JPH0377061A - 水晶発振子を用いた抗原―抗体反応の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〉 本発明は、水晶発振子を用いた抗原−抗体反応の測定方
法に関し、更に詳しくは抗原または抗体を担持した不溶
性担体粒子と水晶発振子を利用することによる抗原−抗
体反応の測定方法に関する。

（従来の技術〉 近年、医療分野に限らず、生化学、衛生学、疫学等の種
々の分野において、微量物質、％に抗原及び抗体を定量
的のみならず迅速、簡便に検出することがきわめて重要
な課題となっている。

上記課題の解決を目的として、従来キュベツト（セル）
中で抗体１ｆｃは抗原を担持させた不溶性担体粒子を測
定しようとする抗原または抗体と反応させ、その凝集状
態を光学的手法を用いて定量的に測定する方法が提案さ
れている。

特開昭５４−１０８６９３号公報に記載される方法は、
平均粒径が１６ミクロン以下の不溶性担体粒子に抗体ま
たは抗原を担持し、この担持された抗体及び／または抗
原に抗原もしくは抗体またはその混合物を液体媒体中で
反応させ、この反応混合物に波長が０．６−ｚ４ミクロ
ンの範囲から選ばれる光を反応開始以後、２以上の時点
に於て照射し、一定時間内にかける該反応混合物の吸光
度または吸光率の増加を測定することによう、抗原抗体
反応を定量的に判定しようとするものである。

ＡＮＡＬＩＴＩＣＡＬ　　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（７ナリ
テイカル・ケミストリー）、第５９巻、２５１９頁−２
５２２頁、（１９８７）に記載される方法は０、２ミク
ロンのポリスチレンラテックスに変性ｒ−グロブリンを
固定化し、液体媒体中でリウマチ因子との免疫反応によ
う、一定の大きさの凝集体を形成させ、凝集体の大きさ
と一致するＡｒレーザ光を該液体媒体に照射し、凝集体
によってＡｒレーザ光を吸収させ凝集体周囲の温度上昇
によって発生する音波を圧電素子で電気信号に変換し。

電気信号の大きさを測定することによシ、抗原−抗体反
応を定量的に判定しようとするものである。

一方、抗原または抗体を担持した不溶性担体粒子と水晶
発振子を組み合わせた抗原−抗体反応の測定方法として
は、以下の方法が提案されている。

特開昭６３−１１８３５号公報に記載される方法は、水
晶発振子表面に抗体または抗原を固定化した水晶発振子
バイオセンサーにかいて、抗原−抗体反応によって結合
した基質にさらに抗体または抗原を固定化したラテック
スまたはその他の微粒子を抗原−抗体反応によって結合
させることによって水晶発振子バイオセンサーの感度を
増幅させて、抗原−抗体反応を測定するというものであ
る。

特開昭６４−３５２６９号公報に記載される方法は、水
晶発振子表面に抗体または抗原を固定化した水晶発振子
バイオセンサーにおいて、抗原−抗体反応によって結合
した基質にさらに抗体筐たは抗原を固定化した磁性微粒
子を抗原−抗体反応によって結合させ、磁気引力によシ
磁性微粒子を水晶発振子表面に引き付けることによって
水晶発振子バイオセンサーの感度を増幅させて、抗原−
抗体反応を測定するというものである。

（発明が解決しようとする課題） 抗体あるいは抗原を固定化した不溶性担体粒子に抗原ま
たは抗体を反応させて凝集体を形成させ。

これを光学的手法を用いて定量的に測定する場合。

その測定装置は、光源、モノクロメータ、受光素子、増
幅器、積分器など２種々の光学機器によって構成される
。従って、装置全体がきわめて太きなものに□ル、さら
に９価格も高価となる。このような装置を用いる場合、
装置の設置スペースが大きくなう、また、装置の持ち運
びは容易に行えないため、ベツドサイドなどでの迅速測
定やモニタリングには向かないという問題がある。また
。

−測定（一検体）当シの検査コストを下げるために、大
量の検体数を連続的に測定して、装置の稼働率を上げる
必要があう、開業医などの検体数の少ない場所での使用
は、コスト高になってしオうという問題がある。

