JP2002310873A - 水晶振動子を用いた測定試薬及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 測定対象が低分子物質や、抗体結合部位を一
箇所しか有さない物質であっても高感度で測定を行うこ
とができる測定試薬及び測定方法を提供する。 【解決手段】 被測定物質に対する特異的結合能を有す
る認識素子が水晶振動子に固定化されてなる水晶振動子
センサ、及び、前記被測定物質が高分子タンパク質に複
数個結合してなる競合標準物質から成る測定試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、水晶振動子を用い
て微量成分を測定する測定試薬及び測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、医療検査・環境測定・食品検査等
の領域において、微量成分を短時間で簡便に測定するこ
とが重要な課題となっており、そのような微量成分の測
定方法として、免疫反応等の生物学的親和性を利用する
方法が提案され、開発が進められている。

【０００３】そのような方法の中で、近年注目されてい
るのが水晶振動子を用いた測定方法である。この測定方
法によれば、水晶振動子表面に物質が吸着することによ
り、その吸着物質の重量に比例して水晶振動子の周波数
が変化することを利用して微量成分の検出、測定をする
ことができる。水晶振動子を用いた微量成分の測定方法
としては、通常、予め水晶振動子表面に認識素子を吸着
・固定化し、これと被測定物質とを反応させ、反応前後
の周波数変化量を求めることにより、被測定物質の認識
素子との反応性及び被測定物質の質量を測定する方法が
用いられている。

【０００４】抗原又は抗体を担持した不溶性担体粒子と
水晶振動子とを組み合わせた抗原−抗体反応の測定方法
としては、以下の方法が提案されている。特開昭６３−
１１８３５号公報に記載されている方法は、水晶振動子
表面に抗体又は抗原を固定化した水晶振動子バイオセン
サーにおいて、抗原−抗体反応によって結合した基質に
更に抗体又は抗原を固定化したラテックス又はその他の
微粒子を抗原−抗体反応によって結合させることによっ
て水晶振動子バイオセンサーの感度を増幅させるという
ものである。

【０００５】しかしながら、特開昭６３−１１８３５号
公報に記載されている方法では、抗原が複数の抗体結合
部位を有する高分子であることが不可欠である。被測定
物質がダイオキシン類をはじめとする環境汚染物質等の
ように低分子である場合や抗体結合部位を一箇所しか有
さない場合には、抗体又は抗原を固定化したラテックス
が被測定物質に結合することができず、同方法では測定
することが困難であった。

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記に鑑
み、測定対象が低分子物質や、抗体結合部位を一箇所し
か有さない物質であっても高感度で測定を行うことがで
きる測定試薬及び測定方法を提供することを目的とす
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】

【０００７】本発明は、被測定物質に対する特異的結合
能を有する認識素子が水晶振動子に固定化されてなる水
晶振動子センサ、及び、前記被測定物質が高分子タンパ
ク質に複数個結合してなる競合標準物質から成る測定試
薬である。

【０００８】本発明の測定試薬を用いる測定方法であっ
て、水晶振動子の周波数変化量を測定し、上記周波数変
化量より測定試料中の被測定物質の量を求める測定方法
もまた、本発明の１つである。以下に本発明を詳述す
る。

【０００９】本発明は、水晶振動子表面に物質が吸着す
ることにより、その吸着物質の重量に比例して水晶振動
子の周波数が変化することを利用して被測定物質の質量
を測定する方法を用いるものであるが、従来の方法とは
異なり、被測定物質を高分子タンパク質等に複数個結合
させて、これを競合標準物質とし、検体中の被測定物質
と競合させる競合反応を用いることを特徴とするもので
ある。従って、本発明においては、従来の方法とは異な
り、検体中に存在する被測定物質が多いほど、競合標準
物質と水晶振動子表面の認識素子との結合が妨げられる
ために周波数変化量が減少する。

【００１０】本発明の測定試薬は、被測定物質に対する
特異的結合能を有する認識素子が水晶振動子に固定化さ
れてなる水晶振動子センサ、及び、前記被測定物質が高
分子タンパク質に複数個結合してなる競合標準物質から
成るものである。

