JP4246009B2 - リガンドを担持した担体の製造方法 - Google Patents
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Description
担体に抗原や抗体を固定するには、数多くの方法が行われている。例えば、物理吸着によるものや、共有結合による結合方法が挙げられる(非特許文献1(石川榮治ら 酵素免疫測定法 1978年 医学書院 東京))。一般に共有結合法は結合が強固で、担体に多くの抗原、抗体を結合させることができる優れた方法である。この方法の中でも、カルボキシル基とアミノ基の間の結合を利用した方法として、主に混合酸無水物法とカルボジイミド法が用いられている。しかしながら、これらは操作上、再現性に難点があるという問題点がある。そこで、N−ヒドロキシスクシンイミド(N-Hydroxysuccinimide)法が考案された(非特許文献2(H Hosoda et al. Synthesis of corticosteroid haptens possessing the bridge at the C-4 position. Chem Pharm. Bull. 1980, 28: 1294) および非特許文献3(H Hosoda et al. The preparation of steroid N-hydrosuccinimide esters and their reactivities with bovine serum albumin. Chem Pharm. Bull. 1979, 27: 742))。この方法は、EDAC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)などの水溶性カルボジイミドで担体のカルボキシル基を活性化し、これにリガンドのアミノ基をN−ヒドロキシスクシンイミドで結合させるものである。この反応に用いる試薬は、幾つかのメーカーから市販されており入手可能である(非特許文献4(PIERCE Chemical Company, instruction sheet EDC No.22980))。
なお、免疫学的検査に用いられる担体がリガンドを効率よく結合していることは、当該検査の感度を高める上で重要であるため、効率よくリガンドを結合した担体の製造には強い要望があるものと考える。
すなわち本発明は、以下の手段を提供する。
(1)ゼラチンおよびアラビアゴムを含み、かつリガンドを担持した担体の製造方法であって、
ゼラチンおよびアラビアゴムを含む担体のカルボキシル基を活性化させる第一反応および活性化されたカルボキシル基にリガンドのアミノ基を結合させる第二反応を含むN−ヒドロキシスクシンイミド法に従って担体にリガンドを担持させる工程を含み、
ここで第二反応が、以下からなる群より選択される反応液中で行われることを特徴とする方法:
(a)0より高く0.01 M以下の濃度の緩衝液、
(b)0より高く0.2重量%以下の濃度の塩の水溶液、
(c)0より高く10重量%以下の濃度の糖類の水溶液、および
(d)純水。
(2)前記(a)0より高く0.01 M以下の濃度の緩衝液が、0より高く0.01 M以下の濃度でpH 4〜5の緩衝液である、(1)に記載の方法。
本発明の担体は、ゼラチンおよびアラビアゴムを含み、かつリガンドを効率よく担持したものである。本発明の担体は、担持しているリガンドの種類に応じて、免疫学的な分析、生化学的な分析、遺伝学的な分析等、種々の分析反応に利用することができる。
担体がコアセルベートの形態を有する場合、コアセルベート径(直径)は、コアセルベート形成終了時のpHおよびゼラチン/アラビアゴム重量比(G/A)により適宜調節することができるが(図1参照)、一般に免疫学的分析に使用する担体を作製する場合には、コアセルベート径(直径)を例えば1〜10μmとすることができる。
なお、本発明において、リガンドの担体への結合は、N−ヒドロキシスクシンイミド法によるもの、すなわち、担体のカルボキシル基とリガンドのアミノ基との共有結合によるものであるため、リガンド自身が本来アミノ基を有しているものであることが望ましい。担体にリガンドを担持させる手法については、後で説明する。
