JPS63158460A - 検定の方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物体液中の検体に対して検定を行う方法に
関する。この種の検定は、該生物体液に存在する他の粒
子種による妨害をしばしば受ける。

このような妨害を克服する方法の１つとして、検定前に
検体を生物体液中の残りから分離することを含む予備工
程を行うことがある。本発明はこの種の方法に関する。

米国特許第３７２０７６０号は、アレルゲンに対する抗
体に対して、体液分析のイン・ゲイトロ法に関する。該
体液試料は、不溶性粒子上に予じめ固定化されたアレル
ゲンと接触される。該粒子は分離・洗浄され、次に標識
した、試薬、アレルゲンまたは抗体と反応される。該不
溶性粒子への標識物の結合度は、元々の試料中の抗体濃
度を示す。

英国特許第２０３０２９０号は、遊離型及び結合型の両
方の検体を含有する生物体液中における、サイロイド・
ホルモンのような遊離型の検体を検定する方法を記述す
る。最初の工程で、該液体試料は、検体に対する非標識
受容体と接触されるが、この受容体は、遊離した検体を
受容体に結合させるために、検定チューブ壁土にコーテ
ィングされ可溶化しないようになっている。上清液を除
去し、洗浄した後、該チューブは標識検体または標識受
容体と接触される。該チューブへの標識物の結合度は、
最初に液体中に遊離していた検体濃度を示す。

これらの先行技術による方法の不都合な点は、２回目の
インキュベーションが、検体が可溶化されない状態で行
われることである。このため、明らかに該検体が物理的
に反応しにくくなっている。

即ち、検体の反応性をも低下させたり、その性質を変え
ることもありうる。

欧州特許第５１９８５号は、特異的１ｇＨに対する試験
として、試料を該１ｇＨに対する抗原（アレルゲン）を
有する吸収性ディスクと接触される方法を記述する。該
ディスクは次にプロテアーゼと接触され、結合したＩｇ
Ｅを分解し、抗原に独特のフラグメントを生成、次いで
それが検定される。

本工程の不都合点は、該ディスク表面が小さく、また、
同じ特異性をもつ他のアイソタイプと競合するために、
該特異的１ｇＥの濃度を過小評価することになる、とい
うことである。

本発明は、生物体液中の検体に対する検定を行う方法で
あって、 ａ）生物体液を、特定結合体へ検体を結合させるような
条件下で該検体に対する特異的な結合体を有する第一粒
子と接触させて、検体を該特異的結合体に結合させ、検
体／特異的結合体の複合体を有する第一粒子を回収し、 ｂ）該複合体を有する第一粒子を処理し、検体あるいは
、抗原として認識しうるフラグメントを溶液内に移行さ
せ、 Ｃ）該溶液に第二粒子を、該第二粒子の凝集をもたらす
ような条件下で加えて検定液をつくり、そして、 該試料中の検体の検定として、この凝集の程度を測定す
る、 各工程からなる方法を提供する。

該橋体の性質からみて、本発明は広く適用が可能である
。該検体は抗原またはハプテンでありうるが、その場合
には、該特異的結合体は、一般にそれに対応する抗体で
ある（必ずしも抗体でなければならないわけではない）
。また、該検体は抗体でありうるが、その場合には、該
特異的結合体は、都合の良いように、検体に親和性のあ
る抗原かそれに対する第二の抗体でありうる。本発明は
定性的及び定量的な検定に適用できる。定量的に適用さ
れる場合、本発明は全検体濃度あるいは（代替的に）遊
離型の検体濃度の検定に適用されうる。全検体及び遊離
型の検体の検定における本法の実施例を、以下に述べる
。また、該生物体液の性質は、本発明にとっては全く重
要でないことも述べる。

本法の第一工程は、該生物体液の試料を、該検体に対す
る特異的結合体を有する第一粒子と接触させることによ
って、反応混合物を生成することを含む。該混合物は、
検体が特異的結合体に結合するのに適した既知条件下で
インキュベートされる。該特異的結合体は、様々な既知
技術のいずれによっても可溶化されない。該特異的結合
体は、例えば反応溶媒中に懸濁化している小さな不溶性
粒子（例えばポリスチレン）に共有結合されうる。

