ES2440326T3 - Kit de reactivo de ensayo y uso en un procedimiento para medir un analito en una muestra de ensayo - Google Patents

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Abstract

Un kit de reactivo de ensayo para medir un analito, comprendiendo dicho kit al menos una Solución Aque es una solución tampón que tiene una conductividad eléctrica no inferior a 30 mS/cm; y una Solución B quetiene una conductividad eléctrica no superior a 6,5 mS/cm, siendo dicha Solución B una suspensión de partículasque suspende partículas de vehículo insolubles que transportan una sustancia para capturar el analito.

Description

Kit de reactivo de ensayo y uso en un procedimiento para medir un analito en una muestra de ensayo
5 CAMPO TECNICO [0001] La presente invencion se refiere a un reactivo de ensayo para medir el analito en una muestra de ensayo, usando el nivel de aglutinacion por suspension de particulas que suspende particulas de vehiculo insolubles que transportan una sustancia para capturar el analito como indicador, asi como al suministro de un procedimiento
10 para medir el analito en una muestra de ensayo que usa el reactivo de ensayo anterior. TECNICA ANTERIOR [0002] El procedimiento de medida de una sustancia sujeta a medicion (antigeno o anticuerpo) en una
15 muestra de ensayo, que usa un reactivo de ensayo con suspension de particulas que suspende particulas de vehiculo insolubles que transportan un anticuerpo o antigeno, que usa el nivel de aglutinacion por las particulas despues de reaccion con la muestra de ensayo como indicador, se conoce como inmunoaglutinacion y se usa ampliamente.
20 [0003] Se ha referido que el vehiculo insoluble que transporta un anticuerpo puede dispersarse en una fase liquida con una fuerza ionica baja que tiene una concentracion de NaCl no superior a una concentracion prescrita, o inversamente, en una fase liquida con una fuerza ionica elevada que tiene una concentracion de NaCl no inferior a una concentracion prescrita.
25 [0004] El vehiculo insoluble que transporta una proteina suspendida en un disolvente con una fuerza ionica baja que tiene una concentracion de NaCl no superior a una concentracion prescrita, es decir, suspendida en un disolvente que tiene una conductividad electrica baja, es excelente para alcanzar una buena dispensabilidad y sensibilidad. Sin embargo, puede producirse una aglutinacion no especifica debida a contaminacion de iones por impurezas de muestras biologicas.
30 [0005] Se sabe que en las muestras biologicas existen interferencias que influyen en la reaccion inmunologica de la sustancia diana. Para evitar la influencia de las interferencias de la reaccion inmunologica se han usado ampliamente procedimientos que emplean reactivos con diversos aditivos. Por ejemplo, se conoce un procedimiento de uso de la solucion de reaccion para detectar una sustancia diana y la solucion tampon, que es un
35 segundo reactivo que contiene un aditivo, para evitar la influencia de las interferencias. En muchos casos, la solucion tampon tiene una conductividad electrica (aproximadamente de 15 a 20 ms/cm) cercana a la del suero salino. En sistemas de medida que usan un vehiculo insoluble de suspension de anticuerpos en una condicion de baja conductividad electrica, puede producirse aglutinacion no especifica cuando la solucion de reaccion se mezcla con la solucion tampon durante la medida.
40 [0006] En inmunoaglutinacion o similares, pueden usarse diversos aditivos (por ejemplo, polietilenglicol o guanidina) con el fin de aumentar la sensibilidad del reactivo. Sin embargo, si se usa un aditivo, la conductividad electrica aumentara y, por tanto, puede producirse aglutinacion no especifica cuando la solucion de reaccion se mezcla con la solucion tampon durante la medida.
