JPS63200064A - 抗原抗体反応の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗原抗体反応の測定法に関する。

〔従来の技術と発明が震央しようとする問題点〕抗原抗
体反応の測定法は多くの成分を含む試料の中で、物量的
にある抗体または抗原がこれに対応する抗原または抗体
と反応することを利用している。しかし、実際には目的
とする抗原−抗体反応以外の非特異的な反応が起こるこ
とが知られている。今までのところ、この非特異的反応
のメカニズムは十分に解明されていないが次のような原
因が考えられている。

（イ）抗体を担持する系において、担持され次抗体中に
、目的とする抗原以外の物質に対、する抗体が存在する
。

（ロ）担持された抗原または抗体を、抗原と認識して反
応する目的外の抗体が試料溶液中に存在する。

（ハ）担持された抗原または抗体、あるいは担体そのも
のと、抗原抗体反応以外の作用機序によって反応する物
質が存在する。

上記（イ）については該抗体を、アフィニティークロマ
トグラフィー等によりＮＭすることによって対処できる
。

上記（ロ）の要因としてはりウマトイド因子が知られて
おり、非特異的に抗体であるＩｇＧのＦｃ部分と反応す
る。このため、　ＩｇＧのＦｃ　　部分を除去してＦ（
ａｂ’）！化することＫよって、非特異的反応を減少さ
せる方法が提案されている（特開昭ｒｌＩ−ｉＪｑｓｑ
ｓ号公報記載）。しかしながら。

Ｆ　（ａ　ｂ’　）ｔ　　に対しても反応する抗体の存
在が知られている（　０１ｉｎ、　Ｏｈｅｍ、　３１／
３，３９１（１９ｇ！！　）記載）。

上記（ハ）については担体表面の電荷の調節や。

抗原抗体反応を行う際に添加する緩衝液を工夫する等の
方法が試みられているものの多くの場合１反応の実態は
明らかでなく、（ロ）との区別も出来ないことも多い。

そこで上記（ロ）および（ハ）Ｋ対しては、特に抗体が
担持され次反応系において免疫していない動物から得を
抗体分画、ま九は血清を添加して非特異的反応を回避し
ようという試みがあるが、必ずしも十分な効果を上げて
いない。

ま九〇ＫＡ（癌胎児性抗原）のように蛋白質変性に対し
て安定な物質の測定においては、非特異的反応活性のあ
る蛋白分画を沈殿分離する方法が効果的であるが５手間
がかかることおよび通常の蛋白質の測定には使えないこ
とから。

その適用が非常に制限されるといった問題点があった。

一方、抗原抗体反応、を応用した定性、定量法は、臨床
検査の分野ではＯＥＡ以外にも数多く。

非特異的反応は検査結果の誤りにつながるため早急な対
応が望まれていた。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで本発明者らは種々の検討を重ねた結果。

通常　ｐＨ５〜ＩＱ程度である抗原または抗体を含有す
る試料溶液の　ｐＨを一旦グ以下とすることにより、非
特異的反応を防ぐことができることを見い出し１本発明
を完成するに到った。

すなわち１本発明の要旨は担体に抗体又は抗原を担持さ
せ、この担持された抗体又は抗原と。

試料溶液中の抗原又は抗体とを水性媒体中で反応させて
抗原または抗体を測定する方法において、該試料溶液中
に含まれる蛋白質を変性沈殿させることなく、該試料溶
液の　ｐＨを一旦１以上弘以下に低下させ１次いでその
　ｐＨをｓ−ｉ。

させることを特徴とする抗原抗体反応の測定法に存する
。

以下１本発明の詳細な説明する。

本発明で使用する担体としては抗体または抗原を担持し
得るものであればいずれのものも使用できるが１通常、
試料溶液に実質的に不溶性の有機高分子物質または無機
物質が使用される。

