JP4246012B2

JP4246012B2 - リガンドを担持した担体の製造方法および前記担体を用いて免疫学的測定を行う方法

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Description

本発明は、リガンド結合能が高く、かつ免疫学的測定等に用いた際のバックグラウンドが低い、ゼラチンおよびアラビアゴムを含むリガンド結合用担体の製造方法に関する。また、本発明は、リガンドを効率よく担持し、かつ免疫学的測定等に用いた際のバックグラウンドが低い、ゼラチン/アラビアゴムを含む担体の製造方法、並びに前記方法により製造された担体を用いて免疫学的測定を行う方法に関する。本発明の方法により得られるリガンドを担持した担体は、粒子凝集反応、酵素免疫反応、化学発光法などの担体を用いた免疫学的測定に使用可能である。

抗原や抗体等のリガンドを固定化した担体は、免疫学的な検査に利用されている。なかでも、担体が粒子の形状のものは粒子凝集法などによく用いられている。

抗原や抗体等のリガンドを固定する担体は、生物由来担体と人工担体に大別することができる。前者は、動物赤血球などが代表で、ヒツジ血球などをホルマリンやグルタルアルデヒドで固定化して使用される。しかし、生物由来であるため表面に存在する抗原部位が交差反応を引き起こし、目的とする凝集反応を正確に検出できない場合がある。この欠点を補うために人工担体が開発された。その中でも生体由来のゼラチンと水溶性多糖類を用いる複合コアセルベートは古く、非特許文献１（HG Bundenberg de Jong. In Colloid Science 1949 Vol 2, Amsterdam）によって紹介され、その後、数々の検討がなされている。特許文献１（特開昭59-35143号）では、有機溶媒非存在下においてゼラチン、水溶性多糖及びメタリン酸イオンからコアセルベートを作成する方法を述べている。コアセルベート合成時に有機溶媒を使用する方法については、特許文献２（特開昭57-153658号）および特許文献３（特開昭58-113754号）に記載されている。また、特許文献４（特公平7-86508）で木暮らは、リガンド固定用担体の検討を行い、ゼラチンとアラビアゴムを用いて水溶性有機溶媒の存在条件下でコアセルベートを形成し、その際に水溶性有機溶媒、ゼラチン(Ｇ)、アラビアゴム(Ａ)の濃度と比率が、担体の非特異凝集に大きく影響することを突き止めた。該考案によると、29〜65％のエタノールに代表される水溶性有機溶媒と0.01〜2％のゼラチンと0.01〜2％のアラビアゴムを、アラビアゴムに対するゼラチンの比率（以下、本明細書においてＧ/Ａともいう）を0.4〜2.4で使用することにより、非特異凝集が起こりにくいとした。また該考案によると、Ｇ/Ａが0.4未満ではコアセルベートが形成されず、Ｇ/Ａが2.4以上では不定形粒子となることを報告している。

これらのゼラチン/アラビアゴムコアセルベートに抗原や抗体を固定するには、数多くの方法が行われている。例えば、タンニン酸処理のような物理吸着によるものや、共有結合による結合方法が挙げられる（非特許文献２(石川榮治ら酵素免疫測定法 1978年医学書院東京)）。一般に共有結合法は結合が強固で、担体に多くの抗原、抗体を結合させることができる優れた方法である。この方法の中でも、カルボキシル基とアミノ基の間の結合を利用した方法として、主に混合酸無水物法とカルボジイミド法が用いられている。しかしながら、これらは操作上、再現性に難点があるという問題点がある。そこで、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（N-Hydroxysuccinimide）法が考案された（非特許文献３(H Hosoda et al. Synthesis of corticosteroid haptens possessing the bridge at the C-4 position. Chem Pharm. Bull. 1980, 28: 1294) および非特許文献４(H Hosoda et al. The preparation of steroid N-hydrosuccinimide esters and their reactivities with bovine serum albumin. Chem Pharm. Bull. 1979, 27: 742)）。これは、ＥＤＡＣ（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide）などの水溶性カルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどのＮ−ヒドロキシ化合物を用いて担体のカルボキシル基を活性化し、これにリガンドのアミノ基を結合させる方法である。
HG Bundenberg de Jong. In Colloid Science 1949 Vol 2, Amsterdam 特開昭59-35143号公報特開昭57-153658号公報特開昭58-113754号公報特公平7-86508号公報石川榮治ら酵素免疫測定法 1978年医学書院東京 H Hosoda et al. Synthesis of corticosteroid haptens possessing the bridge at the C-4 position. Chem Pharm. Bull. 1980, 28: 1294 H Hosoda et al. The preparation of steroid N-hydrosuccinimide esters and their reactivities with bovine serum albumin. Chem Pharm. Bull. 1979, 27: 742