【００１１】本発明の測定試薬の被測定物質としては特
に限定されず、例えば、ヒト血清、尿、体液、河川・湖
沼の水、汚泥、焼却炉の煤塵等に含まれる微量成分等が
挙げられる。上記微量成分としては、例えば、コプラナ
ーＰＣＢ類を含むダイオキシン類、内分泌攪乱物質に指
定されたいわゆる環境ホルモン等を始めとする環境汚染
物質やヒト体内中の微量ホルモン類等が挙げられる。

【００１２】本発明の測定試薬は、被測定物質が分子量
１００〜１０００程度の低分子物質や抗体結合部位を一
箇所しか有さない物質であっても高感度に測定すること
ができる。

【００１３】本発明で用いられる水晶振動子センサは、
被測定物質に対する特異的結合能を有する認識素子が水
晶振動子に固定化されてなるものである。上記認識素子
としては被測定物質に対する特異的に結合するものであ
れば特に限定されず、例えば、被測定物質と抗原抗体反
応を起こす抗体、被測定物質を特異的に認識するレセプ
ター分子等が挙げられる。

【００１４】上記抗体としては、例えば、被測定物質及
びハプテン化被測定物質を抗原として、ウサギ、ヤギ、
ヒツジ等の動物を免疫し、その血清からＩｇＧ画分を精
製して得られるポリクローナル抗体；細胞融合法により
得られるモノクローナル抗体等が挙げられる。上記抗体
として、例えば、酵素処理等により得られるＦ（ａｂ
´）_２、Ｆａｂ´やＦａｂを用いてもよく、更に遺伝子
組換え技術により調製したＦａｂ´やｓｃＦｖ等を用い
てもよい。

【００１５】上記レセプター分子としては特に限定され
ないが、例えば、ダイオキシン類はＡｈ（アリルハイド
ロカーボン）レセプターと結合することが知られてお
り、このようなセプターを用いることができる。

【００１６】上記認識素子としては、他に被測定物質と
の結合能を有するペプチドやＤＮＡ等を用いてもよく、
更に、モレキュラーインプリンティング法により作製さ
れる、被測定物質と相補的な結合部位を有した高分子ポ
リマーを用いてもよい。

【００１７】上記水晶振動子としては、例えば、ＡＴカ
ット、ＧＴカット、ＢＴカット等が挙げられ、電極の材
質としては金や銀等が適している。上記水晶振動子の発
振周波数としては特に限定されず、用途に従い適宜選択
すればよいが、５〜５０ＭＨｚが好ましい。５ＭＨｚ未
満であると、感度が充分ではなく、５０ＭＨｚを超える
と、ノイズが生じるために実用的ではない。より好まし
くは、９〜３０ＭＨｚである。

【００１８】上記水晶振動子に認識素子を固定化する方
法としては特に限定されず、公知の方法を用いることが
でき、例えば、ｃｙｔｅａｍｉｎｅ処理した後グルタル
アルデヒド処理を施した水晶振動子に、認識素子を吸着
させる方法等が挙げられる。

【００１９】本発明で用いられる競合標準物質は、被測
定物質が高分子タンパク質に複数個結合したものであ
る。上記高分子タンパク質としては特に限定されない
が、入手の容易さや経済的な面から、例えば、生化学分
野等で汎用されている分子量数万以上のタンパク質であ
る血清アルブミン、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ等の酵素等が好適に用いられる。

【００２０】上記被測定物質を高分子タンパク質に複数
個結合させる方法としては、例えば、混合酸無水物法、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法、同反応性架橋法、Ｎ
−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）スクシンイミド
型架橋法等が挙げられる。

【００２１】本発明の測定試薬は、更に、被測定物質に
対する特異的結合能を有する認識素子が不溶性担体に固
定化されてなる凝集素子を含有することが好ましい。水
晶振動子に固定された認識素子−競合標準物質複合体
に、更に、凝集素子が結合することにより重量が増加
し、その結果、周波数変化量が増幅し、より低濃度の被
測定物質を検出・定量することが可能となる。

【００２２】上記不溶性担体としては本発明で用いられ
る液体媒体に実質的に不溶性であれば特に限定されず、
例えば、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合
体、スチレン−スチレンスルホン酸ソーダ共重合体、ス
チレン−メタクリル酸エステル共重合体、スチレン−ク
ロルメチルスチレン共重合体、塩素化ポリスチレン等の
有機高分子物質からなる粒子；シリカ、シリカ−アルミ
ナ等の無機酸化物微粒子；有機薄膜を被履したフェライ
ト等の磁性金属微粒子等が挙げられる。上記不溶性担体
の粒径は、０．０１〜１μｍであることが好ましい。
０．０１μｍ未満であると、充分な発振周波数変化が生
じにくくなり、１μｍを超えると、液体媒体中に安定に
分散することが困難となる。