45 [0007] Por otra parte, en los casos en que se usa un vehiculo insoluble que transporta una proteina en suspension en un disolvente que tiene una alta conductividad electrica, no se produce autoaglutinacion en un periodo de tiempo breve, no en un marco de varias horas. Sin embargo, la autoaglutinacion tiene lugar durante almacenamiento de larga duracion de varios dias o varios meses o mas, de manera que puede no conseguirse dicho
50 almacenamiento. [DOCUMENTOS DE LA TECNICA ANTERIOR] [DOCUMENTOS DE PATENTE]
[0008]
[Documento de patente 1] JP-2005-351.643-A [Documento de patente 2] JP-3.095.541-B
[Documento de patente 3] JP-5�-1�2.16�-A [Documento de patente 4] JP-�.0�5. �46-A
[DOCUMENTOS DISTINTOS DE PATENTE] 5
[0009]
[Documento distinto de patente 1] J. Biomater. Sci. Polymer Edn, Vol. 10, n° 11, pag. 1093-1105 (1999)
10 RESUMEN DE LA INVENCION
PROBLEMAS QUE SE RESOLVERAN MEDIANTE LA INVENCION
[0010] Un objeto de la presente invencion es proporcionar un kit de reactivo de ensayo para una sustancia
15 sujeta a medicion en una muestra de ensayo, usando el nivel de aglutinacion por una suspension de particulas que suspende particulas de vehiculo insolubles que transportan una sustancia para capturar la sustancia sujeta a medicion como indicador, en el que el reactivo no experimenta autoaglutinacion durante el almacenamiento, y con el que rara vez se produce aglutinacion no especifica durante la medida, asi como proporcionar un procedimiento de medida del analito en una muestra de ensayo.
20 MEDIOS PARA RESOLVER LOS PROBLEMAS
[0011] Los autores de la invencion realizaron estudios intensos para descubrir que no se produce autoaglutinacion durante la condicion de almacenamiento y que la aglutinacion no especifica puede inhibirse durante 25 la medida formando el reactivo de ensayo en un sistema de solucion binario que incluye una suspension de particulas y una solucion tampon, haciendo tambien la suspension de particulas con conductividad electrica inferior a un valor especifico, y haciendo la solucion tampon con conductividad electrica superior a un valor especifico que es mayor que el de la solucion tampon empleado normalmente en reactivos de ensayo, y mezclando la solucion tampon y la suspension de particulas inmediatamente antes del inicio de la operacion de medida, completando con ello la
30 presente invencion.
[0012] Es decir, la presente invencion proporciona un kit de reactivo de ensayo para medir un analito, comprendiendo el reactivo al menos una Solucion A que es una solucion tampon que tiene una conductividad electrica no inferior a 30 ms/cm; y una Solucion B que tiene una conductividad electrica no superior a 6,5 ms/cm, 35 siendo la Solucion B una suspension de particulas que suspende particulas de vehiculo insolubles que transportan una sustancia para capturar la sustancia sujeta a medicion. La presente invencion tambien proporciona un procedimiento de medida del analito en una muestra de ensayo usando el reactivo de ensayo anterior segun la presente invencion, comprendiendo el procedimiento las etapas de mezclado de la Solucion A, la Solucion B y la muestra de ensayo; y de medida del nivel de aglutinacion de las particulas en la mezcla obtenida, en el que al
40 menos la Solucion A y la Solucion B se mezclan inmediatamente antes del inicio de una operacion de medida, en el que dicha Solucion A se mezcla con dicha Solucion B en una cantidad tal que no se produce aglutinacion no especifica.
EFECTOS DE LA INVENCION
45 [0013] Mediante la presente invencion, dado que no se produce autoaglutinacion durante el almacenamiento, y la aglutinacion no especifica rara vez ocurre durante la medida, la sustancia sujeta a medicion en una muestra de ensayo puede medirse con precision.
50 BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
[0014]
La Fig. 1 muestra un modo del procedimiento de mezcla para mezclar la Solucion A, la Solucion B y
55 una muestra de ensayo cuando el procedimiento de la presente invencion se lleva a cabo usando un aparato de medida automatico. La Fig. 2 muestra otro modo del procedimiento de mezcla para mezclar la Solucion A, la Solucion B y una muestra de ensayo cuando el procedimiento de la presente invencion se lleva a cabo mediante un aparato de medida automatico usando un tubo en forma de Y.
La Fig. 3 muestra otro modo del procedimiento de mezcla para mezclar la Solucion A, la Solucion B y una muestra de ensayo cuando el procedimiento de la presente invencion se lleva a cabo usando un filtro de filtrado. La Fig. 4 muestra una curva de calibracion preparada en un Ejemplo de la presente invencion.
5 MODO DE REALIZAR LA INVENCION
[0015] Tal como se describe anteriormente, el kit de reactivo de la presente invencion comprende una Solucion A, que es una solucion tampon, y una Solucion B, que es una suspension de particulas. La Solucion A y la
10 Solucion B son dos liquidos separados contenidos en diferentes recipientes. Estas soluciones se mezclan inmediatamente antes de la operacion de medida. El modo de mezclado se describira mas adelante.
