JPH05209884A - 抗原、抗体検出方法 - Google Patents
抗原、抗体検出方法Info
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- JPH05209884A JPH05209884A JP29254591A JP29254591A JPH05209884A JP H05209884 A JPH05209884 A JP H05209884A JP 29254591 A JP29254591 A JP 29254591A JP 29254591 A JP29254591 A JP 29254591A JP H05209884 A JPH05209884 A JP H05209884A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 好ましくは磁性細菌から抽出した磁性細菌粒
子に、ピリジルジチオアルキル脂肪酸Ｎ−スクシンイミ
ジルエステルを用い、蛍光標識を行った抗体または抗原
を固定化し、抗原または抗体と抗原抗体反応を行って凝
集を生じさせる。その後、凝集物を磁気的に分離し、蛍
光強度を測定する。 【効果】 きわめて微量まで高感度、高精度にて定量で
きる。
子に、ピリジルジチオアルキル脂肪酸Ｎ−スクシンイミ
ジルエステルを用い、蛍光標識を行った抗体または抗原
を固定化し、抗原または抗体と抗原抗体反応を行って凝
集を生じさせる。その後、凝集物を磁気的に分離し、蛍
光強度を測定する。 【効果】 きわめて微量まで高感度、高精度にて定量で
きる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗原や抗体の微量検出
方法に関する。
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】抗原や抗体を検出するためのイムノアッ
セイが注目を集めている。
セイが注目を集めている。
【０００３】例えば、食物や薬剤中などのアレルゲンの
検出や除去は、アレルギーの診断、予防などにおいて極
めて重要である。これまでアレルゲンの検出には、放射
性同位体を用いるＲＡＳＴ（Radioallergosorbent tes
t）法、皮膚テスト（ブリックテスト、スクラッチテス
ト、皮内テスト）、ヒスタミン遊離試験などが用いられ
てきた。しかし、ＲＡＳＴ法は放射性同位体を用いなけ
ればならず、皮膚テストは、アナフィラキシーショック
などの危険を伴うという欠点がある。このため新しいア
レルゲンの検出システムの開発が望まれている。
検出や除去は、アレルギーの診断、予防などにおいて極
めて重要である。これまでアレルゲンの検出には、放射
性同位体を用いるＲＡＳＴ（Radioallergosorbent tes
t）法、皮膚テスト（ブリックテスト、スクラッチテス
ト、皮内テスト）、ヒスタミン遊離試験などが用いられ
てきた。しかし、ＲＡＳＴ法は放射性同位体を用いなけ
ればならず、皮膚テストは、アナフィラキシーショック
などの危険を伴うという欠点がある。このため新しいア
レルゲンの検出システムの開発が望まれている。
【０００４】そこで、本発明者らは、磁性細菌から抽出
した磁性細菌粒子に蛍光色素標識抗体を固定化し、微量
抗原の検出を行う旨を報告している（ANALYTICAL CHEMI
STRY,VOL. ６３，No. ３，FEBRUARY １，１９９１ Ｐ
２６８−Ｐ２７２）。
した磁性細菌粒子に蛍光色素標識抗体を固定化し、微量
抗原の検出を行う旨を報告している（ANALYTICAL CHEMI
STRY,VOL. ６３，No. ３，FEBRUARY １，１９９１ Ｐ
２６８−Ｐ２７２）。
【０００５】この方法は、蛍光色素標識抗体固定化磁性
細菌粒子と抗原とを液中で反応させ、抗原抗体反応に基
づく凝集を生じさせたのち、凝集分離後の液の分散液の
蛍光強度を測定し、蛍光強度の減少から、抗体減少量を
検出し、抗原量を定量するものである。しかし、この方
法では、前記報文Ｐ２７１Figure４に示されるように、
数百pg/ml 程度までの抗体量の減少量までしか定量でき
ず、抗原の微量定量に不適である。
細菌粒子と抗原とを液中で反応させ、抗原抗体反応に基
づく凝集を生じさせたのち、凝集分離後の液の分散液の
蛍光強度を測定し、蛍光強度の減少から、抗体減少量を
検出し、抗原量を定量するものである。しかし、この方
法では、前記報文Ｐ２７１Figure４に示されるように、
数百pg/ml 程度までの抗体量の減少量までしか定量でき
ず、抗原の微量定量に不適である。
【０００６】そこで、本発明者らはさらに、蛍光標識を
行った抗体または抗原を固定化した磁性細菌から抽出し
た磁性細菌粒子と、抗原または抗体とを液中で反応さ
せ、抗原抗体反応に基づく凝集を生じさせたのち、これ
を磁気的に分離濃縮し、凝集物の蛍光濃度を測定するこ
とを提案している。しかし、この方法でも、百pg/ml 程
度までの定量しかできない。
行った抗体または抗原を固定化した磁性細菌から抽出し
た磁性細菌粒子と、抗原または抗体とを液中で反応さ
せ、抗原抗体反応に基づく凝集を生じさせたのち、これ
を磁気的に分離濃縮し、凝集物の蛍光濃度を測定するこ
とを提案している。しかし、この方法でも、百pg/ml 程
度までの定量しかできない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の主たる目的
は、磁性細菌粒子等の強磁性粒子を用い、きわめて微量
の抗原、抗体を精度よく検出できる方法を提供すること
にある。
