SE445393B - Forfarande for immunoanalys med anvendning av f(ab')?712-fragment av immunoglobulin samt reagens - Google Patents

Description

1Ü_ 15 20 25 30 35 7900661-5 2 i att man blandar ett prov av-fluiden med F(ab');-fragment av ett immunoglobulin, som är specifikt för antigenet: under bild- ning av en reaktionsblandning, som är i huvudsak fri från helt immunoglobulin och F(c)-fragment därav, inkuberar bland- ningen för att åstadkomma reaktion mellan f(ab')?-fragmenten och eventuellt närvarande antigen, och bestämmer deníomfattningy vari reaktionen har ägt rum i blandningen och därigenom förekoms- ten och/eller mängden av antigenet i fluidprovet, såsom närmare anges i krav l. ' Immunoglobuliner, såsom IgG, kan spjälkas i sina F(ab')2- och F(c)-fragment med kända metoder;'t.ex. genom enzy- matisk nedbrytning med pepsin. F(ab')?-fragmenten kan skiljas från F(c)-fragmenten och användas i förfarandet enligt uppfinningen.

Exempelvis kan framställningen av F(aL')2-ske pä följande sätt.

Helt immnnoglobulin blandas med pepsin (2 mg pepsin per 100 mg immunoglobulin) i en 0,1 M acetatbuffert med pH H,5. Blandningen inkuberas 24 h vid 37°C. Det bildade F(ab')2 avskiljs på en kolonn o av “Ultrogel AGA 4.4", varvid man får 80 - 90 u av det teoretiska utbytet av F(ah')Z. I ' F(ab')2~fragmenten av ímmunoglobulin kan användas i let för helt immunoglobulin i manga ímmunoanalysmetoder, där än specifik reaktion inträffar mellan immunoglobulin och ett antigen, men ingen reaktion mellan immunoglobulinet och RP eller Clq er- fordras. (Det inses, att det finns kända analyser, där RF eller Clq tillsätts som reagens för reaktion med immunoglobulin. I sådana 'analyser kan F(ab')2-fragmenten inte utan vidare användas som er- sättning för helt immunoglobulin.) Sålunda kan F(ab')¿-fragmenten användas i lösning,_exempelvis i vissa med konkurrerande bindning arbetande analyser. Det är ofta fördelaktigt att använda en radio- aktiv nuklid eller annan märkning i sådana analyser (och andra analyser), och F(ab')2~fragmenten kan ha en sådan märkníng. Omfatt- ningen av reaktionen mellan antigenet och fragmenten bestäms dä med hjälp av märkningen. I ett exempel på en sådan analys med kan- kurrerande bindning blandas den antigenhaltiga fluiden med både märkta och omärkta F(ab')2~fragment, så att en knnkurrerande sind- ningsreaktion inträffar mellan fragmenten och antigenet, varpå mängden märkta fragment, som har reagerat med antigenet, eller mängden märkta fragment, som är kvar oreagerade i blandningen, bestäms, varigenom närvaron och/eller mängden av antigen i fluiden kan fastställas. i roosouatxfxrr 131.511 '~ (__. 10 20 30 7900661-5 3.

F(abf)2-fragmenten kan användas i insolubiliserad form, dvs. bundna (innefattande såväl absorberade som kovalent bundna) vid en vattenolöslig bärare. Bärarens beskaffenhet kan variera av- sevärt; exempelvis kan den ha formen av en folie eller en slang eller vara eLL partikelformigt material. En löredragen iorm av partikelformigt material är magnetinkt attraherbart, sä att det efter reaktion med detför analys avsedda antigenet och fragmenten kan frånskiljas med hjälp av ett magnetiskt fält. Sådana analyser 327.

En annan föredragen form av insolubiliserade F(ab')2- beskrivs i belgiska patentskriften 852 fragment är en latexsuspension, och nnlana suspensioner kan användas i stället för hull immunoglobulín I Latexagglutinationstest pä antigener. I sudana test blandar man ett prov av den vätska, som skall undersökas på ett antigen (t.ex. mänskligt serum), med latex~ partiklar, som har en beläggning av en antikropp för antigenet. I förfarandet enligt uppfinningen används F(ab')2-fragment i stället-_ för helt immunoglobulin som antikropp i beläggningen. Specifik bind- ning mellan beläggningen och antigenet leder till att Jatexpar- tiklarna blir agglutinerade. Agglutinationens omfattning kan be- dömas visuellt (för kvalitativa resultat) eller kvantiseras genom~ räkning (företrädesvis genom automatisk räkning av de agglutinerade eller lämpligast de oagglutinerade partiklarna).

