SU1431662A3

SU1431662A3 - Способ получени реагента дл проведени реакции агглютинации

Info

Publication number: SU1431662A3
Application number: SU823430146A
Authority: SU
Inventors: Тсутсуй Сатоси; Судо Тадамитсу; Ито Митио
Original assignee: Мицубиси Кемикал Индастриз Лимитед (Фирма)
Priority date: 1981-05-02
Filing date: 1982-05-03
Publication date: 1988-10-15
Also published as: ATE15107T1; KR900002347B1; AU550925B2; DK157109C; PT74834B; HU186928B; EP0064275B1; ES511798A0; ES8401260A1; DK157109B; JPS57182168A; EP0064275A1; CA1186222A; NO159964B; AU8282482A; NO821448L; IL65648A0; CS241506B2; PT74834A; DE3265562D1

Abstract

Изобретение касаетс медицины. .в частности иммунохимических peai е; .-- тов. Цель изобретени - повьшение чувствительности реагента. Дл этого частицы носител , составл ющие часть реагента, размером 0,052-1,2 ьжм сен сибилизируют антигеном или антителом. Частицы носител , сенсибилизированные антигеном или антителом, перед суспен- дированием в водной среде обрабатьша- ют стабилизатором, включающим аминокислоты , белки, полипептиды, не осаждающиес в иммунологической реакции агглютинации. Водна среда с рН 5-10, в которой суспендируют носитель, имеет электропроводность 5,0 мс/см и . меньше и конечную концентрацию частиц 0,01-20%. 1 табл. о 9

Description

Nliili

СО

а о ю

Изобретение относитс к иммунохими- ческому реагенту , и может быть использовано в медицине, биохимии, гигиене и эпидемиологии при анализе следовых количеств соединений, особенно антигенов и антител.

Цель изобретени - повышение чувствительности реагента.

Способ осуществл етс следующим |Q образом.

Частицы носител , которые составл ют часть реагента по данному изоб- ретению, представл ют собой частицы практически нерастворимые в водной jj среде. Такие частицы носител могут быть изготовлены из любого подход щего соединени , которое включает в себ латексы таких полимерных соединений , как полистирол, бутадиенсти- 20 рольный сополимер, полиакрилат, полиме- такрилат, сополимер акрилонитрила с бутадиеном и стиролом, латексы этих полимеров , активированные введением карбоксильных или анидных групп с помощью со- 25 полимеризации с акриловой кислотой,ме- такрнповой кислотой, акриламидом и т.п. клетки крови, такие бактерии, как стафилококки и стрептококки, serra- tue marcescens, риккетсии, а также JQ части этих бактерий.

Средний диаметр частиц носителей равен от 0,05 до J,2 мкм или от 0,1 до 1,00 мкм, предпочтительно от 0,2 до 0,8 мкм. Если диаметр частиц носите- л слишком велик,то пределы анализа сужаютс или станов тс более нестабильными . С другой стороны, частицы носител с малым диаметром привод т к экономическим потер м при получении реагента и имеют низкую чувствительность . Следовательно, частицы как с Чрезмерно большим, так и с чрезмерно малыми р. диаметрами использовать не следует.45

Антигены, наносимые на частицы носител реагента по данному изобретению включают в себ , например, белки, полипептиды, стероиды, полисахариды, липиды, пыльцу, пыль, гаптены и т.п. Антитела включают в себ , например, белки, получаемые реакцией с указан- ными айтигенами.

Концентраци частиц носител обычно равна 0,03-0,3%, предпочтительно 0,05-0,2% (конечна концентрацрш). При более высокой концентрации частиц носител необходимо использовать более сложное.оборудование дл проведе55

Q

j 0 5 Q

5

ни анализа с реагентом по данному изобретению, причем дальнейшее увеличение эффективности не достигаетс . При низких концентраци х частиц не получают удовлетворительную чувствительность и реакционную способность.

Частицы носител можно сенсибилизировать антигеном или антителом по любой известной методике, т.е. физической адсорбцией антигена или антитела на частицах носител , химическим св зующим антигена или антитела с частицами носител либо комбинацией этих способов.

Количество антигена или антитела дл сенсибилизации носител выбирают в зависимости от конкретного типа антигена или антитела и нужной точности анализа с помощью данного реагента.

Частицы носител , сенсибилизированные антигеном или антителом, перед суспендированием в водной среде могут быть обработаны стабилизатором,включающим в себ аминокислоты, полипептиды , белки и т.п., которые не осаждаютс в данной иммунологической реакции , причем в качестве стабилизатора предпочтительно использовать сывороточный альбумин. Обработку стабилизатором предпочтительно проводить известным способом, с точки зрени хранени и стабильности реакции. Особенно значительный эффект достигаетс в тех случа х, когда антиген или антитело физически адсорбированы на носителе.