は、磁性細菌粒子等の強磁性粒子を用い、きわめて微量
の抗原、抗体を精度よく検出できる方法を提供すること
にある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】このような目的は、下記
の（１）〜（４）の本発明によって達成される。 （１）ピリジルジチオアルキル脂肪酸Ｎ−スクシンイミ
ジルエステルを用い、強磁性粒子に、抗体または抗原を
固定化し、蛍光標識を行い、これと抗原または抗体とを
液中で反応させ、抗原抗体反応に基づく凝集を生じさせ
たのち、これを磁気的に分離濃縮し、蛍光濃度を測定す
ることを特徴とする抗原、抗体検出方法。
の（１）〜（４）の本発明によって達成される。 （１）ピリジルジチオアルキル脂肪酸Ｎ−スクシンイミ
ジルエステルを用い、強磁性粒子に、抗体または抗原を
固定化し、蛍光標識を行い、これと抗原または抗体とを
液中で反応させ、抗原抗体反応に基づく凝集を生じさせ
たのち、これを磁気的に分離濃縮し、蛍光濃度を測定す
ることを特徴とする抗原、抗体検出方法。
【０００９】（２）前記強磁性粒子は、表面にアミノ基
を有する有機薄膜を有する上記（１）に記載の抗原、抗
体検出方法。
を有する有機薄膜を有する上記（１）に記載の抗原、抗
体検出方法。
【００１０】（３）前記強磁性粒子は、磁性細菌粒子で
ある上記（１）または（２）に記載の抗原、抗体検出方
法。
ある上記（１）または（２）に記載の抗原、抗体検出方
法。
【００１１】（４）前記固定化する抗体または抗原はジ
チオ基を有し、その還元体を固定化する上記（１）ない
し（３）のいずれかに記載の抗原、抗体検出方法。
チオ基を有し、その還元体を固定化する上記（１）ない
し（３）のいずれかに記載の抗原、抗体検出方法。
【００１２】
【発明の具体的構成】以下、本発明の具体的構成につい
て詳細に説明する。磁性細菌は、１９７０年代、アメリ
カで発見され、菌体内に５０〜１００nmの程度の粒径の
マグネタイト（Ｆｅ3 Ｏ4 ）単結晶の微粒子が１０〜２
０個ほど連なったマグネトソームと呼ばれるチェイン状
の粒子を保持している。磁性細菌はこのマグネトソーム
を保持することで地磁気を感知し、磁力線の方向を認識
することができる。磁性細菌は微好気性の細菌であり、
地磁気を感知することで好気的な水面から微好気的な沈
殿物表層へ磁力線に沿って泳ぐことができる。前記報文
に示されるように、このものは単菌分離され、大量培養
が可能となった磁性細菌は大きさがおよそ２μｍのグラ
ム陰性の螺旋菌で、菌体内に１０〜２０個のマグネタイ
ト単結晶を合成する。
て詳細に説明する。磁性細菌は、１９７０年代、アメリ
カで発見され、菌体内に５０〜１００nmの程度の粒径の
マグネタイト（Ｆｅ3 Ｏ4 ）単結晶の微粒子が１０〜２
０個ほど連なったマグネトソームと呼ばれるチェイン状
の粒子を保持している。磁性細菌はこのマグネトソーム
を保持することで地磁気を感知し、磁力線の方向を認識
することができる。磁性細菌は微好気性の細菌であり、
地磁気を感知することで好気的な水面から微好気的な沈
殿物表層へ磁力線に沿って泳ぐことができる。前記報文
に示されるように、このものは単菌分離され、大量培養
が可能となった磁性細菌は大きさがおよそ２μｍのグラ
ム陰性の螺旋菌で、菌体内に１０〜２０個のマグネタイ
ト単結晶を合成する。
【００１３】この磁性細菌中の磁性粒子は、六角柱で粒
径、形状が非常に均一であり、純度も高く、粒子を含む
菌体の磁化を微粒子当りに換算すると約５０emu/g であ
る。また、保磁力は２３０ Oe で、単磁区構造をとって
いることが確かめられている。
径、形状が非常に均一であり、純度も高く、粒子を含む
菌体の磁化を微粒子当りに換算すると約５０emu/g であ
る。また、保磁力は２３０ Oe で、単磁区構造をとって
いることが確かめられている。
【００１４】また、粒子表面が有機薄膜で覆われている
ことから金属の溶出がほとんど起こらず安定に存在し、
水溶液中での分散性にも優れているといった特性を有し
ている。そして、この有機薄膜はホスファチジルエタノ
ールアミンを主成分とする厚さが約４nmの脂質二分子膜
である。この有機薄膜は除去しないで使用することが好
ましい。なお、磁性細菌粒子は、通常１次粒子単独であ
るが、その２〜１０個の２次粒子であってもよい。
ことから金属の溶出がほとんど起こらず安定に存在し、
水溶液中での分散性にも優れているといった特性を有し
ている。そして、この有機薄膜はホスファチジルエタノ
ールアミンを主成分とする厚さが約４nmの脂質二分子膜
である。この有機薄膜は除去しないで使用することが好
ましい。なお、磁性細菌粒子は、通常１次粒子単独であ
るが、その２〜１０個の２次粒子であってもよい。
【００１５】磁性細菌からの磁性細菌粒子の抽出方法に
はフレンチプレスを用いた物理的圧力破砕、アルカリ煮
沸、酵素処理、超音波破砕処理などがあり、いずれの方
法で抽出された磁性細菌粒子もその表面が有機薄膜で覆
われている。リゾチーム、プロテアーゼなどの酵素を用
いると、菌体内で保持されていたマグネトソームの状態
で抽出することができ、また、超音波処理を用いると一
つ一つが分散した状態のものが得られる。よって、その
利用目的により適した抽出方法を用いることが望まれ
る。磁性細菌粒子を大量に得る場合には、超音波による
破砕が適している。抽出後、磁石等により磁性細菌粒子
を分離する。なお、この有機薄膜は化学処理により除去
可能であるが、後述の抗原、抗体の固定化のために残し
ておく。すなわち、本発明で用いる強磁性粒子は、結合
性官能基を有するリン脂質層の有機薄膜で被覆された磁
