JPH0521186B2 - - Google Patents
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- JPH0521186B2 JPH0521186B2 JP1280006A JP28000689A JPH0521186B2 JP H0521186 B2 JPH0521186 B2 JP H0521186B2 JP 1280006 A JP1280006 A JP 1280006A JP 28000689 A JP28000689 A JP 28000689A JP H0521186 B2 JPH0521186 B2 JP H0521186B2
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は免疫検定に関するものでありそしてさ
らに詳しくいえば、免疫グロブリンの結合の性質
による免疫検定法およびこの検定に有用な試薬に
関するものである。
らに詳しくいえば、免疫グロブリンの結合の性質
による免疫検定法およびこの検定に有用な試薬に
関するものである。
免疫グロブリン抗体が対応する特定の抗原また
はハプテン（Ag）に結合すること、そしてこれ
が多くの免疫検定法に利用されていることはよく
知られている。例えば人間の血清はその中に存在
するある特定のAgによつて対応する抗体を使つ
て、例えば選択的結合法あるいはラテツクス凝集
法によつて検定される。これらの方法および他の
方法は当業者には公知である。
はハプテン（Ag）に結合すること、そしてこれ
が多くの免疫検定法に利用されていることはよく
知られている。例えば人間の血清はその中に存在
するある特定のAgによつて対応する抗体を使つ
て、例えば選択的結合法あるいはラテツクス凝集
法によつて検定される。これらの方法および他の
方法は当業者には公知である。
このような検定方法において起こり得る問題の
１つは、検定する血清中の他のタンパク質による
干渉である。特に人間の血清にはリウマトイド因
子（RF）およびClq（補体成分）が含まれていて、
これらの物質も免疫グロブリン抗体と結合する。
さらに、人間の血清中のRFとClqの量は広範囲に
変化するので、血清の検定の前に内生のRFとClq
を不活性にするかまたは取り除く処理が通常必要
である。これをしなければ検定の結果、特に定量
の結果は著しく誤つているであろう。
１つは、検定する血清中の他のタンパク質による
干渉である。特に人間の血清にはリウマトイド因
子（RF）およびClq（補体成分）が含まれていて、
これらの物質も免疫グロブリン抗体と結合する。
さらに、人間の血清中のRFとClqの量は広範囲に
変化するので、血清の検定の前に内生のRFとClq
を不活性にするかまたは取り除く処理が通常必要
である。これをしなければ検定の結果、特に定量
の結果は著しく誤つているであろう。
本発明者は、RFまたはClqが存在してもその干
渉を受けずに行なえる、免疫グロブリンの抗原
（本明細書においてはハプテンを含むものとする）
に対する結合性を利用した免疫検定法を提供す
る。特に、本発明による方法は免疫グロブリン全
体よりもむしろ免疫グロブリンのＦ（ab′）2断片を
使う免疫検定法である。例えば免疫グロブリンＧ
（IgG）のＦ（ab′）2断片［ただしウシＦ（ab′）2断
片
を除く］は抗原と特別な結合をする性質を持つて
いるがFRまたはClqとは結合しない。（免疫グロ
ブリンのＦ(c)断片は免疫グロブリンのRFまたは
Clqとの結合反応の原因となるが、特定な抗原と
の結合反応の原因とはならない。）本発明方法に
よれば、RFまたはClqとの結合性なしに特定の
Agに対する免疫グロブリンの結合性を保つこと
ができる。
渉を受けずに行なえる、免疫グロブリンの抗原
（本明細書においてはハプテンを含むものとする）
に対する結合性を利用した免疫検定法を提供す
る。特に、本発明による方法は免疫グロブリン全
体よりもむしろ免疫グロブリンのＦ（ab′）2断片を
使う免疫検定法である。例えば免疫グロブリンＧ
（IgG）のＦ（ab′）2断片［ただしウシＦ（ab′）2断
片
を除く］は抗原と特別な結合をする性質を持つて
