JP2590330B2 - 抗原抗体反応の測定法 - Google Patents

抗原抗体反応の測定法

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗原抗体反応の測定法に関する。
〔従来の技術と発明が解決しようとする問題点〕
抗原抗体反応の測定法は多くの成分を含む試料の中
で、物量的にある抗体または抗原がこれに対応する抗原
または抗体と反応することを利用している。しかし、実
際には目的とする抗原−抗体反応以外の非特異的な反応
が起こることが知られている。今までのところ、この非
特異的反応のメカニズムは十分に解明されていないが次
のような原因が考えられている。
(イ) 抗体を担持する系において、担持された抗体中
に、目的とする抗原以外の物質に対する抗体を存在す
る。
(ロ) 担持された抗原または抗体を、抗原と認識して
反応する目的外の抗体が試料溶液中に存在する。
(ハ) 担持された抗原または抗体、あるいは担体その
ものと、抗原抗体反応以外の作用機序によつて反応する
物質が存在する。
上記(イ)については該抗体を、アフイニテイークロ
マトグラフイー等により精製することによつて対処でき
る。
上記(ロ)の要因としてはリウマトイド因子が知られ
ており、非特異的に抗体であるIgGのFc部分と反応す
る。このため、IgGのFc部分を除去してF(ab′)
することによつて、非特異的反応を減少させる方法が提
案されている(特開昭54−139595号公報記載)。しかし
ながら、F(ab′)に対しても反応する抗体の存在が
知られている(Clin.Chem.31/3,397(1985)記載)。
上記(ハ)については担体表面の電荷の調節や、抗原
抗体反応を行う際に添加する緩衝液を工夫する等の方法
が試みられているものの多くの場合、反応の実態は明ら
かでなく、(ロ)との区別も出来ないことも多い。そこ
で上記(ロ)および(ハ)に対しては、特に抗体が担持
された反応系において免疫していない動物から得た抗体
分画、または血清を添加して非特異的反応を回避しよう
という試みがあるが、必ずしも十分な効果を上げていな
い。
またCEA(癌胎児性抗原)のように蛋白質変性に対し
て安定した物質の測定においては、非特異的反応活性の
ある蛋白分画を沈殿分離する方法が効果的であるが、手
間がかかることおよび通常の蛋白質の測定には使えない
ことから、その適用が非常に制限されるといつた問題点
があつた。
一方、抗原抗体反応を応用した定性、定量法は、臨床
検査の分野ではCEA以外にも数多く、非特異的反応は検
査結果の誤りにつながるため早急な対応が望まれてい
た。
〔問題点を解決するための手段〕
そこで本発明者らは種々の検討を重ねた結果、通常pH
5〜10程度である抗原または抗体を含有する試料溶液のp
Hを一旦4以下とすることにより、非特異的反応を防ぐ
ことができることを見い出し、本発明を完成するに到つ
た。
すなわち、本発明の要旨は担体に抗体又は抗原を担持
させ、この担持された抗体又は抗原と、試料溶液中の抗
原又は抗体とを水性媒体中でラテックス凝集反応法によ
り反応させて抗原または抗体を測定する方法において、
該試料溶液中に含まれる蛋白質を変性沈殿させることな
く、該試料溶液のpHを、有機酸を含む緩衝液を用いて一
旦1以上4以下に低下させ、次いでそのpHを5〜10の範
囲に調整した後、該試料溶液中の抗原または抗体と担体
に担持された抗体又は抗原とを反応させることを特徴と
する抗原抗体反応の測定法に存する。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で使用する担体としては抗体または抗原を担持
し得るものであればいずれのものも使用できるが、通
常、試料溶液に実質的に不溶性の有機高分子物質または
無機物質が使用される。かかる有機高分子物質としては
合成樹脂成型品、合成樹脂微粒子品(例えばポリスチレ
ンラテツクス粒子)、赤血球、バクテリア及び細胞膜片
等が例示される。また、無機物質としてはガラス、シリ
カ、アルミナ、シリカ−アルミナ、活性炭及びカーボン
粒子等が例示される。特に平均粒径0.05〜1.0μmのポ
リスチレンラテツクス粒子及び平均粒径2〜8mmのガラ
スビーズが好適である。
上記担体に担持する担体としては下記する抗原に対す
る抗体である蛋白質が挙げられるが、「改訂新版免疫化
学」山村雄一外3名編集第457〜544頁(昭和48年朝倉書
店発行)に記載されている如く、免疫カツプリング及び
これから誘導されるFab、Fab′、F(ab′)も含まれ
る。一方、抗原としては例えば蛋白質、ポリペプチド、
ステロイド、多糖類、脂質、花粉、ダスト等種々のもの
が挙げられる。
これら抗体または抗原を上記担体に担持する方法とし
ては周知の方法、例えば担体に対して抗体または抗原を
物理的に吸着させてもよいし、担体表面の官能基と化学
