JP3363166B2 - 相互に対する極めて高い特異的親和性を有するペプチド対をイン・ビトロ診断分野に使用する方法 - Google Patents
相互に対する極めて高い特異的親和性を有するペプチド対をイン・ビトロ診断分野に使用する方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は他のペプチド（ヘテロダ
イマー形成）に対する極めて高い親和性と自身（ホモダ
イマー形成）に対する低い親和性を有するある種のペプ
チドをイン・ビトロ（試験管内）診断の分野に用いるこ
とに関する。
イマー形成）に対する極めて高い親和性と自身（ホモダ
イマー形成）に対する低い親和性を有するある種のペプ
チドをイン・ビトロ（試験管内）診断の分野に用いるこ
とに関する。
【０００２】
【従来の技術】二つの（生体）分子が極めて相互作用し
やすいために相互に対して高い結合親和性を示すことが
できる例は多く知られている。ここで言及できる一例は
抗体・抗原間の特異的で方向性のある相互作用であり、
それに基づいて免疫学的方法が行われまたその実用化に
よりイン・ビトロ診断が極めて豊かなものとなってい
る。かかる特異結合パートナー（例えばモノクローナル
抗体、レクチン、レセプターなど）の使用により、診断
に関連する高度に特異的な抗原を認識することが可能と
なった。特異性の問題のほかに、感度の問題も診断の為
のバイオコンプレックス検出にとって同程度に重要であ
る。
やすいために相互に対して高い結合親和性を示すことが
できる例は多く知られている。ここで言及できる一例は
抗体・抗原間の特異的で方向性のある相互作用であり、
それに基づいて免疫学的方法が行われまたその実用化に
よりイン・ビトロ診断が極めて豊かなものとなってい
る。かかる特異結合パートナー（例えばモノクローナル
抗体、レクチン、レセプターなど）の使用により、診断
に関連する高度に特異的な抗原を認識することが可能と
なった。特異性の問題のほかに、感度の問題も診断の為
のバイオコンプレックス検出にとって同程度に重要であ
る。
【０００３】様々な理由から、例えば共有結合的にまた
は吸着により固相に被分析物質（analyte)の特異結合パ
ートナーを結合させる診断方法においては、この特異結
合パートナーを直接にではなく該被分析物質とは反応し
ない別の特異結合対を介して前記固相（以下“ユニバー
サル固相”と記す）に結合させることが便利であること
がわかっている。
は吸着により固相に被分析物質（analyte)の特異結合パ
ートナーを結合させる診断方法においては、この特異結
合パートナーを直接にではなく該被分析物質とは反応し
ない別の特異結合対を介して前記固相（以下“ユニバー
サル固相”と記す）に結合させることが便利であること
がわかっている。
【０００４】さらに、特異生体分子の使用がそれらの安
定性および有効性（potency）によって制限される方法
においては、ある種の試薬例えば酵素接合体の場合であ
ってさえも、相当する間接的方法を用いた方がよいこと
があること、すなわち、その特異結合パートナーを信号
発出成分に、被分析物質または第一特異結合パートナー
とは反応しない別の特異結合対を介して結合することが
便利であることもわかっている。
定性および有効性（potency）によって制限される方法
においては、ある種の試薬例えば酵素接合体の場合であ
ってさえも、相当する間接的方法を用いた方がよいこと
があること、すなわち、その特異結合パートナーを信号
発出成分に、被分析物質または第一特異結合パートナー
とは反応しない別の特異結合対を介して結合することが
便利であることもわかっている。
【０００５】これによって、例えば各種被分析物質に対
する“ユニバーサル接合体”を用いることができる。
する“ユニバーサル接合体”を用いることができる。
【０００６】“ユニバーサル固相”を得るには、例えば
マウス・免疫グロブリン特異試薬例えば抗−マウス抗体
または抗体特異試薬例えばプロテインＡが用いられそし
て常法により固相に適用される（Practice and Theory
of Enzyme Immunoassays, P.Tijssen, Elsevier, １９
８８）。このアイデアの魅力は基本的に、特に、このよ
うにして調製された固相が各特異マウス抗体を免疫反応
故に方向性をもって再現性よく結合できることにある。
このようにして調製された固相は原則として古典的静止
固相（“既製試薬（ready-to-use reagent）”）とし
て、あるいは免疫反応の際の均一相に用いることができ
る。
マウス・免疫グロブリン特異試薬例えば抗−マウス抗体
または抗体特異試薬例えばプロテインＡが用いられそし
て常法により固相に適用される（Practice and Theory
of Enzyme Immunoassays, P.Tijssen, Elsevier, １９
８８）。このアイデアの魅力は基本的に、特に、このよ
うにして調製された固相が各特異マウス抗体を免疫反応
故に方向性をもって再現性よく結合できることにある。
このようにして調製された固相は原則として古典的静止
固相（“既製試薬（ready-to-use reagent）”）とし
て、あるいは免疫反応の際の均一相に用いることができ
る。
【０００７】免疫化学検出法および特異的不均一免疫化
学検出法それ自体は当業者に知られている。ここで述べ
得る既知の“ユニバーサル固相”の欠点は専ら抗体コー
ティングに限られるほか一部のアッセイ・セットアップ
に限られる（完全モノクローナルＥＬＩＳＡ方式、抗原
固相には用い得ない）ことである。
学検出法それ自体は当業者に知られている。ここで述べ
得る既知の“ユニバーサル固相”の欠点は専ら抗体コー
ティングに限られるほか一部のアッセイ・セットアップ
に限られる（完全モノクローナルＥＬＩＳＡ方式、抗原
固相には用い得ない）ことである。
【０００８】さらに、認め得るＨＡＭＡ力価（ＨＡＭＡ
＝ヒト抗−マウス抗体）を有する検体が、モノクローナ
ル抗体をヒトにイン・ビボ（生体内）投与後に、かかる
アッセイ・デザイン、特に均一相で行われるものに対し
て極めて鋭敏に干渉することがある、従って誤った診断
が下されることがあることも知られている。
＝ヒト抗−マウス抗体）を有する検体が、モノクローナ
ル抗体をヒトにイン・ビボ（生体内）投与後に、かかる
アッセイ・デザイン、特に均一相で行われるものに対し
て極めて鋭敏に干渉することがある、従って誤った診断
が下されることがあることも知られている。
【０００９】前述のアイデアを実用化するためのもう一
つの系はビオチン／アビジンを用いたものである（例え
ば米国特許第４,２２８,２３７号）。高い生成結合力を
認め得る点でそれが特別な位置を占めることは明らかで
ある。この系の広範囲にわたる用途が総括論文に記載さ
れている（Methods in Enzymology, Vol. 184（1990）,
Avidin-Biotin Technology, Ed. Meir Wilchek；E.A.
Bayer）。
つの系はビオチン／アビジンを用いたものである（例え
ば米国特許第４,２２８,２３７号）。高い生成結合力を
認め得る点でそれが特別な位置を占めることは明らかで
ある。この系の広範囲にわたる用途が総括論文に記載さ
れている（Methods in Enzymology, Vol. 184（1990）,
Avidin-Biotin Technology, Ed. Meir Wilchek；E.A.