Solucion A (solucion tampon)
15 [0016] El agente tampon contenido en la Solucion A, que es una solucion tampon, puede ser un agente tampon bien conocido usado normalmente en reactivos de ensayo. Entre los ejemplos preferidos del agente tampon se incluyen aminoacidos como alanina, arginina, asparagina, acido aspartico, cisteina, glutamina, acido glutamico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina; sales de acidos carboxilicos como acido citrico, acido maleico y acido glutarico; sales de acido fosforico como
20 fosfato de sodio e hidrogenofosfato de sodio; sales de acido carbonico como carbonato de calcio y carbonato de magnesio; y tampon de Good. Se usan preferentemente tampon Tris, tampon de Good y tampones de fosfato, pero el agente tampon no se limita a ellos.
[0017] La conductividad electrica de la Solucion A es no inferior a 30 ms/cm, preferentemente no inferior a 35
25 ms/cm. No existe un limite superior especifico de la conductividad electrica, y la conductividad electrica es normalmente no superior a 200 ms/cm, preferentemente no superior a 100 ms/cm. Si se ajusta la conductividad electrica de la Solucion A a no menos de 30 ms/cm, puede inhibirse drasticamente la aglutinacion no especifica durante la medida. Las soluciones tampon usadas ampliamente en los reactivos de ensayo convencionales son aquellas que tienen una conductividad electrica similar a la del suero salino, es decir, aquellas que tienen una
30 conductividad electrica de aproximadamente 15 a 20 ms/cm. Asi, uno de los rasgos caracteristicos de la presente invencion es el uso de una solucion tampon que tiene una conductividad electrica superior a las de las soluciones tampon usadas normalmente. La conductividad electrica puede medirse mediante un procedimiento convencional usando un instrumento de medida de conductividad electrica ampliamente disponible en el comercio. La medida de la conductividad electrica se realiza a temperatura ambiente.
35 [0018] La conductividad electrica de la Solucion A puede ajustarse a un valor arbitrario ajustando la concentracion del agente tampon descrito anteriormente, o anadiendo un compuesto ionico acuoso. Entre los ejemplos del compuesto ionico acuoso se incluyen cloruros, bromuros y yoduros de metales alcalinos como sodio y potasio, y de metales alcalinoterreos como magnesio y calcio, asi como sales de acido carbonico, sales de acido
40 carbonico hidrogenadas, sales de acido acetico y sales de acido sulfurico que contienen estos metales; y alumbres. Entre ellos, NaCl es sencillo y se prefiere. Usando un instrumento de medida de conductividad electrica disponible comercialmente, la conductividad electrica de un liquido puede medirse en tiempo real, de manera que puede conseguirse facilmente una conductividad electrica deseada anadiendo el compuesto ionico acuoso mientras se mide la conductividad electrica.
45 [0019] Solucion B (suspension de particulas). Tal como se describe anteriormente, en la Solucion B, las particulas de vehiculo insolubles que transportan una sustancia para capturar la sustancia sujeta a medicion estan contenidas en un estado suspendido. Las particulas suspendidas no estan limitadas en absoluto, y pueden ser particulas bien conocidas usadas convencionalmente en los reactivos de ensayo.
50 [0020] Mas en particular, la sustancia para capturar la sustancia sujeta a medicion puede ser cualquier sustancia siempre y cuando pueda unirse especificamente a la sustancia sujeta a medicion, es decir, una sustancia que pueda unirse a la sustancia sujeta a medicion a traves de una reaccion de union especifica como reaccion de antigeno-anticuerpo o reaccion de ligando-receptor. El procedimiento en el que se usa una reaccion de antigeno
55 anticuerpo es un inmunoensayo bien conocido denominado inmunoaglutinacion. En los casos en que la sustancia sujeta a medicion es un antigeno, se transporta un anticuerpo que experimenta una reaccion de antigeno-anticuerpo con el antigeno, o un fragmento de union de antigeno del mismo (por ejemplo, fragmento Fab o fragmento F(ab')2 que conserva la capacidad de unirse con el antigeno). Incluso en los casos en que la sustancia sujeta a medicion es un anticuerpo, se transporta un anticuerpo o un fragmento de union de antigeno del mismo, ya que un anticuerpo es tambien un antigeno. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.