まず、ゼラチンのゲル化温度以上(好ましくは35℃以上、例えば約40℃)において、0.01〜2重量%のゼラチン(G)と0.01〜2重量%のアラビアゴム(A)を、その重量比(G/A)を一般的には0.5〜1.5、好ましくは0.5〜1.2、より好ましくは0.5〜1.0になるように、29〜65重量%の水溶性有機溶媒中で混合する。ここで水溶性有機溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン等が使用可能であるが、毒性等を考慮すればエタノールが望ましい。また、G/Aが上記範囲を超えるとコアセルベート径の調製が困難になる傾向があり、上記範囲を下回るとリガンドの結合量が減少する傾向がある。コアセルベートの調製液中には、当該分野で公知のとおり、コアセルベート粒子の凝集を防止するために、界面活性剤を添加しておくことが好ましい。界面活性剤の種類および添加量については、その効果を奏する範囲内において当業者であれば適宜設定することができる。
上述のとおり調製された、アルデヒドで架橋済みコアセルベートに対して、これを純水で洗浄後、必要に応じて染色を行い、公知のN−ヒドロキシスクシンイミド法を適用する。N−ヒドロキシスクシンイミド法は、担体のカルボキシル基を活性化させる「第一反応」と、活性化されたカルボキシル基とリガンドのアミノ基とを結合させる「第二反応」を含む。まず、「第一反応」として、N−ヒドロキシスクシンイミドとカルボジイミドをそれぞれ適切な濃度(例えばそれぞれ最終濃度0.0075〜0.03g/mL)で含む反応液に、先の架橋済みコアセルベートを懸濁し、室温で2時間から一晩(例えば6〜12時間)反応させる。第一反応の後、コアセルベートを遠心洗浄し、次いで「第二反応」として、目的とする抗体を適切な濃度(例えば最終濃度1〜50μg/mL)で含む反応液を加え、室温あるいは冷蔵(2〜8℃)で2時間から一晩(例えば6〜15時間)反応させる。なお、本明細書において、第一および第二の各反応において基質が反応する場となる液体を「反応液」と称する。
後述の実施例では、第二反応で用いられる「低濃度の緩衝液」は、好ましくは上記濃度範囲のpH5以下の緩衝液、より好ましくは上記濃度範囲のpH4〜5の緩衝液、具体的には、上記濃度範囲のリン酸クエン酸バッファー、酢酸−酢酸ナトリウムバッファー、グリシン−塩酸バッファーが挙げられる。後述の実施例ではpHが上記範囲より高いと、リガンドの担体への結合効率が低下するため好ましくない。また、リガンドがタンパク質である場合には、pHが4より低いと、その高次構造が破壊され得るため好ましくない。
なお、第二反応で使用される反応液は、当該反応液中にアミノ基を含有すると(例えば、グリシンHClバッファー等の場合)リガンドの結合効率の低下が懸念されるが、後述の実施例(図3)に示されるとおりグリシンのアミノ基の影響は少ないと考えられる。
<実施例1>
本実施例では、N−ヒドロキシスクシンイミド法の第二反応で使用する反応液が、リガンドの担体への結合量に及ぼす影響を調べた。
[方法]
(1)ゼラチンアラビアゴムコアセルベートの形成
0.6gのアラビアゴム(仙波糖化工業)をEtOH:H2O(2:1)に溶かし、更にTween20、フェリコロイドW10(タイホー工業)を添加し、1N NaOHでpHを調整したのち、40℃に加温した4%ゼラチン水溶液(S1757、ニッピ工業)を13mL混合する。攪拌しながら、0.2N酢酸をゆっくり添加し、コアセルベートを作製する。予め求めたpH 5〜5.6において酢酸添加を中止して、目的径約8〜10μmのコアセルベートを作製した。コアセルベートが形成されたら、氷水の入ったバットにてそのまま攪拌して10℃以下に冷却し、ゲル化した。後、グルタルアルデヒド(和光純薬製)を2mL加え、そのまま30分間攪拌し、室温で一晩静置してコアセルベートを架橋した。
得られたコアセルベートは、粒度分布測定器(HORIBA製作所 CAPA700)を用いてコアセルベート径を確認した。
架橋したコアセルベートは、純水で洗浄後、20%(V/V)に調整した。その10mLを分取して、精製水にN−ヒドロキシスクシンイミド(ナカライテスク(株))とEDAC(Sigma Chemical)をそれぞれ0.01g/mLになるように溶かしたもの10mLを加え、攪拌しながら室温で2時間反応させた(第一反応)。反応後、コアセルベートを遠心洗浄し、ウサギ抗ヒトIgG(Jackson)を0.01M PBS(pH7.2)をはじめとする各種水溶液に5μg/mLになるように溶解したものを加えて、室温で一晩反応させた(第二反応)。第二反応後はBSA/PBS(0.1%BSA含PBS pH7.2)で3回洗浄して、ウサギ抗ヒトIgG感作粒子とした。また、同様に抗体を加えない未感作粒子も作製した。