Bayer）。
【００１０】しかしながら、このアビジン分子には、イ
ン・ビトロ診断における系のこの成分の性質から来る欠
点がある。すなわち、糖タンパク質アビジンは異常なほ
ど高い等電点（pI）を有し、ために中性pH、すなわち生
理学的条件のもとでは、強い陽荷電を有する分子として
陰性に荷電した分子例えば核酸、リン脂質などと、また
荷電した表面とも強い非特異的な相互作用を示す。さら
に、糖タンパク質の微不均一性故に規定されたそして厳
密に再現性ある生成物を得ることができないことも知ら
れている。さらにその分子の炭水化物部分は他の生物学
的分子（例えば“内生レクチン”）との望ましくない副
作用のもととなり、これによって著しく感度が低下する
可能性がある。既述の引用文献には内生レクチンに対す
るアビジンの望ましくない結合についての注釈が含まれ
ている。
ン・ビトロ診断における系のこの成分の性質から来る欠
点がある。すなわち、糖タンパク質アビジンは異常なほ
ど高い等電点（pI）を有し、ために中性pH、すなわち生
理学的条件のもとでは、強い陽荷電を有する分子として
陰性に荷電した分子例えば核酸、リン脂質などと、また
荷電した表面とも強い非特異的な相互作用を示す。さら
に、糖タンパク質の微不均一性故に規定されたそして厳
密に再現性ある生成物を得ることができないことも知ら
れている。さらにその分子の炭水化物部分は他の生物学
的分子（例えば“内生レクチン”）との望ましくない副
作用のもととなり、これによって著しく感度が低下する
可能性がある。既述の引用文献には内生レクチンに対す
るアビジンの望ましくない結合についての注釈が含まれ
ている。
【００１１】これらの欠点はストレプトミセス・アビジ
ニ（Streptomyces avidinii）なる細菌からのアナロー
グであるストレプトアビジンを用いることによって大方
避けることができる。後者はほぼ同レベルの対ビオチン
親和性を有する。それは中性点近くにpIを有し、さらに
分子内に炭水化物を全くもたない。にもかかわらず、ス
トレプトアビジン／ビオチン系についても基本的問題が
あり、鋭敏な干渉を生じ、またイン・ビトロ診断に用い
た場合には多分に信頼できない結果を生じることがあ
る。ビタミンであるビオチンがすべての生細胞によって
要求され、ためにすべての組織および体液中に偏在する
ことは知られている。すなわち、例えばヒト血清中のビ
オチン濃度は約１０ng／mlである。この結果、すべての
診断応用において、個人の生理学的状態および個人の食
癖（例えば多ビタミン製品の摂取）に応じて様々な程度
にビオチン含量が変動し得る検体材料と試薬との間に競
合が生じる。
ニ（Streptomyces avidinii）なる細菌からのアナロー
グであるストレプトアビジンを用いることによって大方
避けることができる。後者はほぼ同レベルの対ビオチン
親和性を有する。それは中性点近くにpIを有し、さらに
分子内に炭水化物を全くもたない。にもかかわらず、ス
トレプトアビジン／ビオチン系についても基本的問題が
あり、鋭敏な干渉を生じ、またイン・ビトロ診断に用い
た場合には多分に信頼できない結果を生じることがあ
る。ビタミンであるビオチンがすべての生細胞によって
要求され、ためにすべての組織および体液中に偏在する
ことは知られている。すなわち、例えばヒト血清中のビ
オチン濃度は約１０ng／mlである。この結果、すべての
診断応用において、個人の生理学的状態および個人の食
癖（例えば多ビタミン製品の摂取）に応じて様々な程度
にビオチン含量が変動し得る検体材料と試薬との間に競
合が生じる。
【００１２】ストレプトアビジン／ビオチン系のイン・
ビボ使用にはもう一つの重大な潜在的干渉が伴う（G. P
aganelli et al., Radiolocalisation of tumour preta
rgeted by biotinylated monoclonal antibody；Advanc
es in the applications ofmonoclonal antibodies in
clinicaloncology；abstracts）。このための手順は、
ビオチニル化抗体を投与後、約３〜５日後にインジウム
標識ストレプトアビジンを投与するというものである。
アビジンおよびストレプトアビジンはいずれも高免疫原
性物質であって、ために投与後ヒトにおいて応答を招く
ことは知られている。このコンテキストではいわゆるＨ
ＡＳＡ、すなわちヒト抗−ストレプトアビジン抗体、が
挙げられ、それによって血清診断におけるアッセイ・デ
ザイン上深刻な問題を招くことがある。
ビボ使用にはもう一つの重大な潜在的干渉が伴う（G. P
aganelli et al., Radiolocalisation of tumour preta
rgeted by biotinylated monoclonal antibody；Advanc
es in the applications ofmonoclonal antibodies in
clinicaloncology；abstracts）。このための手順は、
ビオチニル化抗体を投与後、約３〜５日後にインジウム
標識ストレプトアビジンを投与するというものである。
アビジンおよびストレプトアビジンはいずれも高免疫原
性物質であって、ために投与後ヒトにおいて応答を招く
ことは知られている。このコンテキストではいわゆるＨ
ＡＳＡ、すなわちヒト抗−ストレプトアビジン抗体、が
挙げられ、それによって血清診断におけるアッセイ・デ
ザイン上深刻な問題を招くことがある。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、前述
の諸欠点をもたないイン・ビトロ診断用高親和性系を提
供することにある。さらに、個々の成分を確立された手
順でもって容易に、再現性よくかつ汚染されることなく
得ることも意図されている。
の諸欠点をもたないイン・ビトロ診断用高親和性系を提
供することにある。さらに、個々の成分を確立された手
順でもって容易に、再現性よくかつ汚染されることなく
得ることも意図されている。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明方法は、ＤＮＡに
結合できまたそうすることによって転写を変調できるあ
る種のタンパク質のペプチド切片の極めて強力な相互作
用に基づいている。例えば、fos遺伝子生成物のjun遺伝
子生成物への結合が起きると極めて強固なヘテロダイマ
ーが形成されることがわかった。さらにこの結合は高濃
度のカオトロピック物質（例えば尿素）、洗剤および塩
に対して、また低いpH値および極めて高いpH値に対して
抵抗性を示す。アミノ酸位２８５−３２４のいわゆるc-
Junプロテインのロイシン・ジッパーおよび１６２−２
０１位のv-Fosプロテインのロイシン・ジッパーより成
る合成ペプチドについて、同等のヘテロダイマー結合強
度が測定された。これらペプチドのアミノ酸配列は次の
とおりである： c-Jun“ロイシン・ジッパー・ペプチド”： RIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNY v-Fos“ロイシン・ジッパー・ペプチド”： LTDTLQAETDQLEDKKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAY
結合できまたそうすることによって転写を変調できるあ
る種のタンパク質のペプチド切片の極めて強力な相互作
用に基づいている。例えば、fos遺伝子生成物のjun遺伝
子生成物への結合が起きると極めて強固なヘテロダイマ
ーが形成されることがわかった。さらにこの結合は高濃
度のカオトロピック物質（例えば尿素）、洗剤および塩
に対して、また低いpH値および極めて高いpH値に対して
抵抗性を示す。アミノ酸位２８５−３２４のいわゆるc-
Junプロテインのロイシン・ジッパーおよび１６２−２
０１位のv-Fosプロテインのロイシン・ジッパーより成
る合成ペプチドについて、同等のヘテロダイマー結合強
度が測定された。これらペプチドのアミノ酸配列は次の
とおりである： c-Jun“ロイシン・ジッパー・ペプチド”： RIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNY v-Fos“ロイシン・ジッパー・ペプチド”： LTDTLQAETDQLEDKKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAY
【００１５】以下の文字コードを用いた：
Ａ＝アラニン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスパラギン酸、
Ｅ＝グルタミン酸、Ｇ＝グリシン、Ｉ＝イソロイシン、
Ｋ＝リジン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メオチニン、Ｎ＝アス
パラギン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリ
ン、Ｔ＝トレオニン、Ｖ＝バリン、Ｙ＝チロシン。
Ｅ＝グルタミン酸、Ｇ＝グリシン、Ｉ＝イソロイシン、
Ｋ＝リジン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メオチニン、Ｎ＝アス
パラギン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリ
ン、Ｔ＝トレオニン、Ｖ＝バリン、Ｙ＝チロシン。
【００１６】現在の知識水準によれば、７アミノ酸間隔
で規則的に配列されている（前式において下線を施して
ある）内部ロイシン残基は活性である。c-jun遺伝子生
成物とは対照的に、c-Jun“ロイシン・ジッパー・ペプ
チド”はホモダイマー化を全く示さない。v-Fos“ロイ
シン・ジッパー・ペプチド”は完全なv-fos遺伝子生成
物と同様、大きなホモダイマー化傾向を示さないが、
（前述の如く）c-Jun“ロイシン・ジッパー・ペプチ
ド”と極めて安定なヘテロダイマー複合体を形成する
（E.K. O'SHEA et al., Science 245, 646−648（198
9）およびM. NEUBERG et al., Nature 341, 243−245
（1989））。
で規則的に配列されている（前式において下線を施して
ある）内部ロイシン残基は活性である。c-jun遺伝子生
成物とは対照的に、c-Jun“ロイシン・ジッパー・ペプ
チド”はホモダイマー化を全く示さない。v-Fos“ロイ
シン・ジッパー・ペプチド”は完全なv-fos遺伝子生成
物と同様、大きなホモダイマー化傾向を示さないが、
（前述の如く）c-Jun“ロイシン・ジッパー・ペプチ
ド”と極めて安定なヘテロダイマー複合体を形成する
（E.K. O'SHEA et al., Science 245, 646−648（198
9）およびM. NEUBERG et al., Nature 341, 243−245
（1989））。
【００１７】本発明にいう“ロイシン・ジッパー・ペプ
チド”は前述の如くに配列したロイシン残基を含むペプ
チドであり、そして好ましいペプチドはc-Junおよびv-F
os配列を含む。c-Junおよびv-Fosは格別に好ましい。
チド”は前述の如くに配列したロイシン残基を含むペプ
チドであり、そして好ましいペプチドはc-Junおよびv-F
os配列を含む。c-Junおよびv-Fosは格別に好ましい。
【００１８】意外にも“ロイシン・ジッパー・ペプチ
ド”は本発明に従って固相試薬、トラップ試薬としてお
よび検出試薬として用いた場合にはいずれの場合にも、
複合体安定性が極めて高いことからこのタイプの従来試
薬（プロテインＡ、プロテインＧ、ポリクローナルまた
はモノクローナル抗体）よりも優れていることがわかっ
た。
ド”は本発明に従って固相試薬、トラップ試薬としてお
よび検出試薬として用いた場合にはいずれの場合にも、
複合体安定性が極めて高いことからこのタイプの従来試
薬（プロテインＡ、プロテインＧ、ポリクローナルまた
はモノクローナル抗体）よりも優れていることがわかっ
た。
【００１９】本発明は相互に対する極めて高い特異的親
和性を有するペプチド（“ロイシン・ジッパー・ペプチ
ド”）対をイン・ビトロ診断領域に用いることに関す
る。
和性を有するペプチド（“ロイシン・ジッパー・ペプチ
ド”）対をイン・ビトロ診断領域に用いることに関す
る。
【００２０】さらに、本発明は、固相に結合される特異
結合パートナーが“ロイシン・ジッパー”ペプチド対を
介して固相に結合される被分析物質の測定のための不均
一免疫化学的方法に関する。
結合パートナーが“ロイシン・ジッパー”ペプチド対を
介して固相に結合される被分析物質の測定のための不均
一免疫化学的方法に関する。
【００２１】さらに本発明は、“ロイシン・ジッパー”
ペプチド対の一方のペプチドが吸着によりまたは共有結
合的に、直接にまたはスペーサーを介して固相に結合さ
れる、被分析物質の測定のための不均一免疫化学的方法
に用いるためのユニバーサル固相に関する。
ペプチド対の一方のペプチドが吸着によりまたは共有結
合的に、直接にまたはスペーサーを介して固相に結合さ
れる、被分析物質の測定のための不均一免疫化学的方法
に用いるためのユニバーサル固相に関する。
【００２２】さらに本発明は、“ロイシン・ジッパー”
ペプチドの少なくとも一方のペプチドが検出のための特
異結合パートナーに結合され、そしてこの対の第二ペプ
チドが信号発出成分に結合される、免疫化学的方法に用
いるためのユニバーサル試薬に関する。
ペプチドの少なくとも一方のペプチドが検出のための特
異結合パートナーに結合され、そしてこの対の第二ペプ
チドが信号発出成分に結合される、免疫化学的方法に用
いるためのユニバーサル試薬に関する。
【００２３】さらに、本発明方法により、“ロイシン・
ジッパー”ペプチド対の第二ペプチドの１以上の分子を
検出のための特異結合パートナーに直接にまたは担体分
子または粒子を介して結合させることができ、またそう
することによって特異的に調整できる信号増加を得るこ
とができる。
ジッパー”ペプチド対の第二ペプチドの１以上の分子を
検出のための特異結合パートナーに直接にまたは担体分
子または粒子を介して結合させることができ、またそう
することによって特異的に調整できる信号増加を得るこ
とができる。
【００２４】本発明は従ってさらに、“ロイシン・ジッ
パー”ペプチド対の第二ペプチドの１以上の分子が特異
結合パートナーに直接にまたは担体分子を介して結合さ
れる、イムノアッセイ信号の増加方法に関する。
パー”ペプチド対の第二ペプチドの１以上の分子が特異
結合パートナーに直接にまたは担体分子を介して結合さ
れる、イムノアッセイ信号の増加方法に関する。
【００２５】FosおよびJun“ジッパー・ペプチド”およ
び対応する完全な遺伝子生成物はいずれもそれらの親水
性の故に水に易溶なので、いずれのペプチドまたは遺伝
子生成物も固相へのカップリングに使用できる。適当な
固相は当業者に知られている。使用できる固相の代表例
は例えばプラスチック例えばポリスチレンまたはポリア
ミド例えばナイロン、などで作られたチューブまたは成
形品、メンブレン様構造または磁化できる粒子例えば常
磁性粒子などである。さらに、各ペプチドを吸着により
または共有結合的に、直接にまたはスペーサー例えば別
のペプチドまたはタンパク質または比較的小さい分子、
を介して固相に結合させることができる。
び対応する完全な遺伝子生成物はいずれもそれらの親水
性の故に水に易溶なので、いずれのペプチドまたは遺伝
子生成物も固相へのカップリングに使用できる。適当な
固相は当業者に知られている。使用できる固相の代表例
は例えばプラスチック例えばポリスチレンまたはポリア
ミド例えばナイロン、などで作られたチューブまたは成
形品、メンブレン様構造または磁化できる粒子例えば常
磁性粒子などである。さらに、各ペプチドを吸着により
または共有結合的に、直接にまたはスペーサー例えば別
のペプチドまたはタンパク質または比較的小さい分子、
を介して固相に結合させることができる。
【００２６】対応する相補“ジッパー・ペプチド”は例
えば抗体または抗原に自体当業者に知られた方法により
結合させることができる。抗体はモノ−またはポリクロ
ーナル−であってよい。本発明にいう抗原とはハプテン
であってもよい。
えば抗体または抗原に自体当業者に知られた方法により
結合させることができる。抗体はモノ−またはポリクロ
ーナル−であってよい。本発明にいう抗原とはハプテン
であってもよい。
【００２７】本発明による他の使用例は、前記ペプチド
と他のリガンドおよび酵素、レセプター、サイトカイ
ン、リンホカイン、触媒抗体、ドメイン（domain）抗
体、コンプレクソン（complexon）および他の融合タン
パク質との共有結合的連結である。共有結合的連結は、
スルクヒドリルおよびアミノ基を介して、また適当なリ
ンカーにより炭水化物残基を介して行うことができる。
と他のリガンドおよび酵素、レセプター、サイトカイ
ン、リンホカイン、触媒抗体、ドメイン（domain）抗
体、コンプレクソン（complexon）および他の融合タン
パク質との共有結合的連結である。共有結合的連結は、
スルクヒドリルおよびアミノ基を介して、また適当なリ
ンカーにより炭水化物残基を介して行うことができる。
【００２８】これらの“ジッパー・ペプチド”のアミノ
酸配列は知られているので、現在の技術水準があれば、
またアミノ酸入手が容易であるのでバイオアベイラビリ
ティの問題は困難なものではない。技術水準として、短
時間のうちに規定された、再現性ある、そして特に汚染
されていないペプチドを与えることのできる自動ペプチ
ド合成装置がある。これによって、例えばその再現性が
被処理材料の品質に少なからず依存する時間のかかる単
離方法を使わずに済む。さらに本発明においては合成段
階にペプチドの所要の官能化を含ませることが重要であ
る。例えばロイシン・ジッパー配列の外でスルフヒドリ
ル基を介してFosジッパー・ペプチドを引き続きいずれ
かの所要の担体タンパク質に共有結合的に連結させるこ
とができるようにするために、例えば２個のグリシンを
介してFosジッパー・ペプチドのアミノ末端にシステイ
ンを合成により付加する。同様に適切な他の延長ペプチ
ドに任意の所望の数のアミノ酸およびいくつかのシステ
インを含ませるようにすることも可能であろう。このよ
うにして得られるシステインＳＨ基は次いで例えば誘導
体化および／またはモノクローナル抗体へのカップリン
グに用いることができる。
酸配列は知られているので、現在の技術水準があれば、
またアミノ酸入手が容易であるのでバイオアベイラビリ
ティの問題は困難なものではない。技術水準として、短
時間のうちに規定された、再現性ある、そして特に汚染