いるがFRまたはClqとは結合しない。（免疫グロ
ブリンのＦ(c)断片は免疫グロブリンのRFまたは
Clqとの結合反応の原因となるが、特定な抗原と
の結合反応の原因とはならない。）本発明方法に
よれば、RFまたはClqとの結合性なしに特定の
Agに対する免疫グロブリンの結合性を保つこと
ができる。
本発明は流体中のある抗原とこの抗原に対して
特別な免疫グロブリンのＦ（ab′）2断片〔ただしウ
シＦ（ab′）2断片を除く〕との、免疫グロブリン全
体およびそのＦ(c)断片の実質的な不存在下での反
応から成る免疫検定法を提供する。
特別な免疫グロブリンのＦ（ab′）2断片〔ただしウ
シＦ（ab′）2断片を除く〕との、免疫グロブリン全
体およびそのＦ(c)断片の実質的な不存在下での反
応から成る免疫検定法を提供する。
本発明はまた
内因性ClqまたはRFまたはこれら両方を溶解し
て含む流体中の、前記ClqおよびRF以外の抗原を
検定する方法であつて、 (a) 液相を形成する前記流体の試料を、前記抗原
に対して特異的な免疫グロブリンのＦ（ab′）2断
片であるがウシＦ（ab′）2断片ではないＦ（ab′）2
断片と結合させた磁気吸引可能な水に不溶性の
物質から成る固相と混合して反応混合物を形成
し、ここで内因性ClqおよびRFからの干渉を避
けるため、反応混合物は免疫グロブリン全体お
よびそのＦ(c)断片を実質的に含んでいないもの
とし、 (b) 前記Ｆ（ab′）2断片とそこに存在する抗原とが
反応するように、反応混合物をインキユベート
し、 (c) 前記反応に続いて液相と固相とを磁気的に分
離し、そして (d) 反応混合物中に起きた前記反応の程度を測定
し、それによつて試料中の抗原の存在または量
を検定する、 各工程から成る、検定方法を提供するものであ
る。
て含む流体中の、前記ClqおよびRF以外の抗原を
検定する方法であつて、 (a) 液相を形成する前記流体の試料を、前記抗原
に対して特異的な免疫グロブリンのＦ（ab′）2断
片であるがウシＦ（ab′）2断片ではないＦ（ab′）2
断片と結合させた磁気吸引可能な水に不溶性の
物質から成る固相と混合して反応混合物を形成
し、ここで内因性ClqおよびRFからの干渉を避
けるため、反応混合物は免疫グロブリン全体お
よびそのＦ(c)断片を実質的に含んでいないもの
とし、 (b) 前記Ｆ（ab′）2断片とそこに存在する抗原とが
反応するように、反応混合物をインキユベート
し、 (c) 前記反応に続いて液相と固相とを磁気的に分
離し、そして (d) 反応混合物中に起きた前記反応の程度を測定
し、それによつて試料中の抗原の存在または量
を検定する、 各工程から成る、検定方法を提供するものであ
る。
IgGのような免疫グロブリンは当業者に公知の
方法、例えばペプシンを使つた酵素消化によつて
成分のＦ（ab′）2およびＦ(c)断片に分裂できる。そ
してＦ（ab′）2断片をＦ(c)断片と分離し、本発明の
方法に使用する。Ｆ（ab′）2の調製の例を次に示
す。全IgG100mg当りペプシン２mgの割合でIgGと
ペプシンとをPH4.5の0.1M酢酸緩衝液中で混合す
る。この混合物を37℃で24時間インキユベートす
る。形成したＦ（ab′）2をウルトロゲル
（Ultrogel）AcA4.4カラム上で分離するＦ（ab′）2
の理論値の80〜90％の収量を得る。
方法、例えばペプシンを使つた酵素消化によつて
成分のＦ（ab′）2およびＦ(c)断片に分裂できる。そ
してＦ（ab′）2断片をＦ(c)断片と分離し、本発明の
方法に使用する。Ｆ（ab′）2の調製の例を次に示
す。全IgG100mg当りペプシン２mgの割合でIgGと
ペプシンとをPH4.5の0.1M酢酸緩衝液中で混合す
る。この混合物を37℃で24時間インキユベートす
る。形成したＦ（ab′）2をウルトロゲル
（Ultrogel）AcA4.4カラム上で分離するＦ（ab′）2
の理論値の80〜90％の収量を得る。
本発明によれば、ある抗原と免疫グロブリンと
の間の特定な反応は起こすがRFまたはClqと免疫
グロブリンとの間の反応は要求されない免疫検定
法において、全免疫グロブリンの代りにＦ（ab′）2
断片〔だしウシＦ（ab′）2断片を除く〕を広く使う