【００２３】上記不溶性担体に認識素子を固定化する方
法としては特に限定されず、公知の方法を用いることが
でき、例えば、不溶性担体粒子にカップリング剤等を用
いて化学的に吸着させる方法、不溶性担体として反応性
官能基を粒子表面に有する高分子物質のラテックスを用
いて化学的に吸着させる方法、疎水性相互作用等を利用
した物理的に吸着させる方法等が挙げられる。

【００２４】本発明の測定試薬を用いた測定方法を図１
に模式的に示す。本発明の測定試薬を用いて測定を行う
と、水晶振動子センサ１の認識素子に対して、競合標準
物質２と検体中の被測定物質３とが競合的に結合する。
このため、本発明の測定試薬によれば、被測定物質３が
分子量１００〜１０００程度の低分子物質や抗体結合部
位を一箇所しか有さない物質であっても高感度に測定す
ることができる。本発明の測定試薬を用いた場合、検体
中に存在する被測定物質３が多いほど、競合標準物質２
と認識素子との結合が妨げられるので周波数変化量が減
少する。更に、本発明の測定試薬に凝集素子４を加える
と、水晶振動子センサ１に結合した競合標準物質２に、
凝集素子４が結合することにより重量が増加し、その結
果、周波数変化量が増幅し、より低濃度の被測定物質を
検出・定量することが可能となる。

【００２５】以下に、上記認識素子として抗体を用いた
場合を例として掲げ、本発明の測定方法の１態様を説明
する。本発明の測定方法を実施するにあたり、まず、測
定装置を組み立てることが必要であるが、本発明で用い
られる測定装置としては、例えば、特開平３−７７０６
１号公報に記載されているものを用いることができる。
上記測定装置において、水晶振動子チップは、発振回
路、周波数カウンター及びデータ処理用のマイクロコン
ピューターによって構成される測定システムに接続され
る。

【００２６】まず水晶振動子に抗体を担持させ、この状
態で水晶振動子の周波数を測定する。次に、抗原を複数
結合したタンパク質及び抗原が含まれている検体の混合
物を添加して、競合的免疫反応を行う。

【００２７】このとき検体中に抗原が含まれていれば、
抗原を複数結合したタンパク質が水晶振動子表面に担持
された抗体に結合することが阻害される。水晶振動子の
周波数は表面上に結合した物質の重量依存して減少する
ため、抗原結合タンパク質が水晶振動子に吸着する重量
が減少すれば、周波数減少値も小さくなる。水晶振動子
表面上の抗体と結合していない、遊離している抗原結合
タンパク質を除去・洗浄する。この状態で水晶振動子周
波数を測定する。

【００２８】次に周波数変化値を増幅させるため、抗体
を吸着させた不溶性担体粒子を加え抗原抗体反応を起こ
させる。すなわち抗原結合タンパク質を水晶振動子上の
抗体と不溶性担体粒子上の抗体で挟み込む、サンドイッ
チ状態にしてより重量を増加させることにより周波数変
化を増幅させる。以上の測定の間の反応温度は室温でも
可能であるが、好ましくは２５〜３７℃の環境下で行う
ことが好ましい。

【００２９】本発明では、数種類の既知濃度の被測定物
質を用いて検量線を作成し、これを用いて検体中の被測
定物質の濃度の算出を行う。上記測定装置において、一
度使用した水晶振動子は、タンパク質等による汚染を洗
浄除去して、再度使用してもよいが、水晶振動子は百円
程度と廉価であることから一測定毎に取り替えてもよ
い。

【００３０】

【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。

【００３１】以下に、本発明の実施例として低分子量化
合物である２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）を被
測定物質とした測定系について説明する。 （実施例１） ＜水晶振動子の抗ＤＮＰ抗体固定化＞水晶振動子はＡＴ
カット（９ＭＨｚ）を用いた。金電極表面を０．０１Ｍ
のｃｙｔｅａｍｉｎｅ処理し、続いて１％グルタルアル
デヒド処理した後、精製水で洗浄した。次に５０μｇ／
ｍＬの濃度にした抗ＤＮＰモノクローナル抗体液を３０
μＬ加え、室温で９０分間インキュベーションすること
により固定化した。