されていないペプチドを与えることのできる自動ペプチ
ド合成装置がある。これによって、例えばその再現性が
被処理材料の品質に少なからず依存する時間のかかる単
離方法を使わずに済む。さらに本発明においては合成段
階にペプチドの所要の官能化を含ませることが重要であ
る。例えばロイシン・ジッパー配列の外でスルフヒドリ
ル基を介してFosジッパー・ペプチドを引き続きいずれ
かの所要の担体タンパク質に共有結合的に連結させるこ
とができるようにするために、例えば２個のグリシンを
介してFosジッパー・ペプチドのアミノ末端にシステイ
ンを合成により付加する。同様に適切な他の延長ペプチ
ドに任意の所望の数のアミノ酸およびいくつかのシステ
インを含ませるようにすることも可能であろう。このよ
うにして得られるシステインＳＨ基は次いで例えば誘導
体化および／またはモノクローナル抗体へのカップリン
グに用いることができる。
【００２９】これは、例えばマレイミド基を自体知られ
た方法により、例えばＮ−（ガンマ−マレイミドブチリ
ルオキシ）スクシンイミドと反応させることにより抗体
中に導入し、そしてFosロイシン・ジッパー・ペプチド
を末端システインＳＨ基を介してマレイミド二重結合に
付加させるというようにして行うことができる。この場
合に、カップリングはＭＡｂのアミノ基のうちの一つを
介してFosペプチド中のシステインのＳＨ基に対して行
われる。
た方法により、例えばＮ−（ガンマ−マレイミドブチリ
ルオキシ）スクシンイミドと反応させることにより抗体
中に導入し、そしてFosロイシン・ジッパー・ペプチド
を末端システインＳＨ基を介してマレイミド二重結合に
付加させるというようにして行うことができる。この場
合に、カップリングはＭＡｂのアミノ基のうちの一つを
介してFosペプチド中のシステインのＳＨ基に対して行
われる。
【００３０】あるいはまた、その抗体のヒンジ領域（ジ
スルフィド橋）を介してFosまたはJunロイシン・ジッパ
ー・ペプチドを抗体に、連結することも可能であり、こ
れは例えば自体既知の方法で末端システインＳＨ基を介
してFosロイシン・ジッパー・ペプチドのビス−マレイ
ミドを一官能化し、次いで未だ変化していない導入済み
の第二のマレイミド基を介して例えばジチオトレイトー
ルで還元してある抗体のヒンジ部チオール基に付加する
ことによって行うことができる。この第二の方法には、
FosまたはJunロイシン・ジッパー・ペプチドの抗体への
連結が抗原結合部位の外で標的のしぼられた仕方で行わ
れるという長所がある。
スルフィド橋）を介してFosまたはJunロイシン・ジッパ
ー・ペプチドを抗体に、連結することも可能であり、こ
れは例えば自体既知の方法で末端システインＳＨ基を介
してFosロイシン・ジッパー・ペプチドのビス−マレイ
ミドを一官能化し、次いで未だ変化していない導入済み
の第二のマレイミド基を介して例えばジチオトレイトー
ルで還元してある抗体のヒンジ部チオール基に付加する
ことによって行うことができる。この第二の方法には、
FosまたはJunロイシン・ジッパー・ペプチドの抗体への
連結が抗原結合部位の外で標的のしぼられた仕方で行わ
れるという長所がある。
【００３１】図１〜４はJun−Fos相互作用のイン・ビト
ロ診断への広範囲にわたる有益な使用についての原理上
の諸可能性を例示として概略的に示したものである。既
述の技術との本質的な差は、Jun／Fos相互作用が二つの
低分子量物質の高親和性系より成る点である。比較的低
い分子量のためにフレキシビリティの度合が相当に高ま
り、従って注文にあった解決策が得られる。それらの空
間的要求が穏当であるので生体分子に対しペプチドをそ
れらの生物活性を失うことなく結合させることができ
る。大きな立体障害により制限される方法の制限はさほ
ど厳しいものではない。さらにまた、低分子量故に、合
成が簡単であって、“カプラー成分”として例えば理論
上１分子あたり４結合部位というストレプトアビジン化
学量論よりも優れているだけでなく自由に設計できる構
築物（construct）が可能となる。この直接の結果とし
て、診断系感度は増加しかつその増加はコントロール可
能である。
ロ診断への広範囲にわたる有益な使用についての原理上
の諸可能性を例示として概略的に示したものである。既
述の技術との本質的な差は、Jun／Fos相互作用が二つの
低分子量物質の高親和性系より成る点である。比較的低
い分子量のためにフレキシビリティの度合が相当に高ま
り、従って注文にあった解決策が得られる。それらの空
間的要求が穏当であるので生体分子に対しペプチドをそ
れらの生物活性を失うことなく結合させることができ
る。大きな立体障害により制限される方法の制限はさほ
ど厳しいものではない。さらにまた、低分子量故に、合
成が簡単であって、“カプラー成分”として例えば理論
上１分子あたり４結合部位というストレプトアビジン化
学量論よりも優れているだけでなく自由に設計できる構
築物（construct）が可能となる。この直接の結果とし
て、診断系感度は増加しかつその増加はコントロール可
能である。
【００３２】〔図の説明〕
図１：固相
これに関しては、ユニバーサル固相を提供するには以下
の手順が可能であり、またそれらは例えばポリスチレン
容器、磁性粒子、ラテックス粒子などの上で達成するこ
とができる：
の手順が可能であり、またそれらは例えばポリスチレン
容器、磁性粒子、ラテックス粒子などの上で達成するこ
とができる：
【００３３】ａ） 至適化されたコーティング法を用い
た吸着； ｂ） 官能化された固相への化学的連結による共有結
合； ｃ） ジッパー・ペプチドを容易に吸着され得る担体分
子に予め共有結合的に連結した後吸着； ｄ） ジッパー・ペプチドが化学的に結合される担体分
子に官能化された固相を連結させることによる共有結
合。
た吸着； ｂ） 官能化された固相への化学的連結による共有結
合； ｃ） ジッパー・ペプチドを容易に吸着され得る担体分
子に予め共有結合的に連結した後吸着； ｄ） ジッパー・ペプチドが化学的に結合される担体分
子に官能化された固相を連結させることによる共有結
合。
【００３４】特異固相は、特異結合パートナーで接合さ
れた相補ペプチドとの二次的反応におけるペプチドヘテ
ロダイマー形成を用いて調製される。
れた相補ペプチドとの二次的反応におけるペプチドヘテ
ロダイマー形成を用いて調製される。
【００３５】図２：接合体
既知の方法により、ジッパー・ペプチドを所要の取込み
率をもって特異結合パートナーに接合させる。信号発出
は、第一のペプチドに相補的であっていずれかの望まし
い信号発出成分（例えば酵素、蛍光原、発光原、放射性
核種など）が連結されるペプチドとの二次的反応の後に
起きる。
率をもって特異結合パートナーに接合させる。信号発出
は、第一のペプチドに相補的であっていずれかの望まし
い信号発出成分（例えば酵素、蛍光原、発光原、放射性
核種など）が連結されるペプチドとの二次的反応の後に
起きる。
【００３６】図３：増幅系
いずれかの所望の信号の増幅はジッパー・ペプチドを用
いて以下の方法により達成することができる：
いて以下の方法により達成することができる：
【００３７】ａ） 抗原を認識する第一特異結合パート
ナーに対する第二特異結合パートナーを数回ジッパー・
ペプチドで置換するかまたは立体的理由からペプチド担
持担体分子に連結する； ｂ） 特異結合パートナーを信号発出成分と同じペプチ
ドで置換する。これら二成分の“カップリング”は第一
のものに対して相補的なペプチドが所要の取込み率で結
合されている担体分子を用いて達成される； ｃ） 増幅は、ｂ）に記載の“カプラー成分”とペプチ
ドを備えた信号発出成分との間の前形成複合体を用いる
ことによって行われる。
ナーに対する第二特異結合パートナーを数回ジッパー・
ペプチドで置換するかまたは立体的理由からペプチド担
持担体分子に連結する； ｂ） 特異結合パートナーを信号発出成分と同じペプチ
ドで置換する。これら二成分の“カップリング”は第一
のものに対して相補的なペプチドが所要の取込み率で結
合されている担体分子を用いて達成される； ｃ） 増幅は、ｂ）に記載の“カプラー成分”とペプチ
ドを備えた信号発出成分との間の前形成複合体を用いる
ことによって行われる。
【００３８】図４：人工の対照血清／標準
ジッパー・ペプチドに連結された第一特異結合パートナ
ーが抗原を認識する。二次的反応において、第一のもの
に対して相補的であって、いずれかの所望の抗原性構造
（例えばペプチド、タンパク質など）に接合され、そし
て信号発出成分に連結した第二特異結合パートナーに向
けられたペプチドとでヘテロダイマーを形成する。
ーが抗原を認識する。二次的反応において、第一のもの
に対して相補的であって、いずれかの所望の抗原性構造
（例えばペプチド、タンパク質など）に接合され、そし
て信号発出成分に連結した第二特異結合パートナーに向
けられたペプチドとでヘテロダイマーを形成する。
【００３９】実施例および特許請求の範囲は本発明の開
示の一部を形成する。それら実施例は本発明の例示に役
立つものではあるがそれをいささかも限定するものでは
ない。
示の一部を形成する。それら実施例は本発明の例示に役
立つものではあるがそれをいささかも限定するものでは
ない。
【００４０】実施例１
段階１：
マイクロタイタープレートのJunペプチドによるコーテ
ィング ０.１Ｍ炭酸ナトリウム中に１０μｇ／ml Junペプチド