[0021] En los casos en que la sustancia sujeta a medicion es un antigeno, los ejemplos de la sustancia sujeta a medicion incluyen, pero no se limitan a: marcadores de proteinas como PCR (proteina C reactiva), antigeno 5 prostatico especifico, ferritina, β-2 microglobulina, mioglobina, megalina, podocalixina, transferrina, albumina y creatinina; diversos marcadores tumorales; lipoproteinas como LDL, HDL y TG; antigenos viricos como virus de influenza A, virus de influenza B, virus SR (VSR), rinovirus, rotavirus, norovirus, adenovirus, astrovirus, VHA, HB, VHC, VIH y VEB; antigenos de bacterias como Chlamydia trachomatis, estreptococos hemoliticos, Bordetella pertussis, Helicobacter pylori, leptospira, Treponema pallidum, Toxoplasma gondii, Borrelia, Legionella, bacteria del
10 carbunco y SARM; toxinas producidas por bacterias; antigenos lipidicos de micoplasma; hormonas peptidicas como gonadotropina corionica humana; esteroides como hormonas esteroideas; aminas fisiologicamente activas como epinefrina y morfina; vitaminas como vitaminas B; prostaglandinas; antibioticos como tetraciclina; productos agroquimicos; y hormonas ambientales. Entre los ejemplos preferidos se incluyen antigenos como PCR, antigeno prostatico especifico, ferritina y β-2 microglobulina.
15 [0022] En los casos en que la sustancia sujeta a medicion es un anticuerpo, entre los ejemplos se incluyen anticuerpos que reaccionan especificamente con el antigeno como los marcadores de proteinas descritos anteriormente, varios marcadores tumorales, lipoproteinas, antigenos viricos, antigenos bacterianos, toxinas producidas por bacterias o similares, hormonas peptidicas, esteroides, aminas fisiologicamente activas, vitaminas,
20 antibioticos, productos agroquimicos y hormonas ambientales.
[0023] En los casos en que el analito es un antigeno, las particulas de vehiculo son sensibilizadas con un anticuerpo que se une al analito. En los casos en que el analito es un anticuerpo, las particulas de vehiculo son sensibilizadas con un antigeno que se une al analito. En los casos en que el analito es un ligando, las particulas de
25 vehiculo son sensibilizadas con un receptor que se une al analito. En los casos en que el analito es un receptor, las particulas de vehiculo son sensibilizadas con un ligando que se une al analito.
[0024] El vehiculo insoluble puede ser tambien un material bien conocido que se usa convencionalmente en reactivos de ensayo. Los ejemplos del mismo incluyen latex de resina hechos de polietileno o poliestireno; y
30 particulas de oxido de aluminio, silice, oro coloide, particulas magneticas y similares. Entre estos vehiculos insolubles, se usan preferentemente particulas de latex, especialmente particulas de latex de poliestireno.
[0025] La concentracion de las particulas suspendidas en la Solucion B puede seleccionarse de forma apropiada dependiendo del tipo de sustancia para capturar el analito, el tipo de analito, la concentracion esperada de
35 analito en la muestra de ensayo y asi sucesivamente, y normalmente es de aproximadamente el 0,01 al 0,5%.
[0026] La conductividad electrica de la Solucion B es no superior a 6,5 ms/cm, preferentemente no superior a 5 ms/cm. Cuando la conductividad electrica de la Solucion B es no superior a 6,5 ms/cm, se evita la autoaglutinacion de las particulas durante el almacenamiento, y la aglutinacion no especifica durante la medida rara vez se produce.
40 No existe un limite inferior especifico de la conductividad electrica, y la conductividad electrica es normalmente no inferior a 0,1 ms/cm. La conductividad electrica no superior a 6,5 ms/cm se consigue usando agua, un alcohol (por ejemplo, etanol o similar), solucion de azucares (por ejemplo, glucosa, sacarosa, maltosa, lactosa) o similares como disolvente de la Solucion B. Puede anadirse cloruro de sodio o un agente tampon a la Solucion B en la medida en que pueda seguirse consiguiendo la conductividad electrica descrita anteriormente.