このような状況下、本発明者は、上記特許文献４（特公平7-86508号）の方法に従ってゼラチン/アラビアゴムコアセルベートを作製し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法により抗体結合を試みたところ、抗体結合量の高いもの、低いものができることがあること、更に、ＭＰＨＡ（Mix passive hemagglutination assay）法にこれらコアセルベートをインジケーターとして適用した場合に明瞭な陰性像を形成しないものがあることに気づいた。このような問題点を本発明者は新たに見出し、本発明ではこのような問題点を解決することを目的とする。すなわち、本発明は、リガンドを効率よく結合させることが可能なリガンド結合用担体であって、かつ当該担体にリガンドを担持させて免疫学的測定等に用いた際にバックグランドを低減することが可能な担体を再現性よく製造する方法を提供することを目的とする。

なお、上述の特許文献４（特公平7-86508号）で木暮らは、ゼラチン/アラビアゴムコアセルベートにおけるＧ/Ａを、コアセルベートの非特異凝集反応の発生を防ぐことを目的として決定しているが、「リガンドを効率よく結合させる、バックグラウンドを下げる」という観点から、コアセルベート調製液を検討しておらず、またこのような観点から検討を行った他の報告例もない。また、免疫学的測定において、リガンドを効率よく結合していること、明瞭な陰性像を形成することは必須事項であり、このような担体の製造には強い要望があるものと考える。

上記課題を解決するため検討を重ねた結果、本発明者は、リガンドを担持させるための担体を調製する際の調製液中に含まれる水溶性有機溶媒濃度が、その後のリガンド結合効率および免疫学的測定に利用された際のバックグラウンドに多大な影響を与えていることを発見し、本発明を完成させるに至った。

すなわち本発明は、以下の手段を提供する。

（１）ゼラチンおよびアラビアゴムを含み、かつリガンドを担持した担体の製造方法であって、
水溶性有機溶媒を２０〜４０（v/v）％の濃度で含む水溶液中でゼラチンおよびアラビアゴムを混合し、リガンド結合用担体を調製する工程と、
調製されたリガンド結合用担体に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法を用いてリガンドを担持させる工程と
を含むことを特徴とする方法。

（２）ゼラチンおよびアラビアゴムを含み、かつリガンドを担持した担体を用いて免疫学的測定を行う方法であって、
水溶性有機溶媒を２０〜４０（v/v）％の濃度で含む水溶液中でゼラチンおよびアラビアゴムを混合し、リガンド結合用担体を調製する工程と、
調製されたリガンド結合用担体に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法を用いてリガンドを担持させる工程と、
リガンドを担持した担体を用いて、混合受身凝集アッセイ（Mix passive hemagglutination assay）もしくは酵素免疫測定法（enzyme linked immunosorbent assay）を行う工程と
を含むことを特徴とする方法。
（３）前記水溶性有機溶媒がメタノールであり、前記濃度が２５〜３５（v/v）％であることを特徴とする（１）または（２）に記載の方法。