ウサギ抗ヒトIgG感作粒子と未感作粒子をBSA/PBS pH7.2で0.5(V/V)に希釈し、その200μLを分取して遠心し、沈さに、BSA/PBS pH7.2で予め求めた最適濃度に希釈した抗ウサギIgG抗体POD標識(フナコシ)を1mL加えて攪拌しながら室温で1時間反応させた。後、BSA/PBS pH7.2で6回洗浄して、沈さに1mLの基質溶液(OPD含、H2O2添加クエン酸バッファー pH5)を加えて室温で15分間発色の後、3N硫酸0.5mLを加えて遠心し、上清のOD492nmを測定した(図2)。あるいは、抗ウサギIgG抗体POD標識の代わりにアルカリフォスファターゼ標識の同抗体を用いて、OD405nmを測定した(図3)。
図2および図3に、第二反応で用いる反応液を各種変えた場合の抗体結合量の違いを示す。用いた反応液を以下に記す。
CP4: 0.01M リン酸クエン酸バッファー(pH4)
CP5: 0.01M リン酸クエン酸バッファー(pH5)
CP6: 0.01M リン酸クエン酸バッファー(pH6)
CP7: 0.01M リン酸クエン酸バッファー(pH7)
CP8: 0.01M リン酸クエン酸バッファー(pH8)
0.2〜0.8% NaCl: 0.2〜0.8重量% NaCl水溶液
純水: ミリポワ(MILLIPORE)社純水製造システムにより調製
HEPES: 0.01M HEPES(pH8.5)
MES: 0.1M MES(2-(N-morpholino)ethane sulfonic acid)(pH4.5)
AcOH−Na: 0.01M 酢酸−酢酸ナトリウムバッファー(pH5)
0.01M PBS: 0.01M Phosphate buffered saline(pH7)
0.01M PB: 0.005Mもしくは0.01M Phosphate buffer(pH7)
0.01M CB: 0.01M 炭酸バッファー(pH9.2)
Gly−NaOH: 0.15M グリシン−NaOHバッファー(pH8.2)
Gly−HCl: 0.015Mもしくは0.15M グリシン−HClバッファー(pH4.6)
1.25〜10% Suc: 1.25〜10重量% スクロース水溶液
本実施例では、N−ヒドロキシスクシンイミド法の第一反応で使用する反応液および第二反応で使用する反応液をそれぞれ変化させて、リガンドの担体への結合量に及ぼす影響を調べた。
[方法]
第一反応で使用する反応液を変化させた以外は、実施例1に記載の手法に従った。
図4に、第一反応および第二反応で用いる反応液をそれぞれ変えた場合の抗体結合量の違いを示す。図4によると、第一反応に0.01M PBS(phosphate buffered saline)pH7を使用すると、第二反応に純水を使用しても抗体結合量は低かった。一方、第一反応にCP5、純水、生理食塩水(0.9% NaCl)、MES(pH4.5)を使用し、第二反応に純水を使用した場合には、抗体結合量が高かった。また、0.1M MES(pH4.5)を使用した第一反応とCP5、純水を使用した第二反応の組み合わせでは、抗体結合量は高かったが、HEPES(pH8.5)を第二反応で使用すると抗体結合量は低くなった。
図4の結果は、第一反応が、文献等に示されるように酸性条件でなければ、活性基が分解されることを示していると考えられる。しかしながら、担体のカルボキシル基を活性化する第一反応において酸性緩衝液(CP5)を使用すると多くの抗体が結合する理由は不明である。
Claims (2)
- ゼラチンおよびアラビアゴムを含み、かつリガンドを担持した担体の製造方法であって、
ゼラチンおよびアラビアゴムを含む担体のカルボキシル基を活性化させる第一反応および活性化されたカルボキシル基にリガンドのアミノ基を結合させる第二反応を含むN−ヒドロキシスクシンイミド法に従って担体にリガンドを担持させる工程を含み、
ここで第二反応が、以下からなる群より選択される反応液中で行われることを特徴とする方法:
(a)0より高く0.01 M以下の濃度の緩衝液、
(b)0より高く0.2重量%以下の濃度の塩の水溶液、
(c)0より高く10重量%以下の濃度の糖類の水溶液、および
(d)純水。 - 前記(a)0より高く0.01 M以下の濃度の緩衝液が、0より高く0.01 M以下の濃度でpH 4〜5の緩衝液である、請求項1に記載の方法。
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