ことができる。（免疫グロブリンと反応する試薬
としてはRFまたはClqを加える検定法が知られて
いる。このような検定においてはＦ（ab′）2断片を
単純に全免疫グロブリンの代りに使うことはでき
ない。）Ｆ（ab′）2断片は磁気吸引可能な水に不溶
性の物質に結合（この場合、吸引および共有結合
の両方を含む）した固相の状態で使う。物質の形
状は幅広く異なつていることができる。例えばシ
ート状または中空のチユーブ状または好ましくは
粒子状であることができる。またその性質は検定
する抗原と断片との反応の後に磁場によつて分離
できるものである。この型の検定は本発明者らの
特開昭52−141697号に記載されているので詳細に
はそれを参照されたい。
の間の特定な反応は起こすがRFまたはClqと免疫
グロブリンとの間の反応は要求されない免疫検定
法において、全免疫グロブリンの代りにＦ（ab′）2
断片〔だしウシＦ（ab′）2断片を除く〕を広く使う
ことができる。（免疫グロブリンと反応する試薬
としてはRFまたはClqを加える検定法が知られて
いる。このような検定においてはＦ（ab′）2断片を
単純に全免疫グロブリンの代りに使うことはでき
ない。）Ｆ（ab′）2断片は磁気吸引可能な水に不溶
性の物質に結合（この場合、吸引および共有結合
の両方を含む）した固相の状態で使う。物質の形
状は幅広く異なつていることができる。例えばシ
ート状または中空のチユーブ状または好ましくは
粒子状であることができる。またその性質は検定
する抗原と断片との反応の後に磁場によつて分離
できるものである。この型の検定は本発明者らの
特開昭52−141697号に記載されているので詳細に
はそれを参照されたい。
他の不溶性Ｆ（ab′）2断片の好ましい形はラテツ
クス懸濁体であり、この懸濁体は抗体のラテツク
ス凝集試験において、全免疫グロブリンの代りに
使うことができる。このような試験において、抗
原（例えば人間の血清）の試験をする流体の試料
をその抗原に対する抗体で覆われたラテツクス粒
子と混合する。本発明の方法によれば、被覆する
免疫グロブリン抗体全体の代りにＦ（ab′）2断片を
使う。被覆物と抗原との特定の結合はラテツクス
粒子の凝集を起こす。定性的結果のためには、凝
集の程度は視覚的に観察できる。また計数好まし
くは凝集したもののまたはさらに好ましくは未凝
集の粒子の自動的計数によつて定量することがで
きる。
クス懸濁体であり、この懸濁体は抗体のラテツク
ス凝集試験において、全免疫グロブリンの代りに
使うことができる。このような試験において、抗
原（例えば人間の血清）の試験をする流体の試料
をその抗原に対する抗体で覆われたラテツクス粒
子と混合する。本発明の方法によれば、被覆する
免疫グロブリン抗体全体の代りにＦ（ab′）2断片を
使う。被覆物と抗原との特定の結合はラテツクス
粒子の凝集を起こす。定性的結果のためには、凝
集の程度は視覚的に観察できる。また計数好まし
くは凝集したもののまたはさらに好ましくは未凝
集の粒子の自動的計数によつて定量することがで
きる。
他の見地では、本発明は流体中のAgの定量分
析の方法も含んでいる。ここで検定する流体の試
料をこれに結合するＦ（ab′）2断片をもつラテツク
ス粒子と混合して反応混合物をつくり、この抗原
とＦ（ab′）2断片との反応によつてラテツクスの凝
集を起こし、そこで凝集の程度（もしあれば）を
混合物の観察により決定し、流体試料中の抗原の
存在または量を決定する。
析の方法も含んでいる。ここで検定する流体の試
料をこれに結合するＦ（ab′）2断片をもつラテツク
ス粒子と混合して反応混合物をつくり、この抗原
とＦ（ab′）2断片との反応によつてラテツクスの凝
集を起こし、そこで凝集の程度（もしあれば）を
混合物の観察により決定し、流体試料中の抗原の
存在または量を決定する。
Ｆ（ab′）2断片を使つたラテツクス凝集試験にお
いては、凝集を抑制するので少しのジチオトレイ
トール（DTT）もあつてはいけない。DTTは過
酸化水素による酸化によつて不活性にすることが
できる。
いては、凝集を抑制するので少しのジチオトレイ
トール（DTT）もあつてはいけない。DTTは過
