JP3598333B2 - 水晶振動子を用いた測定試薬及び測定方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、水晶振動子を用いて微量成分を測定する測定試薬及び測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、医療検査・環境測定・食品検査等の領域において、微量成分を短時間で簡便に測定することが重要な課題となっており、そのような微量成分の測定方法として、免疫反応等の生物学的親和性を利用する方法が提案され、開発が進められている。
【０００３】
そのような方法の中で、近年注目されているのが水晶振動子を用いた測定方法である。この測定方法によれば、水晶振動子表面に物質が吸着することにより、その吸着物質の重量に比例して水晶振動子の周波数が変化することを利用して微量成分の検出、測定をすることができる。
水晶振動子を用いた微量成分の測定方法としては、通常、予め水晶振動子表面に認識素子を吸着・固定化し、これと被測定物質とを反応させ、反応前後の周波数変化量を求めることにより、被測定物質の認識素子との反応性及び被測定物質の質量を測定する方法が用いられている。
【０００４】
抗原又は抗体を担持した不溶性担体粒子と水晶振動子とを組み合わせた抗原−抗体反応の測定方法としては、以下の方法が提案されている。
特開昭６３−１１８３５号公報に記載されている方法は、水晶振動子表面に抗体又は抗原を固定化した水晶振動子バイオセンサーにおいて、抗原−抗体反応によって結合した基質に更に抗体又は抗原を固定化したラテックス又はその他の微粒子を抗原−抗体反応によって結合させることによって水晶振動子バイオセンサーの感度を増幅させるというものである。
【０００５】
しかしながら、特開昭６３−１１８３５号公報に記載されている方法では、抗原が複数の抗体結合部位を有する高分子であることが不可欠である。
被測定物質がダイオキシン類をはじめとする環境汚染物質等のように低分子である場合や抗体結合部位を一箇所しか有さない場合には、抗体又は抗原を固定化したラテックスが被測定物質に結合することができず、同方法では測定することが困難であった。
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記に鑑み、測定対象が低分子物質や、抗体結合部位を一箇所しか有さない物質であっても高感度で測定を行うことができる測定試薬及び測定方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、被測定物質に対する特異的結合能を有する認識素子が水晶振動子に固定化されてなる水晶振動子センサ、及び、前記被測定物質が高分子タンパク質に複数個結合してなる競合標準物質から成る測定試薬である。
【０００８】
本発明の測定試薬を用いる測定方法であって、水晶振動子の周波数変化量を測定し、上記周波数変化量より測定試料中の被測定物質の量を求める測定方法もまた、本発明の１つである。
以下に本発明を詳述する。
【０００９】
本発明は、水晶振動子表面に物質が吸着することにより、その吸着物質の重量に比例して水晶振動子の周波数が変化することを利用して被測定物質の質量を測定する方法を用いるものであるが、従来の方法とは異なり、被測定物質を高分子タンパク質等に複数個結合させて、これを競合標準物質とし、検体中の被測定物質と競合させる競合反応を用いることを特徴とするものである。
従って、本発明においては、従来の方法とは異なり、検体中に存在する被測定物質が多いほど、競合標準物質と水晶振動子表面の認識素子との結合が妨げられるために周波数変化量が減少する。
【００１０】
本発明の測定試薬は、被測定物質に対する特異的結合能を有する認識素子が水晶振動子に固定化されてなる水晶振動子センサ、及び、前記被測定物質が高分子タンパク質に複数個結合してなる競合標準物質から成るものである。
【００１１】
本発明の測定試薬の被測定物質としては特に限定されず、例えば、ヒト血清、尿、体液、河川・湖沼の水、汚泥、焼却炉の煤塵等に含まれる微量成分等が挙げられる。
