JP4246012B2 - リガンドを担持した担体の製造方法および前記担体を用いて免疫学的測定を行う方法 - Google Patents
リガンドを担持した担体の製造方法および前記担体を用いて免疫学的測定を行う方法 Download PDFInfo
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Description
HG Bundenberg de Jong. In Colloid Science 1949 Vol 2, Amsterdam
水溶性有機溶媒を20〜40(v/v)%の濃度で含む水溶液中でゼラチンおよびアラビアゴムを混合し、リガンド結合用担体を調製する工程と、
調製されたリガンド結合用担体に、N−ヒドロキシスクシンイミド法を用いてリガンドを担持させる工程と
を含むことを特徴とする方法。
水溶性有機溶媒を20〜40(v/v)%の濃度で含む水溶液中でゼラチンおよびアラビアゴムを混合し、リガンド結合用担体を調製する工程と、
調製されたリガンド結合用担体に、N−ヒドロキシスクシンイミド法を用いてリガンドを担持させる工程と、
リガンドを担持した担体を用いて、混合受身凝集アッセイ(Mix passive hemagglutination assay)もしくは酵素免疫測定法(enzyme linked immunosorbent assay)を行う工程と
を含むことを特徴とする方法。
(3) 前記水溶性有機溶媒がメタノールであり、前記濃度が25〜35(v/v)%であることを特徴とする(1)または(2)に記載の方法。
まず、本発明のリガンド結合用担体の調製方法について説明する。
次に、調製されたコアセルベートの形態の担体にリガンドを担持させる方法について説明する。本発明では、担体にリガンドを担持させるための手法として、公知のリガンド結合方法の使用が可能であるが、N−ヒドロキシスクシンイミド法を採用することが好ましい。以下、リガンドとして抗体を用いた場合を例に説明する。
上記記載に従って調製されたリガンドを担持した担体は、担持しているリガンドの種類に応じて種々の分析反応に使用することができる。例えば、抗体を担持したコアセルベートは、免疫学的測定への利用が可能であり、具体的には、混合受身凝集アッセイ(Mix passive hemagglutination assay)、酵素免疫測定法(enzyme linked immunosorbent assay)、化学発光免疫測定法(Luminescence immunoassay)、凝集法(agglutination assay)に使用可能である。混合受身凝集アッセイへの利用に関しては、測定対象となる抗体に対する抗原をプレート等の基板上に固相し、ここに抗体を担持したコアセルベートを加え反応させ、凝集反応の有無を観察することにより行うことができる。また、酵素免疫測定法への利用に関しては、測定対象となる抗体に対する抗原をプレート等の基板上に固相し、ここに抗体を担持したコアセルベートを加え反応させ、次いで前記抗体に対する標識二次抗体を反応させ、当該標識の有無を観察することにより行うことができる。
a)コアセルベート調製
コアセルベートの主要構成材料のゼラチンS1757はニッピ工業、アラビアゴムは仙波糖化工業より入手した。磁性体溶液はフェリコロイドW10(タイホー工業)を使用した。エタノール、1N NaOH、1N 酢酸、グルタルアルデヒド、Tween20は和光純薬製を使用した。コアセルベートは攪拌機で600 rpmにて攪拌を行い合成した。
コアセルベートには、N−ヒドロキシスクシンイミド法(NHS法)でウサギ抗ヒトIgG抗体(Jackson)の感作を行った。N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)はナカライテスク、Kyoto、Japan製を、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC)はSigma Chemical製を使用した。抗体結合は、ヤギ抗ウサギIgG POD標識抗体(フナコシ)を用いて測定した。
本実施例では、担体調製液中の水溶性有機溶媒濃度が抗体感作に及ぼす影響を調べた。
(1)磁性体含有ゼラチン/アラビアゴムコアセルベート(磁性体粒子)の合成
4.2gのアラビアゴムをEtOH:H2O(体積比1:2)溶液480mLに溶かし、更に10% Tween20、1.4mL、フェリコロイドW10(タイホー工業)0.7mLを添加し、1N NaOHでpHを10以上にしたのち、40℃に加温した4%ゼラチン水溶液(ニッピ工業)70mLを混合する(担体調製液中のEtOH最終濃度 28(v/v)%)。攪拌しながら、0.2N酢酸をゆっくり添加し、磁性体粒子を作製する。予め求めたpHおおよそ5.2〜5.6において酢酸添加を中止して、7μm径の磁性体粒子を作製した。コアセルベートが形成されたら、氷水の入ったバットにて攪拌して10℃以下に冷却し、ゲル化した。後、グルタルアルデヒド 14mLを加え、そのまま30分間攪拌した後、室温で一晩静置して磁性体粒子を架橋した。
NHS法によって磁性体粒子を前処理し、抗体感作を試みた。