を含有する溶液１５０μｌをデンマーク国ロスキルデ
（Roskilde）のNunc社により供給されたマイクロタイタ
ープレートの１６ウエルの各々に入れる。希釈液を入れ
たアッセイプレートを２０℃で１８時間放置し、次いで
ウエル内の溶液を吸引により除去し、そしてそれらウエ
ルをリン酸緩衝生食水（ＰＢＳ、pH７.４）中の１０ｇ
／リットルウシ血清アルブミン溶液３００μｌを用いて
３〜４回充填および吸引除去により洗浄し、次にアッセ
イプレートをシリカゲル上２０℃で乾燥する。
ィング ０.１Ｍ炭酸ナトリウム中に１０μｇ／ml Junペプチド
を含有する溶液１５０μｌをデンマーク国ロスキルデ
（Roskilde）のNunc社により供給されたマイクロタイタ
ープレートの１６ウエルの各々に入れる。希釈液を入れ
たアッセイプレートを２０℃で１８時間放置し、次いで
ウエル内の溶液を吸引により除去し、そしてそれらウエ
ルをリン酸緩衝生食水（ＰＢＳ、pH７.４）中の１０ｇ
／リットルウシ血清アルブミン溶液３００μｌを用いて
３〜４回充填および吸引除去により洗浄し、次にアッセ
イプレートをシリカゲル上２０℃で乾燥する。
【００４１】段階２：
マレイミド−抗体の調製
接合されるべき抗体（ＰＢＳ中４mg／ml濃度；２.５m
l）をホウ酸リチウム緩衝液（２.５ml）（調製について
は下記参照）と混合する。pH７.５を有する生成溶液に
撹拌しながらジオキサン中のＧＭＢＳ（Ｎ−ガンマ−マ
レイミドブチリルオキシ−スクシンイミド）の１３mg／
ml溶液０.４５mlを添加する（IgGに対し３０倍モル過剰
のＧＭＢＳに相当する）。室温で１時間インキュベート
した後、過剰の試薬をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、pH
７.２で平衡させたSephadex G-25カラムでのゲル濾過に
より除去する。
l）をホウ酸リチウム緩衝液（２.５ml）（調製について
は下記参照）と混合する。pH７.５を有する生成溶液に
撹拌しながらジオキサン中のＧＭＢＳ（Ｎ−ガンマ−マ
レイミドブチリルオキシ−スクシンイミド）の１３mg／
ml溶液０.４５mlを添加する（IgGに対し３０倍モル過剰
のＧＭＢＳに相当する）。室温で１時間インキュベート
した後、過剰の試薬をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、pH
７.２で平衡させたSephadex G-25カラムでのゲル濾過に
より除去する。
【００４２】ホウ酸リチウム緩衝液、pH８.５の調製
１.２４ｇのホウ酸を水（８０ml）とジオキサン（２０m
l）の混合物に撹拌添加する。ホウ酸を溶解させながら
固体水酸化リチウムを添加してpH８.５に調節する。
l）の混合物に撹拌添加する。ホウ酸を溶解させながら
固体水酸化リチウムを添加してpH８.５に調節する。
【００４３】段階３：
Fosロイシン・ジッパー・ペプチドのマレイミド−抗体
へのカップリング 段階２における如く調製されたマレイミド−抗体（ＰＢ
Ｓ ２ml中に２mg）を１当量のFosロイシン・ジッパー・
ペプチド（ＰＢＳ １００μｌ中に６４μｇ）と共に室
温で１時間インキュベートする。次いで塩化ナトリウム
／クエン酸ナトリウム緩衝液、pH７.３（０.４Ｍ塩化ナ
トリウムと０.０４Ｍクエン酸ナトリウム）を用いてAcA
３４カラム（直径２.５cm；高さ４５cm）を通してのゲ
ル濾過を行う。
へのカップリング 段階２における如く調製されたマレイミド−抗体（ＰＢ
Ｓ ２ml中に２mg）を１当量のFosロイシン・ジッパー・
ペプチド（ＰＢＳ １００μｌ中に６４μｇ）と共に室
温で１時間インキュベートする。次いで塩化ナトリウム
／クエン酸ナトリウム緩衝液、pH７.３（０.４Ｍ塩化ナ
トリウムと０.０４Ｍクエン酸ナトリウム）を用いてAcA
３４カラム（直径２.５cm；高さ４５cm）を通してのゲ
ル濾過を行う。
【００４４】段階４：
ペルオキシダーゼ−標識抗体および検出用ＴＭＢ基質の
調製 ＫＯＥＨＬＥＲとＭＩＬＳＴＥＩＮのモノクローナル抗
体調製方法（Nature 256, 495, 1975）により抗体を生
成させ、そして同じ抗原特異性を有する様々なモノクロ
ーナル抗体をSTAEHLI et al. （J. of Immunological M
ethods 32, 297−304, 1980）により記載された方法に
より同定した。ゲルクロマトグラフィーによる精製およ
びリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、pH７.４）に対する透析
の後、モノクローナル抗体画分含有プール（４mg／mlの
タンパク質）を、TANAMORI et al. （J. Immunol. Met
h. 62, 123−131, 1983）に記載の如く、Calbiochem社
から入手したＮ−ガンマ−マレイミドブチリルオキシス
クシンイミド（ＧＭＢＳ）と引き続き反応させる。
調製 ＫＯＥＨＬＥＲとＭＩＬＳＴＥＩＮのモノクローナル抗
体調製方法（Nature 256, 495, 1975）により抗体を生
成させ、そして同じ抗原特異性を有する様々なモノクロ
ーナル抗体をSTAEHLI et al. （J. of Immunological M
ethods 32, 297−304, 1980）により記載された方法に
より同定した。ゲルクロマトグラフィーによる精製およ
びリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、pH７.４）に対する透析
の後、モノクローナル抗体画分含有プール（４mg／mlの
タンパク質）を、TANAMORI et al. （J. Immunol. Met
h. 62, 123−131, 1983）に記載の如く、Calbiochem社
から入手したＮ−ガンマ−マレイミドブチリルオキシス
クシンイミド（ＧＭＢＳ）と引き続き反応させる。
【００４５】このようにして得られた抗体−ＰＯＤ接合
体の溶液の最終希釈液を各アッセイに用いるために作
る。接合体希釈媒質として使用されるのは、０.１Ｍ ２
−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１,３−プロパ
ンジオール（ＴＲＩＳ）、０.５％ RTween 20、０.５〜
１％安定化用タンパク質を含有する緩衝液、pH７.４、
である。従来技術により調製されたポリクローナル抗体
も同様にして調節する。
体の溶液の最終希釈液を各アッセイに用いるために作
る。接合体希釈媒質として使用されるのは、０.１Ｍ ２
−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１,３−プロパ
ンジオール（ＴＲＩＳ）、０.５％ RTween 20、０.５〜
１％安定化用タンパク質を含有する緩衝液、pH７.４、
である。従来技術により調製されたポリクローナル抗体
も同様にして調節する。
【００４６】二つの貯蔵液から調製される過酸化水素お
よびテトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）を含有する基質
系または基質調製物を用いてＡｂ−ＩｇＧ／ＰＯＤ接合
体を検出する。
よびテトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）を含有する基質
系または基質調製物を用いてＡｂ−ＩｇＧ／ＰＯＤ接合
体を検出する。
【００４７】貯蔵液１：ＴＭＢ二塩酸塩を二重蒸留水
（double-distilled water）を撹拌添加することにより
５ｇ／リットル、すなわち１６mmol／リットル、の濃度
となるように溶解し、そして５Ｎ塩酸でpH１.５に調節
する。この溶液に撹拌しながらペニシリンＧを２００mg
／リットル、すなわち０.５６mmol／リットル、の最終
濃度となるように添加する。
（double-distilled water）を撹拌添加することにより
５ｇ／リットル、すなわち１６mmol／リットル、の濃度
となるように溶解し、そして５Ｎ塩酸でpH１.５に調節
する。この溶液に撹拌しながらペニシリンＧを２００mg
／リットル、すなわち０.５６mmol／リットル、の最終
濃度となるように添加する。
【００４８】貯蔵液２：１.４mlの氷酢酸、１.５mlの１
Ｎ ＮａＯＨおよび２５０mg、すなわち３mmol、の尿素
−過酸化水素アダクトの形のＨ2Ｏ2を９００mlの二重蒸
留水に添加する。溶解完了後、容量を二重蒸留水で１リ
ットルにする。ＴＭＢ基質調製物：１容量部の貯蔵液１
と１０容量部の貯蔵液２とを混合する。
Ｎ ＮａＯＨおよび２５０mg、すなわち３mmol、の尿素
−過酸化水素アダクトの形のＨ2Ｏ2を９００mlの二重蒸
留水に添加する。溶解完了後、容量を二重蒸留水で１リ
ットルにする。ＴＭＢ基質調製物：１容量部の貯蔵液１
と１０容量部の貯蔵液２とを混合する。
【００４９】段階５：
本発明によるペプチドを用いたＥＬＩＳＡによる抗原測
定 段階３における如く調製された０.０１mg／mlのFosペプ
チド−抗体接合体を塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウ
ム緩衝液中に含む溶液１０μlを前述の如くペプチドで
コーティングされたマイクロタイタープレートのウエル
内に入れる。適切な場合には１０〜３０分後に吸引によ
り溶液を除去しそしてそれらウエルを洗浄することがで
