JP2002310875A - 梅毒検査試薬及び梅毒検査方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 簡便な操作性を有し、高感度測定及び測定装
置の小型化が可能となる梅毒検査試薬及び検査方法を提
供する。 【解決手段】 不溶性担体に梅毒トレポネーマ抗原を担
持させてなる抗原−担体複合体、及び、水晶振動子より
成る梅毒検査試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、梅毒検査に用いる
検査試薬及び検査方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】梅毒感染を調べる方法の中に、梅毒抗原
と特異的に結合する抗体を測定する方法がある。これは
梅毒菌の破砕抽出物を直接抗原として用いて、患者血清
中の抗体との反応を利用する検査法であり、その中でも
赤血球に梅毒抗原を固定化して、抗体と反応させ凝集さ
せ検出する方法、いわゆるＴＰＨＡが現在広く用いられ
ている。

【０００３】例えば、特公昭６３−１４９１１号公報に
は、赤血球に梅毒菌から抽出・精製した抗原蛋白を担持
させて、これと測定試料中の抗体と反応させ、凝集・沈
殿することにより目視にて感染の有無を判定する方法が
記載されている。

【０００４】しかしながら、同方法は、測定試料をプレ
ート上で希釈液を用いて２倍段階希釈を行った後、抗原
感作血球を添加する等操作が煩雑であること、抗原抗体
反応により生じる凝集体沈殿物を目視で判定するため測
定値に誤差が生じやすいこと、測定感度が低いこと、等
の問題点を有している。

【０００５】このような測定値誤差や測定感度の低さを
解決するためには、抗体又は抗原を固定化した不溶性担
体粒子に抗原又は抗体を反応させて凝集体を形成させ、
これを光学的手法を用いて定量的に測定する方法が用い
られている。

【０００６】そのような場合、測定装置は、光源、モノ
クロメータ、受光素子、増幅器、積分器等、種々の光学
機器によって構成される。従って、装置全体が極めて大
きなものとなり、更に価格も高価となる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記現状に
鑑み、簡便な操作性を有し、高感度測定及び測定装置の
小型化を可能とする梅毒検査試薬及び検査方法を提供す
ることを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、不溶性担体に
梅毒トレポネーマ抗原を担持させてなる抗原−担体複合
体、及び、水晶振動子より成る梅毒検査試薬である。本
発明の梅毒検査試薬を用いる梅毒検査方法であって、水
晶振動子の周波数変化量を測定し、前記周波数変化量よ
り測定試料中の抗体量を求める梅毒検査方法もまた、本
発明の１つである。以下に本発明を詳述する。

【０００９】本発明は、水晶振動子利用測定法を応用し
た梅毒の免疫検査方法である。水晶振動子利用測定法と
は水晶振動子表面に物質が吸着することにより、その吸
着物質の質量に依存して水晶振動子の周波数が変化する
ことを利用した測定方法である。

【００１０】本発明は不溶性担体粒子に梅毒トレポネー
マ抗原を担持させてなる抗原−担体複合体と測定試料と
を液体媒体中で反応させ、同時に該反応に関わる抗原を
表面に固定化していない水晶振動子を該液体媒体中で発
振させ、該抗原抗体反応により生じる凝集体が水晶振動
子表面上に吸着することによる水晶振動子発振周波数の
変化量を測定して該抗体量を測定する、梅毒検査試薬及
び検査方法に関する。

【００１１】これは具体的には片面封止型の水晶振動子
を恒温キュベット中の抗原−担体複合体を含む液体媒体
に浸漬して発振させ発振周波数が安定したところで、該
発振周波数Ｆ１を測定し、次に該恒温キュベット中に測
定試料を一定量添加してそのまま攪拌を行い、再度発振
周波数が安定したところで測定し、この値をＦ２として
周波数変化ΔＦ２＝Ｆ１−Ｆ２を求める。

【００１２】得られたΔＦ２より、予め既知濃度の試料
を用いて作成した検量線に従い、分析試料中の測定しよ
うとする抗体の濃度を求めることができる。測定操作は
上記のごとく簡便であり、また血球凝集より高感度な測
定が可能となる。更に光学測定装置とは異なり、水晶振
動子測定装置は小型軽量化できる等の特徴を有してい
る。

【００１３】本発明で用いられる抗原−担体複合体は、
不溶性担体に梅毒トレポネーマ抗原を担持させてなるも
のである。上記不溶性担体としては本発明で用いられる
液体媒体に実質的に不溶性であれば特に限定されず、例
えば、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、
スチレン−スチレンスルホン酸ソーダ共重合体、スチレ
ン−メタクリル酸エステル共重合体、スチレン−クロル
メチルスチレン共重合体、塩素化ポリスチレン等の有機
高分子物質からなる粒子；シリカ、シリカ−アルミナ等
の無機酸化物微粒子；有機薄膜を被履したフェライト等
の磁性金属微粒子等が挙げられる。上記不溶性担体の粒
径は、０．０１〜１μｍであることが好ましい。０．０
１μｍ未満であると、充分な発振周波数変化が生じにく
くなり、１μｍを超えると、液体媒体中に安定に分散す
ることが困難となる。

