JPH0368346B2 - - Google Patents
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- JPH0368346B2 JPH0368346B2 JP57011053A JP1105382A JPH0368346B2 JP H0368346 B2 JPH0368346 B2 JP H0368346B2 JP 57011053 A JP57011053 A JP 57011053A JP 1105382 A JP1105382 A JP 1105382A JP H0368346 B2 JPH0368346 B2 JP H0368346B2
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Classifications
-
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Description
本発明は一般には免疫定量法の分野に係り、時
に肝炎Ａウイルスに対するIgMの免疫定量法に関
する。本発明は人の血清または血漿中の肝炎Ａウ
イルスについてIgMの検定特異性を改善する方法
を包含する。 肝炎Ａ感染症の急性の相の過程で、肝炎Ａウイ
ルスに対するIgM−タイプ抗体（抗−HAV
IgM）が患者の血清中に出現し、早期回復期を通
じて接続し、そして正常な被験者では検出されな
い。それ故、抗−HAV IgMの検出により急性肝
炎Ａ感染症に対する診断法が提供される。 先行技術には特異な抗体検出法を分類するのに
種々なアプローチが開示されている。例えば、米
国特許第4020151号、同第4048298号および同第
3904367号；ブラドレイ（Bradley）等、ジヤー
ナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジイ
（Journal of Clinical Microbiology）、1977年５
月、第521〜530頁；ランセツト（Lancet）、1978
年９月23日、第684頁；ヘパテイテス・サイエン
テイフイツク・メモランダム（Hepatitis
Scientific Memorandom）、1978年11月、第３
頁；およびヘパテイテイス・サイエンテイフイツ
ク・メモランダム、1979年２月、第２頁、これら
の全ては特異抗体検出法の分類についてのアプロ
ーチを指示している。本出願人の出願に係る特開
昭55−22186号公報には特にIgMについての３段
階固相免疫定量法が記載されている。後者のアツ
セイでは、抗−人IgM（μ鎖特異性）で被覆した
プラスチック・ビーズを順次血清標本、肝炎Ａウ
イルス抗原および肝炎Ａウイルス抗原に対する標
識抗体と共に培養している。本発明は該アツセイ
の改良を提示するものであり、この改良によると
μ鎖特異性抗−人IgMまたは供試試料で被覆した
固体支持体を人の肝炎陰性血清、血漿もしくは
IgG含有フラクションの希薄水溶液で処理する。 本発明は、肝炎Ａウイルス抗原に対するIgM抗
体を測定することによる肝炎Ａ感染の急性期を検
知する改良である。この改良は、供試試料を肝炎
陰性血清、血漿またはそのIgG含有フラクション
を含む水溶液で希釈することを包含する。すなわ
ち、供試試料を約0.1％肝炎陰性人血清もしくは
血漿を含む希釈剤で100〜200倍に希釈することに
より、抗−人IgM被覆固体支持体試薬アツセーを
包含する固相アツセーの特異性が著しく改善され
ることが見い出された。このアツセーにおいて
は、固体支持体試薬を希釈した供試試料と反応さ
せ、洗滌し、肝炎Ａ抗原と反応させ、洗滌し、そ
して標識肝炎Ａ抗体と反応させ、洗滌し、そして
固体支持体上のラベルの量を測定する。あるいは
また、固体支持体は肝炎陰性人血清、血漿または
そのIgG含有フラクションの希水溶液で前処理す
ることもできる。この後者の態様では、IgG含有
フラクションによる処理が好ましい。尚本発明の
固相アツセーに用いる固体支持体としては重合体
ビーズ等適宜の固相反応用固体支持体が用いられ
る。これらの大きさ、形状は限定されないが、表
面積のわかっている固体支持体が通常１〜数個用
いられる。ビーズを例にとるとその大きさはよく
知られるように直径５mm〜２cm程度であり、言う
までもなくラテックス凝集法に用いるような懸濁
性微粒子とは本質的に異なる。 本発明の好ましい態様を実施するために、次の
試薬を調製した。 抗−μ被覆ビーズ： 人IgM、μ鎖特異性に対する山羊抗血清をリト
ン・ビオネテイクス（Litton Bionetics）から得