酸化水素による酸化によつて不活性にすることが
できる。
本発明による検定方法は、連続流動法（当事者
には知られている）によるのが適切であり、、反
応混合物の個々の部分は導管に沿つて通過し、不
活性部分（例えば空気）によつて分離され、所望
によつては洗浄液体部分によつて分離される。こ
れは、米国特許番号第2797149号明細書に記載さ
れているので詳細にはそれを参照されたい。
には知られている）によるのが適切であり、、反
応混合物の個々の部分は導管に沿つて通過し、不
活性部分（例えば空気）によつて分離され、所望
によつては洗浄液体部分によつて分離される。こ
れは、米国特許番号第2797149号明細書に記載さ
れているので詳細にはそれを参照されたい。
不活性化されたＦ（ab′）2断片は色々な方法で調
製できる。例えば適切な基質上に断片を吸収させ
る。または、免疫グロブリン（例えばIgG）全体
を基質上に共有結合させ、そしてＦ（ab′）2断片を
基質上に共有結合で残しておいてＦ(c)断片を分裂
してしまう。こうして吸収性の被覆をもつラテツ
クスとＦ（ab′）2断片とを緩衝液中で混合するか、
またはラテツクスに免疫グロブリン抗体全体を結
合しＦ（ab′）2断片はラテツクスに結合させたまま
Ｆ(c)断片を分裂して離しこれを混合物中から除去
する方法によつてＦ（ab′）2で被覆したラテツクス
を調製できる。この方法の１つの例においては、
本発明者らの特開昭52−119293号明細書に記載さ
れた方法によつて免疫グロブリンをラテツクスに
結合する。さらに詳細には前記明細書を参照のこ
と。簡単には、ラテツクスに強く固着しタンパク
分解に対してかなり抵抗力のあるタンパク質でま
ずラテツクスを被覆する。このようなタンパク質
は例えばラクトフエリンである。そして免疫グロ
ブリン抗体を結合試薬として例えばＮ−ε−クロ
ルアセチルリジン（NCA）のLeuchs無水物を使
つてラクトフエリンに共有結合させる。ラテツク
ス−ラクトフエリン−NCA−抗体を例えば次に
示す条件下で消化する。PH3.2の0.2M酢酸緩衝
液、ペプシン／免疫グロブリン比＝1/10、0.5％
ラテツクス懸濁液、37℃で60分のインキユベー
ト。このようにして免疫グロブリンのＦ（ab′）2断
片を担持するラテツクス粒子が得られる。
製できる。例えば適切な基質上に断片を吸収させ
る。または、免疫グロブリン（例えばIgG）全体
を基質上に共有結合させ、そしてＦ（ab′）2断片を
基質上に共有結合で残しておいてＦ(c)断片を分裂
してしまう。こうして吸収性の被覆をもつラテツ
クスとＦ（ab′）2断片とを緩衝液中で混合するか、
またはラテツクスに免疫グロブリン抗体全体を結
合しＦ（ab′）2断片はラテツクスに結合させたまま
Ｆ(c)断片を分裂して離しこれを混合物中から除去
する方法によつてＦ（ab′）2で被覆したラテツクス
を調製できる。この方法の１つの例においては、
本発明者らの特開昭52−119293号明細書に記載さ
れた方法によつて免疫グロブリンをラテツクスに
結合する。さらに詳細には前記明細書を参照のこ
と。簡単には、ラテツクスに強く固着しタンパク
分解に対してかなり抵抗力のあるタンパク質でま
ずラテツクスを被覆する。このようなタンパク質
は例えばラクトフエリンである。そして免疫グロ
ブリン抗体を結合試薬として例えばＮ−ε−クロ
ルアセチルリジン（NCA）のLeuchs無水物を使
つてラクトフエリンに共有結合させる。ラテツク
ス−ラクトフエリン−NCA−抗体を例えば次に
示す条件下で消化する。PH3.2の0.2M酢酸緩衝
液、ペプシン／免疫グロブリン比＝1/10、0.5％
ラテツクス懸濁液、37℃で60分のインキユベー
ト。このようにして免疫グロブリンのＦ（ab′）2断
片を担持するラテツクス粒子が得られる。
この方法および吸収法によつて得られたラテツ
クス粒子または他のＦ（ab′）2担持基質はRFに富
む血清中で起こるようにはRFによつて凝集する
ことはない。このラテツクス粒子はAgのラテツ
クス凝集試験においてRFまたはClqが存在してい
ても良好に使用できる。
クス粒子または他のＦ（ab′）2担持基質はRFに富
む血清中で起こるようにはRFによつて凝集する