きる。それらのウエルに２０μlの血清または血漿、１
０μlのインキュベーション媒質（ＢＷ、ＯＳＮＤ）を
入れる。３７℃で３０分後にウエルの内容物を吸引によ
り除去し、そしてそれらウエルをＰＢＳ中に１ｇ／リッ
トルRTween 20を含有する洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。次いで接合体の最終希釈液１００μlをウエルに添
加する。３７℃で３０分間インキュベート後、ウエルの
内容物を吸引により除去し、そして再び３回洗浄する。
次に１００μlのＴＭＢ基質調製物を各ウエルに添加
し、２０〜２２℃で３０分間インキュベートしそしてイ
ンキュベーションを１００μlの１Ｎ硫酸を添加するこ
とにより止める。呈色溶液の吸光度をＰＢＳを基準とし
て用いて４５０nmの波長で測定する（Ｅ450）。
定 段階３における如く調製された０.０１mg／mlのFosペプ
チド−抗体接合体を塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウ
ム緩衝液中に含む溶液１０μlを前述の如くペプチドで
コーティングされたマイクロタイタープレートのウエル
内に入れる。適切な場合には１０〜３０分後に吸引によ
り溶液を除去しそしてそれらウエルを洗浄することがで
きる。それらのウエルに２０μlの血清または血漿、１
０μlのインキュベーション媒質（ＢＷ、ＯＳＮＤ）を
入れる。３７℃で３０分後にウエルの内容物を吸引によ
り除去し、そしてそれらウエルをＰＢＳ中に１ｇ／リッ
トルRTween 20を含有する洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。次いで接合体の最終希釈液１００μlをウエルに添
加する。３７℃で３０分間インキュベート後、ウエルの
内容物を吸引により除去し、そして再び３回洗浄する。
次に１００μlのＴＭＢ基質調製物を各ウエルに添加
し、２０〜２２℃で３０分間インキュベートしそしてイ
ンキュベーションを１００μlの１Ｎ硫酸を添加するこ
とにより止める。呈色溶液の吸光度をＰＢＳを基準とし
て用いて４５０nmの波長で測定する（Ｅ450）。
【００５０】実施例２
段階１：
マイクロタイタープレートのコーティング
５０mM炭酸塩緩衝液中に５μｇ／ml JunまたはFosペプ
チドを含む溶液１５０μlをロスキルデ（デンマーク）
のNunc社により供給されたマイクロタイタープレートの
ウエルの各々に入れる。溶液添加したアッセイプレート
を室温で一夜放置し、次いでウエル内溶液を吸引により
除去し、そしてそれらウエルを２５０μlのリン酸緩衝
生食水を用いて充填および吸引除去することにより３回
洗浄する。次にそれらアッセイプレートを２０℃でシリ
カゲル上で放置乾燥する。
チドを含む溶液１５０μlをロスキルデ（デンマーク）
のNunc社により供給されたマイクロタイタープレートの
ウエルの各々に入れる。溶液添加したアッセイプレート
を室温で一夜放置し、次いでウエル内溶液を吸引により
除去し、そしてそれらウエルを２５０μlのリン酸緩衝
生食水を用いて充填および吸引除去することにより３回
洗浄する。次にそれらアッセイプレートを２０℃でシリ
カゲル上で放置乾燥する。
【００５１】段階２：
マレイミド−抗体の調製
接合されるべき抗体（ＰＢＳ中４mg／ml濃度；１ml）を
ホウ酸リチウム緩衝液（１ml）と混合する。pH８.０を
有する生成溶液に撹拌しながらジオキサン中のＧＭＢＳ
（Ｎ−ガンマ−マレイミドブチリルオキシ−スクシンイ
ミド）の１３mg／ml溶液０.０１７mlを添加する（Ｉｇ
Ｇに対し３０倍モル過剰のＧＭＢＳに相当する）。室温
で１時間インキュベートした後、過剰の試薬を５μＭ T
itriplexＩ含有リン酸緩衝液、pH６.０で平衡させたSep
hadex G-25カラムでのゲル濾過により除去する。
ホウ酸リチウム緩衝液（１ml）と混合する。pH８.０を
有する生成溶液に撹拌しながらジオキサン中のＧＭＢＳ
（Ｎ−ガンマ−マレイミドブチリルオキシ−スクシンイ
ミド）の１３mg／ml溶液０.０１７mlを添加する（Ｉｇ
Ｇに対し３０倍モル過剰のＧＭＢＳに相当する）。室温
で１時間インキュベートした後、過剰の試薬を５μＭ T
itriplexＩ含有リン酸緩衝液、pH６.０で平衡させたSep
hadex G-25カラムでのゲル濾過により除去する。
【００５２】段階３：
JunまたはFosロイシン・ジッパー・ペプチドのマレイミ
ド−抗体へのカップリング 段階２における如く調製されたマレイミド−抗体（５μ
Ｍ Titriplex Ｉ含有リン酸緩衝液（pH６.０）２ml中に
２mg）を１当量のJunまたはFosロイシン・ジッパー・ペ
プチド（ＰＢＳ １ml中に１５mg）と共に室温で１時間
インキュベートする。次いで５０mM tris（pH７.４）を
用いてSephadex G-25カラム(直径１cm；高さ１５cm）を
通してのゲル濾過を行う。
ド−抗体へのカップリング 段階２における如く調製されたマレイミド−抗体（５μ
Ｍ Titriplex Ｉ含有リン酸緩衝液（pH６.０）２ml中に
２mg）を１当量のJunまたはFosロイシン・ジッパー・ペ
プチド（ＰＢＳ １ml中に１５mg）と共に室温で１時間
インキュベートする。次いで５０mM tris（pH７.４）を
用いてSephadex G-25カラム(直径１cm；高さ１５cm）を
通してのゲル濾過を行う。
【００５３】段階３ａ）：
官能化されたJunまたはFosロイシン・ジッパー・ペプチ
ドのマレイミド−抗体へのカップリング ２.１mgのJunまたはFosペプチドを０.２１mlのＰＢＳに
とり、そして９.５μlのＳＡＭＳＡ貯蔵液（Ｓ−アセチ
ル−メルカプトコハク酸無水物；ＦＬＵＫＡ；ジオキサ
ン１ml中に２２.２mg）と混合する。室温で３０分間反
応させた後、その溶液を６０μlの１Ｍ ＮＨ2ＯＨ水溶
液で処理しそして室温でさらに１５分間インキュベート
する。その反応混合物を次いで５μＭ Titriplex Ｉ含
有リン酸緩衝液（pH６）を用いてBiogel P2カラムで脱
塩する。
ドのマレイミド−抗体へのカップリング ２.１mgのJunまたはFosペプチドを０.２１mlのＰＢＳに
とり、そして９.５μlのＳＡＭＳＡ貯蔵液（Ｓ−アセチ
ル−メルカプトコハク酸無水物；ＦＬＵＫＡ；ジオキサ
ン１ml中に２２.２mg）と混合する。室温で３０分間反
応させた後、その溶液を６０μlの１Ｍ ＮＨ2ＯＨ水溶
液で処理しそして室温でさらに１５分間インキュベート
する。その反応混合物を次いで５μＭ Titriplex Ｉ含
有リン酸緩衝液（pH６）を用いてBiogel P2カラムで脱
塩する。
【００５４】マレイミド−抗体に対する以後のカップリ
ング手順は段階３と同様にして行われる。
ング手順は段階３と同様にして行われる。
【００５５】段階４：
本発明によるペプチドを用いたＥＬＩＳＡによるＣＥＡ
測定 緩衝液（ＯＳＮＤ、Behringwerke）中に段階２における
如く調製された０.０１mg／mlのFosペプチド−抗−ＣＥ
Ａ抗体接合体を含むもの１００μlを前述の如くJunペプ
チドでコーティングされたマイクロタイタープレートの
ウエルに入れる。適切な場合には、その溶液を３７℃で
２時間後に吸引除去でき、またそれらウエルをEnzygnos
t洗浄用緩衝液（ＯＳＥＷ）で洗浄することができる。
２０μlの血清またはＣＥＡ標準および１００μlの抗−
ＣＥＡ抗体最終希釈液（例えばポリクローナル、ウサ
ギ）（ペルオキシダーゼで標識された形のもの）をウエ
ルに入れる。３７℃で２時間の反応時間後、ウエル内容
物を吸引除去しそして洗浄用緩衝液による洗浄を再び行
う。最後に１００μlのＴＭＢ基質調製物を各ウエルに
入れ、室温で３０分間インキュベートしそしてインキュ
ベーションを１００μlの１Ｎ硫酸の添加により止め
る。呈色溶液の吸光度をＰＢＳを基準として用いて４５
０nmの波長で測定する。
測定 緩衝液（ＯＳＮＤ、Behringwerke）中に段階２における
如く調製された０.０１mg／mlのFosペプチド−抗−ＣＥ
Ａ抗体接合体を含むもの１００μlを前述の如くJunペプ
チドでコーティングされたマイクロタイタープレートの
ウエルに入れる。適切な場合には、その溶液を３７℃で
２時間後に吸引除去でき、またそれらウエルをEnzygnos
t洗浄用緩衝液（ＯＳＥＷ）で洗浄することができる。
２０μlの血清またはＣＥＡ標準および１００μlの抗−
ＣＥＡ抗体最終希釈液（例えばポリクローナル、ウサ
ギ）（ペルオキシダーゼで標識された形のもの）をウエ
ルに入れる。３７℃で２時間の反応時間後、ウエル内容
物を吸引除去しそして洗浄用緩衝液による洗浄を再び行
う。最後に１００μlのＴＭＢ基質調製物を各ウエルに
入れ、室温で３０分間インキュベートしそしてインキュ
ベーションを１００μlの１Ｎ硫酸の添加により止め
る。呈色溶液の吸光度をＰＢＳを基準として用いて４５
０nmの波長で測定する。
【００５６】実施態様例Ａ
本発明によるペプチドを用いたＣＥＡ−ＥＬＩＳＡの標
準プロット
準プロット
【表１】
【００５７】実施態様例Ｂ：
ＣＥＡ ＥＬＩＳＡの本発明によるペプチドとの相関と
他の市販ＣＥＡアッセイとの比較 実施態様例Ａと同様にして本発明ペプチドを用いたＥＬ
ＩＳＡによりＣＥＡ測定を行ったが、今度はFosペプチ
ド−被覆マイクロタイタープレートとJun−抗−ＣＥＡ
接合体を用いた逆の系で行った。