【００１４】上記梅毒トレポネーマ抗原としては、梅毒
トレポネーマ（病原性Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄ
ｕｍ）菌体を破砕したものを直接用いてもよく、又は、
これを可溶化したものを用いてもよい。また、特開平４
−１８８０６７号公報に記載されているように、精製し
た梅毒トレポネーマ抗原を免疫原として免疫した動物か
ら回収した抗体を固定化したアフィニティクロマトグラ
フィーにより精製した梅毒トレポネーマ抗原を用いても
よい。

【００１５】上記不溶性担体に梅毒トレポネーマ抗原を
担持させる方法としては特に限定されず、公知の方法を
用いることができ、例えば、不溶性担体粒子にカップリ
ング剤等を用いて化学的に吸着させる方法、不溶性担体
として反応性官能基を粒子表面に有する高分子物質のラ
テックスを用いて化学的に吸着させる方法、疎水性相互
作用等を利用した物理的に吸着させる方法等が挙げられ
る。

【００１６】本発明で用いられる水晶振動子としては、
例えば、ＡＴカット、ＧＴカット、ＢＴカット等が挙げ
られ、電極の材質としては金や銀等が適している。水晶
振動子としては９ＭＨｚのものが汎用されているが、５
ＭＨｚ、３０ＭＨｚや５０ＭＨｚを用いてもよい。一般
に３０ＭＨｚ、５０ＭＨｚの水晶振動子で測定した周波
数値は９ＭＨｚのそれと比較して、それぞれ約１０倍、
約３０倍になり、より低濃度の抗梅毒梅毒トレポネーマ
抗体を検出・定量することが可能となり、高感度測定を
行うことができる。

【００１７】上記水晶振動子としては、高濃度電解質溶
液中での安定な発振を行うため、片面を絶縁性の板で封
止した型のものを用いることが好ましい。片面封止には
種々の公知の方法を用いることができるが、片面封止に
よる個体差を低減させるために水晶振動子の片面に、電
極部分を除いてシリコン接着剤を塗布し、水晶板と同じ
大きさの絶縁性の薄板（例えば、水晶板等）を貼り付け
て封止した素子を用いることが好ましい。更に、発振の
安定性を向上させるために、電極に接続しているリード
線のうち液体媒体中に浸漬する部分は、接着性に優れた
シリコン系樹脂等の接着剤等で完全に覆うことが好まし
い。

【００１８】更に、水晶振動子表面へのタンパク質等の
非特異的吸着を抑制するために予め測定しようとする抗
原や抗体以外のタンパク質で水晶振動子の表面を被覆し
ておいてもよい。

【００１９】本発明の梅毒検査試薬を用いた検査方法を
図１に模式的に示す。本発明の梅毒検査試薬を用いて検
査を行うと、抗原−担体複合体２と被測定対象物質であ
る抗梅毒抗体３とが抗原抗体反応により凝集体を形成す
る。この凝集体が水晶振動子１表面上に吸着することに
より、水晶振動子発振周波数が変化し、この変化量を測
定することにより抗梅毒抗体３量を測定することができ
る。

【００２０】以下に、本発明の検査方法の１態様を説明
する。本発明の検査方法を実施するにあたり、まず、測
定装置を組み立てることが必要であるが、本発明で用い
られる測定装置としては、例えば、特開平３−７７０６
１号公報に記載されているものを用いることができる。
上記測定装置において、水晶振動子チップは、発振回
路、周波数カウンター及びデータ処理用のマイクロコン
ピューターによって構成される測定システムに接続され
る。

【００２１】上記測定装置の組み立てに続いて、不溶性
担体粒子に梅毒トレポネーマ抗原が担持された抗原−担
体複合体を緩衝液溶液等の液体媒体中に分散させ、測定
用の恒温セル中にいれて攪拌子により一定速度で攪拌し
ておく。ここで、本発明で用いられる液体媒体として
は、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩
酸緩衝液等が好ましい。

【００２２】上記液体媒体として用いられる緩衝液のｐ
Ｈとしては、ｐＨ５．０〜９．０であることが好まし
い。この範囲外であると抗体抗原反応がおこりにくくな
る。より好ましくは、ｐＨ５．５〜７．５である。ま
た、これらの緩衝液のイオン強度としては、０．１〜１
００ｍＭであることが好ましい。この範囲外であると抗
体抗原反応がおこりにくくなる。より好ましくは、１〜
２０ｍＭである。