別の側面に従えば、本発明は、担体へのリガンド結合量を増大させる方法であって、水溶性有機溶媒を２０〜４０（v/v）％の濃度で含む水溶液（担体調製液）中でゼラチンおよびアラビアゴムを混合し、リガンド結合用担体を調製する工程と、調製されたリガンド結合用担体に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法を用いてリガンドを担持させる工程とを含む方法を提供する。

更に別の側面に従えば、本発明は、リガンドを担持した担体を用いた免疫学的測定において当該測定時のバックグラウンドを低減する方法であって、水溶性有機溶媒を２０〜４０（v/v）％の濃度で含む水溶液（担体調製液）中でゼラチンおよびアラビアゴムを混合し、リガンド結合用担体を調製する工程と、調製されたリガンド結合用担体に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法を用いてリガンドを担持させる工程と、リガンドを担持した担体を用いて免疫学的測定を行う工程とを含む方法を提供する。

本発明のリガンド結合用担体の製造方法によれば、リガンド結合効率の高い担体であって、かつ免疫学的測定に使用した際のバックグラウンドを低減させることが可能な担体を再現性よく製造することが可能である。本発明の方法により作製されるリガンド結合用担体は、免疫学的反応等の分析反応に関与するリガンドを高効率に結合させることが可能であり、分析反応時のバックグラウンドが低いため、当該担体を用いて高感度な分析反応を行うことが可能となる。

以下、本発明を詳細に説明するが、以下の記載は、本発明を説明するためのものであって本発明を限定するものではない。

１．リガンド結合用担体の調製
まず、本発明のリガンド結合用担体の調製方法について説明する。

本明細書において「ゼラチンおよびアラビアゴムを含むリガンド結合用担体」は、リガンドを担持させるための担体であり、ここで「含む」とは、ゼラチンおよびアラビアゴムを主成分として担体が構成されているが、その他必要に応じて任意成分を含んでいてもよいことを意味する。任意成分としては、例えば、担体に所望の性質を付与するために添加される物質、および担体を形成する際に添加され担体に混入する化学物質等が挙げられる。ここで「担体に所望の性質を付与するために添加される物質」には、担体内に封入される後述の芯物質が含まれる。

担体原料となるゼラチンは、当該技術分野でゼラチン/アラビアゴムコアセルベートを調製する際に使用可能なものであればよく、主として、ウシ、ブタの骨や皮に含まれるコラーゲン質を分解生成したものを使用することができる。ゼラチンおよびアラビアゴムは、それぞれ商業的に入手可能なものを使用することができる。

また本発明において担体は任意の形態であり得、例えば、コアセルベートのような粒子の形態、あるいはマイクロタイタープレートのウェル等の容器底面上に固相させた一層の膜の形態とすることができる。

担体がコアセルベートの形態を有する場合、コアセルベート径（直径）は、コアセルベート形成終了時のｐＨおよびゼラチン/アラビアゴム重量比（Ｇ/Ａ）により適宜調節することができるが（図１参照）、一般に免疫学的分析に使用する担体を作製する場合には、コアセルベート径（直径）を例えば１〜１０μｍとすることができる。

上記担体に担持させる「リガンド」は、該担体を用いて行われる分析反応に関与するものであり、免疫学的な分析、生化学的な分析、遺伝学的な分析等、任意の分析反応に関与するものであり得る。リガンドとして、例えば、抗原、抗体、酵素、ホルモン、細胞、核酸等が挙げられるが、これに限定されない。

なお、担体にリガンドを結合する手法として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法（すなわち、担体のカルボキシル基とリガンドのアミノ基との共有結合による結合法）を採用する場合、リガンド自身が本来アミノ基を有していることが望ましい。担体にリガンドを担持させる手法については、後で説明する。

先に、「ゼラチンおよびアラビアゴムを含むリガンド結合用担体（リガンドを担持していないもの）」の調製の仕方について説明する。ここでは、その形態がコアセルベートである場合を例に説明する。