性微粒子である。
はフレンチプレスを用いた物理的圧力破砕、アルカリ煮
沸、酵素処理、超音波破砕処理などがあり、いずれの方
法で抽出された磁性細菌粒子もその表面が有機薄膜で覆
われている。リゾチーム、プロテアーゼなどの酵素を用
いると、菌体内で保持されていたマグネトソームの状態
で抽出することができ、また、超音波処理を用いると一
つ一つが分散した状態のものが得られる。よって、その
利用目的により適した抽出方法を用いることが望まれ
る。磁性細菌粒子を大量に得る場合には、超音波による
破砕が適している。抽出後、磁石等により磁性細菌粒子
を分離する。なお、この有機薄膜は化学処理により除去
可能であるが、後述の抗原、抗体の固定化のために残し
ておく。すなわち、本発明で用いる強磁性粒子は、結合
性官能基を有するリン脂質層の有機薄膜で被覆された磁
性微粒子である。
【００１６】ここで結合性官能基としては、アミノ基が
好適である。このような結合性官能基としてアミノ基−
ＮＨ2 を有するリン脂質としては、例えば、ホスファチ
ジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスフ
ァチジルイノシトール、カルジオリピン、ホスファチジ
ル−Ｎ−メチルエタノールアミン、ホスファチジルコリ
ン、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリ
ン、ホスファチジルトレオニン等がある。
好適である。このような結合性官能基としてアミノ基−
ＮＨ2 を有するリン脂質としては、例えば、ホスファチ
ジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスフ
ァチジルイノシトール、カルジオリピン、ホスファチジ
ル−Ｎ−メチルエタノールアミン、ホスファチジルコリ
ン、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリ
ン、ホスファチジルトレオニン等がある。
【００１７】また、強磁性微粒子としては、例えば、Ｆ
ｅ3 ０4 、γ−Ｆｅ2 Ｏ3 、Ｃｏ−γ−Ｆｅ2 Ｏ3 、
（ＮｉＣｕＺｎ）Ｏ・Ｆｅ2 Ｏ3 、（ＣｕＺｎ）Ｏ・Ｆ
ｅ2 Ｏ3 、（Ｍｎ・Ｚｎ）Ｏ・Ｆｅ2 Ｏ3 、（ＮｉＺ
ｎ）Ｏ・Ｆｅ2 Ｏ3 、ＳｒＯ・６Ｆｅ2 Ｏ3 、ＢａＯ・
６Ｆｅ2 Ｏ3 、ＳｉＯ2 で被覆したＦｅ3 ０4 、（粒径
約２００A ）［Enzyme Microb. Technol.,vol.2, p.2〜
10(1980)参照] 、各種の高分子材料（ナイロン、ポリア
クリルアミドタンパク質等）とフェライトとの複合微粒
子等を挙げることができる。
ｅ3 ０4 、γ−Ｆｅ2 Ｏ3 、Ｃｏ−γ−Ｆｅ2 Ｏ3 、
（ＮｉＣｕＺｎ）Ｏ・Ｆｅ2 Ｏ3 、（ＣｕＺｎ）Ｏ・Ｆ
ｅ2 Ｏ3 、（Ｍｎ・Ｚｎ）Ｏ・Ｆｅ2 Ｏ3 、（ＮｉＺ
ｎ）Ｏ・Ｆｅ2 Ｏ3 、ＳｒＯ・６Ｆｅ2 Ｏ3 、ＢａＯ・
６Ｆｅ2 Ｏ3 、ＳｉＯ2 で被覆したＦｅ3 ０4 、（粒径
約２００A ）［Enzyme Microb. Technol.,vol.2, p.2〜
10(1980)参照] 、各種の高分子材料（ナイロン、ポリア
クリルアミドタンパク質等）とフェライトとの複合微粒
子等を挙げることができる。
【００１８】このようなフェライト系の粒子は、公知の
方法の他に、例えば、水性媒体中において結合性官能基
を有するリン脂質の脂質二重層からなるリボソームを形
成し、このリボソーム内に共沈法によりフェライトを合
成する方法等でも製造される。また、磁性金属粒子やそ
れらの複合体でもよい。これらの磁性細菌粒子以外の磁
性粒子への抗体または抗原の固定化に先立って、抗原ま
たは抗体の固定化技術として公知の前処理方法を用いる
ことができる。例えば、シランカップリング剤、ブドウ
状球菌より得られるプロテインＡを磁気微粒子に被覆さ
せる方法などである。
方法の他に、例えば、水性媒体中において結合性官能基
を有するリン脂質の脂質二重層からなるリボソームを形
成し、このリボソーム内に共沈法によりフェライトを合
成する方法等でも製造される。また、磁性金属粒子やそ
れらの複合体でもよい。これらの磁性細菌粒子以外の磁
性粒子への抗体または抗原の固定化に先立って、抗原ま
たは抗体の固定化技術として公知の前処理方法を用いる
ことができる。例えば、シランカップリング剤、ブドウ
状球菌より得られるプロテインＡを磁気微粒子に被覆さ
せる方法などである。
【００１９】このような磁性細菌粒子等の強磁性粒子に
は、蛍光標識を行った抗体や抗原が固定化される。蛍光
標識抗体等を磁性細菌粒子に固定するには、磁性細菌粒
子等の有機薄膜のアミノ基を利用して、ピリジルジチオ
アルキル脂肪酸Ｎ−スクシンイミジルエステルを用いて
行えばよい。ピリジルジチオアルキル脂肪酸Ｎ−スクシ
ンイミジルエステルとしては、下記化１で表される２−
ピリジルジチオ直鎖アルキル脂肪酸のＮ−スクシンイミ
ジルエステル、特にｎ＝２の３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオン酸Ｎ−Ｎ−スクシンイミジルエステル
（ＳＰＤＰ）が好ましい。
は、蛍光標識を行った抗体や抗原が固定化される。蛍光
標識抗体等を磁性細菌粒子に固定するには、磁性細菌粒
子等の有機薄膜のアミノ基を利用して、ピリジルジチオ
アルキル脂肪酸Ｎ−スクシンイミジルエステルを用いて
行えばよい。ピリジルジチオアルキル脂肪酸Ｎ−スクシ
ンイミジルエステルとしては、下記化１で表される２−
ピリジルジチオ直鎖アルキル脂肪酸のＮ−スクシンイミ