かかる有機高分子物質としては合成樹脂成型品。

合成樹脂成型品（例えばポリスチレンラテックス粒子）
、赤血球、バクテリア及び細胞膜片等が例示される。ま
た、無機物質としてはガラス、シリカ、アルミナ、シリ
カ−アルミナ、活性炭及びカーボン粒子等が例示される
。特に平均粒径Ｏ，ＯＳ〜／、Ｏｐｍ　のポリスチレン
ラテックス粒子及び平均粒径ユ〜を−のガラスピーズが
好適である。

上記担体に担持する抗体としては下記する抗原に対する
抗体である蛋白質が挙げられるが。

「改訂新版免疫化学」山村雄−外３名編集第ｕｓ’ｔ〜
５ＩＩ４１頁（昭和ａｔ年朝倉書店発行）に記載されて
いる如く、免疫カップリング及びこれから誘導されるＦ
ａｂ　１１　Ｆａｂ’、　Ｆ（ａｂ’）、も含まれる。

一方、抗原としては例えば蛋白質、ポリペプチド、ステ
ロイド、多糖類、脂質、花粉、ダスト等種々のものが挙
げられる。

これら抗体または抗原を上記担体に担持する〜１０ｍ９
／−担持される。例えばポリスチレンラテックスの場合
００７〜１重１ｊｋｑｂのポリスチレン当り１１　Ｑ、
／〜／−〜１ｍｌ／−の範囲で担持される。

本発明の抗原または抗体を含む試料溶液としては１例え
ば血清や尿等が挙げられる。また。

測定しようとする抗原ま次は抗体等を生理食塩水または
リン醗、トリスー塩酸などの緩衝液等に溶解した溶液も
適用することができる。

血清の　ｐＨは通常、ワ、Ｊｊ〜７．１　ｊであり、尿
の　ｐＨは通常ｓ〜５である。ま九上記の緩衝液の　ｐ
Ｈは溶解している抗原ま九は抗体の安定性の点から通常
！　−／　０の範囲で使用される。

本発明においては、上記試料溶液を前記担体に担持され
た抗体または抗原と反応させる前に一旦その　ｐＨを１
以上ダ以下、好ましくは２〜３．１に低下させる。その
後、ｏ−５ｏｃ、好ましくは室温で７１０分以下、好ま
しくはｌＯ〜３Ｑ分程度放置することにより試料溶液に
含まれる非特異的反応をする物質が不活性化され、非特
異的反応、が惹起しない。

ｐＨを調整するための酸性溶液としては塩酸。

硫酸、リン酸等の無機酸；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、
乳酸、マレイン酸、マロン酸、？Ｉ！！１石酸。

リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、フマル醗、蓚酸、フタ
ル酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸等の有
機醸を含む水溶液が挙げられる。その中でも０．２　Ｍ
グリシン−ＨＣｌ、０．２Ｍクエン酸−ＮａＯＨ、０，
２Ｍ酒石酸−ＮａＯＨ等の緩Ｈ型陽イオン交換樹脂を用
いる方法も使用することができる。

試料溶液を一ダ時間以上　ｐＨ／〜ダに保持すると蛋白
質が変性する恐れがあるので好ましくない。次いで、上
記試料溶液のｐＨを　ｐＨ５以上のリン酸、トリス−塩
酸などの緩衝液等により　ｐＨを５−ｉｏ、好ましくは
７〜９の範囲に調整し、抗原−抗体反応の反応性の高い
　ｐＨ範囲において前記担体に担持された抗体または抗
原と反応させる。

担体に担持させ次抗体または抗原と試料溶液中の抗＊−
＊たは抗体とを反応させる方法としては公知の種々の方
法が使用できる。主なものとしてはＦＩＩＡ法（放射性
同位元素標識免疫測定法）、ＫＩＡ法（酵素標識免疫測
定法）、ラテックス凝集反応法等がある。

ＦＩＩＡ法は測定しようとする物質と結合する抗体″ま
たは抗原を放射性同位元素である例えばヨウ素／、１／
で標識し、測定対象物と結合した抗体−１次は抗原の放
射性同位元素から放射される放射線を測定することＫよ
り定量する方法である。