た。ポリスチレンビーズ（６mm）を２時間0.01M
トリス緩衝剤（PH9.0）で10-3希釈した抗血清で
被覆し、乾燥しそして風乾した。ビーズを使用時
まで４℃で保存した。 肝炎Ａウイルス（AHV）抗原溶液： HAVは肝炎Ａの急性段階でのきぬざるの肝臓
から得られた。肝臓抽出物を調製し、そしてウイ
ルス感染性をホルマリンで不活性化した。抽出物
を、５ｍＭ EDIAおよび0.1％アジ化ナトリウム
を含有する正常な塩水（PBS）中0.01Mホスフエ
ート緩衝剤、PH7.0に希釈してアツセーに適当な
cpmを得た。 125I−抗−HAV： IgGを高い抗−HAV力価をもつ回復期血清か
らDEAEセルロースクロマトグラフイーにより単
離した。これをグリーンウツド（Greenwood）
の方法により 125Iで同位元素標識した。ヨウ化
した抗体を、牛血清、正常人血清、EDTAおよ
びアジ化ナトリウムを含むPBSで約５×
106cpm／mlに希釈した。 第一希釈液： 試験すべき各標品を正常な塩水（0.9％塩化ナ
トリウム）またはホスフエート緩衝化塩水
（PBS0.01Mりん酸ナトリウム、PH7.2、0.9％塩水
中）で200倍にまず希釈した。 第二希釈液（標品希釈剤）： 第二溶液を標品に更に希釈するのに使用した。
塩水またはPBS中の標品の第一希釈物の適量を
反応ために入れ、そして0.1％正常人血清または
血漿；10％胎児牛血清；0.005M EDTA（エチレ
ンジアミンテトラアセテート）；0.2％ツイン
（Tween）−20；および0.1％アジ化ナトリウムか
らなる0.01PBS中の溶液（PH7.4）で21倍に希釈
する。 アツセー比較対照： 陽性対照を肝炎Ａにかかつている被験者から急
性もしくは早期回復期血清から調製した。陰性対
照は抗−HAVにとつて陰性の血清から同様にし
て調製した。 試験操作： 試験操作は次のとおり要約することができる。 １ ビーズ・抗μ＋IgM→ビーズ・抗μ−IgM ２ ビーズ・抗μ−IgM＋HAV→ビーズ・抗μ
−IgM−HAV ３ ビーズ・抗μ−IgM−HAV＋ 125I抗−HAV
→ビーズ・抗μ−IgM−HAV− 125I−抗−
HAV 陽性および陰性対照を包含する試験は以下のプ
ロトコールに従つて実施する。 １ ２ml正常塩水に各標品10μを加える。 ２ 反応トレーのための一つに各対照または希釈
標品10μをピペツトで入れる。 ３ 各ため、タツプ・トレー（tap tray）に標品
希釈物200μを加えて混入する。 ４ 各ために人IgMに対する抗体で被覆したビー
ズ１個を加える。 ５ トレーおよびタツプをふたをして混合する。
室温で２時間培養する。 ６ 液体を吸い出し、次に各ビーズを水５mlで２
回洗う。 ７ 各ためにHAV溶液200μを加える。ふたを
し、そして室温で18〜22時間培養する。 ８ 工程６をくりかえす。 ９ 各ために抗−HAV 125Iを200μ加える。ふ
たをし、そして45℃で４時間培養する。 10 工程６をくりかえす。 11 ビーズを計算チューブに移し、そして適当な
計数器で１分間計数する。 12 陽性対照の平均cpmおよび陰性対照の平均
cpmを求める。 陽性対照平均値の1/10を陰性対照平均値に加
えることにより陽性−陰性臨界値（カツトオフ
＝cutcff）を算出する。例えば PC／10＋NC＝カツトオフ cpm値がカツトオフと同等かもしくはそれよ
り大きいときは、標品を陽性と判定する。 13 試験成績のチエツクとして、各対照について
正味のcpm値を用いて陽性対陰性（Ｐ：Ｎ）比
を求める。有効な操作を確実にするにはＰ：Ｎ
値が＜5.0でなければならない。 肝炎Ａ IgM特異性に対する標品希釈および正
常人血漿（NHP）の存在の効果を表に示す。
に肝炎Ａウイルスに対するIgMの免疫定量法に関
する。本発明は人の血清または血漿中の肝炎Ａウ
イルスについてIgMの検定特異性を改善する方法
を包含する。 肝炎Ａ感染症の急性の相の過程で、肝炎Ａウイ
ルスに対するIgM−タイプ抗体（抗−HAV
IgM）が患者の血清中に出現し、早期回復期を通
じて接続し、そして正常な被験者では検出されな
い。それ故、抗−HAV IgMの検出により急性肝
炎Ａ感染症に対する診断法が提供される。 先行技術には特異な抗体検出法を分類するのに
種々なアプローチが開示されている。例えば、米
国特許第4020151号、同第4048298号および同第
3904367号；ブラドレイ（Bradley）等、ジヤー
ナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジイ
（Journal of Clinical Microbiology）、1977年５