【００２３】上記抗原−担体複合体の液体媒体中の濃度
としては特に限定されず、適宜設定することができる
が、０．０１〜１．０重量％であることが好ましい。
０．０１重量％未満であると、抗原抗体反応を充分に行
わせることができず、１．０重量％であると、抗原−担
体複合体が液体媒体中で安定に分散することが困難にな
る。

【００２４】測定の際の反応温度としては、１０〜４０
℃であることが好ましい。この温度範囲外であると、抗
体抗原反応が起こりにくくなる。より好ましくは、１５
〜３０℃である。

【００２５】上記攪拌子の回転速度としては、５００〜
１５００ｒｐｍであることが好ましい。５００〜１５０
０ｒｐｍであると、抗原抗体反応を、速やかに行わせる
と同時に発振を安定に行わせることができる。より好ま
しくは、８００〜１０００ｒｐｍである。上記攪拌子は
反応中は一定の回転速度を保つことが好ましい。

【００２６】上記測定装置において、一度使用した水晶
振動子は、タンパク質等による汚染を洗浄除去して、再
度使用してもよいが、水晶振動子は廉価であることから
一測定毎に取り替えてもよい。

【００２７】次に水晶振動子を上記恒温セル中の液体媒
体に浸漬して発振させる。発振周波数が安定したところ
で、周波数を測定し、これをＦ１とする。次に、測定試
料の混合物を添加し、免疫反応を開始する。そのまま攪
拌を続け、周波数変化が安定した値を測定する。これを
Ｆ２とし、Ｆ１からＦ２を引いた値をΔＦ２とする。得
られたΔＦ２を予め抗体濃度既知の標準血清を用いて同
様の操作を行って作成した検量線（抗体濃度−周波数変
化）に挿入して、測定試料中の抗体濃度を算出する。こ
のような本発明の検査方法によれば、測定試料中の抗体
濃度を簡便かつ高感度に測定することが可能となり、梅
毒感染を容易に判定することが可能となる。

【００２８】

【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。

【００２９】水晶振動子は日本電波工業社製ＡＴ−Ｃｕ
ｔ９ＭＨｚ（金電極）を用いた。梅毒トレポネーマ抗原
担持不溶性担体粒子は積水化学工業社製の抗トレポネー
マ抗体測定用メディエース梅毒トレポネーマＬＡを用
い、標準血清である梅毒抗体陽性血清（０、４５、１１
４、２８３、４８５ Ｔｉｔｅｒ Ｕｎｉｔ）も積水化
学工業社製のものを用いた。

【００３０】測定は同水晶振動子、発振回路及び周波数
カウンター（ＱＣＡ９１７、ＳＥＩＫＯ ＥＧ＆Ｇ社
製）を用いて行い、データはパーソナルコンピューター
を用いて取り込み、データの解析を行った。

【００３１】測定は吸光度測定用セルを１０×１０×１
２ｍｍに加工したものを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６．５）を１．２ｍＬ、ラテックス試薬を０．１ｍＬ入
れてスターラーで攪拌した。

【００３２】この溶液に水晶振動子の片側にシリコン樹
脂で水晶の素板を貼り合わせ片側の電極のみが溶液に接
するようにした水晶振動子を入れ、周波数が安定したと
ころで周波数Ｆ１を測定した後、標準血清を２０μＬ加
え、血清を加えてから１０分後の周波数Ｆ２を測定し
た。

【００３３】Ｆ１の値からＦ２の値を差し引き周波数変
化量ΔＦ２を算出した。なお、本測定は恒温槽の中で２
０℃で行った。結果を表１及び図２に示した。

【００３４】

【表１】

【００３５】

【発明の効果】本発明の試薬を用いて測定すれば、非常
に簡単な操作で、迅速にかつ高精度な梅毒検査を行うこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の梅毒検査試薬を用いた検査方法を模式
的に示した図である。

【図２】本発明における抗梅毒抗体濃度と周波数変化量
の関係を示すグラフである。

【符号の説明】

１ 水晶振動子 ２ 抗原−担体複合体 ３ 抗梅毒抗体

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 土居 淳 大阪府三島郡島本町百山２−１ 積水化学 工業株式会社内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 不溶性担体に梅毒トレポネーマ抗原を担
   持させてなる抗原−担体複合体、及び、水晶振動子より
   成ることを特徴とする梅毒検査試薬。
2. 【請求項２】 請求項１記載の梅毒検査試薬を用いる梅
   毒検査方法であって、水晶振動子の周波数変化量を測定
   し、前記周波数変化量より測定試料中の抗体量を求める
   ことを特徴とする梅毒検査方法。