該反応溶媒中からの分離を容易にするために、該粒子に
は磁気誘引性をもたせうる。

全検体を検定し、該検体のほとんどあるいは全てを特異
的結合体に確実に結合させるために、一般に、該試料中
に存在することが期待される検体量よりも過剰全の特異
的結合体を使用することが好ましい。一方１、遊離型の
検体濃度の検定に際しては、一般に、遊離している検体
と天然蛋白結合体に結合した検体との平衡に実質的な影
響を及ぼすような高い濃度の、該特異的結合体を使用す
るのは望ましくない。特異的結合体の絶対量は重要では
ないだろうが、その量が検定ごとに正確に同一であるこ
とが一般に重要である。標品を使用して検定すれば検量
線をつくることができるので、この検量線を用いて未知
試料の検体濃度が実質的に読みとられうるのである。

可溶化されない、検体／特異的結合部複合体は、該反応
混合物の残存物から、いずれか適当な手段（例えば、遠
心、磁気誘引または上清液の単純な吸引）によって分離
される。好ましくは、該非可溶化複合体は、未付着試薬
の除去を確実にするために、洗浄される。次いで、これ
は、本発明の第二工程により、該検体または抗原に独特
のそのフラグメントを溶液に戻すために処理を受ける。

はとんどの場合に、本処理は、ペプシンまたはその代わ
りにトリプシンのような酵素により、効果的に実現され
うる。例えば、可溶化されない抗体が、工程ａ）におい
て、非蛋白性の抗原あるいはハプテンをとらえるために
使用された場合、ペプシンによる処理は、該抗体を破壊
し、該抗原またはハプテンを溶液中に放出するために行
われうる。

可溶化されない、抗原またはハプテンが、工程ａ）にお
いて、抗体をとらえるために使用された場合、制御され
た酵素作用は、該抗体を分解し、そのＦｃフラグメント
を溶液中に放出するために使われうる。本工程の好都合
な点は、該Ｆｃフラグメントの中に、抗原性が非常に高
く、抗体全体としてよりもはるかに高感度で検定されう
ろことが知られているものがある、ということである。

本検定が以下に述べる凝集の技術によって行われる場合
、これらのフラグメントは、無傷性抗体よりも安定した
凝集体を形成するという、さらなる利点をもつことにな
り、一層、耐久性及び感度が上昇する。

可溶化されない抗体が工程ａ）において使用された場合
、抗体をはずし、該検体を溶液中に放出させるために、
酵素以外の試薬を使用することが可能であろう。このよ
うな試薬の例としては、３〜６モル／ｇの濃度で使用さ
れる、グアニジニウムハイドロクロライドがある。該検
体（または、上で述べたような、そのフラグメント）を
溶液中に移行させるのに必要な本処理の性質及び程度は
、常法の実験によって、認識あるいは決定される。

検体は、それが存在していた生物体液由来の妨害粒子種
が存在しない溶液中に移行すれば検定可能となる。溶液
の工程の好都合な点は、本工程が、検体に対して、ペテ
ロジイニアスな方法より経費、速さ、簡便さ及び耐久性
の点で一般に好適なホモジイニアスな方法で検定される
ことを許容する、ということである。本発明の方法は特
に、該検体（またはフラグメント）が凝集法により検定
される場合によく適用される。凝集の程度は比濁分析に
より決定されうるが、我々のＩＭＰＡＣＴ　（商標）診
断技法のような粒子計数法によりうまく決定される。本
システムは、一定体積の液体中の粒子数の計算を含む。

該粒子は既知の一定の大きさであり、装置はおおよそそ
の大きさの粒子だけを計算するように目盛調整がされて
いる。このため、凝集によって形成される、２つあるい
はそれ以上の粒子の集合体は除外され、計算されない。

本発明に依るこの好適な方法において、工程ａ）におい
て使用される特異的結合体は、事前に特定の大きさくサ
イズＡ）の第一粒子に付着することによって不溶化され
る。不溶化された検体／特異的結合部複合体を有する粒
子は、反応混合物から分離され、洗浄の後、該検体を再
可溶化するために酵素で処理される。次いで検体を含有
する溶液は、異った大きさくサイズＢ）の被覆第二粒子
を用いた既知の凝集法によって検定されるが、その際、
この液体（溶液中の粒子種、サイズＡ粒子、サイズ８粒
子、及び凝集したサイズ８粒子を含む。）は粒子計数計
に通される。後者はサイズ８粒子のみを数え、大きすぎ
る（または小さすぎる）サイズＡ粒子及び凝集サイズ８
粒子は数えない。この代わりに、該第一粒子は、第二粒
子の凝集（度）が決定される時に磁気誘引されて、検定
液から簡便に除去されうる。