上記微量成分としては、例えば、コプラナーＰＣＢ類を含むダイオキシン類、内分泌攪乱物質に指定されたいわゆる環境ホルモン等を始めとする環境汚染物質やヒト体内中の微量ホルモン類等が挙げられる。
【００１２】
本発明の測定試薬は、被測定物質が分子量１００〜１０００程度の低分子物質や抗体結合部位を一箇所しか有さない物質であっても高感度に測定することができる。
【００１３】
本発明で用いられる水晶振動子センサは、被測定物質に対する特異的結合能を有する認識素子が水晶振動子に固定化されてなるものである。
上記認識素子としては被測定物質に対する特異的に結合するものであれば特に限定されず、例えば、被測定物質と抗原抗体反応を起こす抗体、被測定物質を特異的に認識するレセプター分子等が挙げられる。
【００１４】
上記抗体としては、例えば、被測定物質及びハプテン化被測定物質を抗原として、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の動物を免疫し、その血清からＩｇＧ画分を精製して得られるポリクローナル抗体；細胞融合法により得られるモノクローナル抗体等が挙げられる。
上記抗体として、例えば、酵素処理等により得られるＦ（ａｂ´）_２、Ｆａｂ´やＦａｂを用いてもよく、更に遺伝子組換え技術により調製したＦａｂ´やｓｃＦｖ等を用いてもよい。
【００１５】
上記レセプター分子としては特に限定されないが、例えば、ダイオキシン類はＡｈ（アリルハイドロカーボン）レセプターと結合することが知られており、このようなセプターを用いることができる。
【００１６】
上記認識素子としては、他に被測定物質との結合能を有するペプチドやＤＮＡ等を用いてもよく、更に、モレキュラーインプリンティング法により作製される、被測定物質と相補的な結合部位を有した高分子ポリマーを用いてもよい。
【００１７】
上記水晶振動子としては、例えば、ＡＴカット、ＧＴカット、ＢＴカット等が挙げられ、電極の材質としては金や銀等が適している。
上記水晶振動子の発振周波数としては特に限定されず、用途に従い適宜選択すればよいが、５〜５０ＭＨｚが好ましい。５ＭＨｚ未満であると、感度が充分ではなく、５０ＭＨｚを超えると、ノイズが生じるために実用的ではない。より好ましくは、９〜３０ＭＨｚである。
【００１８】
上記水晶振動子に認識素子を固定化する方法としては特に限定されず、公知の方法を用いることができ、例えば、ｃｙｔｅａｍｉｎｅ処理した後グルタルアルデヒド処理を施した水晶振動子に、認識素子を吸着させる方法等が挙げられる。
【００１９】
本発明で用いられる競合標準物質は、被測定物質が高分子タンパク質に複数個結合したものである。
上記高分子タンパク質としては特に限定されないが、入手の容易さや経済的な面から、例えば、生化学分野等で汎用されている分子量数万以上のタンパク質である血清アルブミン、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等の酵素等が好適に用いられる。
【００２０】
上記被測定物質を高分子タンパク質に複数個結合させる方法としては、例えば、混合酸無水物法、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法、同反応性架橋法、Ｎ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）スクシンイミド型架橋法等が挙げられる。
【００２１】
本発明の測定試薬は、更に、被測定物質に対する特異的結合能を有する認識素子が不溶性担体に固定化されてなる凝集素子を含有することが好ましい。
水晶振動子に固定された認識素子−競合標準物質複合体に、更に、凝集素子が結合することにより重量が増加し、その結果、周波数変化量が増幅し、より低濃度の被測定物質を検出・定量することが可能となる。
【００２２】