Det är att märka, att i latexagglutinationstest med F(ab[)2-fragment ingen ditiotreitol får förekomma, eftersom denna , inhiberar agglutineringen. Eventuell ditiotreitol kan inaktiveras med väteperoxid. I Analysförfarandet enligt uppfinningen kan i passande fall genomföras med metoder för kontinuerlig strömming (vilka är kända), vid vilka individuella segment av reaktionsblandningen framförs genom en ledning skilda av inert segment (t.ex. luft- .segment) ooh eventuellt tvättvätskesegment{ Detta beskrivs i amerikanska patentskriften 2 797 1H9. _ _ _ Insolubiliserade F(ab')2-fragment kan framställas pä flera olika sätt. Fragmenten kan exempelvis absorberas på en lämplig bäryta. Alternativt kan helt immunoglobulin (t.ex. IgG) bindas kovalent vid en bäryta och sedan behandlas för avspjälk- ning av F(c)-fragmenten, varvid F(aD')2-fragmenten kvarlämnas kovalent bundna vid bäraren. Sålunda kan F(ab')q-belagd latex framställas pä vilket som helst av dessa båda sätt, dvs man kan' PooR QUALITY i m_ 20 25 30 35 t79OÜ661-5 -+ blanda latexen (försedd med-en absorptiv beläggning) med F(ah')?- fragment i en_huffert, varvid F(ab'l2-fragmenten absorberas _ direkt på latexen, eller också kan man koppla hel immunoglo- bulinantikropp till latexen och sedan spjälka den för att fri- göra.F(c)-fragmenten (vilka därpå kan bortskaffas från bland- ningen), kvarlämnande F(ab')2~fragmenten bundna vid latexen. I ett exempel på detta förfarande binds immunoglobulinet till latexen med den metod, som beskrivs i den samtidigt härmed in- givna patentansökan med prioritet från brittiska patentansökan 3238/78 av den 26 januari 1978. T korthet består metoden i att först belägga latexen med ett protein, som häftar starkt vid latexen och är relativt resistent mot proteolys. Ett exempel på ett sådant protein är laktoferrin. Immunoglobulínantikropparna kopplas sedan kovalent till laktoferrinet med hjälp av exempel- vis Leuchs anhydrid eller N-e-kloroacetvllysin (NPA) som kopp- lingsmedel. Latexlaktoferrin-NCA-antikropparna digerèras med- pepsin, exempelvis under följande betinqelser: 0,? M acetatbuffert, pH 3,2, förhållande pepsin till immunoglobulin 1:10. 0,5-nroc. latexsuspension, inkubation under 60 min vid 37oC. Man får så- lunda latexpartiklar med F(ab')2-fragment av immunoglobulinet.

De sålunda eller med absorptionsmetoden erhållna latex- partiklarna (eller andra F(ab')2-bärande material) agglutineras inte vid sådana Rïëhalter som uppträder i RF-rika sera. Latex- partiklarna kan med framgång användas i latexagglutinatíonstest på antigen även i närvaro av RF eller Û1q.

Uppfinníngen erbjuder också ett reagens för använd- ning i immunoanalys, vilket innefattar en suspension av finför- delat partikelformígt material med därvid bundna F(ab')2-fragment av ett immunoglobulin, vilken suspension är i huvudsak fri från immnnoglobulinet och F(c)-fragment därav. I sådana reagens kan "F(ab'),-fragmenten exempelvis vara kovalent bundna vid eller absorb erade på partiklarna. Partiklarna kan innehålla magnetiskt attraherbart material, och fragmenten kan ha en identifierande märkning. Partiklarna kan ha vilken lämplig storlek som helst, men i allmänhet ligger storleken inom området 1 - 20 um. Särskilt (ehuru inte enbart) för användning vid analys under kontinuerlig stromning bör partiklarna ha en densitet inom området 1,H - 3,2 g/ml, så att olämplig flotering eller sedimenteríng av partiklarna i reaktionsblandningen undviks.