ジルエステル、特にｎ＝２の３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオン酸Ｎ−Ｎ−スクシンイミジルエステル
（ＳＰＤＰ）が好ましい。
【００２０】
【化１】
【００２１】そして、図１に示されるように強磁性粒子
表面の有機薄膜のアミノ基と脱スクシンイミド反応を生
じさせ、アミド結合により３−（２−ピリジルチオ）エ
チレン基等の２−ピリジルジチオアルキレン基を結合す
る。
表面の有機薄膜のアミノ基と脱スクシンイミド反応を生
じさせ、アミド結合により３−（２−ピリジルチオ）エ
チレン基等の２−ピリジルジチオアルキレン基を結合す
る。
【００２２】使用可能な抗体、抗原としては、分子内部
にジチオ基−ＳＳ−を有するＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、
ＩｇＡ、ＩｇＤ等の抗体や−ＳＨ基を有する抗原が使用
可能である。そして、一般的なＩｇＧを例にとると、ジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤やペプシン等の
還元酵素を用い、末端に−ＳＨ基を持つ還元体を作成す
る。図１には、ＩｇＧをＤＴＴによりＦａｂフラグメン
トをもつＩｇＧ抗体フラグメント（還元体）とした例が
示される。
にジチオ基−ＳＳ−を有するＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、
ＩｇＡ、ＩｇＤ等の抗体や−ＳＨ基を有する抗原が使用
可能である。そして、一般的なＩｇＧを例にとると、ジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤やペプシン等の
還元酵素を用い、末端に−ＳＨ基を持つ還元体を作成す
る。図１には、ＩｇＧをＤＴＴによりＦａｂフラグメン
トをもつＩｇＧ抗体フラグメント（還元体）とした例が
示される。
【００２３】この後、被検抗原または抗体と相補性をも
つ抗体フラグメントを、図１に示されるように、強磁性
粒子に固定化する。すなわち、抗体フラグメントは、脱
ＨＳ反応により、アルキレンカルボニルアミノ基を介
し、強磁性粒子表面の有機薄膜に固定化される。
つ抗体フラグメントを、図１に示されるように、強磁性
粒子に固定化する。すなわち、抗体フラグメントは、脱
ＨＳ反応により、アルキレンカルボニルアミノ基を介
し、強磁性粒子表面の有機薄膜に固定化される。
【００２４】なお、蛍光物質についても制限はなく、フ
ルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラ
メチルローダミンイソチオシアネート（ＦＲＩＴＣ）等
公知のいずれのものも使用可能である。
ルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラ
メチルローダミンイソチオシアネート（ＦＲＩＴＣ）等
公知のいずれのものも使用可能である。
【００２５】蛍光物質の抗体等に対する固定量は、一般
的に、抗体等１分子あたり、１〜１０分子程度である。
蛍光標識抗体等の磁性細菌粒子等に対する固定量は、一
般に、粒子１個あたり、１〜１０分子程度とする。固定
化と標識とはどちらが先てもよい。
的に、抗体等１分子あたり、１〜１０分子程度である。
蛍光標識抗体等の磁性細菌粒子等に対する固定量は、一
般に、粒子１個あたり、１〜１０分子程度とする。固定
化と標識とはどちらが先てもよい。
【００２６】本発明では、このような蛍光標識抗体ある
いは抗原を固定した磁性細菌粒子等を、緩衝液中に好ま
しくは超音波分散する。そして、例えば蛍光標識抗体固
定磁性細菌微粒子と、アレルゲン等との抗原抗体反応を
行う。ここで用いる抗原、抗体の組み合わせの例として
は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、アルブミン、ＨｃＧ、Ａ
ＦＰ、カルジオライピン抗原、血液型物資、コンカナバ
リン、ＤＮＴ、プロスタグランジン、ＣＲＰ、ＨＢｓ、
ヒト成長ホルモン、ステロイドホルモン、ＣＥＡ、Ｉｇ
Ｄ等の抗原類、抗アルブミン抗体、抗ＨＣＧ抗体、抗Ｉ
ｇＧ抗体、抗ＩｇＡ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＥ抗
体、抗ＩｇＤ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＤＮＴ抗体、抗プ
ロスタグランジン抗体、抗ヒト凝固ファクター抗体、抗
ＣＲＰ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗ヒト成長ホルモン抗体、
抗ステロイドホルモン抗体、およびこれらを含む血清、
ならびにモノクローナル抗体等の抗体類等、公知のいず
れのものも適用可能である。反応時には、外部から磁場
を印加し、磁性細菌粒子等の凝集を促進することが好ま
しい。反応時間は１〜６０分程度とする。
いは抗原を固定した磁性細菌粒子等を、緩衝液中に好ま
しくは超音波分散する。そして、例えば蛍光標識抗体固
定磁性細菌微粒子と、アレルゲン等との抗原抗体反応を
行う。ここで用いる抗原、抗体の組み合わせの例として
は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、アルブミン、ＨｃＧ、Ａ
ＦＰ、カルジオライピン抗原、血液型物資、コンカナバ
リン、ＤＮＴ、プロスタグランジン、ＣＲＰ、ＨＢｓ、
ヒト成長ホルモン、ステロイドホルモン、ＣＥＡ、Ｉｇ
Ｄ等の抗原類、抗アルブミン抗体、抗ＨＣＧ抗体、抗Ｉ