一方、従来の抗体筐たは抗原を固定化した不溶性担体粒
子と水晶発振子を組み合わせた抗原−抗体反応の測定方
法は、抗体筐たは抗原を水晶発振子表面に固定化するこ
とが必要であシ、操作が繁雑であると同時に固定化した
抗体筐たは抗原が失活することによう測定感度が低下す
ると−う欠点がある。さらに、抗原−抗体反応によυ水
晶振動子表面に結合した基質に、抗体または抗原を固定
化した不溶性担体粒子を抗原−抗体反応によ多結合させ
るときに未結合の基質を分離するＢ／Ｆ分離操作が必要
であり測定操作が繁雑である。

（１１１題を解決するための手段） 本発明は、上記の課題を解決するためになされたもので
ある。

すなわち本発明は、抗原または抗体と、この抗原咬たは
抗体に対応する抗体または抗原を担持した不溶性担体粒
子とを液体媒体中で反応させ、同時に、該反応にかかわ
る抗原または抗体を表面に固定化していない水晶発振子
を該液体媒体中で発振させ、該反応に起因する凝集体形
成による水晶発振子の発振周波数の変化を測定すること
を特徴とする抗原−抗体反応の測定方法に関する。

以下に本発明の詳細を述べる。

本発明で用いる不溶性担体粒子としては２本発明の測定
を行うときに用いられる液体媒体に実質的に不溶性であ
る有機高分子物質の微粒子２例えばポリスチレン、スチ
レン−ブタジェン共重合体。

スチレン−スチレンスルホン酸ソーｉ共重合体スチレン
−メタクリル酸エステル共重合体、スチレン−クロルメ
チルスチレン共重合体、塩素化ボリスチレン等のラテッ
クス、またはシリカ、シリカ−アルミナ等の無機酸化物
微粒子、有機薄膜を被覆した７エライトなどの磁性金属
微粒子などが挙げられる。不溶性担体粒子の粒径は、十
分な発振周波数変化をもたらすために、好ましくは、Ｏ
，ＯＳμｍ以上であり、更に液体媒体中に安定に分散す
ることが可能な範囲で大きくできるが好ましくは１μｍ
以下であることがよい。

該不溶性担体粒子に抗体または抗原を物理的または化学
的に吸着させて、抗体筐たは抗原が担持された不溶性担
体粒子とされる。

ここで、不溶性担体粒子に担持させる抗体または抗原と
しては９本発明の抗原−抗体反応の測定方法により、そ
の存在璽たは濃度（量）を測定しようとする抗原または
抗体と対応する（すなわち抗原−抗体反応を生ずる）も
のが使用される。

一般に不溶性担体粒子に担持する抗体としては。

ウサギ、ヒツジ、ヤギ等の動物由来の多価抗体。

モノクローナル抗体などが使用される。一方抗原として
は１例えばタンパク質、ポリペプチド、ステロイド、多
糖類、脂質、花粉、ダスト等積々のものを用いることが
出来る。

不溶性担体粒子に、抗体筐たは抗原、％に抗体を担持さ
せる方法としては既に多くの方法が提案されており、い
ずれの方法を用いてもよい。不溶性担体粒子に例えば特
にハブテンの様な不完全抗原を担持させる場合には、該
担体粒子を例えばカップリング剤により化学的に処理し
て、該抗原を化学的に吸着させるのが有利である。また
、不溶性担体粒子として９例えばスルホン基、アミノ基
。

カルボキシル基またはその反応性誘導基等の官能性基を
有する高分子物質のラテックスを用い、このようなラテ
ックスに抗体または抗原を化学的に吸着させることもで
きる。

次に本発明で使用される水晶発振子について説明する。

本発明で使用する水晶発振子としては。

測定しようとする抗原−抗体反応にかかわる抗原または
抗体を表面に固定化しないものを使用することが特徴で
ある。従って、従来の抗原または抗体を表面に固定化し
た水晶発振子バイオセンサーのような、抗原または抗体
の固定化操作は不必要である。

本発明に使用する水晶発振子の種類（ＡＴカット、ＧＴ
カット、ＢＴカット等）や、電極の材質（金、銀１等）
、形状などは、特に制限されるものではないが、高濃度
電解質溶液中での安定な発振を行わせるため９片面を絶
縁性の板で封止した型の素子を用いることが好ましい。