本発明のこの面についての２つの好適な実施態様が、こ
こで記述される。

１、この態様は、一群の抗体から特定の抗体をとり出す
ために、抗原で被覆された２、３ミクロンのラテックス
粒子の使用を含む。この適用は、ヒトの血清または血漿
中の特定のアレルゲンに対するＩｇＥ抗体を同定する際
に特に有用である。

この実施態様において試料はラテックス粒子に共有結合
した過剰量の抗原（アレルゲン）を含む２．３マイクロ
ンのラテックスとインキュベートされる。ＩｇＥ（該ア
レルゲンに対する特定の結合部位を有する。）は粒子に
結合し、次いで遠心分離される。上清液は傾瀉され、非
特異的ＩｇＥ分子を含む血清が除かれる。該粒子は緩衝
液中に再び懸濁化され、ペプシンが加えられて、ラテッ
クスに結合した、アレルゲン／特異的ＩｇＥ複合体を分
解する。この工程は特異的ＩｇＥ分子のＦｃフラグメン
トを溶液中に放出させる。

中性ｐＨの緩衝液で反応停止後、混合物（２，３ミクロ
ンの粒子、ペプシン分解物及びＦｃフラグメント）はＩ
ＭＰＡＣＴまたは他のラテックス凝集／粒子計数自動分
析計に移行される。共有結合した、ウサギ抗ヒト（Ｉｇ
Ｅ−Ｆｃ）血清を含む０．８ミクロンのラテックス粒子
の懸濁液が加えられる。該Ｆｃフラグメントは多価であ
るために、ラテックス凝集はペプシン分解物中に存在す
るＦｃフラグメント量に正比例して生じる。装置の判別
計又はパルス高分析計は、凝集しなかった、０．８マイ
クロンの粒子を計数するようにセットされ、２．３マイ
クロンの粒子の存在は無視する。標品を使用して、患者
からとった試験試料の判定のために、検量線が作成され
うる。

先の章で述べた２、３ミクロンの粒子を使用する代わり
にもっと小さな粒子（例えば直径０．２ミクロンのもの
）が使用できただろうことが明らかとなるだろう。また
もうひとつの異った例として磁気誘引されるようにした
２、３ミクロンのラテックス粒子も使用しうる。この粒
子を用いれば０．８ミクロンの粒子存在下、該粒子を懸
濁液からとり出されうるし、粒子計数法の代わりに比濁
分析法を用いることも可能になる。

特定のＩｇＨに対する検定としてこの方法は、欧州特許
出願第５１９８５号において述べられた方法よりも有利
点をもつ。第一に、ＩｇＥは通常、試料中の免疫グロブ
リン成分（これらのほとんどまたは全てが該アレルゲン
と免疫反応性をもちうる）の少量成分であるため、アレ
ルゲンで被覆された、広範な表面領域はＩｇＥと完全に
結合することを必要とする。このような表面領域は、吸
収性ペーパーディスクによってごく容易に提供されうる
が、アレルゲンで被覆した第一粒子を適当量使用するこ
とによっても容易に得られる。第二に、該アドレス／Ｉ
　ｇＥ複合体がＩｇＥまたはフラグメントを可溶化する
ために酵素で処理される場合、該第一粒子は検定液から
簡単に除かれるので、この段階で分離工程は必要ない。

２、この態様は、蛋白結合抗原も含有する血清から遊離
型抗原をとり出すために、抗体で被覆された、２．３　
ミクロンラテックス粒子を使用することを含む。この適
用は、小分子（チロキシン（Ｔ）、）リョードチロニン
（Ｔ３）、コルチゾール、テストステロン及び、ジフェ
ニルヒダントイン、パルプロ酸ナトリウム及びカルバマ
ゼピンのような薬剤）の非蛋白結合部を決定するのに特
に有用である。これらの物質は、キャリアー蛋白に可逆
的に結合して、血液中に運搬される。Ｔ４の場合では９
９．９８％が、血清中の３つの蛋白、すなわちチロキシ
ン結合アルブミン、プレアルブミン及び血清アルブミン
に結合している。コルチゾールの約９０％が血清蛋白（
トランスコルチン及びアルブミン）に結合している。テ
ストステロンの場合では約９８％が２つの蛋白（性ホル
モン結合アルブミン及びアルブミン）に結合している。

