の極大値よりヒトＩｇＧ高濃
度側すなわち、抗体過少側の曲線は、該層の値ｔ”ｘ、
該ヒト１ｇ０８度’ｆｒ、　ｙｍ９／ｄｌ　、！：　”
ｊ　ヒト、ｙの逆数に対するＸの３次多項式 ％式％ ＋　１．４７５Ｘ１０　　ｘ　　　　　　　　　（式５
）により、ヒトＩｇＧ１度側すなわち抗体過剰側の曲線
は により良好に近似できた。

第３表に於ける該差の値の極大値はヒト１ｇ０８度が６
６７１ｎ９／ａの時に得られ、このヒトＩｇＧ１１１度
に於ける該層の比の値２．０５５’ｉ対応曲線（５）の
極大値に相当する該層の比の基準値とした。

なお一般にヒト血清中のヒ）ＩｇＧ１度は８００〜１８
００■／　ｄｌの範囲で異常値の場合でも１００〜１０
０００ｍ９／ｄｔの程度の範囲内にあると言われている
。

従ってヒ）　ＩｇＧ濃度が未知の被検液を測定するに当
たってはヒトＩｇＧ濃度１０，００　ｏｔｎｙ／ｄｔの
時の該層の値０．０１０５からその時の標準偏差０．０
００５の２倍を減じた０、００９５’を基準とし、該層
の値が０．００９５に満たない場合は測定範囲外でヒト
ＩｇＧ濃度が極めて高い領域にある旨を示す事とした。

該層の値が０．００９５以上の場合は、次いで該層の比
の値と、該層の比の基準値である２、０５５とを比較し
、該層の比の値が２．０５５未満の場合（式５）に２．
０５５以上の場合（式６）に抜差の値を適応し被検液中
のヒトＩｇＧ１度を得る事とした。

（Ａ）　　未知試料の測定 （２）の測定方法で正常人の血清を５例測定したところ
該層の値はいずれも該層の比の基準値２．０５５より小
であり、ヒトＩｇＧ濃度が６６７〜／ｄｔを越す事を示
した。一方収差の値は０．０９７１　、０．０７８３゜
０．０６５１．０．０５８７．０．０５４３金示し、こ
の値を（式５）に代入しヒ）　ＩｇＧ濃度計算するとそ
れぞれ９８０　、１１１１．１２６２．１３６４．１４
５１ｍ９／ｄｌとなりいずれもヒ）ＩｇＧ１度が臨床上
の正常域にある事を示した。

次に上記測定でヒ）ＩｇＧ濃度９８０ｍｌ１ＺＪを示し
た血清をトリス−塩酸緩衝液（…＝　７．５　）で３倍
に希釈し、（２）の測定方法で測定したところ該層の比
の値は３．９１３を示し、ヒトＩｇＧ　９度が６６７■
／ｃｔｔ以下である事を示した。次いで該層の値０．１
８９３（ｉ−（式６）に代入しヒトＩｇＧｉＪ［ｆ計算
すると、３２５ｍ９／ｄｔとなった。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗体を固定化した不浴性粒子担体の懸濁液に、
対応する抗原を添加し、添加後の時間に対する吸光度の
変化基を示すグラフである。 図中実線は抗原過少領域に属する被検液の場合で点線は
抗原過剰領域に属する被検液の場合の結果を示す。 第２図、第４図、第６図はそれぞれ、横軸全被検液中の
抗原又は抗体濃度とし、縦軸を一定時間に対する吸光度
の差としてプロットした対応曲線囚を示す。 第３図、第５図、第７図は横軸を被検液中の抗原又は抗
体濃度とし、縦軸を２′＃定時間に対する吸光度の差の
比としてプロットした対応［ｉｌｌＭ（Ｂ）を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）不溶性担体粒子に抗体又は抗原を固定化し、該担
   体粒子に固定化された抗体又は抗原に既知濃度の抗原又
   は抗体を反応させ、２点以上の経時的変化した時点で光
   を照射し、上記反応における反応物の光の吸光度又は透
   過率の変化を測定し、一定時間に於ける該吸光度又は透
   過率の差と抗原又は抗体濃度との間の対応曲線（Ａ）を
   求め、且つ、別に上記反応に於ける２以上の任意の特定
   時間に対する光の吸光度又は透過率の差の比と抗原又は
   抗体濃度との間の対応曲線（Ｂ）を求め、次いで未知濃
   度の試料について一定時間に於ける光の吸光度又は透過
   率の差と特定時間に対する光の吸光度又は透過率の差の
   比を測定し、該光の吸光度又は透過率の差の比が対応曲
   線（Ａ）の極大値に相当する値を基準として低濃度側領
   域に属するか高濃度側領域に属するかを確認し、上記確
   認した濃度領域の対応曲線（Ａ）を使用して上記光の吸
   光度又は透過率の差に相当する濃度を決定することを特
   徴とする抗原又は抗体濃度の測定方法。
2. （２）前記対応曲線（Ａ）を求めるに当たり、反応開始
   後の２点以上の経時的変化した時点間を、一定時間とす
   る特許請求の範囲第１項記載の抗原又は抗体濃度の測定
   方法。
3. （３）前記対応曲線（Ａ）を求めるに当たり反応開始前
   の１点以上の時点と反応開始後の１点以上との時点間を
   、一定時間とする特許請求の範囲第１項記載の抗原又は
   抗体濃度の測定方法。