片面封止には種々の公知の方法を用いることが出来るが
９片面封止による固体差を低減させるために水晶発振子
の片面に、電極部分を除いて接着剤を塗布し、水晶板と
同じ大きさの絶縁性の薄板（例えば水晶板等）を張υ付
けて封止した素子を用いることが好ましい。更に９発振
の安定性を向上させるために電極に接続しているリード
線のうち液体媒体中に浸漬する部分は、接着性に優れた
シリコン系樹脂等の接着剤などで完全に覆うことが好ま
しい。

さらに、水晶発振子表面へのタンパク質等の非特異的吸
着を抑制するために予め測定しようとする抗原−抗体反
応にかかわる抗原や抗体以外のタンパク質で表面を被覆
しておくこともできる。

以上のような本発明で使用する水晶発振子の具体例を第
１図、第２図及び第３図に示す。第１図は正面図、第２
図は背面図、第３図は第２図のａ−ａ′線断面図である
。これらの図に示されるように、水晶板１の両面には電
極２が取りつけられ。

各電極にはリード線３がとｂつけられている。第２図に
示されるように、水晶発振子の片面は絶縁性薄板５が接
着剤４によって接着され、封止されている。また、リー
ド線３の、液体媒体中に浸漬する部分は、接着剤４によ
って被覆されている。

本発明の測定方法を行うために使用される測定装置とし
ては１例えば第４図に示されるような公知の装置が用い
られる。第４図において１片面封止型の水晶発振子６は
９発振回路２周波数カウンタ及びデータ処理用のマイク
ロコンピュータによって構成される測定システムに接続
される。そして水晶振動子６は、測定時に反応を行う測
定用の恒温セルフ内へ設置される。恒温セルフ内には。

液体媒体を攪拌するための攪拌子８が設置され。

該攪拌子８を操作するためにマグネットスターラ９が恒
温セルフの下部に配置される。

本発明の抗原−抗体反応の測定方法は２以上のような不
活性担体粒子、水晶発振子、測定装置等と、測定しよう
とする分析試料を用いて行われる。

そこで、これらを用いて行われる本発明の測定方法の原
理を簡単に述べる。

分析試料中に、測定しようとする抗原または抗体が存在
すると、これに対応する抗体または抗原を担持した不溶
性担体粒子と分析試料を液体媒体中で混合した際に、抗
原−抗体反応が生じ、この反応によって凝集体を形成す
る。この凝集体形成によって、予め該液体媒体中で発振
させておいた水晶発振子の発振周波数が変化する。この
発振周波数の変化量や変化速度は２分析試料中の測定し
１；板ち ようとする抗原または抗体の濃度（量）番地例欄箒妾令
するので９発振周波数の変化量や変化速度を測定するこ
とによシ９分析試料中の測定しようとする抗原または抗
体の存在または濃度（量）を検知することができるので
ある。

具体的な測定方法の例を次に述べる。

まず、測定装置を組み、抗体渣たは抗原を担持した不溶
性担体粒子を緩衝溶液等の液体媒体中に分散させ、測定
用の恒温セル中にいれて攪拌子によう一定速度で攪拌し
てかく。

ここで１本発明で使用する液体媒体としては。

リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液等が
好ましい。

また、抗体または抗原を担持した不溶性担体粒子は、適
宜の濃度で使用されるが、抗原−抗体反応を十分に行わ
せることから、前記液体媒体中０．０１重重量風上が好
ましい。更に感度向上のため不溶性担体粒子が液体媒体
中で安定に分散することが可能な範囲で濃くすることが
出来るが１．０重量蝿以下であることが好ましい。

さらに、攪拌子の回転速度は、抗原−抗体反応を、速や
かに行わせると同時に発振を安定に行わせるために好渣
しくは５００　ｒｐｒｎ　−１５０Ｏｒｐｍの範囲で、
竹に好ましくは、　　８００　ｒｐｍ　−１００Ｏｒｐ
ｍの範囲とすることができ９反応中は一定の回転速度に
保つことが好ましい。