ことはない。このラテツクス粒子はAgのラテツ
クス凝集試験においてRFまたはClqが存在してい
ても良好に使用できる。
本発明はまた、免疫グロブリン全体およびその
Ｆ(c)断片を実質的に含まず、免疫グロブリンのＦ
（ab′）2断片の結合した粒子状物質が微細に分散し
ている懸濁液から成る免疫検定に使う試薬を提供
する。このような試薬においては、Ｆ（ab′）2断片
は例えば共有結合または吸収によつて粒子上に結
合している。その粒子は磁気的に引き付けられる
物質から成り、断片は同定標識をもつている。粒
子は都合のよい大きさでよいが通常約１〜20μで
ある。特に連続液法において使用する場合は（こ
れに限らないが）、反応混合物中の粒子の不適当
な浮遊または沈殿を避けるために、粒子の比重は
約1.4〜3.2であるのがよい。
Ｆ(c)断片を実質的に含まず、免疫グロブリンのＦ
（ab′）2断片の結合した粒子状物質が微細に分散し
ている懸濁液から成る免疫検定に使う試薬を提供
する。このような試薬においては、Ｆ（ab′）2断片
は例えば共有結合または吸収によつて粒子上に結
合している。その粒子は磁気的に引き付けられる
物質から成り、断片は同定標識をもつている。粒
子は都合のよい大きさでよいが通常約１〜20μで
ある。特に連続液法において使用する場合は（こ
れに限らないが）、反応混合物中の粒子の不適当
な浮遊または沈殿を避けるために、粒子の比重は
約1.4〜3.2であるのがよい。
本件発明においては、Ｆ（ab′）2断片を結合させ
る水に不溶性の物質を磁気吸引可能な物質に限定
し、反応後の分離手段を磁気的分離手段に限定し
ている。すなわち、該水不溶性物質たとえばラテ
ツクス粒子の凝集反応の利用については除外して
いる。その理由は、凝集反応の利用については、
本件分割出願の原出願に係る特許第1583024号の
発明として既に特許を受けているので、重複を避
けるためである。RFやClqの影響がなく抗原を正
確に検定できるという顕著な効果は、Ｆ（ab′）2断
片を結合させた水不溶性物質の凝集反応の利用に
よつても得られるが、全く同様な効果が、Ｆ
（ab′）2断片を磁気吸引可能な水不溶性物質に結合
させ、反応後に磁気的に分離するという、非凝集
反応の利用によつても得られることは、前記した
とおりである。
る水に不溶性の物質を磁気吸引可能な物質に限定
し、反応後の分離手段を磁気的分離手段に限定し
ている。すなわち、該水不溶性物質たとえばラテ
ツクス粒子の凝集反応の利用については除外して
いる。その理由は、凝集反応の利用については、
本件分割出願の原出願に係る特許第1583024号の
発明として既に特許を受けているので、重複を避
けるためである。RFやClqの影響がなく抗原を正
確に検定できるという顕著な効果は、Ｆ（ab′）2断
片を結合させた水不溶性物質の凝集反応の利用に
よつても得られるが、全く同様な効果が、Ｆ
（ab′）2断片を磁気吸引可能な水不溶性物質に結合
させ、反応後に磁気的に分離するという、非凝集
反応の利用によつても得られることは、前記した
とおりである。
本発明のよりよい理解のために、次に説明とし
て実施例を挙げる。
て実施例を挙げる。
例 １
吸収によるＦ（ab′）2ラテツクス粒子の調製ラテ
ツクス粒子（Dow、直径0.794ミクロン、S.
D.0.44ミクロン、No.41943、セルバフアインバイ
オケミカ社、Ｄ−6900ハイデルベルグ１、ドイ
ツ）の10％懸濁液をPH9.1の0.02Mグリシン／
0.035MNaCl緩衝液で20倍に希釈し、この緩衝液
で１度洗浄する。１ml当り２〜３mgのＦ（ab′）2溶
液を前記のように調製された懸濁液の1/10体積加
え、室温で10〜15分間インキユベートした後、前
記緩衝液中の人間の血清アルブミン（HSA）の
10％溶液1/10体積を加えタンパク質の飽和を確か
める。さらに20〜30分間インキユベートした後、
最初の緩衝液で２度洗浄し、次にHSAを１％含
む0.10Mグリシン／0.17MNaCl緩衝液PH9.1の最
切の体積量中に再び懸濁し、0.5％つまり初濃度
に比べ20倍に希釈されているラテツクス懸濁液を
つくる。
ツクス粒子（Dow、直径0.794ミクロン、S.