45 [0027] Con el kit de reactivo de ensayo de la presente invencion, es posible emplear concurrentemente un(os) aditivo(s) como reactivos de coloracion y reactivos de reaccion para detectar el analito; enzimas como colesterol-oxidasa y colesterol-esterasa; tensioactivos; proteinas para estabilizacion de anticuerpos o inhibicion de reacciones no especificas; azucares y glicerol para ajustar la densidad relativa. Estos aditivos pueden anadirse a la
50 Solucion A o la Solucion B, o a otro reactivo (otro liquido) separado de la Solucion A y la Solucion B.
Procedimiento de medida
[0028] El procedimiento de medida segun la presente invencion mediante el uso del kit de reactivo de ensayo
55 anterior comprende las etapas de mezcla de la Solucion A, la Solucion B y la muestra de ensayo; y de medida del nivel de aglutinacion de las particulas descritas anteriormente en la mezcla obtenida.
[0029] La muestra de ensayo no esta limitada en ningun modo siempre y cuando pueda contener el antigeno, anticuerpo o similar descrito anteriormente que es el analito. Sin embargo, dado que la aglutinacion no especifica durante la medida procede presumiblemente de la contaminacion de los iones de los contaminantes de la muestra de ensayo, la presente invencion demuestra al maximo su potencia cuando se aplica a una muestra de ensayo recogida de un ser humano o un animal, preferentemente el cuerpo humano. Entre los ejemplos de dicha muestra de ensayo se incluyen liquidos como sangre, suero, orina, liquido cefalorraquideo, sudor, liquido linfatico, saliva y jugos
5 gastricos; heces; pelo; cornea; y unas. En especial se emplea preferentemente sangre, suero o plasma originado de la sangre.
[0030] En relacion con la mezcla de la Solucion A, la Solucion B y la muestra de ensayo, el orden de mezclado no esta limitado siempre y cuando puedan mezclarse estos tres componentes (en los casos en que el 10 reactivo de ensayo incluya un aditivo separado, tambien el aditivo). El procedimiento de mezcla incluye un procedimiento en el que los tres componentes se mezclan simultaneamente; un procedimiento en el que la muestra de ensayo se mezcla despues de mezclar la Solucion A y la Solucion B; un procedimiento en el que la Solucion B se mezcla despues de mezclar la Solucion A y la muestra de ensayo; y asi sucesivamente. El procedimiento de aglutinacion que usa un aparato de medida automatico tambien se realiza ampliamente, y preferentemente en la 15 presente invencion puede emplearse tambien un aparato de medida automatico disponible comercialmente. Las formas de realizacion de mezcla de la Solucion A, la Solucion B y la muestra de ensayo mediante el uso de un aparato de medida automatico incluyen, por ejemplo, las mostradas en las fig. 1 y 2. En el procedimiento mostrado en la fig. 1, primero se anade el liquido inferior y despues se anade el liquido superior. El procedimiento mostrado en la fig. 2 es un procedimiento que usa un tubo en forma de Y, en el que la Solucion A y la Solucion B se reunen y se
20 mezclan, y a continuacion la mezcla obtenida se mezcla con la muestra de ensayo. El procedimiento mostrado en la fig. 3 es un procedimiento que usa un tubo de filtrado, en el que la Solucion A se coloca en el tubo, la muestra de ensayo se coloca en el filtro, la Solucion A y la muestra de ensayo se someten a filtrado con mezcla, y la mezcla resultante se vierte gota a gota en la Solucion B. Se prefiere agitar la mezcla despues del mezclado.
25 [0031] Al menos la mezcla de la Solucion A con la Solucion B se realiza inmediatamente antes del inicio de la operacion de medida. El termino quot;operacion de medidaquot; significa en la presente memoria descriptiva la operacion de medida del grado de aglutinacion de las particulas en la mezcla, y normalmente es la medida de absorbancia o turbidez. El termino quot;inmediatamente antesquot; significa en la presente memoria descriptiva en un plazo de 10 minutos, preferentemente en un plazo de 5 minutos, antes del inicio de la operacion de medida. Mediante la mezcla de la
30 Solucion A con la Solucion B inmediatamente antes del inicio de la operacion de medida, puede conseguirse prevenir la autoaglutinacion durante el almacenamiento y la aglutinacion no especifica durante la medida. Se prefiere ajustar la temperatura de los liquidos respectivos en el momento del mezclado a la temperatura a la que se realiza la reaccion, y normalmente de temperatura ambiente a 3��C.