次に９片面封止型水晶発振子を上記恒温セル中の液体媒
体に浸漬して発振させる。発振周波数が安定したところ
で、該発振周波ａＦ１を測定する。

次に該恒温セル中に分析試料を一定量添加してそのまま
攪拌を行い、再度発振周波数が安定したところで２発振
周波数を測定してＦ２とする。以上の操作にかける発振
周波数変化　、１Ｆ＝Ｆ１−Ｆ２から、予め、既知濃度
の試料を用いて求めておいた検量線にしたがい２分析試
料中の測定しようとする抗原筐たは抗体の存在及び濃度
を求めることが出来る。

以上の測定の間、恒温セル中の液体媒体の温度は、好ま
しくは２０〜４０’Ｃ，％に好ましくは。

２５〜３７℃に保つのがよく１反応中は恒温にするのが
好筐しい。この範囲を外れると抗原−抗体反応が不安定
になうやすい。

その他、凝集体形成による発振周波数の変化速度からも
その濃度を検知することが出来る。また。

本発明の方法は、凝集体形成阻止反応を利用する。

試料の定量法にも適用することができる。さらに本発明
の測定方法はフローシステムの装置でも同様に行うこと
ができる。

前記測定装置にかいて、−度使用した水晶発振子は、タ
ンパク質などによる汚染を洗浄除去して。

再度使用してもよいが、該水晶発振子は廉価であること
から一測定毎に取シ替えてもよい。

以上のような本発明の測定方法によれば、未知試料中の
種々の抗原または抗体の存在または濃度（量）ｔ−検知
することが可能である。例えば２分析試料として、ヒト
の血清、尿９体液、唾液、細胞抽出液１組織抽出液等を
用いて９ｍ々の疾病等の診断を行うことができる。具体
的には、Ｃ−反応性タンパク（炎症性疾患等の診断）、
リウマチ因子（慢性関節リウマチの診断）、抗ストレプ
トリジンＯ価（溶血性連鎖球菌感染症等の診断）。

フィブリン体分解産物（汎発性血管向凝固症候群の診断
）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（妊娠の診断）、α−７
エトプロテイン（ｗ、発性肝癌の診断）。

Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（Ｂ型肝炎の診断）。

尿中微量アルブミン（腎疾患の診断）、β２−ミクログ
ロブリン（腎不全の診断）などの存在の検知及び定量を
行うことができる。

（実施例） 以下９本発明の実施例として、Ｃ反応性タンパク（以下
、単にＣＲＰとする）測定への応用について詳述する。

く片面封止型水晶発振子の作製〉 基本となる水晶発振子はＡＴカット、９ＭＨｚ（へ雲通
信社製）を用いた。

第１図は１本実施例の水晶発振子の正面図、第２図は、
背面図である。第３図は、第２図のａ−ａ′間の断面図
である。図中で示される水晶板１の両面には、電極２が
取シ付けられており、該電極からは第４図で示す測定装
置の発振回路に接続されるリード線３が取シ付けられて
いる。

該水晶発振子の片面（背面）には、シリコンシーラント
４５（シリコン系接着剤、信越化学工業■製）によう、
水晶製の絶縁性薄板５ｔ−張シ付けて封止しである。更
に、リード線についても測定溶液に浸漬して直接液体媒
体と接触する部分はシリコンシーラント４５で被覆した
。

封正による水晶発振子のばらつき（個体差）を除くため
に９次の操作によシ器片面封止型水晶発振子の感度係数
に′ｔ−予め求めておいた。

恒温セル中に純水（比抵抗１８ＭΩ／　ｃｍ以上）。

５多サッカロース純水溶液、及び１０％サッカロース純
水溶液をいれて、それぞれの溶液中で片面封止型水晶発
振子を発振させ１発振周波数を測定した。次に、各溶液
の７７Ｔ値（ρ：浴溶液粘度。

ｎ：溶液の密度）と各測定周波数の間の校正直線を作成
し、その勾配Ｋｔ−各片器片止型水晶発振子の感度係数
とした。実測の周波数変化の補正は。

測定値ＪＦをそのとき用いた片面封止型水晶発振子の感
度係数にで除すことによって行った。

〈ラテックス溶液の調製〉 セラテスタムＣＲＰ−Ｈ（抗ＣＲＰ抗体担持ポリスチレ
ンラテックス、日立化成工業株式会社製商品名）ＩＢＩ
！に対して５０　ｍＭ　ＩＪン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ
ａｓ）Ｉｓｍｃの割合で混合調製した。