ＥＩＡ法は、測定しようとする物質と結合する抗体また
は抗原を例えばあらかじめペルオキシダーゼ等の酵素で
標識し、測定対象物と反応させた後、その対象物の量を
標識した酵素の活性として定量する。即１０反范物と発
色性の酵素基質を反応させ１発色剤によシ発色させる。

その発色の吸収波長の光を照射し、その吸光度を測定し
、定量する方法である。

ラテックス凝集反応法は、測定しようとする物質と反応
する抗体または抗ＩｊＸを担体１例えばを測定するもの
である。この場合、ポリスチレンラテックスは平均粒径
０．０　！ｒ　Ｐ−１，０ｐｍ　のものを使用し、０．
１〜１重を蒼ラテックスに対して測定しようとする物質
の抗体または抗原をＯ／〜／−〜ノ〜／ｍｌ禦−苧一一
の範囲で担持させる。測定する試料溶液はトリス−塩酸
、リン酸などの緩衝液等により希釈した後、上記の抗体
または抗原を担持させたラテックスを分注し、十分攪拌
する。

ラテックスは抗原−抗体反応によシ凝集反応を開始する
。一般にこの反応はプラスチックまたはガラスセル内で
行ない、セル外部よｆ）　ｏ、ｕ〜コ、弘μｍ　の波長
から選ばれる適当な波長の光を照射し、吸光度変化また
は散乱光の強度を測定することＫより、セル中の抗体ま
たは抗原量を定量する。

〔実施例〕

以下、実施例によシ本発明を更に詳細に説明するが１本
発明はその要旨を超えない限９以下の実施例に限定され
るものではない。

なお、試料溶液中の非特異的反応物質の確認は次の方法
で行なった。

測定対象物質を免疫していない動物の血清よりＩｇＧ＆
取り出し担体に担持させ、試料溶液と反応させる。例え
ば担体にポリスチレンラテックスを用い次場合、非特異
的反応物質を含む試料（血清）ではそのＩｇＧと非特異
的反応酸反尾、シ、凝集する。非特異的反応物質を含ま
ない場合は凝集しない。この方法の他に担体に担持させ
た抗体を予め抗体に対する抗原と十分反応させた後、測
定試料溶液を添加する。非特異的反応物質を含む試料溶
液の場合はさらに抗体は非特異的反応物質と反応し、ラ
テックス反応の場合は凝集する。非特異的反応物質を含
まない場合は試料溶液中に抗原が存在しても抗体はすで
に抗原と反応しているため反応しない。つまり、ラテッ
クス凝集反応では凝集しない。

実施例においてはかかる方法によって確認された非特異
的反応検体を使用した。

実施例／−Ｊ及び比較例１ 実質的にＡＦＰ（アルファフェトプロティン）を含まな
い、非特異的反応を示す血清中におけるＡＦＰを測定し
た。

まず、試料溶液ｓ　ｏ　ｐｔに表１に示したｐＨ−０３
の緩衝液ｒ　ｏ　ｐｔ　を添加し、試験管内でよく攪拌
し食後、全量をプラスチック製サンプリングカップ（三
菱化成社製’　ＬＰＺＡ１００＃装置用）に移す。室温
で３０分放置した後、全自動免疫診断装置鷺ＬＰｘｐ、
ｌｏｏ　Ｉ　（三菱化成社製）Ｋより測定する。本装置
によりプラスチックセルに試料１０ｐＬ、　　トリス−
塩酸緩衝液ユ！０μＬ、及び、Ｌ−ＡＦＰラテックス試
薬（三菱化成社製）ｊθμｔを自動的に分注し、攪拌後
セルの外部よＦ）　９　ＩＩ　Ｏｎｍ　の近赤外光を照
射することによシ、吸光度を経時的に測定した。表７に
その結果を反応速度Ｖ（吸光度をｉｓ秒毎にａＯデータ
測定し、各点を最小二乗法によって求めた一次回帰式の
傾向きを６０倍した値）として示す。