まず、ゼラチンのゲル化温度以上（好ましくは35℃以上、例えば約40℃）において、0.01〜2重量％のゼラチン(Ｇ)と0.01〜2重量％のアラビアゴム(Ａ)を、その重量比(Ｇ/Ａ)を一般的には0.5〜1.5、好ましくは0.5〜1.2、より好ましくは0.5〜1.0になるように、水溶性有機溶媒を20〜40（v/v）％の濃度で含む水溶液（担体調製液）中で混合する。

ここで水溶性有機溶媒は、水と自由に混和可能な有機溶媒であって、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、エチルエーテル等が使用可能であるが、本発明の効果を奏する限り他の任意の水溶性有機溶媒も使用可能であるが、中でもメタノール、エタノールが望ましい。また、担体調製液中の水溶性有機溶媒の濃度は、20〜40（v/v）％、好ましくは25〜35（v/v）％である。本発明では、担体調製液中の水溶性有機溶媒の濃度をこのような範囲に設定することにより、その後のコアセルベートへのリガンド結合効率を増大させることが可能であるとともに、当該コアセルベートを免疫学的測定に使用した際のバックグラウンドを低減することができる。

また、Ｇ/Ａが上記範囲を超えるとコアセルベート径の調製が困難になる傾向があり、上記範囲を下回るとリガンドの結合量が減少する傾向がある。担体調製液中には、当該分野で公知のとおり、コアセルベート粒子の凝集を防止するために、界面活性剤を添加しておくことが好ましい。界面活性剤の種類および添加量については、その効果を奏する範囲内において当業者であれば適宜設定することができる。

次いで、酸（例えば酢酸、プロピオン酸、希塩酸、希硫酸）の添加により、ゼラチン/アラビアゴムコアセルベートを析出させる。ここで酸の添加量は、作製したいコアセルベート径に応じて適宜設定する（図１参照）。その後ゲル化温度以下（好ましくは35℃以下、例えば約10℃）に冷却し、グルタルアルデヒド、ホルマリン等のアルデヒドで架橋する。

また、コアセルベートの形態を有する担体の作製にあたっては、芯物質を加えて、芯物質をコアセルベートで包んだいわゆるマイクロカプセルとすることもできる。所望の芯物質を用いることにより、コアセルベートの比重調整、コアセルベートの磁性化、着色等を行うことが可能である。その際には適当な界面活性剤（例えばTween20、Tween80、Triton X-100など）を添加して、分散性を上げておくことが望ましい。芯物質としては、SiO₂（ガラス）、TiO₂、CuO、CoO、Fe₂O₃などの金属酸化物の微粉末、カーボン、タルクなど種々のものを利用することができる。磁性体を含有させた担体は、適宜の磁気発生手段（永久磁石、電磁石等）により、液体中での攪拌、洗浄、測定等の各種処理工程を短時間で行うことができる。なお、当業者であれば、担体を所望の性質とするために適切な芯物質の種類および芯物質の使用量について適宜選択することができる。

また、コアセルベート以外の形態を有する担体、例えば容器底面上に固相させた膜状の担体については、以下に記載のとおり調製することができる。すなわち、ゼラチンのゲル化温度以上において、0.01〜2重量％のゼラチン（Ｇ）と0.01〜2重量％のアラビアゴム（Ａ）をＧ/Ａ比0.5〜1.5となるように、水溶性有機溶媒を20〜40（v/v）％の濃度で含む水溶液（上記規定の担体調製液）中で混合し、これをゲル化温度以下に冷却し、アルデヒドで架橋することにより調製することができる。

２．リガンドを担持した担体の調製
次に、調製されたコアセルベートの形態の担体にリガンドを担持させる方法について説明する。本発明では、担体にリガンドを担持させるための手法として、公知のリガンド結合方法の使用が可能であるが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法を採用することが好ましい。以下、リガンドとして抗体を用いた場合を例に説明する。