他の市販ＣＥＡアッセイとの比較 実施態様例Ａと同様にして本発明ペプチドを用いたＥＬ
ＩＳＡによりＣＥＡ測定を行ったが、今度はFosペプチ
ド−被覆マイクロタイタープレートとJun−抗−ＣＥＡ
接合体を用いた逆の系で行った。
【００５８】
【表２】
【００５９】結果：市販ＣＥＡアッセイキットと直接比
較することによりＣＥＡ濃度の極めて良好な相関が明ら
かとなった（相関係数 ｒ＝０.９９９）。
較することによりＣＥＡ濃度の極めて良好な相関が明ら
かとなった（相関係数 ｒ＝０.９９９）。
【００６０】段階５：
本発明ペプチドを用いたＥＬＩＳＡによるＡＦＰの測定
実施例２、段階３または３ａにおける如く調製されたJu
nペプチド−抗−ＡＦＰ抗体接合体（ヒツジからの抗−
ＡＦＰ抗体）を実施例２、段階１における如くFosペプ
チドでコーティングされたマイクロタイタープレートの
ウエルに１００μlずつピペットでとり、そして３７℃
で２時間インキュベートする。それらウエルを洗浄用緩
衝液（ＯＳＥＷ、Behringwerke）で３回洗浄後、標準ま
たは検体を２０μlずつ、そしてヒツジからのペルオキ
シダーゼ−接合抗−ＡＦＰ抗体を添加した緩衝液（ＯＳ
ＮＤ、Behringwerke）を１００μl導入した。３７℃で
２時間のインキュベーションを再び洗浄段階（前記参
照）をもって止め、そして基質／発色原反応を実施例
２、段階４における如く行う。
nペプチド−抗−ＡＦＰ抗体接合体（ヒツジからの抗−
ＡＦＰ抗体）を実施例２、段階１における如くFosペプ
チドでコーティングされたマイクロタイタープレートの
ウエルに１００μlずつピペットでとり、そして３７℃
で２時間インキュベートする。それらウエルを洗浄用緩
衝液（ＯＳＥＷ、Behringwerke）で３回洗浄後、標準ま
たは検体を２０μlずつ、そしてヒツジからのペルオキ
シダーゼ−接合抗−ＡＦＰ抗体を添加した緩衝液（ＯＳ
ＮＤ、Behringwerke）を１００μl導入した。３７℃で
２時間のインキュベーションを再び洗浄段階（前記参
照）をもって止め、そして基質／発色原反応を実施例
２、段階４における如く行う。
【００６１】Junペプチド−抗−ＡＦＰ抗体は２５〜０.
５μｇ／mlの濃度範囲で用いられるが、これは標準Ｓ５
（３００ ＩＵ／ml）についての４５０nmにおける測定
信号が０.８Ｅの最小吸光度となるように選択されたペ
ルオキシダーゼ−接合抗−ＡＦＰ抗体の濃度に適してい
る。
５μｇ／mlの濃度範囲で用いられるが、これは標準Ｓ５
（３００ ＩＵ／ml）についての４５０nmにおける測定
信号が０.８Ｅの最小吸光度となるように選択されたペ
ルオキシダーゼ−接合抗−ＡＦＰ抗体の濃度に適してい
る。
【００６２】Jun／Fos ＡＦＰアッセイの実施態様例：
Ａ） Jun−Fos相互作用の特異性Ｉ
Jun−Fos相互作用の特異性をチェックするために、様々
なペプチド被覆および未被覆マイクロタイタープレート
を、JunまたはFosペプチドが結合された、あるいはペプ
チドが全く結合されていない抗−ＡＦＰ抗体と組み合わ
せて、前述のアッセイ手順と同様に用いた。
なペプチド被覆および未被覆マイクロタイタープレート
を、JunまたはFosペプチドが結合された、あるいはペプ
チドが全く結合されていない抗−ＡＦＰ抗体と組み合わ
せて、前述のアッセイ手順と同様に用いた。
【００６３】結果：“Fos固相”をJun−抗−ＡＦＰ抗体
と併用した場合にのみ、標準Ｓ５（３００ ＩＵ ＡＦＰ
／ml）に対して標準Ｓ０（０ ＩＵ ＡＦＰ／ml）に対す
るよりも有意に高い測定信号を得ることができた（表
３）。
と併用した場合にのみ、標準Ｓ５（３００ ＩＵ ＡＦＰ
／ml）に対して標準Ｓ０（０ ＩＵ ＡＦＰ／ml）に対す
るよりも有意に高い測定信号を得ることができた（表
３）。
【００６４】
【表３】
【００６５】Ｂ） Jun−Fos相互作用の特異性II
前述のJun／Fos ＡＦＰアッセイに先立って、１ウエル
あたり各々１００μlのJunまたはFosペプチド含有緩衝
液（緩衝液＝ＯＳＮＤ）を用いた３７℃で１時間のイン
キュベーション段階を設けた。３回洗浄後、以後のアッ
セイ手順は前述のとおりとした。
あたり各々１００μlのJunまたはFosペプチド含有緩衝
液（緩衝液＝ＯＳＮＤ）を用いた３７℃で１時間のイン
キュベーション段階を設けた。３回洗浄後、以後のアッ
セイ手順は前述のとおりとした。
【００６６】結果：遊離Junペプチドを添加することに
よってのみJun−抗−ＡＦＰ抗体のFos−被覆固相への結
合を阻害することができた（表４）。
よってのみJun−抗−ＡＦＰ抗体のFos−被覆固相への結
合を阻害することができた（表４）。
【００６７】
【表４】
【００６８】Ｃ） Jun／Fos ＡＦＰアッセイの標準プ
ロット：
ロット：
【表５】
【図１】固相でのJun−Fos相互作用のイン・ビトロ診断
への使用についての原理上の諸可能性の例を概略的に図
示したものである。
への使用についての原理上の諸可能性の例を概略的に図
示したものである。
【図２】接合体でのJun−Fos相互作用のイン・ビトロ診
断への使用についての原理上の諸可能性の例を概略的に
図示したものである。
断への使用についての原理上の諸可能性の例を概略的に
図示したものである。
【図３】（Ａ）〜（Ｃ）は増幅系でのJun−Fos相互作用
のイン・ビトロ診断への使用についての原理上の諸可能
性の例を概略的に図示したものである。
のイン・ビトロ診断への使用についての原理上の諸可能
性の例を概略的に図示したものである。
【図４】人工の対照血清／標準でのJun−Fos相互作用の
イン・ビトロ診断への使用についての原理上の諸可能性
の例を概略的に図示したものである。
イン・ビトロ診断への使用についての原理上の諸可能性
の例を概略的に図示したものである。
フロントページの続き
(72)発明者 ハンス・ハーラルト・ゼトラツエク
ドイツ連邦共和国デー−3550マルブル
ク．ゾネンハング３
(72)発明者 ベルンハルト・アウアーバハ
ドイツ連邦共和国デー−3550マルブル
ク．ホルダーシユトラウホ７
(72)発明者 ペーター・プフライデラー
ドイツ連邦共和国デー−3550マルブル
ク．アウフデムシヤウムリユク１
(72)発明者 ロルフ・ミユラー
ドイツ連邦共和国デー−3550マルブル
ク．フープグラーベン６
(56)参考文献 Ｍｃｎｉｇｈｔ Ｓ．Ｌ．，Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，米
国，1991年４月，32−39
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/53
ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (13)
- 【請求項１】 相互に対する極めて高い親和性を有する
ペプチドである“ロイシン・ジッパー・ペプチド”の対
をイン・ビトロ診断分野に使用する方法。 - 【請求項２】 固相イムノアッセイにおいて“ロイシン
・ジッパー”ペプチド対の一方のペプチドを吸着により
または共有結合的に、直接にまたはスペーサーを介して
該固相に結合させ、そして“ロイシン・ジッパー”ペプ
チド対の第二ペプチドを検出されるべき被分析物質を固
定するための特異結合パートナーに結合させて被分析物
質を検出する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 イムノアッセイにおいて、検出のための
特異結合パートナーを“ロイシン・ジッパー”ペプチド
対の一方のペプチドに結合させ、そしてこの対の第二ペ
プチドを信号発出成分に結合させる請求項１記載の方
法。 - 【請求項４】 “ロイシン・ジッパー”ペプチド対の第
二ペプチドの１分子以上を直接にまたは担体分子を介し
て特異結合パートナーに結合させる請求項３記載の方
法。 - 【請求項５】 抗原に対する特異結合パートナーを“ロ
イシン・ジッパー”ペプチドを介して、被分析物質の第
二特異結合パートナーにより特異結合パートナーとして
認識される抗原性構造に連結させる請求項１記載の方
法。 - 【請求項６】 固相に結合された特異結合パートナーを
一対の“ロイシン・ジッパー”ペプチドを介して固相に
結合させることより成る被分析物質測定のための不均一
免疫化学的方法。 - 【請求項７】 固相がマイクロタイタープレートまたは
磁気的に引きつけることのできる粒子である請求項６記
載の方法。 - 【請求項８】 検出のための特異結合パートナーを、
“ロイシン・ジッパー”ペプチド対の一方のペプチドに
結合させ、そしてこの対の第二ペプチドに信号発出成分
を担持させることより成る被分析物質測定のための不均
一免疫化学的方法。 - 【請求項９】 “ロイシン・ジッパー”ペプチド対の第
二ペプチドの１分子以上が特異結合パートナーに直接に
または担体分子を介して結合される請求項８記載の方
法。 - 【請求項１０】 イムノアッセイにおいて“ロイシン・
ジッパー”ペプチド対の一方のペプチドの１分子以上が
検出のための特異結合パートナーに直接にまたは担体分
子を介して結合され、そしてこの対の第二ペプチドが信
号発出成分を担持する請求項１記載の方法。 - 【請求項１１】 “ロイシン・ジッパー・ペプチド”
が、ＦｏｓまたはＪｕｎである、請求項１〜１０の何れ
か１項に記載の方法。 - 【請求項１２】 “ロイシン・ジッパー”ペプチドの対
の一方のペプチドが吸着によりまたは共有結合的に、直