前述した３つの薬剤は抗てんかん治療において使用され
ており、これらの薬剤の各々９５％が血清中のアルブミ
ンと結合している。以上の全ての場合において、臨床的
に最も関係が深いのは、遊離型の検体濃度である。これ
らのことから、はるかに多い蛋白結合体からの妨害なし
に、遊離型の部分を測定することは、診断及び患者の治
療を助ける上で非常に有用な手段となるのである。

該技法は、測定される検体に特異的な抗体で被覆された
ラテックスの使用を必要とする。該抗体量は一般に、期
待される遊離した検体量より過剰であるが、蛋白結合型
と遊離型との間の平衡を実質的に移動させるほどの量で
あるべきではない。該抗体量が検定チューブによって同
一であることが特に重要である。先の実施態様の場合の
ように、抽出工程ａ）において使用されるラテックス粒
子の大きさは、検定の第二段階で使用されるそれよりも
大きく　（または小さく）すべきである。

遊離型の検体濃度に比例した、一定食の検体をとり出す
ために第一ラテックスが次のように使用される二　− 全蛋白濃度がＰｉ　　（ｉ＝１〜ｎ）の一連のｉ蛋白と
結合した結合型との平衡において、遊離型の検体の濃度
（Ｆ）は全濃度（Ｔ）の検体に対して次の式で与えられ
る二　一 検体の小さい部分をとり出すために、ラテックス抗体試
薬１を用いると、開式は次のようになる：　− Ｔ＝ ・・・・・・・・・・・・・・・　（り該抗体ｆｆ１（
Ｐｎ＋１）及び親和性（Ｋ　ｎ１１）は、次の条件が成
り立つようにされるべきである二　−Ｆ′、ｃｌＬＦ 及び 多くの点で、モノクローナル抗体のような低親和性の抗
体は特に有用である。というのは、とり出される検体量
が、広範囲にわたって遊離型の検体濃度に正比例するか
らである二　−とり出される検体量”　Ｋｎ＋Ｉ　Ｐｎ
＋ｌ　Ｆ’一方、高親和性抗体に対しては となる：　− これらの条件の下、遊離型の検体濃度が高い場合におい
ては、限界値（抗体の容量Ｐｎ＋１と等価である。）が
得られるが、これは遊離型の検体濃度とは独立である。

本法は、初めの短いインキュベーションの工程において
検体をとり出すために、ラテックスの第一抗体試薬を使
用することを含む。反応混合物が遠心分離され、上清が
デカントされ、ラテックス試薬から検体を放出するため
に沈殿にペプシン（ＨＣｆＩ）が加えられる。溶液中の
検体は次いで、例えば米国特許第４１８４８４９号また
は第４４２７７８１号において記述される技法によって
検定される。粒子径分析器（計数計）で使用するのに適
当な粒子径の第ニラテックスが用いられる。前述のよう
に、比較的大きい（または小さい）不活性化された、第
一抗体ラテックスは、計数計にはかからず、第二抗体ラ
テックスのラテックス凝集反応が、Ｉ　ＭＰＡＣＴシス
テムによる計数計によって分析される。本法は英国特許
第２０３０２９０Ａ号（上で述べた）で記述される方法
より優れているが、これは本法がより迅速で、偏差がな
いからである。抗体で被覆した第一ラテックス粒子の使
用は、試料に存在する抗体量の適切な制御を許容する。

このような制御は、上で述べた通り、検体の蛋白結合型
と遊離型の間の平衡を実質的に移動させることなしに、
試料から充分な遊離型の検体をとり出すために非常に重
要である。

次の実施例は、本発明を例示する。付属の表は、次の実
験によって決定された、特定１ｇＥ濃度に対する非凝集
粒子の割合を示したグラフである。

実施例 １、試薬及び緩衝液 次の試薬が購入された：ローンーポウレンク（Ｒｈｏｎ
ｅ　−Ｐｏｕｌｅｎｃ）クールベボア、フランスからカ
ルボキシル基（エスタポールＫ　１５０）を有するラテ
ックス粒子（０，８ミグ０２１０％Ｗ／Ｖエスタポール
に９９）及びそれをもたない乳液状粒子（２，３ミクロ
ン、１０％Ｗ／Ｖ）　；シグマ化学（セントルイス。