上述のとおり調製された、アルデヒドで架橋済みコアセルベートに対して、これを純水で洗浄後、必要に応じて染色を行い、公知のＮ−ヒドロキシスクシンイミド法を適用する。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法は、担体のカルボキシル基を活性化させる「第一反応」と、活性化されたカルボキシル基とリガンドのアミノ基とを結合させる「第二反応」を含む。まず、「第一反応」として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとカルボジイミドをそれぞれ適切な濃度（例えばそれぞれ最終濃度0.0075〜0.03ｇ/ｍＬ）で含む反応液に、先の架橋済みコアセルベートを懸濁し、室温で2時間から一晩（例えば6〜12時間）反応させる。第一反応の後、コアセルベートを遠心洗浄し、次いで「第二反応」として、目的とする抗体を適切な濃度（例えば最終濃度１〜50μｇ/ｍＬ）で含む反応液を加え、室温あるいは冷蔵（2〜8℃）で2時間から一晩（例えば６〜15時間）反応させる。なお、本明細書において、第一および第二の各反応において基質が反応する場となる液体を「反応液」と称する。

「第一反応」の反応液として、酸性緩衝液、例えばＭＥＳ(ｐＨ4.5)やリン酸クエン酸バッファー(ｐＨ５)、あるいは純水、生理食塩水（0.9％ＮａＣｌ溶液）を使用することができる。「第二反応」の反応液として、低濃度の緩衝液、塩濃度の低い塩の水溶液、糖類濃度の低い糖類の水溶液および純水の何れかを好ましく使用することができる。「第二反応」の反応液として、例えば、0.01Ｍ以下のリン酸クエン酸バッファー（ｐＨ5.0）、0.01Ｍ以下の酢酸−酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ5.0）、0.01Ｍ以下のＭＥＳ(ｐＨ 4.6)、0.1重量％以下の塩化ナトリウム水溶液、0.1重量％以下のスクロース溶液、純水等が挙げられる。

第二反応の後、BSA（bovine serum albumin）やゼラチン、動物血清などで、未反応の官能基をブロックし（ブロッキング）、所望の免疫学的反応に供される抗体を担持したコアセルベートが作製される。作製されたコアセルベートは、そのまま目的とする免疫学的反応用の溶液に置換して目的の反応に利用してもよいし、バイアル瓶等に分注して凍結乾燥し、長期保存をすることも可能である。

また、本発明で用いるＮ−ヒドロキシスクシンイミド法は、当該方法において公知のとおり、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドに代えて、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジンを含むＮ−ヒドロキシ化合物を使用することができる。また、当該方法において公知のとおり、カルボジイミドとして、ＥＤＡＣ；１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、ＤＩＰＣ；ジイソプロピルカルボジイミド等を使用することができる。なお、後述の実施例では、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとＥＤＡＣを使用した。

３．リガンドを担持した担体を用いた免疫学的測定
上記記載に従って調製されたリガンドを担持した担体は、担持しているリガンドの種類に応じて種々の分析反応に使用することができる。例えば、抗体を担持したコアセルベートは、免疫学的測定への利用が可能であり、具体的には、混合受身凝集アッセイ（Mix passive hemagglutination assay）、酵素免疫測定法（enzyme linked immunosorbent assay）、化学発光免疫測定法（Luminescence immunoassay）、凝集法（agglutination assay）に使用可能である。混合受身凝集アッセイへの利用に関しては、測定対象となる抗体に対する抗原をプレート等の基板上に固相し、ここに抗体を担持したコアセルベートを加え反応させ、凝集反応の有無を観察することにより行うことができる。また、酵素免疫測定法への利用に関しては、測定対象となる抗体に対する抗原をプレート等の基板上に固相し、ここに抗体を担持したコアセルベートを加え反応させ、次いで前記抗体に対する標識二次抗体を反応させ、当該標識の有無を観察することにより行うことができる。