ｇＧ抗体、抗ＩｇＡ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＥ抗
体、抗ＩｇＤ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＤＮＴ抗体、抗プ
ロスタグランジン抗体、抗ヒト凝固ファクター抗体、抗
ＣＲＰ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗ヒト成長ホルモン抗体、
抗ステロイドホルモン抗体、およびこれらを含む血清、
ならびにモノクローナル抗体等の抗体類等、公知のいず
れのものも適用可能である。反応時には、外部から磁場
を印加し、磁性細菌粒子等の凝集を促進することが好ま
しい。反応時間は１〜６０分程度とする。
【００２７】反応終了後、抗原抗体反応に基づき凝集し
た磁性細菌粒子等と、未反応の微粒子とを磁気的に分離
濃縮する。凝集粒子を分離するには、凝集粒子の磁界感
応性の高さを利用して、反応終了後の液中の凝集粒子を
磁石により捕集した状態でデカンテーションしたり、あ
るいは液を流入流出させながら、磁石により凝集粒子の
みを捕捉したりすればよい。なお、一般に、凝集粒子
は、１次ないし２次粒子である磁性細菌粒子等１０個程
度の凝集体である。磁気的な分離濃縮を行うことによ
り、非凝集体と分離され、感度が向上する。
た磁性細菌粒子等と、未反応の微粒子とを磁気的に分離
濃縮する。凝集粒子を分離するには、凝集粒子の磁界感
応性の高さを利用して、反応終了後の液中の凝集粒子を
磁石により捕集した状態でデカンテーションしたり、あ
るいは液を流入流出させながら、磁石により凝集粒子の
みを捕捉したりすればよい。なお、一般に、凝集粒子
は、１次ないし２次粒子である磁性細菌粒子等１０個程
度の凝集体である。磁気的な分離濃縮を行うことによ
り、非凝集体と分離され、感度が向上する。
【００２８】分離された凝集強磁性粒子は、必要に応じ
ゼラチンを含む緩衝液中に分散させ、蛍光強度の測定を
行う。また、上澄み液の蛍光強度を測定してもよい。こ
のとき、１pg/ml 以上、例えば１pg/ml 〜１０００pg/m
l の微量抗原量が定量できる。
ゼラチンを含む緩衝液中に分散させ、蛍光強度の測定を
行う。また、上澄み液の蛍光強度を測定してもよい。こ
のとき、１pg/ml 以上、例えば１pg/ml 〜１０００pg/m
l の微量抗原量が定量できる。
【００２９】
【実施例】以下、本発明を、実施例によってさらに詳細
に説明する。 実施例 前記報文（ANALYTICAL CHEMISTRY）に準じ、下記の操作
を行った。
に説明する。 実施例 前記報文（ANALYTICAL CHEMISTRY）に準じ、下記の操作
を行った。
【００３０】まず、磁性細菌Aquaspirillum magnetotac
ticum Strain AMB−１を定常期初期まで、ＭＳＧＭ培地
で培養した。菌体からの磁性細菌粒子の抽出は、超音波
破砕処理後、フレンチプレス処理した。菌体破砕物中か
らの磁性細菌粒子の抽出は、Ｓｍ−Ｃｏ磁石を用いて行
った。
ticum Strain AMB−１を定常期初期まで、ＭＳＧＭ培地
で培養した。菌体からの磁性細菌粒子の抽出は、超音波
破砕処理後、フレンチプレス処理した。菌体破砕物中か
らの磁性細菌粒子の抽出は、Ｓｍ−Ｃｏ磁石を用いて行
った。
【００３１】蛍光標識抗体としては、フルオロセインイ
ソシアネート（ＦＩＴＣ）を固定化したマウスイムノグ
ロブリンＥ（ＩｇＥ）を用いた。磁性細菌粒子は周囲を
脂質膜で覆われていることから、Ｎ−スクシンイミジル
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤ
Ｐ）で、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元した抗体
フラグメントの固定化を行った。
ソシアネート（ＦＩＴＣ）を固定化したマウスイムノグ
ロブリンＥ（ＩｇＥ）を用いた。磁性細菌粒子は周囲を
脂質膜で覆われていることから、Ｎ−スクシンイミジル
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤ
Ｐ）で、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元した抗体
フラグメントの固定化を行った。
【００３２】より詳細には、ＳＰＤＰを用いて固定化す
るためにはまず抗体のＩｇＧ分画の鎖間ジスルフィド結
合（ジチオ基）を還元する事で切断しなければならな
い。すなわち、抗体１０mgを０．１５Ｍ（Tris-HCl Buf
fer pH8.0)に溶解し、１０mMのジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）を添加し、２時間反応させて抗体の還元を行な
い、図１に示されるように、ＩｇＧ分画からＦａｂフラ
グメントを有する還元体を得た。この反応液をセファデ
ックスＧ−１００カラムを用いてゲル濾過精製して抗体
フラグメントを有する分画を精製した。
るためにはまず抗体のＩｇＧ分画の鎖間ジスルフィド結
合（ジチオ基）を還元する事で切断しなければならな
い。すなわち、抗体１０mgを０．１５Ｍ（Tris-HCl Buf
fer pH8.0)に溶解し、１０mMのジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）を添加し、２時間反応させて抗体の還元を行な
い、図１に示されるように、ＩｇＧ分画からＦａｂフラ