的に結合させてもよい。抗体または抗原は通常担体当
り、0.01mg/ml〜10mg/ml担持される。例えばポリスチレ
ンラテツクスの場合0.1〜1重量%のポリスチレン当
り、0.1mg/ml〜1mg/mlの範囲で担持される。
本発明の抗原または抗体を含む試料溶液としては、例
えば血清や尿等が挙げられる。また、測定しようとする
抗原または抗体等を生理食塩水またはリン酸、トリス−
塩酸などの緩衝液等に溶解した溶液も適用することがで
きる。
血清のpHは通常、7.35〜7.45であり、尿のpHは通常5
〜8である。また上記の緩衝液のpHは溶解している抗原
または抗体の安定性の点から通常5〜10の範囲で使用さ
れる。本発明においては、上記試料溶液を前記担体に担
持された抗体または抗原と反応させる前に一旦そのpHを
1以上4以下、好ましくは2〜3.5に低下させる。その
後、0〜50℃、好ましくは室温で120分以下、好ましく
は10〜30分程度放置することにより試料溶液に含まれる
非特異的反応をする物質が不活性化され、非特異的反応
が惹起しない。
pHを調整するための酸性溶液としてはギ酸、酢酸、プ
ロピオン酸、乳酸、マレイン酸、マロン酸、酒石酸、リ
ンゴ酸、コハク酸、クエン酸、フマル酸、蓚酸、フタル
酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸等の有機
酸を含む緩衝液が挙げられる。その中でも0.2Mグリシン
−HCl、0.2Mクエン酸−NaOH、0.2M酒石酸−NaOH等の緩
衝液等が好ましい。
試料溶液を20時間以上pH1〜4に保持すると蛋白質が
変性する恐れがあるので好ましくない。次いで、上記試
料溶液のpHをpH5以上のリン酸、トリス−塩酸などの緩
衝液等によりpHを5〜10、好ましくは7〜9の範囲に調
整し、抗原−抗体反応の反応性の高いpH範囲において前
記担体に担持された抗体または抗原と反応させる。
担体に担持させた抗体または抗原と試料溶液中の抗原
または抗体とを反応させる方法としてはラテツクス凝集
反応法等が挙げられる。
ラテツクス凝集反応法は、測定しようとする物質と反
応する抗体または抗原を担体、例えばポリスチレンラテ
ツクス粒子に担持し、このラテツクスと測定対象物が反
応し凝集する濁度変化を測定するものである。この場
合、ポリスチレンラテツクスは平均粒径0.05〜1.0μm
のものを使用し、0.1〜1重量%ラテツクスに対して測
定しようとする物質の抗体または抗原を 01mg/ml〜1mg
/mlの範囲で担持させる。測定する試料溶液はトリス−
塩酸、リン酸などの緩衝液等により希釈した後、上記の
抗体または抗原を担持させたラテツクスを分注し、十分
撹拌する。
ラテツクスは抗原−抗体反応により凝集反応を開始す
る。一般にこの反応はプラスチツクまたはガラスセル内
で行ない、セル外部より0.4〜2.4μmの波長から選ばれ
る適当な波長の光を照射し、吸光度変化または散乱光の
強度を測定することにより、セル中の抗体または抗原量
を定量する。
〔実施例〕
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、
本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定さ
れるものではない。
なお、試料溶液中の非特異的反応物質の確認は次の方
法で行なつた。
測定対象物質を免疫していない動物の血清よりIgGを
取り出し担体に担持させ、試料溶液と反応させる。例え
ば担体にポリスチレンラテツクスを用いた場合、非特異
的反応物質を含む試料(血清)ではそのIgGと非特異的
反応物質が反応し、凝集する。非特異的反応物質が含ま
ない場合は凝集しない。この方法の他に担体に担持させ
た抗体を予め抗体に対する抗原と十分反応させた後、測
定試料溶液を添加する。非特異的反応物質を含む試料溶
液の場合はさらに抗体は非特異的反応物質と反応し、ラ
テツクス反応の場合は凝集する。非特異的反応物質を含
まない場合は試料溶液中に抗原が存在しても抗体はすで
に抗原と反応しているため反応しない。つまり、ラテツ
クス凝集反応では凝集しない。
実施例においてはかかる方法によつて確認された非特
異的反応検体を使用した。
実施例1〜3及び比較例1 実質的にAFP(アルフアフエトプロテイン)を含まな
い、非特異的反応を示す血清中におけるAFPを測定し
た。
まず、試料溶液50μに表1に示したpH2.3の緩衝液5
0μを添加し、試験管内でよく撹拌した後、全量をプ
ラスチツク製サンプリングカツプ(三菱化成社製“LPIA
100"装置用)に移す。室温で30分放置した後、全自動免
疫診断装置“LPIA100"(三菱化成社製)により測定す
る。本装置によりプラスチツクセルに試料10μ、トリ
ス−塩酸緩衝液250μ、及び−AFPラテツクス試薬
(三菱化成社製)50μを自動的に分注し、撹拌後セル