月、第521〜530頁；ランセツト（Lancet）、1978
年９月23日、第684頁；ヘパテイテス・サイエン
テイフイツク・メモランダム（Hepatitis
Scientific Memorandom）、1978年11月、第３
頁；およびヘパテイテイス・サイエンテイフイツ
ク・メモランダム、1979年２月、第２頁、これら
の全ては特異抗体検出法の分類についてのアプロ
ーチを指示している。本出願人の出願に係る特開
昭55−22186号公報には特にIgMについての３段
階固相免疫定量法が記載されている。後者のアツ
セイでは、抗−人IgM（μ鎖特異性）で被覆した
プラスチック・ビーズを順次血清標本、肝炎Ａウ
イルス抗原および肝炎Ａウイルス抗原に対する標
識抗体と共に培養している。本発明は該アツセイ
の改良を提示するものであり、この改良によると
μ鎖特異性抗−人IgMまたは供試試料で被覆した
固体支持体を人の肝炎陰性血清、血漿もしくは
IgG含有フラクションの希薄水溶液で処理する。 本発明は、肝炎Ａウイルス抗原に対するIgM抗
体を測定することによる肝炎Ａ感染の急性期を検
知する改良である。この改良は、供試試料を肝炎
陰性血清、血漿またはそのIgG含有フラクション
を含む水溶液で希釈することを包含する。すなわ
ち、供試試料を約0.1％肝炎陰性人血清もしくは
血漿を含む希釈剤で100〜200倍に希釈することに
より、抗−人IgM被覆固体支持体試薬アツセーを
包含する固相アツセーの特異性が著しく改善され
ることが見い出された。このアツセーにおいて
は、固体支持体試薬を希釈した供試試料と反応さ
せ、洗滌し、肝炎Ａ抗原と反応させ、洗滌し、そ
して標識肝炎Ａ抗体と反応させ、洗滌し、そして
固体支持体上のラベルの量を測定する。あるいは
また、固体支持体は肝炎陰性人血清、血漿または
そのIgG含有フラクションの希水溶液で前処理す
ることもできる。この後者の態様では、IgG含有
フラクションによる処理が好ましい。尚本発明の
固相アツセーに用いる固体支持体としては重合体
ビーズ等適宜の固相反応用固体支持体が用いられ
る。これらの大きさ、形状は限定されないが、表
面積のわかっている固体支持体が通常１〜数個用
いられる。ビーズを例にとるとその大きさはよく
知られるように直径５mm〜２cm程度であり、言う
までもなくラテックス凝集法に用いるような懸濁
性微粒子とは本質的に異なる。 本発明の好ましい態様を実施するために、次の
試薬を調製した。 抗−μ被覆ビーズ： 人IgM、μ鎖特異性に対する山羊抗血清をリト
ン・ビオネテイクス（Litton Bionetics）から得
た。ポリスチレンビーズ（６mm）を２時間0.01M
トリス緩衝剤（PH9.0）で10-3希釈した抗血清で
被覆し、乾燥しそして風乾した。ビーズを使用時
まで４℃で保存した。 肝炎Ａウイルス（AHV）抗原溶液： HAVは肝炎Ａの急性段階でのきぬざるの肝臓
から得られた。肝臓抽出物を調製し、そしてウイ
ルス感染性をホルマリンで不活性化した。抽出物
を、５ｍＭ EDIAおよび0.1％アジ化ナトリウム
を含有する正常な塩水（PBS）中0.01Mホスフエ
ート緩衝剤、PH7.0に希釈してアツセーに適当な
cpmを得た。 125I−抗−HAV： IgGを高い抗−HAV力価をもつ回復期血清か
らDEAEセルロースクロマトグラフイーにより単
離した。これをグリーンウツド（Greenwood）
の方法により 125Iで同位元素標識した。ヨウ化
した抗体を、牛血清、正常人血清、EDTAおよ
びアジ化ナトリウムを含むPBSで約５×
106cpm／mlに希釈した。 第一希釈液： 試験すべき各標品を正常な塩水（0.9％塩化ナ
トリウム）またはホスフエート緩衝化塩水
（PBS0.01Mりん酸ナトリウム、PH7.2、0.9％塩水
中）で200倍にまず希釈した。 第二希釈液（標品希釈剤）： 第二溶液を標品に更に希釈するのに使用した。
塩水またはPBS中の標品の第一希釈物の適量を
反応ために入れ、そして0.1％正常人血清または
血漿；10％胎児牛血清；0.005M EDTA（エチレ
ンジアミンテトラアセテート）；0.2％ツイン
（Tween）−20；および0.1％アジ化ナトリウムか
らなる0.01PBS中の溶液（PH7.4）で21倍に希釈
する。 アツセー比較対照： 陽性対照を肝炎Ａにかかつている被験者から急
性もしくは早期回復期血清から調製した。陰性対
照は抗−HAVにとつて陰性の血清から同様にし
て調製した。 試験操作： 試験操作は次のとおり要約することができる。 １ ビーズ・抗μ＋IgM→ビーズ・抗μ−IgM ２ ビーズ・抗μ−IgM＋HAV→ビーズ・抗μ