Водна среда, в которой суспендирован носитель, сенсибилизированный антигеном или антителом, должна иметь электропроводность, равную 5,0 или 2,5 мс/см, предпочтительно 1,0 мс/см и ниже. При электропроводности, пре- вьщ ающей 5,0 мс/см, реагент нестабильный , что приводит к снижению точности анализа.

Водна среда может представл ть собой воду, буферный раствор и т.п. и содержать одну или более добавку, выбранную из стабилизаторов, консервантов , хелатных агентов, поверхностно- активных соединений и т.д. Буферные растворы включают в себ глициновые буферы, буферы на основе фосфорной кислоты, цитратные буферы, барбитало- вые буферы, боратные буферы, буферы на основе системы трис(трис)гидрокси- метил(анинометан)-сол на кислота, трис-малатные буферы, аммонийные буферы и т.п.

Стабилизаторы включают в себ , например , указанные стабилизаторы в концентраци х 0,001-1%, предпочтительно 0,05-0,6%.

Предлагаемые консерванты включают в себ мертиолат и азид натри .

В качестве хелатных агентов используют этилен-диаминтетрауксусную кислоту , НИТрИЛТрИуКСуСНуЮ кислоту, ЦИК ЛО-

гександиаминтетрауксусную кислоту и т.п., в качестве поверхностно-активных соединений - неионогенные поверхностно-активные соединени .

рН водной среды равен 5-10 или 6-9,5, предпочтительно 6,5-8,5. Если рН водной среды меньше чем 5, то реагент нестабильный, хот чувствительность повышаетс . Водна среда, имеюща значение рН,более 10, приводит к снижению чувствительности и в некоторых случа х к нестабильности хранени реагента.

Частицы носител , сенсибилизированные антигеном или антителом, суспен- дируют в водной среде в концентрации 0,01-20%, предпочтительно 0,05-10%. При более низкой или более высокой концентраци х результирующий реагент имеет.пониженную стабильность, его использование становитс неудобным и ограниченным,

Предлагаемый реагент получают сенсибилизацией описанных частиц носител антигеном и антителом известным способом с последующей обработкой сен сибилизированного носител стабилизатором и суспендированием носител в водной среде известным способом.

Реагент по данному изобретению при годен в качестве реагента или основного раствора реагента дл проведени реакции на стекл нной пластинке или в испытательной пробирке с визуальньгм наблюдением за агглютинацией или при проведении реакции в оптической кювете с оптическим контролем за ходом реакции.

Реагент может быть использован дл анализа иммунологической реакции. Дл этого предлагаемый реагент разбавл ют буферным раствором и довод т концентрацию носител , сенсибилизированного антигеном или антителом, до уровн , пригодного дл анализа имму- нологической реакции.

Концентраци реагента зависит от вида анализируемого антитела или антигена , их концентрации и реакцион

5 о

0 5

5

ной способности, что определ етс экспериментально . В случае оптического изменени иммунологической реакции конечна концентраци носител равна не менее 0,03 вес.% или от 0,05 до 1 вес.% и более, предпочтительно 0,1-0,5 вес.%.

В случае визуального наблюдени иммунологической реакции результирующа концентраци лежит в интервале от 0,05 до 0,8 вес.%, предпочтительно от О, до 0,5 вес.%.

Буферные растворы, которые можно использовать дл разбавлени реагента , включают в себ глициновые буферы , боратные буферы, буферы трис- хлористоводородна кислота, трис-ма- латные буферы, аммонийные буферы и т.п.

рН используемых буферных растворов 7,6-9,6, предпочтительно.8,0-9,0. Буферный раствор с более низкими значени ми рН вызьшает агглютинацию и, следовательно, делает реагент непригодным , хот и приводит к повышению чувствительности. При более высоких значени х рН снижаетс чувствительность и могут нарушатьс свойства при хранении при повышенных температурах, что нежелательно.

Таким образом, при визуальном наблюдении иммунологической реакции заданное количество реагентов и образца , содержащего антиген или антитело, смешивают на стекл нной пластинке или в испытательной пробирке и наблюдают агглютинацию сенсибилизированных частиц .

В случае оптического измерени иммунологической реакции заданное количество реагента и образца, содержащего антиген или антитело, смешивают и определ ют в оптической кювете изменение светопропускани , светорассе ни или помутнени .