グメントを有する還元体を得た。この反応液をセファデ
ックスＧ−１００カラムを用いてゲル濾過精製して抗体
フラグメントを有する分画を精製した。
【００３３】次に、ＳＰＤＰ６６３μg をエタノール１
００ulに溶解後、蒸留水を４００μl 添加し、磁性細菌
粒子０．５mgをこの溶液に分散し、２時間反応させた。
反応させた磁性細菌粒子をよく洗浄した後、還元した抗
体と４℃、１２時間反応させ抗体の固定化を行った。そ
の後、未反応の抗体を洗浄除去した。
００ulに溶解後、蒸留水を４００μl 添加し、磁性細菌
粒子０．５mgをこの溶液に分散し、２時間反応させた。
反応させた磁性細菌粒子をよく洗浄した後、還元した抗
体と４℃、１２時間反応させ抗体の固定化を行った。そ
の後、未反応の抗体を洗浄除去した。
【００３４】さらに、０．２５M 炭酸ナトリウム緩衝液
（pH９．０）１mlに抗体固定化磁性粉を懸濁し、ＦＩＴ
Ｃ０．１mgを加え４℃１２時間反応させ、未反応のＦＩ
ＴＣを洗浄除去しＰＢＳ中に保存した。
（pH９．０）１mlに抗体固定化磁性粉を懸濁し、ＦＩＴ
Ｃ０．１mgを加え４℃１２時間反応させ、未反応のＦＩ
ＴＣを洗浄除去しＰＢＳ中に保存した。
【００３５】これとは別に、モデルアレルゲンであるジ
ニトロフェニル化した牛血清アルブミン（ＤＮＰ−ＢＳ
Ａ）を、ゼラチン−ベロナール緩衝液（ＧＶＢpH８．３
ゼラチン０．１％）で０〜１０ng/ml の濃度になるよう
に希釈した。この希釈標準試料は測定毎に調製した。
ニトロフェニル化した牛血清アルブミン（ＤＮＰ−ＢＳ
Ａ）を、ゼラチン−ベロナール緩衝液（ＧＶＢpH８．３
ゼラチン０．１％）で０〜１０ng/ml の濃度になるよう
に希釈した。この希釈標準試料は測定毎に調製した。
【００３６】２０μｇの抗体固定化磁性細菌粒子と、１
mlの試料を混合し、３７℃、１５分間インキュベートし
た。抗原抗体反応に基づく凝集反応では、Ｓｍ−Ｃｏ磁
石で磁場を与え、反応時間の短縮を行った。
mlの試料を混合し、３７℃、１５分間インキュベートし
た。抗原抗体反応に基づく凝集反応では、Ｓｍ−Ｃｏ磁
石で磁場を与え、反応時間の短縮を行った。
【００３７】抗原抗体反応をさせた後に、凝集反応を起
こした磁性細菌粒子と未反応の粒子を磁気的に分離し、
凝集反応を起こした粒子を取り除いた残りの上澄み液の
蛍光強度を指標に測定した。すなわち、磁石により凝集
粒子を捕捉した状態で、デカンテーションを行い、その
上澄み液をフロー型マイクロセル（１２μｌ）を改良し
たものを用いて、粒子の沈降を抑えるためにセル外部に
磁場を与え、蛍光強度を測定した。また、凝集粒子は、
ゼラチン１％を含むＧＶＢにThermomixer （サーモニク
ス社Model ＴＭ−１０５）を用いて分散させ、蛍光分光
光度計（日立Ｆ−１２００）で蛍光強度を測定した。励
起光は４９０nm、蛍光は５１６nmの最適波長で検出し、
１０×１０mmの石英セルを用いて測定を行った。蛍光強
度は値の安定する１５分後の値で評価した。
こした磁性細菌粒子と未反応の粒子を磁気的に分離し、
凝集反応を起こした粒子を取り除いた残りの上澄み液の
蛍光強度を指標に測定した。すなわち、磁石により凝集
粒子を捕捉した状態で、デカンテーションを行い、その
上澄み液をフロー型マイクロセル（１２μｌ）を改良し
たものを用いて、粒子の沈降を抑えるためにセル外部に
磁場を与え、蛍光強度を測定した。また、凝集粒子は、
ゼラチン１％を含むＧＶＢにThermomixer （サーモニク
ス社Model ＴＭ−１０５）を用いて分散させ、蛍光分光
光度計（日立Ｆ−１２００）で蛍光強度を測定した。励
起光は４９０nm、蛍光は５１６nmの最適波長で検出し、
１０×１０mmの石英セルを用いて測定を行った。蛍光強
度は値の安定する１５分後の値で評価した。
【００３８】ＤＮＰ−ＢＳＡ濃度０〜５００pg/ml にお
ける蛍光強度を図２に示す。この場合、抗原を加えずイ
ンキュベートし、測定した時のバックグラウンドの値を
１００として相対強度計算した。ＤＮＰ−ＢＳＡ濃度
０．１pg/ml から相対蛍光強度の低下がみられ、より高
感度での検出が可能であった。
ける蛍光強度を図２に示す。この場合、抗原を加えずイ
ンキュベートし、測定した時のバックグラウンドの値を
１００として相対強度計算した。ＤＮＰ−ＢＳＡ濃度
０．１pg/ml から相対蛍光強度の低下がみられ、より高
感度での検出が可能であった。
【００３９】また、ＦＩＴＣ標識マウスＩｇＥ抗体固定
化磁性細菌粒子２０μｇと、マウスＩｇＧ、牛血清アル
ブミン（ＢＳＡ）をそれぞれ混合し（抗原濃度０．０１
mg/ml ）、３７℃、１５分間反応後、蛍光強度を測定し
た。相対蛍光強度を図３に示す。図示のようにＤＮＰ−
ＢＳＡの場合のみ蛍光強度の低下がみられ、他のタンパ
ク質の場合には減少はみられなかった。このことから、
抗原抗体反応に基づく選択的な抗原の測定が可能であっ
た。
化磁性細菌粒子２０μｇと、マウスＩｇＧ、牛血清アル
ブミン（ＢＳＡ）をそれぞれ混合し（抗原濃度０．０１
mg/ml ）、３７℃、１５分間反応後、蛍光強度を測定し
た。相対蛍光強度を図３に示す。図示のようにＤＮＰ−
ＢＳＡの場合のみ蛍光強度の低下がみられ、他のタンパ
ク質の場合には減少はみられなかった。このことから、
抗原抗体反応に基づく選択的な抗原の測定が可能であっ
た。
【００４０】比較例 実施例１で抽出した磁性細菌粒子を超音波洗浄機（Toch
o UC 0310100W ）で分散させ、２．５％グルタルアルデ
ヒド溶液と１時間、室温でインキュベートした。リン酸
緩衝生理食塩水（ＰＢＳpH７．４）で洗浄後、ＦＩＴＣ