実施例１〜Ｊの反応速度は２．９５〜Ｓ、り９であった
。比較例／は試料篩ＺＳＯμｔ　と生理食塩水５０μｔ
　を加え、試験管内でよく攪拌し。

実施例７〜３と同様な方法で反応速匹を求めた。

実施例７〜３と比較し、比較例１ＯＶ値はコＩｊ　１と
高値を示した。

この結果から試料溶液中に含まれる非特異的反応因子の
抑制効果は酸の種類によらないことが判る。

実施例１ 実質的ＫＡＦＰを含まない、非特異的反応を示す試料溶
液！；　ＯｐＬに対してｐＨがユ、３〜ｉ。

までの緩衝液Ｓθμｔを加え、室温でａＯ分放置した後
実施例１〜Ｊと同様の方法により反応速度を測定した。

その結果全図７に示す。これから非特異的反応因子は試
料溶液のｐｇ　　をｑ以下とした時に初めて抑制効果を
示すことがわかる。

実施例ｊ 料溶液の　ｐＨを１．７とし室温で７０分放置した後＝
ａ例ノ〜３と同様の方法により反応速度全測定し、検量
線？作成した（表−及び図２）。

測定目的であるＡＦＰの反応性は抑制されず、非特異因
子をもたない試料中のＡＦＰの備度が正確に定菅される
ことが判る。

表　　一 実施例６〜に ＯＢＡにおいて非特異的反応を示す血清を試料溶液とし
て用いた。試料！ｒ　ＯｐＬ　　と。、コングリシン−
Ｈ０１ｐＨ／、ｊの水溶液！ｒＯｐｔｆ混合し。

試料ｐＨをコ、りとし念後室瀉で７０分放置した。

次に前述の実施例ｊと同様の方法でＭ　　ＯＦｉＡラテ
ックス試薬を用いてＯＥＡ濃度を測定した。

比較として同一の試料ｓ　ｏ　ｐｔ　　と生理食塩水Ｓ
ＯμＬ　を混合し、同様な測定方法で濃度を求めた。こ
の結果を表Ｊに示す。この結果からも本発明法はＯＥＡ
測定においても非特異反応抑制効果をもつことが判る。

表　　３ 実施例９〜ｌλ 非特異的反応物質１−１まない・Ｃ！ＫＡ陽性検体を試
料として！０μｔ　とり、０．２Ｍグリシン−ＭＣＩ　
ｐＨ／、！の水溶液Ｓθμｔ７に混合し、試料溶液の　
ｐＨを２．７とした接室湛で７０分放置し次。

次に実施例ｊと同様の方法でａ″　ＯＫＡラテックス試
薬を用いてＯＫＡ濃度を測定した。比較として同一の試
料ｊＯμｔと生理食塩水ｇｏμｔを混合し、同様な測定
方法で濃度を求めた。この結果を表グに示す。この結果
から非特異的反尾・はｐＨ１以下にすることにより抑制
されるが目的とする（、ＫＡの測定には影＃を与えず、
よい相関を示すことが判る。

表　ダ 実施例１３〜ｌク エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ法）にて測定を行っ
た。

向島の方法（ＭｕＤｒｃｏ　ｖｏｈ　ｔｘｃｇ）、ｕｑ
ｂｏ（ｌｑｇｔ）記載）に従って抗−〇ＥＡウサギ抗体
、ガラスピーズ及びペルオキシダーゼを用いて、同相抗
体及び酵素標識抗体を作成した。

○ＥＡ検体から、リウマトイド因子陰性検体−例（実施
例）、７．／４り及びリウマトイド因子陽性検体３例（
実施例１ｓ、　１６．／７）を選び、各ｒＯｐＬＶｃＯ
，−Ｍクエｙｆｉ溶液　ｉｏ。