35 [0032] Despues de la mezcla, la reaccion se lleva a cabo como en el procedimiento convencional normalmente durante aproximadamente 1 minuto a 1 hora, preferentemente durante aproximadamente 3 minutos a 15 minutos. El nivel de aglutinacion se mide de la misma forma que en los procedimientos convencionales, normalmente mediante un procedimiento optico, preferentemente midiendo la absorbancia o la turbidez. El analito en la muestra de ensayo puede medirse realizando medidas para muestras estandar que tienen varias concentraciones
40 conocidas; representando graficamente la relacion entre la concentracion y el valor medido (absorbancia o similares) para preparar una curva de calibracion; y aplicando el valor medido obtenido para una muestra de ensayo a la curva de calibracion. Se pretende que el termino quot;medidaquot; incluya cualquier operacion centre deteccion, cuantificacion y semicuantificacion.
45 [0033] A continuacion la presente invencion se describira mas en detalle por medio de un ejemplo. Sin embargo, la presente invencion no esta limitada al ejemplo mostrado seguidamente.
EJEMPLOS
50 Ejemplos 1 a 3, Ejemplos comparativos 1 a 5
[0034] Se midio la diferencia en la autoaglutinacion de la suspension de particulas (Solucion B) que suspende las particulas de vehiculo insolubles que transportan un proteina tal como se describe a continuacion. Usando el suero salino como muestra en blanco, se evaluo la diferencia en la aglutinacion no especifica en condiciones de
55 reaccion que tenian conductividad electrica variable de la solucion tampon (Solucion A). Ademas, se evaluo la diferencia en la sensibilidad midiendo la PCR.
[0035] Solucion A: Se anadio cloruro de sodio a una solucion tampon que contenia 100 mM Tris vigilando la conductividad electrica para alcanzar una conductividad electrica prescrita. Conductividad electrica: ms/cm (concentracion de cloruro de sodio: 50 mM, Ejemplos comparativos 1 y 5); 16 ms/cm (concentracion de cloruro de sodio: 150 mM, Ejemplo comparativo 2); 35 ms/cm (concentracion de cloruro de sodio: 400 mM, Ejemplo 1); 5
5 ms/cm (concentracion de cloruro de sodio: 1.000 mM, Ejemplo 2, Ejemplos comparativos 3 y 4), 200 ms/cm (concentracion de cloruro de sodio: 5.000 mM, Ejemplo 3).
[0036] Solucion B: Se anadio cloruro de sodio a una solucion de reaccion que tenia el 0,1% de latex de poliestireno con un tamano medio de particula de 220 nm que transportaba 0,25 mg/ml de anticuerpo anti-PCR
10 dispersado en el agua para conseguir la conductividad electrica prescrita Conductividad electrica: 5 ms/cm (cloruro de sodio: 50 mM, Ejemplos 1 a 3, Ejemplos comparativos 1 y 2), 15 ms/cm (cloruro de sodio: 150 mM, Ejemplo comparativo 3), ms/cm (cloruro de sodio: 1.000 mM, Ejemplos comparativos 4 y 5).
15 Procedimiento
[0037] Se midio la absorbancia inicial y la absorbancia al cabo de un mes de la Solucion B para verificar la aparicion de autoaglutinacion.
20 [0038] Se uso suero salino como una muestra de ensayo en blanco, y el reactivo obtenido mezclando la Solucion A y la Solucion B descritas anteriormente se sometio a medicion usando un analizador automatico para verificar la aglutinacion no especifica del reactivo. Mas en particular, en analizador automatico HITACHI �1� 0 (nombre comercial), se anadieron 120 μl de la Solucion A a 2,4 μl de suero fisiologico; se agito el liquido mezclado obtenido a 3 �C; se dejo en reposo la mezcla result ante durante 5 minutos; se anadieron 120 μl de la Solucion B
25 descrita anteriormente; y se mezclo adicionalmente la mezcla resultante con agitacion a 3��C. Se midio la reaccion de aglutinacion despues de 5 minutos como el cambio en la absorbancia a 5 �0 nm.
[0039] La medida de PCR se realizo usando una solucion de la muestra de ensayo que contenia 0,05 mg/dl de PCR, sometiendo el reactivo obtenido por mezclado de la Solucion A y la Solucion B descritas anteriormente a
30 medida por medio del analizador automatico para verificar el cambio en la absorbancia. Es decir, en analizador automatico HITACHI �1�0 (nombre comercial), se anadieron 120 μl de la Solucion A descrita anteriormente a 2,4 μl de 0,05 mg/dl de solucion PCR, se agito el liquido mezclado obtenido a 3��C; se dejo en reposo la mezcl a resultante durante 5 minutos; se anadieron 120 μl de la Solucion B descrita anteriormente; y se mezclo adicionalmente la mezcla resultante con agitacion a 3 �C. Se midio la reaccion de aglutinacion despues de 5 minutos como el cambio
35 en la absorbancia a 5�0 nm.