Ｍｏ）から１−エチル−３（３−ジメチル−アミノ−プ
ロピル）カルボジイミド−ＨＣρ；テクニコン（Ｔｅｃ
ｈｎｉｃｏｎ、　　タリタウン、ＮＹ）からトウイーン
２０そしてカルバイオケミカル（う・ジヨウ。

ＣＡ）からウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。

緩衝液は、９０ｇ／！ｌ　Ｎ　ａ　Ｃｆｌ及び２０ｍＭ
ホウ酸を用いる、ｐＨ８，２のホウ酸緩衝生理食塩水（
Ｂ　Ｂ　Ｓ）　　；　９０ｇ／Ｉ！　Ｎ　ａ　Ｃ１ｌ　
、　５０ｍＭグリシンを用い、０．１％トゥイーン２０
　（ＣＢ　Ｓ　−Ｔｖｅｅｎ）または１％ＢＳＡ　（Ｃ
ＢＳ−ＢＳＡ）を含む、ｐＨ９，２のグリシン緩衝生理
食塩水そして、９０ｇ／ｌＮａＣ１及び８ｍＭリン酸を
用いる、ｐ１１７．４のリン酸緩衝生理食塩水（Ｐ　Ｂ
　Ｓ）であった。

２、アレルゲンの調製 ダーマトファゴイズ・ブテロニシヌス （Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄａｓ　ｐｔｃｒｏｎｙ
ｓｓｔｎｕｓ、　ＤＰＴ）由来のグリセリン性アレルゲ
ン抽出液及びオオアワガエリの花粉がベンカード社（ニ
ブツム、サリー。

イングランド）から購入された。これらはＰＢＳに対し
て４℃で広く透析され、ＹＭ−１０膜（アミコン社、ダ
ンバース、ＭＡ）上での限外ｉ濾過によって濃縮された
。本溶液は使用直前まで一８０℃で保存された。

３、ラテックス（Ｌｘ　）粒子の調製 ２．３ミクロンの直径のラテックス（Ｌｘ　−２，３）
が、アレルゲン吸着体（ａｌ　ｌｃｒｇｏｓｏｒｂｃｎ
ｔ）として使用された。１００マイクロリツトルの該１
０％懸濁液がＢＢＳ中で洗浄され、同緩衝液２００マク
ロリツトル中に再び懸濁化される；１００マクロリツト
ルがとり出され、カルボジイミド１０ｍｇ／ｍｌ水溶液
２００マイクロリットルを混合、アレルゲンの１０ｍｇ
／ｍ１ＢＢｓ溶液１０マイクロリットルが加えられる。

最終容量は水で１ｍｌに調整され、懸濁液は室温で４時
間、ポルテックスミキサーにかけながらインキュベート
された。１０．０００ｇで１０分間遠心後、Ｌｘ−２，
３は、ＧＢＳ　−ＢＳＡ、ＧＢＳ　−トウイーン及びＣ
ＢＳ−ＢＳＡで連続的に洗浄された。

沈殿物は、ＣＢ５−Ｂ５Ａ１ｍ１に再び懸濁化され、４
℃に保存された。ラテックスに存在するアレルゲン量を
はかるために、こん踏量の放射標識アレルゲンが、ラテ
ックスとのインキュベーションの際に加えられ、洗浄後
、該粒子上に残った放射活性が測定された。０．５％ラ
テックス懸濁液１００マイクロリットル当り約５マクロ
グラムのアレルゲンが吸着された。

直径０．８マクロンのラテックス（Ｌｘ　−０，８）は
、抗ヒトＦｃＥウサギ抗血清由来１ｇＧのＦａｂ’　２
フラグメントで被覆された（マグヌソン（Ｍａｇｎｕｓ
ｓｏｎ）ら、臨床アレルギー（ＣＩｉｎ。

ＡＩｌｅｒｇｙ）、　１１巻、４５３ページの記述によ
る）。

４、特異的ＩｇＥに対する検定 試料（希釈しないか、通常のウサギ血清中１１５または
１／１０に希釈したもの）１００マクロリツトルが、円
錐形のポリスチレンチューブ（エッペンドルフ）中、ア
レルゲン被覆したＬｘ　　−２，３、５０マイクロリツ
トルとともに２１℃９０分間連続振盪しながらインキュ
ベートされた。