D.0.44ミクロン、No.41943、セルバフアインバイ
オケミカ社、Ｄ−6900ハイデルベルグ１、ドイ
ツ）の10％懸濁液をPH9.1の0.02Mグリシン／
0.035MNaCl緩衝液で20倍に希釈し、この緩衝液
で１度洗浄する。１ml当り２〜３mgのＦ（ab′）2溶
液を前記のように調製された懸濁液の1/10体積加
え、室温で10〜15分間インキユベートした後、前
記緩衝液中の人間の血清アルブミン（HSA）の
10％溶液1/10体積を加えタンパク質の飽和を確か
める。さらに20〜30分間インキユベートした後、
最初の緩衝液で２度洗浄し、次にHSAを１％含
む0.10Mグリシン／0.17MNaCl緩衝液PH9.1の最
切の体積量中に再び懸濁し、0.5％つまり初濃度
に比べ20倍に希釈されているラテツクス懸濁液を
つくる。
抗血清
IgEの抗血清をフロイドの完全補助薬を使つて
ラビツト中で生じさせ、１当り“Tween20”
を３滴含むグリシン緩衝液で10倍に希釈し、使用
前に0.22ミクロンミリポー（GWSP06700）フイ
ルターを通してろ過する。
ラビツト中で生じさせ、１当り“Tween20”
を３滴含むグリシン緩衝液で10倍に希釈し、使用
前に0.22ミクロンミリポー（GWSP06700）フイ
ルターを通してろ過する。
自動的に操作される検定
患者の血清を１秒間に0.1mlの割合で、ぜん動
ポンプ、多岐管、粒子計数器および記録計から成
る連続流動系に吸引する。血清をグリシンで緩衝
されたラテツクス粒子1.0mlと混合し、インキユ
ベートコイルを10分間通過する。この溶液を次に
セル計数器に流し、ここで末凝集の粒子を数え、
凝集した粒子は電気的にふるい落される。血清中
のIgE濃度の減少は特にIgEの６〜100IU（国際単
位）の範囲では直接比例する。13人の患者の試料
は、中間範囲で２％の係数偏差をくり返し示し、
放射性免疫検定試験との比較の相関係数は0.95を
示した。
ポンプ、多岐管、粒子計数器および記録計から成
る連続流動系に吸引する。血清をグリシンで緩衝
されたラテツクス粒子1.0mlと混合し、インキユ
ベートコイルを10分間通過する。この溶液を次に
セル計数器に流し、ここで末凝集の粒子を数え、
凝集した粒子は電気的にふるい落される。血清中
のIgE濃度の減少は特にIgEの６〜100IU（国際単
位）の範囲では直接比例する。13人の患者の試料
は、中間範囲で２％の係数偏差をくり返し示し、
放射性免疫検定試験との比較の相関係数は0.95を
示した。
例 ２
ラテツクスに共有結合しているＦ（ab′）2の調製
ジオキサン100μ中に溶解したＮ−ε−クロ
ルアセチルリジン−Ｎ−カルボキシル無水物
（NCA）12mgをPH7.2のリン酸緩衝された塩類
（PBS）１ml中の鉄飽和ラクトフエリン50mgに加
える。暗所で４℃で24時間インキユベートした
後、生成物は保存のための凍結乾燥する。ポリス
チレンラテツクス粒子（直径0.8μ、10％懸濁液）
を、NCA−ラクトフエリン500μｇとPBS0.4mlと
10％ラテツクス50μとを混合することによつて
被覆する。室温で45分間インキユベートした後、
PH9.6の0.2M炭酸緩衝液１mlで２度洗浄する。ア
ルカリ性のPHにおけるクロルアセチル基の加水分
解を避けるために、ただちに環元したIgGAbを
加える。IgGはラビツトの抗馬脾臓フエリチンか
らリン酸アンモニウム沈殿、続いてDEAE−セル
ロースクロマトグラフイーにより得られる。PH
8.5の0.1Mリン酸塩溶液中の最終濃度が８mg／ml
であるIgGを、ジチオトレイトール（DTT）
1.1mMにより37℃１時間で還元する。新しく調
製したNCA−ラクトフエリン−ラテツクスの0.5
％懸濁液１mlと還元したIgGAb溶液の種々の容
量（15μ〜125μ）との混合物を数秒間窒素気
泡を通すことによつて脱酸素化し、真空下で管を
密閉する。暗所に室温で24時間置いた後、BSA1
％とTween−200.1％とを含むPH9.6の0.4M炭酸塩
緩衝液でラテツクスを２度洗浄し、GBS−BSA
中に再び懸濁する。非共有結合IgGはTween−20
によつて除去される。タンパク質界面に結合した
Ab（IgG）を消化するために、粒子をPH3.2の
0.1M酢酸塩緩衝液に懸濁し、酵素／基質比／1/1
０（ｗ／ｗ）の割合のペプシンで37℃１時間イン