Procedimiento de evaluacion
[0040] En lo que se refiere a la autoaglutinacion, se midieron las absorbancias de particulas de latex de
40 poliestireno dispersadas al 0,1% y de la Solucion B antes y despues del almacenamiento, y se evaluo la autoaglutinacion a las conductividades electricas respectivas de acuerdo con los criterios de evaluacion mostrados a continuacion.
Criterios de evaluacion
45 [0041] Basandose en la absorbancia de la dispersion de particulas de latex de poliestireno al 0,1%:
O: la diferencia es del 15% o menos
X: la diferencia es de mas del 15%
50 [0042] Se evaluo la aglutinacion no especifica durante la medida basandose en el cambio en la absorbancia del suero salino, medida mediante un analizador automatico, de acuerdo con los criterios de evaluacion mostrados a continuacion.
55 Criterios de evaluacion
[0043]
O: El cambio en la absorbancia �Abs multiplicado por 10.000 es no mayor que 20
X: El cambio en la absorbancia Abs multiplicado por 10.000 es mayor que 20
Medida de PCR
5 [0044] Se midio la PCR calculando la diferencia entre el cambio en la absorbancia del suero salino, que es una muestra de ensayo en blanco, y el cambio en la absorbancia de 0,05 mg/dl de solucion de PCR, y comparando la sensibilidad.
Medida de la conductividad electrica
10 [0045] Se midieron las conductividades electricas de la Solucion A y la Solucion B usando el instrumento de medida de conductividad electrica CM-60G producido por TOA ELECTRONICS LTD. (electrodo: CT-5�101B, temperatura 25�C).
15 Resultados
[0046] Los resultados se muestran en la Tabla 1 a continuacion.
[0047]
Tabla 1
Conductividad electrica de la solucion B (ms/cm)
5 15
Absorbancia (Abs.)
Inicial 1,3� 2,4� 1,3�
Diferencia en absorbancia de dispersion de latex (%)
+10% +9�% +10%
Absorbancia (Abs.)
1 mes mas tarde 1,39 2,50 2,�1
Diferencia en absorbancia de dispersion de latex (%)
+11% +100% +115%
Valoracion: autoaglutinacion o: no x: si
o x x
Conductividad electrica de la solucion A (ms/cm)
16 35 �5 200 5 �5
Cambio en la absorbancia durante la medida de suero fisiologico (Δabs.x10.000)
443 2.202 2 -5 -3 5 -2
Valoracion: aglutinacion no especifica o: no x: si
x x o o o o o o
Cambio en la absorbancia durante la medida de solucion PCR 0,05 mg/dl (Δabs.x10.000)
- - 1.01� 443 169 11� 60 144
Diferencia
- - 1.019 44� 166 123 5 151
Valoracion final: o: buena x: inaceptable
x x o o o x x x
Ejemplo comparativo 1
Ejemplo comparativo 2 Ejemplo 1 Ejemplo 2 Ejemplo 3 Ejemplo comparativo 3 Ejemplo comparativo 4 Ejemplo comparativo 5
[0048] Tal como se muestra en la Tabla 1, en los Ejemplos comparativos 3 a 5 en los que la conductividad electrica de la Solucion B es mayor que el intervalo definido en la presente invencion, se produjo autoaglutinacion
5 despues de almacenamiento durante 1 mes (en el Ejemplo comparativo 3, la autoaglutinacion se produjo inmediatamente despues del mezclado). En los Ejemplos comparativos 1 y 2 en los que la conductividad electrica de la Solucion A es menor que el intervalo definido en la presente invencion, la absorbancia cambio incluso cuando se sometio a la medida el suero salino, es decir, se produjo aglutinacion no especifica.