以上説明したとおり、本発明に従って所定の濃度で水溶性有機溶媒を含む担体調製液を使用して担体を調製することにより、担体へのリガンド結合効率を高めることができる。また、本発明の方法により調製されたリガンドを担持した担体は、リガンドの結合量が高い上に、分析反応に用いた際のバックグラウンドが低いという利点を有する。よって、本発明の方法により調製されたリガンドを担持した担体を分析反応に用いることにより、高感度な分析反応を行うことが可能である。

以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

＜材料と機器＞
ａ）コアセルベート調製
コアセルベートの主要構成材料のゼラチンS1757はニッピ工業、アラビアゴムは仙波糖化工業より入手した。磁性体溶液はフェリコロイドW10（タイホー工業）を使用した。エタノール、1Ｎ NaOH、1Ｎ酢酸、グルタルアルデヒド、Tween20は和光純薬製を使用した。コアセルベートは攪拌機で600 rpmにて攪拌を行い合成した。

ｂ）ウサギ抗ヒトIgG抗体感作
コアセルベートには、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法（ＮＨＳ法）でウサギ抗ヒトIgG抗体（Jackson）の感作を行った。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）はナカライテスク、Kyoto、Japan製を、１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＡＣ）はSigma Chemical製を使用した。抗体結合は、ヤギ抗ウサギIgG POD標識抗体（フナコシ）を用いて測定した。

＜実施例１＞
本実施例では、担体調製液中の水溶性有機溶媒濃度が抗体感作に及ぼす影響を調べた。

［方法］
（１）磁性体含有ゼラチン/アラビアゴムコアセルベート（磁性体粒子）の合成
4.2ｇのアラビアゴムをEtOH：H₂O（体積比１：２）溶液480ｍＬに溶かし、更に10％ Tween20、1.4ｍＬ、フェリコロイドW10（タイホー工業）0.7ｍＬを添加し、1Ｎ NaOHでｐＨを10以上にしたのち、40℃に加温した4％ゼラチン水溶液（ニッピ工業）70ｍＬを混合する（担体調製液中のEtOH最終濃度 28(v/v)％）。攪拌しながら、0.2Ｎ酢酸をゆっくり添加し、磁性体粒子を作製する。予め求めたｐＨおおよそ5.2〜5.6において酢酸添加を中止して、7μｍ径の磁性体粒子を作製した。コアセルベートが形成されたら、氷水の入ったバットにて攪拌して10℃以下に冷却し、ゲル化した。後、グルタルアルデヒド 14ｍＬを加え、そのまま30分間攪拌した後、室温で一晩静置して磁性体粒子を架橋した。

更にEtOHの濃度のみを変えて、同様にしてコアセルベートを作製した。すなわち、担体調製液中のEtOH最終濃度を、下記の表のとおり変化させた。また、EtOHの代わりにMeOHを使用し、同様の方法でコアセルベートを作製した。

（２）磁性体粒子へのウサギ抗ヒトIgG抗体の感作
ＮＨＳ法によって磁性体粒子を前処理し、抗体感作を試みた。

架橋したコアセルベートは、20％(V/V)粒子に調整し、純水で遠心洗浄し、ＮＨＳ及びＥＤＡＣをそれぞれ0.01ｇ/ｍＬになるように加えて、室温で２時間攪拌し反応させた。反応後、粒子を純水で３回洗浄して、ＮＨＳ処理磁性体粒子とした。

前処理したＮＨＳ処理磁性体粒子に、ウサギ抗ヒトIgG抗体を0.01Ｍ AcOH-AcONa（酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ 5.0）で５μｇ/ｍＬに希釈したものを、粒子濃度10％になるように添加して、室温で一晩攪拌して感作を行った。感作後、0.2％ BSA/PBS（0.2％ bovine serum albuminを含むphosphate buffered saline ｐＨ 7.2）で１回洗浄して、同バッファーに１時間浮遊させ時々攪拌してブロッキングを行った。ブロッキング後、0.2％ BSA/PBS ｐＨ7.2で２回洗浄して、10％濃度になるように浮遊させて感作磁性体粒子を得た。また、同様に抗体を加えずに処理を行い、未感作粒子を作製した（後述の実施例２で使用）。