キユベートする。粒子を遠心分離した後、
NaCl0.17M（GBS）および牛血清アルブミン
（BSA）（GBS−BSA）含有のPH9.2の0.1Mグリ
シン−HCl緩衝液で粒子を２度洗浄し、リウマト
イド血清による凝集の測定によつて粒子浄のもの
ままのIgGの存在を検査する。リウマトイド血清
に反応したラテツクス調製物は凝集がさらに観察
されなくなるまで再びペプシンで消化する。前記
試薬を使つて血清中のフエリチンのラテツクス凝
集試験を前記例１のように行うと、充分満足な結
果であつた。
ルアセチルリジン−Ｎ−カルボキシル無水物
（NCA）12mgをPH7.2のリン酸緩衝された塩類
（PBS）１ml中の鉄飽和ラクトフエリン50mgに加
える。暗所で４℃で24時間インキユベートした
後、生成物は保存のための凍結乾燥する。ポリス
チレンラテツクス粒子（直径0.8μ、10％懸濁液）
を、NCA−ラクトフエリン500μｇとPBS0.4mlと
10％ラテツクス50μとを混合することによつて
被覆する。室温で45分間インキユベートした後、
PH9.6の0.2M炭酸緩衝液１mlで２度洗浄する。ア
ルカリ性のPHにおけるクロルアセチル基の加水分
解を避けるために、ただちに環元したIgGAbを
加える。IgGはラビツトの抗馬脾臓フエリチンか
らリン酸アンモニウム沈殿、続いてDEAE−セル
ロースクロマトグラフイーにより得られる。PH
8.5の0.1Mリン酸塩溶液中の最終濃度が８mg／ml
であるIgGを、ジチオトレイトール（DTT）
1.1mMにより37℃１時間で還元する。新しく調
製したNCA−ラクトフエリン−ラテツクスの0.5
％懸濁液１mlと還元したIgGAb溶液の種々の容
量（15μ〜125μ）との混合物を数秒間窒素気
泡を通すことによつて脱酸素化し、真空下で管を
密閉する。暗所に室温で24時間置いた後、BSA1
％とTween−200.1％とを含むPH9.6の0.4M炭酸塩
緩衝液でラテツクスを２度洗浄し、GBS−BSA
中に再び懸濁する。非共有結合IgGはTween−20
によつて除去される。タンパク質界面に結合した
Ab（IgG）を消化するために、粒子をPH3.2の
0.1M酢酸塩緩衝液に懸濁し、酵素／基質比／1/1
０（ｗ／ｗ）の割合のペプシンで37℃１時間イン
キユベートする。粒子を遠心分離した後、
NaCl0.17M（GBS）および牛血清アルブミン
（BSA）（GBS−BSA）含有のPH9.2の0.1Mグリ
シン−HCl緩衝液で粒子を２度洗浄し、リウマト
イド血清による凝集の測定によつて粒子浄のもの
ままのIgGの存在を検査する。リウマトイド血清
に反応したラテツクス調製物は凝集がさらに観察
されなくなるまで再びペプシンで消化する。前記
試薬を使つて血清中のフエリチンのラテツクス凝
集試験を前記例１のように行うと、充分満足な結
果であつた。
以上の実施例はＦ（ab′）2断片をラテツクス懸濁
体に結合した形で使用するものであるが、ラテツ
クス懸濁体に代えて磁気的分離手段を用いても同
様な結果が得られる。
体に結合した形で使用するものであるが、ラテツ
クス懸濁体に代えて磁気的分離手段を用いても同
様な結果が得られる。
この場合、上記したように磁気的に吸引可能な
水に不溶性の粒子状物質上に結合したＦ（ab′）2断
片から成る固相を流体試料と混合する。この固
相／液相混合物を次にインキユベートしＦ（ab′）2
断片と試料中に存在する抗原とを反応させる。そ
して試料中の抗原の存在または量を従来公知の多
くの磁気的分離手段のひとつにより測定する。こ
れら公知手段はたとえば米国特許番号第4141687
号および第3933997号の各明細書ならびに
〓Biotechnol.Bioeng.，15，pp.603−606（1973）〓、
〓Clin.Chem.Acta.，63，pp.69−72（1975）〓およ
び〓Clin.Chem.Acta.，69，pp.387−396（1976）〓
に詳細に説明されている。
水に不溶性の粒子状物質上に結合したＦ（ab′）2断
片から成る固相を流体試料と混合する。この固
相／液相混合物を次にインキユベートしＦ（ab′）2
断片と試料中に存在する抗原とを反応させる。そ
して試料中の抗原の存在または量を従来公知の多
くの磁気的分離手段のひとつにより測定する。こ
れら公知手段はたとえば米国特許番号第4141687