懸濁液は次いで５４１４　Ｓエッペンドルフ・、マイク
ロセントリフユージ中２分間、１０劃００ＲＰＭで遠心
分離され、一旦９０ｇ／ＩＮａＣρ溶液￥ｍｌで洗浄、
最終的に同溶液５０マイクロリツトルに再び懸濁化され
、ｌｆｆ１ｇ／ｍｌペプシンを含有する０、１５ＮＨＣ
ｆＩ８０マイクロリツトルが加えられた。分解反応は２
Ｍ）リス−ＮａＯＨ２０マイクロリツトルを加えるまで
、３０分間３７℃で続けられた。

試料は次いで、自動粒子計数システム（ＩＭＰＡＣＴ。

アケード診療システム、ブリュッセル、ベルギー）にか
けられたが、ここで懸濁液３０マイクロリツトルが、ウ
サギ抗ヒトＦｃＥ　　Ｆａｂ’　　２で被覆されたＬｘ
　−０，８（ＣＢＳの０．５％懸濁液）３０マイクロリ
ツトルに加えられた。非凝集粒子の計数前、インキュベ
ーションは３０分間、３７℃で連続振盪しながら行われ
た。ＩｇＥの計量は、標準量のＩｇＥ（ＩｇＥ−標準一
血清、カルバイオケミカル、う・ジヨウ、Ｃａ）のペプ
シン分解によって得られる凝集曲線との対照によって行
われた（マグヌソンらの記述の通り（上記をみる）であ
る）。

結　　　　果 １、検定の特異性 本検定におけるＩｇＥ検出の特異性は、Ｆｃと呼ばれる
ＩｇＥフラグメントのペプシンに対する抵抗性に基づい
ており、このことはすでに充分に証明されている。Ｉｇ
ＥのＬｘ−２，３への非特異的吸着を避けるために、血
清試料が、Ｄ　Ｐ　Ｔ　！：対する特異的ＩｇＥではな
くて、高濃度のＩｇＥとともに用いられた。ヒト骨髄Ｗ
ｉ１ｇＥ、ＩｇＥ（ＤＥＳ）もまた量を増やしてＬｘ−
２，３懸濁液に加えられた。これらの実験は、本検定が
試料中の全１ｇＨの曾には依存しないことを示した。

実験は、Ｌｘ２Ｊとのインキュベーション中、量を増や
しながら可溶性１ｇＥも加えて行われ、Ｌｘ−０，８凝
集の完全な阻害を示した。

２、検定の感度 典型的な曲線が図中に示されている。特異的抗ＤＰＴ　
　ＩｇＥの既知ｆｉｌ（非可溶化されたＤＰＴへの免疫
吸着により決定される）を含む血清試料はＰＢＳ中で２
倍に希釈され、ｔ、ｘ　−２，３と混合された。濃度の
範囲は、２５ｐｇ／ｍ１〜２００ｎｇ　／ｍｌで、最大
感度は２００ｐｇ　／ｍｌと１１００ｎ　／ｍｌの間で
あった。２００ｎｇ　／ｍｌより高い濃度においては、
阻止帯の影響はみられなかった。同様の実験が、ＤＰＴ
の代わりにオオアワガエリの花粉を用いて行われ、ＤＰ
Ｔに匹敵する検出範囲を与えた。

血清特異的ＩｇＥの検出は、１９７２年以来広く適用さ
れており、アトピー性疾患の診断の正確さは大きく進歩
してきた。上で検討された米国特許第３７２０７８０号
の発明に基づく放射性アレルゲン吸着試験（ＲＡＳＴ）
が好ましいとされてきた。本試験は、ペーパーディスク
へのアレルゲンのカップリング及び、アレルゲンに特異
的な抗体をペーパーディスクに結合させる条件下での、
検定される生物体液の試料とディスクとの接触を含んで
いた。該ディスクは次いで洗浄され、結合度が、放射性
標識アレルゲンまたは放射性標識抗体を用いて決定され
る。

しかしながら本検定は２つの大きな欠点を有する。第一
に、該アレルゲンは、高頻度の非特異的蛋白吸着を有す
るペーパーディスクとカップルされており、高いバック
グラウンド値と全１ｇＥｆｆｉへの依存性を生む結果と
なる。第二に、ディスク表面は小さいため、同じ特異性
をもってはいる他のアイソタイプとの競合が、特異的Ｉ
ｇＥの濃度の過小評価を与える。