の外部より940nmの近赤外光を照射することにより、吸
光度を経時的に測定した。表1にその結果を反応速度V
(吸光度を15秒毎に40データ測定し、各点を最小二乗法
によつて求めた一次回帰式の傾向きを60倍した値)とし
て示す。
実施例1〜3の反応速度は2.98〜5.79であつた。比較
例1は試料溶液50μと生理食塩水50μを加え、試験
管内でよく撹拌し、実施例1〜3と同様な方法で反応速
度を求めた。実施例1〜3と比較し、比較例1のV値は
25.55と高値を示した。
この結果から試料溶液中に含まれる非特異的反応因子
の抑制効果は酸の種類によらないことが判る。
実施例4 実質的にAFPを含まない、非特異的反応を示す試料溶
液50μに対してpHが2.3〜10までの緩衝液50μを加
え、室温で40分放置した後実施例1〜3と同様の方法に
より反応速度を測定した。その結果を図1に示す。これ
から非特異的反応因子は試料溶液のpHを4以下とした時
に初めて抑制効果を示すことがわかる。
実施例5 濃度既知のAFPを含む試料50μとpH1.5の0.2Mグリシ
ン−HCl溶液を50μを混合し、試料溶液のpHを2.7とし
室温で10分放置した後実施例1〜3と同様の方法により
反応速度を測定し、検量線を作成した(表2及び図
2)。測定目的であるAFPの反応性は抑制されず、非特
異因子をもたない試料中のAFPの濃度が正確に定量され
ることが判る。
実施例6〜8 CEAにおいて非特異的反応を示す血清を試料溶液とし
て用いた。試料50μと0.2Mグリシン−HCl pH1.5の水
溶液50μを混合し、試料pHを2.7とした後室温で10分
放置した。次に前述の実施例5と同様の方法で CEA
ラテツクス試薬を用いてCEA濃度を測定した。比較とし
て同一の試料50μと生理食塩水50μを混合し、同様
な測定方法で濃度を求めた。この結果を表3に示す。こ
の結果からも本発明法はCEA測定においても非特異反応
抑制効果をもつことが判る。
実施例9〜12 非特異的反応物質を含まないCEA陽性検体を試料とし
て50μとり、0.2Mグリシン−HCl pH1.5の水溶液50μ
を混合し、試料溶液のpHを2.7とした後室温で10分放
置した。次に実施例5と同様の方法で CEAラテツク
ス試薬を用いてCEA濃度を測定した。比較として同一の
試料50μと生理食塩水50μを混合し、同様な測定方
法で濃度を求めた。この結果を表4に示す。この結果か
ら非特異的反応はpH4以下にすることにより抑制される
が目的とするCEAの測定には影響を与えず、より相関を
示すことが判る。
〔発明の効果〕 本発明方法によればラテックス凝集反応法による抗原
抗体反応を利用した測定法における非特異的反応を防ぐ
ことができる。
【図面の簡単な説明】
図1は実施例4における試料溶液のpHに対する反応速度
の変化を示すグラフである。 図2は実施例5において作成したAFP濃度と反応速度と
の検量線を示すグラフである。
フロントページの続き (72)発明者 神野 英毅 横浜市緑区鴨志田町1000番地 三菱化成 工業株式会社総合研究所内 (56)参考文献 特開 昭63−38163(JP,A)

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】担体に抗体又は抗原を担持させ、この担持
    された抗体又は抗原と、試料溶液中の抗原又は抗体とを
    水性媒体中でラテックス凝集反応法により反応させて抗
    原または抗体を測定する方法において、非特異的反応を
    防止するために、該試料溶液中に含まれる蛋白質を変性
    沈殿させることなく、該試料溶液のpHを、有機酸を含む
    緩衝液を用いて一旦1以上4以下に低下させ、次いでそ
    のpHを5〜10の範囲に調整した後、該試料溶液中の抗原
    または抗体と担体に担持された抗体又は抗原とを反応さ
    せることを特徴とする抗原抗体反応の測定法。
  2. 【請求項2】該担体が、該試料溶液及び該水性媒体に実
    質的に不溶性の有機高分子物質であることを特徴とする
    特許請求の範囲第1項記載の方法。
  3. 【請求項3】該有機高分子物質が、合成樹脂成型品、又
    は合成樹脂微粒子品であることを特徴とする特許請求の
    範囲第2項記載の方法。
  4. 【請求項4】該合成樹脂微粒子品が、ポリスチレンラッ
    テクス粒子であることを特徴とする特許請求の範囲第3
    項記載の方法。
  5. 【請求項5】該有機酸を含む緩衝液が、グリシン−塩酸
    緩衝液、クエン酸−NaOH緩衝液、又は酒石酸−NaOH緩衝
    液であることを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の
    方法。
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