上記不溶性担体としては本発明で用いられる液体媒体に実質的に不溶性であれば特に限定されず、例えば、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸ソーダ共重合体、スチレン−メタクリル酸エステル共重合体、スチレン−クロルメチルスチレン共重合体、塩素化ポリスチレン等の有機高分子物質からなる粒子；シリカ、シリカ−アルミナ等の無機酸化物微粒子；有機薄膜を被履したフェライト等の磁性金属微粒子等が挙げられる。
上記不溶性担体の粒径は、０．０１〜１μｍであることが好ましい。０．０１μｍ未満であると、充分な発振周波数変化が生じにくくなり、１μｍを超えると、液体媒体中に安定に分散することが困難となる。
【００２３】
上記不溶性担体に認識素子を固定化する方法としては特に限定されず、公知の方法を用いることができ、例えば、不溶性担体粒子にカップリング剤等を用いて化学的に吸着させる方法、不溶性担体として反応性官能基を粒子表面に有する高分子物質のラテックスを用いて化学的に吸着させる方法、疎水性相互作用等を利用した物理的に吸着させる方法等が挙げられる。
【００２４】
本発明の測定試薬を用いた測定方法を図１に模式的に示す。本発明の測定試薬を用いて測定を行うと、水晶振動子センサ１の認識素子に対して、競合標準物質２と検体中の被測定物質３とが競合的に結合する。このため、本発明の測定試薬によれば、被測定物質３が分子量１００〜１０００程度の低分子物質や抗体結合部位を一箇所しか有さない物質であっても高感度に測定することができる。本発明の測定試薬を用いた場合、検体中に存在する被測定物質３が多いほど、競合標準物質２と認識素子との結合が妨げられるので周波数変化量が減少する。更に、本発明の測定試薬に凝集素子４を加えると、水晶振動子センサ１に結合した競合標準物質２に、凝集素子４が結合することにより重量が増加し、その結果、周波数変化量が増幅し、より低濃度の被測定物質を検出・定量することが可能となる。
【００２５】
以下に、上記認識素子として抗体を用いた場合を例として掲げ、本発明の測定方法の１態様を説明する。
本発明の測定方法を実施するにあたり、まず、測定装置を組み立てることが必要であるが、本発明で用いられる測定装置としては、例えば、特開平３−７７０６１号公報に記載されているものを用いることができる。上記測定装置において、水晶振動子チップは、発振回路、周波数カウンター及びデータ処理用のマイクロコンピューターによって構成される測定システムに接続される。
【００２６】
まず水晶振動子に抗体を担持させ、この状態で水晶振動子の周波数を測定する。次に、抗原を複数結合したタンパク質及び抗原が含まれている検体の混合物を添加して、競合的免疫反応を行う。
【００２７】
このとき検体中に抗原が含まれていれば、抗原を複数結合したタンパク質が水晶振動子表面に担持された抗体に結合することが阻害される。水晶振動子の周波数は表面上に結合した物質の重量依存して減少するため、抗原結合タンパク質が水晶振動子に吸着する重量が減少すれば、周波数減少値も小さくなる。水晶振動子表面上の抗体と結合していない、遊離している抗原結合タンパク質を除去・洗浄する。この状態で水晶振動子周波数を測定する。
【００２８】
次に周波数変化値を増幅させるため、抗体を吸着させた不溶性担体粒子を加え抗原抗体反応を起こさせる。すなわち抗原結合タンパク質を水晶振動子上の抗体と不溶性担体粒子上の抗体で挟み込む、サンドイッチ状態にしてより重量を増加させることにより周波数変化を増幅させる。
以上の測定の間の反応温度は室温でも可能であるが、好ましくは２５〜３７℃の環境下で行うことが好ましい。
【００２９】
本発明では、数種類の既知濃度の被測定物質を用いて検量線を作成し、これを用いて検体中の被測定物質の濃度の算出を行う。
上記測定装置において、一度使用した水晶振動子は、タンパク質等による汚染を洗浄除去して、再度使用してもよいが、水晶振動子は百円程度と廉価であることから一測定毎に取り替えてもよい。
【００３０】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３１】
以下に、本発明の実施例として低分子量化合物である２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）を被測定物質とした測定系について説明する。