Если оптическое измерение провод т определением светопропускани , то обычно используют свет с длиной волны , большей чем средний диаметр частиц носител , с соотношением длины волны к диаметру частиц, равным не менее 1,1 или не менее 1,5 и предпочтительно не менее 2. Длина волны обычно лежит в интервале от 600 до 2400 нм, предпочтительно от 800 до 1800 нм. Если свет имеет меньшую длину , то дл получени подход щего светопропускани необходимо использовать частицы носител з достаточно низкой концентрации , а также реагент, имеющий крайне высокую диспергируемость, что приводит к трудности увеличени чувствительности и в некоторых случа х к обратимому протеканию реакции. Больша длина волны также нежелательна из-за снижени чувствительности. Свет может быть как монохроматическим, так IQ и полихроматическим. Оптическа кювета , используема дл измерени свето- , пропускани имеет толщину от 0,2 до 10 мм

Измерение пропускани можно прово- -ig дить определением времени, требуемого дл достижени заданного значени поглощени , либо определением повышени поглощени за определенный промежуток времени,7о

Оптическое измерение с использованием светорассе ни провод т, как при определении светопропускани .

Предлагаемые реагенты представл ют 25 собой сенсибилизированные частицы реагента дл использовани в иммунологических реакци х, С их помощью можно определ ть количества антигена или антитела в различных образцах с хоро- 30 шей воспроизводимостью и высокой точностью . Кроме того, они эффективны после замораживани и размораживани и, следовательно, могут быть лиофили- зованы и использованы повторно, . 5

Способ иллюстрируетс следующими примерами.

Пример «Глобулиновое антитело, против с -фетопротеина раствор ют в Ofi М глициновом буфере (рН 8,3). ло глобулиновых антител соответствует 800-1500 на каждую латексную частицу (имеющую диаметр О,052 мкм, производство фирмы Dow Chemical), Затем раствор смешивают с равным объемом латекс-- глицинового буфера (рН 8,8 при переешивании и комнатной температуре дл остижени адекватной сенсибилизации)„ После разделени центрифугированием супернатант удал ют и осадок обрабаты-gg вают соответствующим количеством бычьего сывороточного альбумина, Получен- ыв таким образом сенсибилизированные астицы суспендируют в буферном раст- оре с концентрацией частиц 1,0%, HMe-gg щем электропроводность i,5 мс/см и одержащем соответствующее количество онсерванта, после чего суспензию оставл ют на хранение, С результирующим

реагентом достигаетс отлична точность анализа.

Дл анализа иммунологической реак ции реагент разбавл ют глициновым буфером (рН 8,6).,

Результаты анализа представлены в таблице.

Примечание. Значени в скобках получены радиоиммунным анализом,

П р и м е р 2, Антитело анти-СРБ (С-реакционноспособного белка) раствор ют в 0,2 М боратном буфере (рН 8,8) и латексные частицы (диаметр 0,220 мкм, производство Dow Chemical) суспендированные в таком буфере, сенсибилизируют результирующим раствором таким образом, чтобы кажда частица несла на себе 800-1800 антигенов , Сенсибилизированные латексные частицы обрабатывают бычьим сывороточным альбумином и суспендируют в соответствующем количестве боратного буфера (4,0 мс/см) с концентрацией частиц 2,0%. Результирующий реагент обладает очень высокой точностью измерени .

Пример 3. Антитело F (аЬ )2 ю крысы или козы против человеческого фибриногена раствор ют в О,1 М трис- малатном буфере (рН 8,6), а латексные частицы (диаметром 1,091 мкм, производство Dow Chemical), суспендиро- is ванные в таком же буфере, сенсибилизируют результирующим раствором, чтобы чувствительность результирующего реагента бьша равна величине пор дка

раствор, иcпoльзye iьiй дл конечного суспендировани сенсибилизированных частиц, имеет проводимость, равную приблизительно 0,5-0,8 мс/см,

П р и м е р 6, Латексные частицы сенсибилизируют высокоочищенным крысиным антителом против человеческого

IgM в глициновом буфере с рН 9,6. Количественные соотношени измен ют в зависимости от качества антител и от нужной чувствительности. Сенсибилизированные частицы обрабатывают соот- ветстветствующим количеством бычьего сывороточного альбумина, а затем суспендируют в водном растворе, имеющем проводимость, равную приблизительно

1,2 мс/см, который может содержать приблизительно 0,05% бычьего сыворо100 нг/мл. Затем частицы обрабатывают 20 точного альбумина, в результате чего бычьин сывороточным альбумином и сус- получают целевой реагент с концентра- пендируют в водном растворе, содержащем 0,1% азида натри (1,0 мс/см) при концентрации частиц 0,01%, При использовании реагент разбавл ют трис-ма- 25 латным буфером (рН 8,4) или буфером трис-хлористоводородна кислота (рН 8,4) до нужной концентрации латекса и npoBOj HT реакцию на стекл нной пластинке либо реагент может использовать-30 с без разбавлени дл оптического анализа. При реакции на стекл нной пластинке с использованием этого реагента различают агглютинирующую и неагглютинирующзпо системы.gg

Пример4, Глобулиновов антитело козы против человеческого раствор ют в 0,1 М трис-малатном буфере (рН 8,8) и раствором сенсибилизируют латексные частицы (диаметром 0,312 мкм,40 получают в услови х примера 7, за производство Dow Chemical),суспен- исключением того, что используют анти- дированные в таком же буфере. Сенси- человеческое igg-антитело f(ab ).j и

цией частиц 2,5%.