Poox e QHAnæY:.-* 10 15 20 30 35 7900661 -5 01 ' Uppfinningen belyses av följande exempel. lí>íe%l_fl_ Framställning av F(ah')2-latexpartiklar genom agsgrption ' En 10-procentig suspension av latexpartiklar (Dow, 0,730 um diameter, SD 0;HH um, nr 01943, Serra Feinbiochemiea, Heidelberg, Tyskland) späddes 20 gånger med en buffert av 0,02 M glycin och 0,035 M natriumklorid, pH 3,1, och tvättades en gång med denna buffert. 1/10 volym F(ah')?-lösning, ? - 3'mg/ml, framställd på ovan-angivet sätt, tillsattes. Efter 10 ~ 15 min inkubation vid rumstemperatur tillsatte nan 1/10 volym 10-pro- - centig humanserumalbumín (HSA) i samma buffert som latexen för att säkerställa mättnad med protein. Efter ytterligare 20 - 30 min inkubation tvättades Iatexen två gånger med den ursprungliga bufferten och omsuspenderades därpå i den ursprungliga volymen buffert-av 0,10 M glycin och 0,17 M natriumklorid, pH 9,1,inne- hållande 1 % HSA, varvid man fick en 0,5-procentig latexsuspen- síon (dvs spådd 20 gånger i förhållande till den ursprungliga koncentrationen), Antíserum _ _ Antiserum för IgE framkallades hos kaniner med hjälp av Freunds kompletta adjuvant och snäddes 10 gånger med glycin- 'buffert innehållande 3 droppar "Tween 20" per liter. Lösningen _filtrerades genom ett 0,22 um "Milipore"-filter (GWSP 06700) före användning. êutomatisk analys Patientserum sögs i ett flöde av 0,1 ml/min genom en med kontinuerlig strömning arbetande anläggning innefattande en peristaltisk pump, ett ledningssystem, en partikelräknare och en skrivare. Serumet blandades med 1,0 ml glyeinbuffrad latex~ *partikelsuspension och leddes under 10 min genom en inkubations- slinga. Lösningen strömmade sedan in i en cellräknare, där antalet oagglutinerade partiklar räknades, varvid de agglutinerade partiklarna utsorterades på elektronisk väg. koncentrationen av IgE i serumet var direkt proportíonell mat ökningen av antalet partiklar inom området 6 - 100 IE (internationella enheter) lgE.

Från tretton patienter tagna prov, som kördes flera gånger genom apparaten, visade en variationskoeffieient av 2 % i mittområdet fnfiRPi-*fv 10 15 20 25 30 17900661-5 6 och en korrelatíonskoeffioient av 0,95 vid jämförelse med radio- immunoanalys.

Exemgel 2 Framställning av F(ab')2 kovalent bundet vid latex 12 mg N-9-kloroacetyllysín-M-karboxianhydrid (NCA) löst i 100 ul dioxan sattes till 50 mg íärnmättad laktoferrin i 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,2. Efter inkubering under 24 h i mörker vid ROC lyofiliserades preparatet för för- varing. Polystyrenlatexpartiklar (0;8 um diameter, 10-procentig suspension) belades genom blandning av 500 ng NCA-laktoferrin med 0,0 ml FBS och 50 ul 10-procentig latex. Efter 45 min in- kubation vid rumstemperatur tvättades partiklarna två gånger med 1 ml 0,2 M karbonatbuffert; pH 9,6. För undvíkande av hydrolys av kloroacetylgrupperna vid alkaliskt pH måste reducerad Igü- antikropp tillsättas omedelbart. IgG.framställdes ur antihästmjälte- ferritin från kanin-genom fällning med ammoniumsulfat och kroma- tografí på DEAE-cellulosa. Vid en slutlig koncentration av 8 mg/ml i 0,1 M fosfatlösning, pH 8,5, reducerades IgG under 1 h vid 37°C med 1,1 mM ditiotreitol. Blandningar innehållande 1 ml 0,5-procentig suspension av nyberedd NCA-laktoferrinlatex och varierande volymer (15 - 125 ul) lösning av reducerad IgG-anti- kropp befriades från syre genom att kväve bubblades igenom under några sekunder. Röret förseglades sedan i vakuum. Efter 2H h vid rumstemperaturen i mörker tvättades-latexrn två'qinqer med 0,0 M karbonatbuffert, pH 9,6, innehållande 1 % bovinserumalhu- min och 0,14% "Tween-20" och suspenderades ånyo i CBS-BSA. Icke kovalent bundet IgG bortskaffades med "Tween-20". För digerering av den till proteingränsytan kopníade antikroppen (IgG) sus- penderades partiklarna i 0,1 M acetatbuffert, pH 3,2, och in- kuberades 1 h vid 37OC med pepsin vid ett viktförhållande av 1/10 mellan enzym och substrat. Efter centriíugerinq och två tvättningar av partiklarna med 0,1 M glycin-vätekloridbuffert, pH 9,2, innehållande 0,17 M natriumklorid och 1 % bovinserumal- bumin (GBS-BSA), kontrollerades förekomsten av intakt IgG på partiklarna genom mätning av agglutinationen med reumatoida sera.