（実施例１）
＜水晶振動子の抗ＤＮＰ抗体固定化＞
水晶振動子はＡＴカット（９ＭＨｚ）を用いた。金電極表面を０．０１Ｍのｃｙｔｅａｍｉｎｅ処理し、続いて１％グルタルアルデヒド処理した後、精製水で洗浄した。次に５０μｇ／ｍＬの濃度にした抗ＤＮＰモノクローナル抗体液を３０μＬ加え、室温で９０分間インキュベーションすることにより固定化した。
【００３２】
精製水で洗浄後、ブロッキングするため０．０２Ｍのグリシン液を３０μＬ加え、室温で２０分間インキュベーションした。精製水で洗浄後、ＱＣＭの発振周波数測定を行いその測定値をＦ１とした。
【００３３】
＜抗原抗体反応Ｉ＞
１ｎｇ／ｍＬのＤＮＰ結合牛血清アルブミン（シグマ社製）溶液にＤＮＰ（シグマ社製）をそれぞれ０、０．０１、０．１、１．０、１０、１００ｎｇ／ｍＬとなるように溶解した液を調製し、これを抗原液とした。
【００３４】
この抗原液１０μＬを実施例１で調製した抗ＤＮＰ抗体固定化水晶振動子に加え、室温にて６０分間インキュベーションすることにより抗原抗体反応Ｉを行った。反応終了後、精製水で洗浄し、ＱＣＭの発振周波数測定を行いその測定値をＦ２とした。
Ｆ１からＦ２を差し引いた値をΔＦ２とした。結果を表１及び図２に示した。
【００３５】
【表１】

【００３６】
表１及び図２示した結果より、上記の方法によれば０．０１〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＤＮＰを測定できることが明らかとなった。
【００３７】
（実施例２）
＜抗原抗体反応ＩＩ（ラテックス試薬による増感反応）＞
１ｎｇ／ｍＬのＤＮＰ結合牛血清アルブミン（シグマ社製）溶液にＤＮＰ（シグマ社製）をそれぞれ１ｎｇ／ｍＬとなるように溶解した液を調製し、これを抗原液とした。実施例１と同様にして抗原抗体反応を行い、洗浄後に免疫試薬用ラテックス（積水化学工業社製）に抗ＤＮＰモノクローナル抗体を固定化した抗ＤＮＰラテックスけん濁液（固形分０．０１％）３０μＬを加え、室温にて９０分間インキュベーションすることにより抗原抗体反応ＩＩを行った。反応終了後、精製水で洗浄し、ＱＣＭ測定を行い測定値をＦ３とした。
Ｆ１からＦ３を差し引いた値をΔＦ３とした。結果を表２に示した。
【００３８】
【表２】

【００３９】
ラテックス粒子を添加することにより周波数変化の測定値は１０倍以上となり、増幅作用が確認された。
【００４０】
【発明の効果】
本発明は、上述の構成よりなるので、非常に簡単な操作で迅速かつ高精度で低分子物質の測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の測定試薬を用いた測定方法を模式的に示した図である。
【図２】本発明におけるＤＮＰ濃度と周波数変化量の関係を示すグラフである。
【符号の説明】
１ 水晶振動子センサ
２ 競合標準物質
３ 被測定物質
４ 凝集素子

Claims (4)

1. 被測定物質に対する特異的結合能を有する認識素子が水晶振動子に固定化されてなる水晶振動子センサ、前記被測定物質が高分子タンパク質に複数個結合してなる競合標準物質、及び、被測定物質に対する特異的結合能を有する認識素子が不溶性担体に固定化されてなる凝集素子を含有し、
   前記被測定物質は、分子量１００〜１０００の低分子物質又は抗体結合部位を一箇所しか有さない物質である
   ことを特徴とする測定試薬。
2. 認識素子は、被測定物質を抗原として特異的に結合することができる抗体であることを特徴とする請求項１記載の測定試薬。
3. 認識素子は、被測定物質に対する特異的に結合することができるレセプター分子であることを特徴とする請求項１記載の測定試薬。
4. 請求項１、２又は３記載の測定試薬を用いる測定方法であって、水晶振動子の周波数変化量を測定し、前記周波数変化量より測定試料中の被測定物質の量を求めることを特徴とする測定方法。

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