標識マウスＩｇＥ抗体と１２時間、４℃でインキュベー
トし固定化を行った。未反応の抗体を洗浄除去後、ＰＢ
Ｓ中に分散させ４℃で保存した。
o UC 0310100W ）で分散させ、２．５％グルタルアルデ
ヒド溶液と１時間、室温でインキュベートした。リン酸
緩衝生理食塩水（ＰＢＳpH７．４）で洗浄後、ＦＩＴＣ
標識マウスＩｇＥ抗体と１２時間、４℃でインキュベー
トし固定化を行った。未反応の抗体を洗浄除去後、ＰＢ
Ｓ中に分散させ４℃で保存した。
【００４１】実施例１と同様に、ＤＮＰ−ＢＳＡを用い
て抗原抗体反応をさせ、磁気的に分離濃縮し、凝集反応
を起こした粒子量をその蛍光強度を指標に測定した。励
起光は４８３nm、蛍光は５２０nmの最適波長で検出し
た。結果を図４に示す。図４に示される結果から、本発
明に従い、より高感度での検出が可能であることがわか
る。
て抗原抗体反応をさせ、磁気的に分離濃縮し、凝集反応
を起こした粒子量をその蛍光強度を指標に測定した。励
起光は４８３nm、蛍光は５２０nmの最適波長で検出し
た。結果を図４に示す。図４に示される結果から、本発
明に従い、より高感度での検出が可能であることがわか
る。
【００４２】
【発明の効果】本発明によれば、抗原または抗体を、き
わめて微量まで高感度に精度よく定量することができ
る。
わめて微量まで高感度に精度よく定量することができ
る。
【図１】本発明における固定化方法を説明するための図
である。
である。
【図２】本発明の検査方法によるＤＮＰ−ＢＳＡ濃度と
相対蛍光強度との関係を示すグラフである。
相対蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図３】本発明の検出方法による抗原の種類と相対蛍光
強度との関係を示すグラフである。
強度との関係を示すグラフである。
【図４】比較検出方法によるＤＮＰ−ＢＳＡ濃度と相対
蛍光強度との関係を示すグラフである。
蛍光強度との関係を示すグラフである。
Claims (4)
- 【請求項１】 ピリジルジチオアルキル脂肪酸Ｎ−スク
シンイミジルエステルを用い、強磁性粒子に、抗体また
は抗原を固定化し、蛍光標識を行い、 これと抗原または抗体とを液中で反応させ、抗原抗体反
応に基づく凝集を生じさせたのち、 これを磁気的に分離濃縮し、蛍光濃度を測定することを
特徴とする抗原、抗体検出方法。 - 【請求項２】 前記強磁性粒子は、表面にアミノ基を有
する有機薄膜を有する請求項１に記載の抗原、抗体検出
方法。 - 【請求項３】 前記強磁性粒子は、磁性細菌粒子である
請求項１または２に記載の抗原、抗体検出方法。 - 【請求項４】 前記固定化する抗体または抗原はジチオ
基を有し、その還元体を固定化する請求項１ないし３の
いずれかに記載の抗原、抗体検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29254591A JPH05209884A (ja) | 1991-10-11 | 1991-10-11 | 抗原、抗体検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29254591A JPH05209884A (ja) | 1991-10-11 | 1991-10-11 | 抗原、抗体検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05209884A true JPH05209884A (ja) | 1993-08-20 |
Family
ID=17783164
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29254591A Withdrawn JPH05209884A (ja) | 1991-10-11 | 1991-10-11 | 抗原、抗体検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05209884A (ja) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0834560A1 (en) * | 1996-03-27 | 1998-04-08 | TDK Corporation | Fine magnetic particles containing useful proteins bound thereto, process for producing the same, and use thereof |
| JP2006515677A (ja) * | 2003-01-22 | 2006-06-01 | バイオナノフォトニクス・アクティーゼルスカブ | 光誘起による固定化 |
| US7354995B2 (en) | 2003-05-02 | 2008-04-08 | Canon Kabushiki Kaisha | Magnetic substance-biosubstance complex structure, peptide fragment capable of linking to magnetic substance and gene therefor, and process for producing the complex structure |
| JP2010508530A (ja) * | 2006-11-02 | 2010-03-18 | アイティーアイ・スコットランド・リミテッド | 磁気認識システム |