感作磁性体粒子をBSA/PBS pH7.2で0.5(V/V)に希釈し、その0.2mLをエッペンチューブに移した。10000 rpm、2分間遠心して上清をアスピレートして除き、沈さ磁性体粒子に、0.05% Tween20−0.1% BSA−PBS pH7.2(以下、Tween-BSA-PBS)で8000倍希釈した抗ウサギIgG POD標識抗体を1mL加えて、室温で1時間インキュベートした。後、Tween-BSA-PBSで5回洗浄し、沈さ磁性体粒子に発色液(0.03% H2O2、10mg OPD/25mL、0.01Mクエン酸0.02Mリン酸バッファー pH5.0)1mLを加えて攪拌し、15分間発色の後、停止液(2N硫酸)0.5mLを加えて遠心し、上清のOD値を492nmで測定した。
図2に、担体調製液中のメタノール(MeOH)もしくはエタノール(EtOH)濃度が、コアセルベートへのウサギ抗ヒトIgG抗体の結合量に及ぼす影響を示す。図2において横軸のアルコール濃度は、担体調製液中の最終濃度((v/v)%)を示す。
本実施例では、担体調製液中の水溶性有機溶媒濃度が、反応像の形成に及ぼす影響を調べた。
(1)未感作粒子の合成
実施例1に従って担体調製液中の水溶性有機溶媒濃度を変化させて作製した未感作粒子(磁性体含有)を使用した。
血小板抽出抗原がU字型ウェル底部に固相されたマイクロプレート(Anti-PLTオリビオMPHAII(オリンパス光学工業株式会社製))を使用して、各種未感作粒子の陰性像を形成した。すなわち、前記マイクロプレートに付属の検体希釈液で4倍に希釈した血小板抗体陰性血清を25μL/well分注し、室温で30分間インキュベート後、生理食塩水を用いて6回洗浄し、次いで「未感作粒子を1.0%RS添加0.01Mリン酸クエン酸バッファーpH6.8で0.3%に希釈懸濁したもの」を25μL/well分注して、磁石プレート上で3分間パターン形成した。
各未感作粒子の陰性像について、ウェルの中心点より周辺まで(ウェル底部を真上からみたときのウェル(正円)の中心点より周辺まで)の領域を格子状の区画に32等分した各領域の透過光量を測定した(社内試作機)。一番透過光量が少ない領域の中心点からの距離を求めた。形成された陰性像がウェル底部の中心にまとまれば数値は小さくなり、陰性像が広がるにつれこの数値は大きくなる。
図3および図4に、担体調製液中のアルコール(MeOH、EtOH)濃度が、血小板抗原上で形成された未感作粒子の陰性像の大きさに及ぼす影響(陰性像の写真)を示す。また、図3および図4に示される陰性像の大きさとアルコール濃度との相関性を図5に示す。
ウェルE1〜H1:7(v/v)%
ウェルA2〜D2:14(v/v)%
ウェルE2〜H2:22(v/v)%
ウェルA3〜D3:29(v/v)%
ウェルE3〜H3:35(v/v)%
ウェルA4〜D4:44(v/v)%
図4において、各ウェルは、コアセルベート調製時のEtOH濃度もしくはMeOH濃度(担体調製液中の最終濃度)が以下のものを示す。
ウェルE1〜H1:EtOH 7(v/v)%
ウェルA2〜D2:EtOH 14(v/v)%
ウェルE2〜H2:EtOH 22(v/v)%
ウェルA3〜D3:EtOH 29(v/v)%
ウェルE3〜H3:EtOH 35(v/v)%
ウェルA4〜D4:MeOH 22(v/v)%
ウェルE4〜H4:MeOH 29(v/v)%
ウェルA5〜D5:MeOH 35(v/v)%
図3および図4に示すように、MeOH、EtOHともに、担体調製液中の最終濃度が15(v/v)%近辺において、コアセルベートの陰性像が一番大きなリング状を呈した。MeOH、EtOHともに、0%においてやや改善されるが、20〜40(v/v)%、好ましくは25〜35(v/v)%において陰性像は小さく締まったものとなった。また、図4からもわかるように、MeOHとEtOHとを比較すると、MeOHの方が陰性像は小さく締まったものとなった。
Claims (3)
- ゼラチンおよびアラビアゴムを含み、かつリガンドを担持した担体の製造方法であって、
水溶性有機溶媒を20〜40(v/v)%の濃度で含む水溶液中でゼラチンおよびアラビアゴムを混合し、リガンド結合用担体を調製する工程と、
調製されたリガンド結合用担体に、N−ヒドロキシスクシンイミド法を用いてリガンドを担持させる工程と
を含むことを特徴とする方法。 - ゼラチンおよびアラビアゴムを含み、かつリガンドを担持した担体を用いて免疫学的測定を行う方法であって、
水溶性有機溶媒を20〜40(v/v)%の濃度で含む水溶液中でゼラチンおよびアラビアゴムを混合し、リガンド結合用担体を調製する工程と、
調製されたリガンド結合用担体に、N−ヒドロキシスクシンイミド法を用いてリガンドを担持させる工程と、
リガンドを担持した担体を用いて、混合受身凝集アッセイ(Mix passive hemagglutination assay)もしくは酵素免疫測定法(enzyme linked immunosorbent assay)を行う工程と
を含むことを特徴とする方法。 - 前記水溶性有機溶媒がメタノールであり、前記濃度が25〜35(v/v)%であることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
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