μｔ１を加え、ｐＨｔ約二、６として室温で３０分放置
した後、コＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＯｌのｐＨｇ、！ｒ溶液ｒ
ｏｐｔを加え、ｐＨを４．９としたものを試料とした。

対照例としては、００−Ｍクエンｗｉｏｏμｔ　と２　
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＯｌ　５　ｏ　ｐｔを予め混合してｐ
Ｈを中性としてから加えたものｔ用いた。

上記試料各ユｏ　ｏ　ｐｔ　に直接固相抗体を加え３７
℃で１３時間インキュベートした。以降の洗浄、標識抗
体との反応、酵素反応及び測定の条件は、上記文献に従
った。その結果をｅｊに示す。

赤　！ 実施例／３．／ＩＩに見られるように、リウマトイド因
子陰性検体では　ｐＨ２，ｌ、処理の有無に拘らずＣＩ
ｔＫＡ定量値はほぼ等しいが、リウマトイド因子陽性検
体では、実施９１１　／　！；〜／’７に見るごと（、
’ｐＨユ、６処卯の方が定量値が顕著に圓＜、非特異的
反応・が抑制されていることがわかる。

〔発明の効果〕

本発明方法によれば抗原抗体反尾、金利用した測定法に
おける非特異的反応を防ぐことができる。

【図面の簡単な説明】

図７は実施例ダにおける試料溶液のｐＨに対する反応速
度の変化會示すグラフである。 図コは実施例５において作成したＡＦＰｌｉ度と反応速
度との検量線を示すグラフである。 出願人　　三愛化成工条株式会社 代理人　　弁理士　長谷用　　− ほか１名 図２

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）担体に抗体又は抗原を担持させ、この担持された
   抗体又は抗原と、試料溶液中の抗原又は抗体とを水性媒
   体中で反応させて抗原または抗体を測定する方法におい
   て、該試料溶液中に含まれる蛋白質を変性沈殿させるこ
   となく、該試料溶液のｐＨを一旦１以上４以下に低下さ
   せ、次いでそのｐＨを５〜１０の範囲に調整した後、該
   試料溶液中の抗原または抗体と担体に担持された抗体又
   は抗原とを反応させることを特徴とする抗原抗体反応の
   測定法。
2. （２）該担体が、該試料溶液及び該水性媒体に実質的に
   不溶性の有機高分子物質、又は無機物質であることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）該有機高分子物質が合成樹脂成型品、又は合成樹
   脂微粒子品であることを特徴とする特許請求の範囲第２
   項記載の方法。
4. （４）該合成樹脂微粒子品が、ポリスチレンラテックス
   粒子であることを特徴とする特許請求の範囲第３項記載
   の方法。
5. （５）該有機高分子物質が、赤血球、バクテリア、細胞
   膜片、又はリボゾームであることを特徴とする特許請求
   の範囲第２項記載の方法。
6. （６）該無機物質が、ガラス、シリカ、アルミナ、又は
   シリカ−アルミナであることを特許とする特許請求の範
   囲第２項記載の方法。
7. （７）該無機物質が活性炭又はカーボン粒子であること
   を特徴とする特許請求の範囲第２項記載の方法。
8. （８）該試料溶液のｐＨ低下を、無機酸及び／又は有機
   酸を含む水溶液の添加混合によって 行うことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法
   。
9. （９）該無機酸が塩酸、硫酸、又はリン酸であることを
   特徴とする特許請求の範囲第８項記載の方法。
10. （１０）該有機酸が、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸
    、マレイン酸、マロン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸
    、クエン酸、フマル酸、蓚酸、フタル酸、ベンゼンスル
    ホン酸、又はトルエンスルホン酸であることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項記載の方法。
11. （１１）該試料溶液のｐＨ低下をＨ型陽イオン交換樹脂
    を用いて行うことを特徴とする特許請求の範囲第１項記
    載の方法。