| JP2010151528A (ja) * | 2008-12-24 | 2010-07-08 | Chisso Corp | チオール基を有する刺激応答性磁性微粒子及びその利用 |
| JP2010175327A (ja) * | 2009-01-28 | 2010-08-12 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | 金属ナノ粒子複合体およびその製造方法、バイオチップおよびその製造方法 |
| WO2010110435A1 (ja) * | 2009-03-27 | 2010-09-30 | 国立大学法人岡山大学 | 有機・無機複合材料及びその製造方法 |
| CN114018892A (zh) * | 2021-11-19 | 2022-02-08 | 江苏科技大学 | 磁性单滴微萃取荧光开关结合pda涂层囊泡检测gst的方法 |
| CN115541891A (zh) * | 2022-11-25 | 2022-12-30 | 济南德亨医学科技有限公司 | 一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒及其制备方法 |
-
1991
- 1991-10-11 JP JP29254591A patent/JPH05209884A/ja not_active Withdrawn
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0834560A1 (en) * | 1996-03-27 | 1998-04-08 | TDK Corporation | Fine magnetic particles containing useful proteins bound thereto, process for producing the same, and use thereof |
| EP0834560A4 (en) * | 1996-03-27 | 2000-09-06 | Tdk Corp | FINE MAGNETIC PARTICLES FOR BINDING USEFUL PROTEINS METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF |
| JP2006515677A (ja) * | 2003-01-22 | 2006-06-01 | バイオナノフォトニクス・アクティーゼルスカブ | 光誘起による固定化 |
| US7354995B2 (en) | 2003-05-02 | 2008-04-08 | Canon Kabushiki Kaisha | Magnetic substance-biosubstance complex structure, peptide fragment capable of linking to magnetic substance and gene therefor, and process for producing the complex structure |
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| JP2010151528A (ja) * | 2008-12-24 | 2010-07-08 | Chisso Corp | チオール基を有する刺激応答性磁性微粒子及びその利用 |
| JP2010175327A (ja) * | 2009-01-28 | 2010-08-12 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | 金属ナノ粒子複合体およびその製造方法、バイオチップおよびその製造方法 |
| WO2010110435A1 (ja) * | 2009-03-27 | 2010-09-30 | 国立大学法人岡山大学 | 有機・無機複合材料及びその製造方法 |
| US20120034670A1 (en) * | 2009-03-27 | 2012-02-09 | Takashi Sakai | Organic-inorganic composite material and process for producing same |
| US8841105B2 (en) * | 2009-03-27 | 2014-09-23 | National University Corporation Okayama University | Organic-inorganic composite material and process for producing same |
| JP5622718B2 (ja) * | 2009-03-27 | 2014-11-12 | 国立大学法人岡山大学 | 有機・無機複合材料及びその製造方法 |
| CN114018892A (zh) * | 2021-11-19 | 2022-02-08 | 江苏科技大学 | 磁性单滴微萃取荧光开关结合pda涂层囊泡检测gst的方法 |
| CN114018892B (zh) * | 2021-11-19 | 2024-01-30 | 江苏科技大学 | 磁性单滴微萃取荧光开关结合pda涂层囊泡检测gst的方法 |
| CN115541891A (zh) * | 2022-11-25 | 2022-12-30 | 济南德亨医学科技有限公司 | 一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒及其制备方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19990107 |