号および第3933997号の各明細書ならびに
〓Biotechnol.Bioeng.，15，pp.603−606（1973）〓、
〓Clin.Chem.Acta.，63，pp.69−72（1975）〓およ
び〓Clin.Chem.Acta.，69，pp.387−396（1976）〓
に詳細に説明されている。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 内因性ClqまたはRFまたはこれら両方を溶解
して含む流体中の、前記ClqおよびRF以外の抗原
を検定する方法であつて、 (a) 液相を形成する前記流体の試料を、前記抗原
に対して特異的な免疫グロブリンのＦ（ab′）2断
片であるがウシＦ（ab′）2断片ではないＦ（ab′）2
断片と結合させた磁気吸引可能な不溶性の物質
から成る固相と混合して反応混合物を形成し、
ここで内因性ClqおよびRFからの干渉を避ける
ため、反応混合物は免疫グロブリン全体および
そのＦ(c)断片を実質的に含んでいないものと
し、 (b) 前記Ｆ（ab′）2断片とそこに存在する抗原とが
反応するように、反応混合物をインキユベート
し、 (c) 前記反応に続いて液相と固相とを磁気的に分
離し、そして (d) 反応混合物中に起きた前記反応の程度を測定
し、それによつて試料中の抗原の存在または量
を検定する、 各工程から成る、検定方法。 ２ 検定する試料が人間の血清である前項１に記
載の方法。 ３ 連続流動法によつて行う前項１または２に記
載の方法。 ４ 不連続手動法によつて行う前項１または２に
記載の方法。 ５ 免疫グロブリンのＦ（ab′）2断片であつてウシ
Ｆ（ab′）2断片ではないＦ（ab′）2断片と結合させた
磁気吸引可能な水に不溶性の物質を微細に分散し
た懸濁液から成り、免疫グロブリン全体およびそ
のＦ(c)断片は実質的に含まない、非凝集反応によ
る免疫検定に使用するための試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB3237/78 | 1978-01-26 | ||
| GB323778 | 1978-01-26 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP730379A Division JPS54119292A (en) | 1978-01-26 | 1979-01-26 | Immunity examination by f*ab**2 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02276968A JPH02276968A (ja) | 1990-11-13 |
| JPH0521186B2 true JPH0521186B2 (ja) | 1993-03-23 |
Family
ID=9754542
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP730379A Granted JPS54119292A (en) | 1978-01-26 | 1979-01-26 | Immunity examination by f*ab**2 |
| JP1280006A Granted JPH02276968A (ja) | 1978-01-26 | 1989-10-30 | Ｆ（ａｂ′）↓２断片を使う免疫検定 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP730379A Granted JPS54119292A (en) | 1978-01-26 | 1979-01-26 | Immunity examination by f*ab**2 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4397960A (ja) |
| JP (2) | JPS54119292A (ja) |
| AU (1) | AU524656B2 (ja) |
| BE (1) | BE873673A (ja) |
| CA (1) | CA1118345A (ja) |
| CH (1) | CH639208A5 (ja) |
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