＜ｃＲｐ標準血清の調製〉 セラテスタムＳ　（ＣＲＰ標準血清、ＣＲＰ濃度５．１
　ｒＮＪ／ｄｔ、　　日立化成工業株式会社製商品名）
をその咬ま用いた。

〈正常血清の調製〉 正常ヒトブール血清（総タンパク濃度５．２９／ｄｉ、
　　Ｉ、Ｉ、Ｃ，Ｊａｐａｎ社製）ｔ−，１％牛血清ア
ルブミンを含有する５　０　ｍＭ　ＩＪン酸緩衝生理食
塩水（ｐＨ６，５）で６倍に希釈して用いた。

く検量線の作成〉 上述の方法で調製したラテックス溶液９−を第４図の恒
温セルフにいれて９次に測定装置（発振回路１周波数カ
ウンタ（岩崎通信社製、ユニバーサルカウンタ５Ｃ−７
２０１）、マイクロコンピュータ（エブソ／■製ＰＣ−
２８６０））に接続した水晶振動子６を恒温セルフに設
置し、攪拌子８で溶液を回転数８０　Ｏｒｐｍで攪拌し
ながら発振させる。発振が安定した段階で９発振周波数
Ｆ１を測定した。ひき続き水晶発振子を発振させたま筐
でＣＲＰ標準血清（セラテスタムＳ、ＣＲＰ濃度５．１
■／ｄｇ、　　日立化成工業株式会社製）をマイクロシ
リンジで１００μＩ！（セル中の最終濃度が５６μｓ　
／　ｄｔと成るように）恒温セル中に添加して、２０分
間攪拌した後９発振周波数Ｆ２を測定した。この間の発
振周波数変化を第５図に示す。

筐た発振周波数変化量は、ＪＦ−Ｆｌ−Ｆ２　＝１３０
（Ｈｚ）、補正周波数変化量ＡＦ／には３．８２ｅして
、ＣＲＰ標準血清の添加量を２５．５０゜７５及び１５
０μｌと変化させて発振周波数変化量を測定した。各々
の補正周波数変化量をまとめて表１に示す。更に恒温セ
ル中の換算ＣＲＰ濃度と補正周波数変化量の関係を第６
図に示す。

第６図から分かるように水晶発振子の補正周波数変化量
ＩＦ／には、恒温セル中のＣＲＰの濃度に依存する。第
６図を、以下の測定における検量線とした。

く正常ヒト血清を用いた測定〉 次に上述と同様の操作で、ラテックス溶液９ｄに対して
、先に調整した正常ヒト血清の添加量を５０，１００及
び２００μｌと変化させて発振周波数変化を測定した。

補正発振周波数変化量を求めた結果を表２に示す。更に
恒温セル中の換算線タンパク濃度と補正周波数変化量の
関係を第７図に示す。これから分かるように正常ヒト血
清のタンパク濃度に対しては補正周波数変化がない。

く検体血清を用いた測定〉 〔実施例〕 次に、予め毛細管沈降法で陽性と判定されたＣＲＰ陽性
検体血清、　　ａ、　　ｂ及びＣ並びに同様の方法で陰
性と判定されたＣＲＰ１ｍ性検体血清ｄ及びｅについて
、ラテックス溶液９−に対して１００μでの検体血清を
添加して前述と同様の操作で、補正周波数変化を測定し
た。この値と。先にＣＲＰ標準血清を用いて作製した検
量線から恒温セル中のＣＲＰ濃度を求め、更に希釈補正
を行って求めた検体血清中のＣＲＰ濃度を表３に実施例
として示す。