接にまたはスペーサーを介して、固相に結合されて成
る、被分析物質測定のための不均一免疫化学的方法に用
いるためのユニバーサル固相。 - 【請求項１３】 “ロイシン・ジッパー”ペプチドの対
の少なくとも一方のペプチドが検出のための特異結合パ
ートナーに結合され、そしてこの対の第二ペプチドが信
号発出成分に結合されて成る免疫化学的方法に用いるた
めのユニバーサル試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4040669A DE4040669A1 (de) | 1990-12-19 | 1990-12-19 | Verwendung von peptidpaaren mit extrem hoher spezifischer affinitaet zueinander im bereich der in vitro diagnostik |
| DE40406695 | 1990-12-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04301570A JPH04301570A (ja) | 1992-10-26 |
| JP3363166B2 true JP3363166B2 (ja) | 2003-01-08 |
Family
ID=6420737
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33480191A Expired - Fee Related JP3363166B2 (ja) | 1990-12-19 | 1991-12-18 | 相互に対する極めて高い特異的親和性を有するペプチド対をイン・ビトロ診断分野に使用する方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0491362B1 (ja) |
| JP (1) | JP3363166B2 (ja) |
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| CA (1) | CA2058019C (ja) |
| DE (2) | DE4040669A1 (ja) |
| DK (1) | DK0491362T3 (ja) |
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| US5635602A (en) * | 1993-08-13 | 1997-06-03 | The Regents Of The University Of California | Design and synthesis of bispecific DNA-antibody conjugates |
| JP3027770B2 (ja) * | 1994-03-05 | 2000-04-04 | ロシュ ダイアグノスティックス ゲーエムベーハー | イムノアッセイで使用するための干渉除去剤 |
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| JPH11512620A (ja) * | 1995-10-06 | 1999-11-02 | ペンス | 発現されたタンパク質の検出および精製のためのコイルドコイルヘテロダイマー法および組成物 |
| US6410692B2 (en) * | 1998-02-02 | 2002-06-25 | Novadx, Inc. | Removal of abundant interfering proteins from a liquid sample using a collapsible affinity matrix |
| DE19808226C1 (de) * | 1998-02-27 | 2000-03-02 | Bruker Analytik Gmbh | Anordnung und Verfahren zur Untersuchung von hydrophilen Makromolekülen in wässriger Lösung |
| CA2263784A1 (en) | 1998-03-23 | 1999-09-23 | Megabios Corporation | Dual-tagged proteins and their uses |
| ID28040A (id) * | 1998-05-19 | 2001-05-03 | Avidex Ltd | Reseptor sel t yang dapat larut |
| US20020102617A1 (en) * | 2000-08-03 | 2002-08-01 | Macbeath Gavin | Protein microarrays |
| AU2001277245A1 (en) * | 2000-08-03 | 2002-02-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Microarrays of functional biomolecules, and uses therefor |
| JP4133344B2 (ja) | 2001-04-23 | 2008-08-13 | 輝行 長棟 | レポーター（標識）分子間相互作用を利用した分析方法 |
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| WO2003093821A1 (en) * | 2002-04-29 | 2003-11-13 | Affibody Ab | Sandwich assay and kit |
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| EP2386639A3 (en) | 2005-11-21 | 2012-05-30 | Protox Therapeutics Incorporated | Modified pore-forming protein toxins and use thereof |
| AU2010256880B2 (en) | 2009-06-02 | 2015-01-22 | Opko Health, Inc. | Identification of small molecules recognized by antibodies in subjects with neurodegenerative diseases |
| WO2011047257A1 (en) | 2009-10-16 | 2011-04-21 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Compositions and methods for producing cyclic peptoid libraries |
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| US4334227A (en) * | 1980-09-26 | 1982-06-08 | A.P.C. Industries, Inc. | Electronic marker device and method of making same |
| GB8422452D0 (en) * | 1984-09-05 | 1984-10-10 | Serono Diagnostics Ltd | Assay |
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- 1990-12-19 DE DE4040669A patent/DE4040669A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-12-17 DE DE59107549T patent/DE59107549D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-17 ES ES91121625T patent/ES2085410T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-17 AT AT91121625T patent/ATE135469T1/de not_active IP Right Cessation
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- 1991-12-17 DK DK91121625.7T patent/DK0491362T3/da active
- 1991-12-18 JP JP33480191A patent/JP3363166B2/ja not_active Expired - Fee Related
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-
1995
- 1995-06-06 US US08/467,943 patent/US5643731A/en not_active Expired - Lifetime
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|---|
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