【００３２】精製水で洗浄後、ブロッキングするため
０．０２Ｍのグリシン液を３０μＬ加え、室温で２０分
間インキュベーションした。精製水で洗浄後、ＱＣＭの
発振周波数測定を行いその測定値をＦ１とした。

【００３３】＜抗原抗体反応I＞１ｎｇ／ｍＬのＤＮＰ
結合牛血清アルブミン（シグマ社製）溶液にＤＮＰ（シ
グマ社製）をそれぞれ０、０．０１、０．１、１．０、
１０、１００ｎｇ／ｍＬとなるように溶解した液を調製
し、これを抗原液とした。

【００３４】この抗原液１０μＬを実施例１で調製した
抗ＤＮＰ抗体固定化水晶振動子に加え、室温にて６０分
間インキュベーションすることにより抗原抗体反応Iを
行った。反応終了後、精製水で洗浄し、ＱＣＭの発振周
波数測定を行いその測定値をＦ２とした。Ｆ１からＦ２
を差し引いた値をΔＦ２とした。結果を表１及び図２に
示した。

【００３５】

【表１】

【００３６】表１及び図２示した結果より、上記の方法
によれば０．０１〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＤＮＰを
測定できることが明らかとなった。

【００３７】（実施例２） ＜抗原抗体反応II（ラテックス試薬による増感反応）＞
１ｎｇ／ｍＬのＤＮＰ結合牛血清アルブミン（シグマ社
製）溶液にＤＮＰ（シグマ社製）をそれぞれ１ｎｇ／ｍ
Ｌとなるように溶解した液を調製し、これを抗原液とし
た。実施例１と同様にして抗原抗体反応を行い、洗浄後
に免疫試薬用ラテックス（積水化学工業社製）に抗ＤＮ
Ｐモノクローナル抗体を固定化した抗ＤＮＰラテックス
けん濁液（固形分０．０１％）３０μＬを加え、室温に
て９０分間インキュベーションすることにより抗原抗体
反応IIを行った。反応終了後、精製水で洗浄し、ＱＣＭ
測定を行い測定値をＦ３とした。Ｆ１からＦ３を差し引
いた値をΔＦ３とした。結果を表２に示した。

【００３８】

【表２】

【００３９】ラテックス粒子を添加することにより周波
数変化の測定値は１０倍以上となり、増幅作用が確認さ
れた。

【００４０】

【発明の効果】本発明は、上述の構成よりなるので、非
常に簡単な操作で迅速かつ高精度で低分子物質の測定を
行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の測定試薬を用いた測定方法を模式的に
示した図である。

【図２】本発明におけるＤＮＰ濃度と周波数変化量の関
係を示すグラフである。

【符号の説明】

１ 水晶振動子センサ ２ 競合標準物質 ３ 被測定物質 ４ 凝集素子

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 土居 淳 大阪府三島郡島本町百山２−１ 積水化学 工業株式会社内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被測定物質に対する特異的結合能を有す
   る認識素子が水晶振動子に固定化されてなる水晶振動子
   センサ、及び、前記被測定物質が高分子タンパク質に複
   数個結合してなる競合標準物質から成ることを特徴とす
   る測定試薬。
2. 【請求項２】 更に、被測定物質に対する特異的結合能
   を有する認識素子が不溶性担体に固定化されてなる凝集
   素子を含有することを特徴とする請求項１記載の測定試
   薬。
3. 【請求項３】 認識素子は、被測定物質を抗原として特
   異的に結合することができる抗体であることを特徴とす
   る請求項１又は２記載の測定試薬。
4. 【請求項４】 認識素子は、被測定物質に対する特異的
   に結合することができるレセプター分子であることを特
   徴とする請求項１又は２記載の測定試薬。
5. 【請求項５】 被測定物質は、ダイオキシン類であるこ
   とを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の測定試
   薬。
6. 【請求項６】 請求項１、２、３、４又は５記載の測定
   試薬を用いる測定方法であって、水晶振動子の周波数変
   化量を測定し、前記周波数変化量より測定試料中の被測
   定物質の量を求めることを特徴とする測定方法。