−IgM−HAV ３ ビーズ・抗μ−IgM−HAV＋ 125I抗−HAV
→ビーズ・抗μ−IgM−HAV− 125I−抗−
HAV 陽性および陰性対照を包含する試験は以下のプ
ロトコールに従つて実施する。 １ ２ml正常塩水に各標品10μを加える。 ２ 反応トレーのための一つに各対照または希釈
標品10μをピペツトで入れる。 ３ 各ため、タツプ・トレー（tap tray）に標品
希釈物200μを加えて混入する。 ４ 各ために人IgMに対する抗体で被覆したビー
ズ１個を加える。 ５ トレーおよびタツプをふたをして混合する。
室温で２時間培養する。 ６ 液体を吸い出し、次に各ビーズを水５mlで２
回洗う。 ７ 各ためにHAV溶液200μを加える。ふたを
し、そして室温で18〜22時間培養する。 ８ 工程６をくりかえす。 ９ 各ために抗−HAV 125Iを200μ加える。ふ
たをし、そして45℃で４時間培養する。 10 工程６をくりかえす。 11 ビーズを計算チューブに移し、そして適当な
計数器で１分間計数する。 12 陽性対照の平均cpmおよび陰性対照の平均
cpmを求める。 陽性対照平均値の1/10を陰性対照平均値に加
えることにより陽性−陰性臨界値（カツトオフ
＝cutcff）を算出する。例えば PC／10＋NC＝カツトオフ cpm値がカツトオフと同等かもしくはそれよ
り大きいときは、標品を陽性と判定する。 13 試験成績のチエツクとして、各対照について
正味のcpm値を用いて陽性対陰性（Ｐ：Ｎ）比
を求める。有効な操作を確実にするにはＰ：Ｎ
値が＜5.0でなければならない。 肝炎Ａ IgM特異性に対する標品希釈および正
常人血漿（NHP）の存在の効果を表に示す。
【表】
患者およびから、強いもしくは上昇した
IgG抗−HAV濃度は偽陽性を与えるが、この偽
陽性は0.1％正常人血漿を含む希釈剤で希釈する
ことにより除かれることがわかる。すなわち、
0.1％肝炎陰性人血清または血漿溶液で約10〜25
倍の希釈度の存在下試料を正常塩水で50〜500倍
に希釈すると、試薬−人抗−IgM被覆固体支持体
のIgM／IgG比の感度を増加させる。免疫定量法
に習熟したものは、抗人IgM被覆固体支持体は、
アツセー操作開始前または上述の如くアツセー操
作中に肝炎陰性血清、血漿またはそのIgGフラク
ションの水溶液と反応し得ることを認めるであろ
う。一般に、試薬のIgM／IgG感度比を増大する
のに極く微量の肝炎陰性血清または血漿が必要と
されるだけである。
IgG抗−HAV濃度は偽陽性を与えるが、この偽
陽性は0.1％正常人血漿を含む希釈剤で希釈する
ことにより除かれることがわかる。すなわち、
0.1％肝炎陰性人血清または血漿溶液で約10〜25
倍の希釈度の存在下試料を正常塩水で50〜500倍
に希釈すると、試薬−人抗−IgM被覆固体支持体
のIgM／IgG比の感度を増加させる。免疫定量法
に習熟したものは、抗人IgM被覆固体支持体は、
アツセー操作開始前または上述の如くアツセー操
作中に肝炎陰性血清、血漿またはそのIgGフラク
ションの水溶液と反応し得ることを認めるであろ
う。一般に、試薬のIgM／IgG感度比を増大する
のに極く微量の肝炎陰性血清または血漿が必要と
されるだけである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 抗人IgM被覆固体支持体を供試試料と反応さ
せ、洗滌し、肝炎Ａ抗原と反応させ、洗滌し、肝
炎Ａ抗原に対する標識抗体と反応させ、洗滌し、
そして固体支持体に結合された標識抗体の量を測
定するタイプの肝炎Ａウイルス抗原に対するIgM
抗体を測定する方法において、供試試料を肝炎陰
性人血清、血漿またはそのIgG含有フラクション
の水溶液で稀釈することを特徴とする方法。 ２ 試薬が抗人IgM被覆固体支持体である供試試
料中の肝炎Ａウイルスに対するIgMを検定する試
薬のIgM／IgG感度比を改良する方法において、
抗人IgM被覆固体支持体を肝炎−陰性人血清、血
漿またはそのIgG含有フラクションの水溶液と接
触させることを特徴とする方法。 ３ 肝炎陰性人血清、血漿またはそのIgG含有フ
ラクションの希水溶液と抗人IgM被覆固体支持体
との混合物からなる免疫定量法試薬。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US22925081A | 1981-01-28 | 1981-01-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57144462A JPS57144462A (en) | 1982-09-07 |