Latexpreparat, som reagerade med reumatoida sera, digererades åter med pepsin, tills ingen agglutination observerades. Latex- agglutinationstest på ferritin i serum utfördes på samma sätt u 7900661-5 7 som 1 exempæl 1 uud detta Pflagenï, vavvíd myclflt ßvda rrsulfaf erhölls._ - - ._ _ , ...__.. _. -.___............_...__...,...,...._«-__..,.__ % BQe>zzf*QïIÅmTY%

Claims (1)

10 lö 20 25 30 35 7900661-5 8 PATHNTKRQX

1. ' förfarande för analys av en fluid på ett antigen ¿cncm agglutinering, k ä n n e t e c k n a t av attman (a) blandar ett prov av fluiden med F(ab')2-fragment av ett immunoglobulin, som är specifikt för antigenet, under bildning av en reaktions- blandning, vari fragmenten är bundna vid vattenlösliga par- tiklar, varvid för undvikande av störning-från exogen Cíq och RF reaktionsblandningen är i huvudsak fri från helt immunoglobu- lin och F(c)-fragment därav, (b) inkuberar blandningen för I h att åstadkomma reaktion mellan F(ab')2-fragmenten och eventuellt närvarande antigen, för att framkalla agglutinering av par- tiklarna och (c) direkt bestämmer den omfattning, vari agglu- tinering har ägt rum i blandningen och därigenom förekomsten och/eller mängden av antigenet i fluidprovet.

2. * Förfarande enligt patentkravet 1, vari partiklarna är latexpartiklar. . 3.: förfarande enligt patentkravet 1, vari agglutineringens _omfattning bestäms genom selektiv räkning av de agglutinerade och oaggulutinerade latexnartiklarna.' U. _ Förfarande enligt patentkravet 1, vari partiklarna är magnetiskt attraherbara, och det partikelformiga materialet efter reaktionen mellan antigenet och fragmenten avskiljs medelst ett magnetiskt fält. ' ' _

5. _ förfarande enligt något av de föregående patentkraven,_ vari fluiden är en biologisk vätska. " 6.' Förfarande enligt patentkravet 1, vari fluiden är mänsk- ligt serum. _ _ _ '

7. Förfarande enligt något av de föregående patentkraven, vilket genomförs med metoder arbetande med kontinuerlig ström- ning.

8. förfarande enligt något av de föregående patent- kraven, vilket genomförs med en intermittent manuell metod.

9. Reagens för användning vid immunoanalys, innefattande en suspension av finfördelat partikelformígt material-med där- vid bundna F(ab')2-fragment av ett immunoglobulin, vilken sus- pension är i_huvudsak fri från immunoglobulin och F(c)-frag- ment därav. 79012661 -5 *J

10. Reagens enligt patentkravet 9, vari det partikel- formiga materialet innefattar magnetiskt attraherbart material.

11. Reagens enligt patentkravet 9 i form av en latex- suspension. '. 'ewa .wav _....f.-_.å>¿.- Å hv. íb x .www .<.u.«' . -\,. . __* . . - . _ I« _' .» ,v< -, -w <.~ > JN., ...u .>-=:=m.»..»....».-,«., h... f., -waß-...;.æw,_.u-.m-.. wflflm M a .ßu-qnfl-.tfl-n-U, ...t