〔比較例〕

前記実施例で用いた検体血清、ａ、ｂ、ｅ及び＾ ｅについて、比較データとして、ラテックス凝集比濁法
でＣＲＰ濃度を求めた。

生理食塩水３μｌ！を希釈液（ｏ、　ｉ　％牛血清アル
ブミン含有５０　ｍＭ　リン酸緩衝生理食塩水ｐＨａ５
）３５０μｌと混合し、３７℃で適時保持したのち。

ラテックス溶液（セラテスタムＣＲＰ−Ｈ１−に対して
５０　ｍＭ　ＩＪン酸緩衝生理食塩水、ｐ）（６，５゜
を８−の割合で混合調製）５０μｌを添加攪拌し。

１分後及び３分後の波長５７０　ｎｍでの吸光度を測定
し、この間の吸光度の増加分から単位時間当シの増加分
を求め、これをブランクの吸光度変化（ｊＡＢ８Ｒｍ）
とする。

次に各検体血清３μｌを希釈液３５０μＥと混合し、３
７℃で適時保持したのち、ラテックス溶液５０μｌを添
加攪拌し、ブランク測定と同一条件で吸光度変化を測定
し、これを、被検液の吸光度変化（ＪＡＢＳア）とする
。

検体血清の吸光度変化（ｊＡＢｓｏａｐ）を式％式％ から算出する。一方、上記と同様に検体血清の代わｂに
ＣＲＰ標準血清（セラテスタムＳ）を用いて吸光度変化
とＣＲＰ濃度の検量線を作成し、上記算出の吸光度変化
に該当するＣＲＰ濃度を上記検量線から求めた。１＞、
以上の測定は日立自動分析装置７０５形（以下１日立７
０５形と略す）を用いて行った。

日立７０５形（光路長６　ｍｍ　）では分析プログラム
のレートアッセイ法を使用すると自動的に装置が上記測
定法にもとづいて測定して、演算し、検体血清中のＣＲ
Ｐ濃度を算出する。

このようセして検体血清ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅについて
測定して求めたＣＲＰ濃度を表３に比較例として示す。

表３から明らかなように本発明の測定方法で求めた検体
血清中のＣＲＰ濃度の値は、ラテックス凝集比濁法で求
めた値とほぼ一致する。

表１ 表２ 表３ （発明の効果） 本発明の抗原−抗体反応の測定方法によれば。

非常に簡単な操作で抗原または抗体の検知及び選択的な
濃度の測定が出来る。さらに１本発明の抗原−抗体反応
の測定方法に用いる装置は、光学的検出機器を含まない
ので小型化しやすくさらに安価に作製できる。従って、
ベツドサイドなどでの迅速測定やモニタリングに用いた
う、開業医など町 検体数の少ない場合でも用いることが容易である。

さらに１種々の抗体または抗原を担持した不溶性担体粒
子と組み合わせることによう、一種の水晶発振子で多種
類の抗原または抗体の検出が可能となシ測定のコストを
下げることが出来る。

【図面の簡単な説明】

第１図は１本発明に使用される水晶発振子の正面図、第
２図は、該水晶発振子の背面図、第３図は、該水晶発振
子のａ　−ａ’線断面図、第４図は。 本発明の測定装置の一例を示す概略図、第５図は。 本発明の測定方法による測定例の発振周波数変化と時間
の関係を示すグラフ、第６図は９本発明の実施例にかけ
るＣＲＰの濃度と発振周波数変化の関係を示すグラフ、
第７図は９本発明の実施例における正常ヒト血清総タン
パク濃度と発振周波数変化の関係を示すグラフである。 符号の説明 １・・・水晶板 ３・・・リード線 ５・・・絶縁性薄板 ７・・・恒温セル ９・・・マグネットスターラ ２・・・電極 ４・・・接着剤 ６・・・片面封止水晶発振子 ８・・・攪拌子 第１図 第２図 第３図 第５図 第４図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗原または抗体と、この抗原または抗体に対応する
   抗体または抗原を担持した不溶性担体粒子とを、液体媒
   体中で反応させ、同時に、該反応にかかわる抗原または
   抗体を表面に固定化していない水晶発振子を該液体媒体
   中で発振させ、該反応に起因する凝集体形成による水晶
   発振子の発振周波数の変化を測定することを特徴とする
   抗原−抗体反応の測定方法。 ２、水晶発振子として、片面を封止したものを用いる請
   求項１記載の抗原−抗体反応の測定方法。