Пример. Высокоочищенное крысиное антитело F (ab )i против hCG раствор ют в 0,2 М трвс-НС1 буфере (рН 8,6) и результирующий раствор используют дл сенсибилизации в нем ла- тексных частиц (диаметром 0,220 мкм, производство Dow Chemical), суспендированных в таком же буфере, при комнатной температуре. После обработки соответствующим количеством бычьего сывороточного альбумина сенсибилизированные частицы суспендируют в водном растворе, имеющем проводимость, равную приблизительно 0,8 мс/см, и концентрацию частиц 1%, и затем оставл ют на хранение,

П р и М е р 8. Латексный реагент

латексные частицы, имеющие диаметр 0,089 мкм (производство Dow Chemica 45 Концентраци латекса равна 0,25%, Ре зультирующий реагент показывает хоро шую точность анализа,

П р и М е р 9, Латексный реагент получают в услови х примера 7 за ис

билизированные частицы обрабатывают затем бычьим сывороточным альбумином и в конце суспендируют в водном растворе с концентрацией частиц 2%, имеющем проводимость, равную приблизительно 3,0 мс/см. При использовании суспензию разбавл ют 0,J М трис-малатным или трис-НС буфером до требуемой 50 лечением того, что используют антиконцентрации или используют сам по себе.

П р и М е р 5. Крысиное антитело F (ab ) 2 против человеческого IgA раствор ют в 0,2 М боратном буфере (рК 8,3), раствор обрабатывают также,

как в примере 4, и получают целевой реагент в суспензии с концентрацией 1% за исключением того, что водный

сеа (канцероэнбиотический антиген) титело f (ab ) и латексные частиц. имеющие диаметр 0,8 мкм (производст Dow Chemical), Концентраци латекса 55 равна 1%, Результирующий реагент по зьшает хорошую точность анализа,

Пример 0, Латексный реаген дл анализа в(-фетйпротеина получаю по методике, описанной в примере J,

1,2 мс/см, который может содержать приблизительно 0,05% бычьего сывороточного альбумина, в результате чего получают целевой реагент с концентра-

получают в услови х примера 7, за исключением того, что используют анти человеческое igg-антитело f(ab ).j и

цией частиц 2,5%.

П р и М е р 8. Латексный реагент

латексные частицы, имеющие диаметр 0,089 мкм (производство Dow Chemical), 45 Концентраци латекса равна 0,25%, Результирующий реагент показывает хорошую точность анализа,

П р и М е р 9, Латексный реагент получают в услови х примера 7 за исклечением того, что используют антисеа (канцероэнбиотический антиген) антитело f (ab ) и латексные частиц., имеющие диаметр 0,8 мкм (производство Dow Chemical), Концентраци латекса равна 1%, Результирующий реагент пока-- зьшает хорошую точность анализа,

Пример 0, Латексный реагент дл анализа в(-фетйпротеина получают по методике, описанной в примере J,

за исключением того, что электропроводность довод т до 5 мОм/см, Результирующий реагент показывает хорошую точность анализа.

Пример 1J, Повтор ют методику примера I с использованием частиц латекса размером 1,20 мкм. Реагент показывает высокую точность измерений,

Пример 2. Повтор ют методику использованную в примере 2, с использованием буферной среды, электропроводность которой составл ла 2,5 /см, Реагент показывает высокую точность измерений,

Таким образоМр предлагаемый реагент обладает высокой чувствительностью при обнаружении антигенов и антител , приближа сь по чувствительности к радиоиммунному анализу.

Claims

Формула изобретени

Способ получени реагента дл проведени реакции агглютинации, включающий сенсибилизацию частиц носител антигеном или антителом, и суспендиро- ванне в водной среде, отличающийс тем, что, с целью повышени чувствительности реагента, дл сенсибилизации используют частицы носител размером 0,052-1,2 мкм и сус- пендирование осуществл ют в среде с электропроводностью 5,0 мс/см и меньше и с концентрацией частиц 0,01- 20%.