ここで記述されるラテックス凝集検定はいくつかの有利
点を有している。第一に、感度がはるかに進歩し、ＲＡ
ＳＴの０．７１Ｕ／ｍｌに比較して０．０１１Ｕ／ｍｌ
に達している。この感度はいくつかの要因の結果である
：即ち、有効なディスク表面が１０倍に増加したことや
、非常に低頻度のラテックスへの非特異的蛋白結合及び
試料とＬｘ−２４との間の接触時間の短縮の結果である
。興味深いことに、該表面は非常に増加するが、非可溶
化されたアレルゲンの量は、ＲＡＳＴに使用されたペー
パーディスクと同じオーダーの大きさく試験当り、約５
μｇ対７μｇ）である。しかしながら、該アレルゲンの
ほとんどは、ＲＡＳＴにおける抗体結合に対して必ずし
も近づきえない。ラテックスの検定の感度は、濃度が培
養培地、気管支−肺胞洗液、唾液あるいは眼房水のよう
に著しく低い液体中での特異的ＩｇＥの検出を可能とす
る。第二に、該ラテックス検定は、カバの花粉が非可溶
化されるディスクに対する対照によって結果が評価され
るＲＡＳＴとは違って、標準１ｇＥ調製液に対する対照
による特異的ＩｇＥの定量的評価を許容する。これは、
アトピー性及び非アトピー性患者の間のより正確な記述
を考慮する。

第三に、アレルゲンの表面及び近づきやすさが増えたた
めに、同じ特異性を有する他のアイソタイプ（ＩｇＧ、
ＩｇＡ及びＩｇＭ）との競合性は完全ではないとしても
、かなり低下している。特異的抗ＤＰＴ抗体を含有する
血清試料は、ＬＸ　−２，３との一回のインキュベーシ
ョン後、ＤＰＩに対していかなるクラスの残存抗体活性
ももたなかった。さらに、ラテックス検定は、約４時間
で行われ、自動化されることが可能である。また本検定
は、ＩｇＥ検出前のペプシン分解工程の使用に付随する
有利点をもっている；例えば、ＩｇＥに対する自己抗体
に由来する妨害がなくされる。

い４名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）生物体液中の検体に対して、検定を行う方法におい
   て、 ａ）生物体液の試料を、特定結合体へ検体を結合させる
   ような条件下で該検体に対する特異的な結合体を有する
   第一粒子と接触させて、検体を該特異的結合体に結合さ
   せ、検体／特異的結合体の複合体を有する第一粒子を回
   収し、 ｂ）該複合体を有する第一粒子を処理し、検体あるいは
   、抗原として認識しうる断片を溶液内に移行させ、 ｃ）該溶液に第二粒子を、該第二粒子の凝集をもたらす
   ような条件下で加えて検定液をつくり、そして、該試料
   中の検体の検定として、この凝集の程度を測定する、 各工程からなる。 ２）検体が抗原または抗体であり、第二粒子が、該検体
   の免疫結合のパートナーを有している、特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ３）検体がハプテンであり、第二粒子が該ハプテンを有
   し、前記工程ｃ）が該ハプテンに対する抗体の存在下で
   行われる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４）該特異的結合体が、不溶性ポリマー状粒子に共有結
   合している形で使用される、特許請求の範囲第１項から
   第３項のいずれかの項に記載された方法。 ５）該複合体が、工程ｂ）において酵素で処理される、
   特許請求の範囲第１項から第３項のいずれかの項に記載
   された方法。 ６）工程ａ）における該第一粒子が均一のサイズであり
   、工程ｃ）において使用される該第二粒子が、第一粒子
   とは異った大きさでかつ均一であり、そして凝集度は工
   程ｃ）において、検定液中の非凝集第二粒子濃度の測定
   により決定さされることからなる特許請求の範囲第１項
   から第５項のいずれかの項に記載された方法。 ７）該検体が、アレルゲンに対する特異的抗体である、
   特許請求の範囲第１項から第６項のいずれかの項に記載
   された方法。 ８）可溶化されない抗体と特異的結合体との複合体が、
   工程ｂ）において酵素で処理して該抗体のＦｃ断片溶液
   とし、次いでそれを検定する、特許請求の範囲第７項記
   載の方法。 ９）該検体が、遊離形と１以上の天然結合体に結合する
   形との両者として生物体液中に存在する遊離部分である
   、特許請求の範囲第１項から第６項のいずれかの項に記
   載された方法。 １０）該第一及び第二粒子がラテックス粒子である、特
   許請求の範囲第１項から第９項のいずれかの項記載の方
   法。