| JPH0368346B2 true JPH0368346B2 (ja) | 1991-10-28 |
Family
ID=22860424
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57011053A Granted JPS57144462A (en) | 1981-01-28 | 1982-01-28 | Improved igm inspection |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS57144462A (ja) |
| BE (1) | BE891901A (ja) |
| CA (1) | CA1172561A (ja) |
| DE (1) | DE3202559A1 (ja) |
| FR (1) | FR2498760B1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| CA1240937A (en) * | 1982-07-26 | 1988-08-23 | Gordon R. Dreesman | Monoclonal igm antibodies and method of preparation |
| EP0507587A3 (en) * | 1991-04-03 | 1993-03-03 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Immunoassay for immunoglubulins |
| DE19548375A1 (de) * | 1995-12-27 | 1997-07-03 | Behringwerke Ag | Immunologische Bestimmungsmethode |
| FR2917173B1 (fr) * | 2007-06-08 | 2009-07-31 | Bio Rad Pasteur Sa | Procede multiplexe de detection d'une infection |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS51106723A (ja) * | 1975-02-19 | 1976-09-21 | Pfizer | |
| JPS5522186A (en) * | 1978-07-28 | 1980-02-16 | Abbott Lab | Immunity test for specific species antibody |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4464474A (en) * | 1980-07-09 | 1984-08-07 | Connaught Laboratories Limited | Non-A, non-B hepatitis assay and vaccine |
-
1982
- 1982-01-18 CA CA000394315A patent/CA1172561A/en not_active Expired
- 1982-01-26 BE BE0/207141A patent/BE891901A/fr not_active IP Right Cessation
- 1982-01-27 FR FR8201260A patent/FR2498760B1/fr not_active Expired
- 1982-01-27 DE DE19823202559 patent/DE3202559A1/de not_active Ceased
- 1982-01-28 JP JP57011053A patent/JPS57144462A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS51106723A (ja) * | 1975-02-19 | 1976-09-21 | Pfizer | |
| JPS5522186A (en) * | 1978-07-28 | 1980-02-16 | Abbott Lab | Immunity test for specific species antibody |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2498760A1 (fr) | 1982-07-30 |
| JPS57144462A (en) | 1982-09-07 |
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