10 [0049] Con los Ejemplos 1 a 3 y los Ejemplos comparativos 3 a 5 en los que no se produjo aglutinacion no especifica, se comparo el cambio en la absorbancia cuando se sometieron a la medida 0,05 mg/dl de solucion PCR. Los Ejemplos 1 a 3 mostraron un cambio mayor en la absorbancia que los Ejemplos comparativos 3 a 5. En el Ejemplo 2 y el Ejemplo comparativo 5, las conductividades electricas de la Solucion A y la Solucion B se ajustaron casi opuestas entre si, de manera que las conductividades electricas finales fueron aproximadamente iguales. Sin embargo, el Ejemplo 2 en el que la conductividad electrica se ajusto como inferior en la Solucion B que en la Solucion A segun la presente invencion mostro una absorbancia mas alta.
[0050] Asi, con el kit de reactivo de ensayo comprendiendo al menos la Solucion A, que es una solucion
5 tampon que tiene la conductividad electrica definida en la presente invencion, y la Solucion B y por el procedimiento de medida de la presente invencion, puede evitarse la autoaglutinacion de las particulas de latex en la Solucion B, consiguiendo con ello una estabilidad excelente durante el almacenamiento. Ademas, se evito la aglutinacion no especifica y se obtuvo una medida con alta sensibilidad.
10 Ejemplo 3
Preparacion de la curva de calibracion
[0051] Usando el reactivo del Ejemplo 2, se realizaron medidas usando soluciones de PCR estandar que
15 tenian diversas concentraciones de la manera descrita anteriormente para realizar la calibracion. La relacion entre el cambio obtenido en la absorbancia y la concentracion PCR se muestra en la fig. 4.
[0052] Tal como se muestra en la fig. 4, dado que el cambio en la absorbancia depende de la concentracion PCR, se demostro que la PCR puede cuantificarse usando este reactivo.
20 Ejemplo 4
Medida de la muestra de suero
25 [0053] Usando el reactivo del Ejemplo 2, se realizaron medidas de PCR para una muestra de suero de la manera descrita anteriormente. Las medidas se repitieron 20 veces y se investigo la reproducibilidad. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
[0054]
30 Tabla 2
Tiempo de medida
Absorbancia
1
0,101
2
0,101
3
0,105
4
0,101
5
0,103
6
0,102
0,104
0,103
9
0,101
10
0,103
11
0,102
12
0,105
13
0,104
14
0,104
15
0,103
16
0,105
1�
0,101
1�
0,105
19
0,102
20
0,101
Media
0,103
Desviacion tipica
0,002
CV
1,50%
[0055] Tal como se muestra en la Tabla 2, los resultados de la medida muestran que la reproducibilidad de la muestra de suero real, obtenida por el procedimiento de la presente invencion, fue muy alta.

Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un kit de reactivo de ensayo para medir un analito, comprendiendo dicho kit al menos una Solucion A que es una solucion tampon que tiene una conductividad electrica no inferior a 30 mS/cm; y una Solucion B que
    5 tiene una conductividad electrica no superior a 6,5 mS/cm, siendo dicha Solucion B una suspension de particulas que suspende particulas de vehiculo insolubles que transportan una sustancia para capturar el analito.
  2. 2. El kit de reactivo de ensayo segun la reivindicacion 1, en el que dicha Solucion A tiene una
    conductividad electrica no superior a 200 mS/cm. 10
  3. 3. El kit de reactivo de ensayo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicha sustancia para capturar la sustancia sujeta a medicion es un anticuerpo o un fragmento de union de antigeno del mismo, o un antigeno.
  4. 4. El kit de reactivo de ensayo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dichas 15 particulas de vehiculo insolubles son particulas de latex.
  5. 5. El kit de reactivo de ensayo segun la reivindicacion 4, en el que dichas particulas de latex son particulas de latex de poliestireno.
    20 6. Un procedimiento de medida de una sustancia sujeta a medicion en una muestra de ensayo que usa el kit de reactivo de ensayo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de mezclado de dicha Solucion A, dicha Solucion B y dicha muestra de ensayo; y de medida del nivel de aglutinacion de las particulas en la mezcla obtenida; en el que al menos dicha Solucion A y dicha Solucion B se mezclan inmediatamente antes del inicio de la operacion de medida, en el que dicha Solucion A se mezcla con dicha
    25 Solucion B en una cantidad tal que no se produce una aglutinacion no especifica.
    �. El procedimiento de medida segun la reivindicacion 6, en el que dicha muestra de ensayo es orina, liquido cefalorraquideo o heces.
    30 �. El procedimiento de medida segun la reivindicacion 6, en el que dicha muestra de ensayo es sangre, suero o plasma sanguineo.
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