（３）ウサギ抗ヒトIgG結合量の測定
感作磁性体粒子をBSA/PBS ｐＨ7.2で0.5(V/V)に希釈し、その0.2ｍＬをエッペンチューブに移した。10000 rpm、２分間遠心して上清をアスピレートして除き、沈さ磁性体粒子に、0.05％ Tween20−0.1％ BSA−PBS ｐＨ7.2（以下、Tween-BSA-PBS）で8000倍希釈した抗ウサギIgG POD標識抗体を１ｍＬ加えて、室温で１時間インキュベートした。後、Tween-BSA-PBSで５回洗浄し、沈さ磁性体粒子に発色液（0.03％ H₂O₂、10mg OPD/25mL、0.01Ｍクエン酸0.02Ｍリン酸バッファーｐＨ5.0）１ｍＬを加えて攪拌し、15分間発色の後、停止液（２Ｎ硫酸）0.5ｍＬを加えて遠心し、上清のＯＤ値を492ｎｍで測定した。

［結果］
図２に、担体調製液中のメタノール（MeOH）もしくはエタノール（EtOH）濃度が、コアセルベートへのウサギ抗ヒトIgG抗体の結合量に及ぼす影響を示す。図２において横軸のアルコール濃度は、担体調製液中の最終濃度（(v/v)％）を示す。

抗体は、担体調製液中のアルコール濃度に依存して結合量が変化した。MeOH、EtOH何れにおいても、20〜40（v/v）％、好ましくは25〜35（v/v）％において抗体結合量が高くなり、それ以上やそれ以下では抗体結合量は低下した。また、MeOH 48％以上、EtOH 38％以上では、良好なコアセルベートが形成されなかった。

＜実施例２＞
本実施例では、担体調製液中の水溶性有機溶媒濃度が、反応像の形成に及ぼす影響を調べた。

［方法］
（１）未感作粒子の合成
実施例１に従って担体調製液中の水溶性有機溶媒濃度を変化させて作製した未感作粒子（磁性体含有）を使用した。

（２）血小板抗原上での未感作粒子の陰性像の形成
血小板抽出抗原がＵ字型ウェル底部に固相されたマイクロプレート（Anti-PLTオリビオMPHAII(オリンパス光学工業株式会社製)）を使用して、各種未感作粒子の陰性像を形成した。すなわち、前記マイクロプレートに付属の検体希釈液で４倍に希釈した血小板抗体陰性血清を25μＬ/well分注し、室温で30分間インキュベート後、生理食塩水を用いて６回洗浄し、次いで「未感作粒子を1.0％ＲＳ添加0.01Ｍリン酸クエン酸バッファーｐＨ6.8で0.3％に希釈懸濁したもの」を25μＬ/well分注して、磁石プレート上で３分間パターン形成した。

（３）血小板抗原上で形成された未感作粒子の陰性像の解析
各未感作粒子の陰性像について、ウェルの中心点より周辺まで（ウェル底部を真上からみたときのウェル（正円）の中心点より周辺まで）の領域を格子状の区画に32等分した各領域の透過光量を測定した（社内試作機）。一番透過光量が少ない領域の中心点からの距離を求めた。形成された陰性像がウェル底部の中心にまとまれば数値は小さくなり、陰性像が広がるにつれこの数値は大きくなる。

［結果］
図３および図４に、担体調製液中のアルコール（MeOH、EtOH）濃度が、血小板抗原上で形成された未感作粒子の陰性像の大きさに及ぼす影響（陰性像の写真）を示す。また、図３および図４に示される陰性像の大きさとアルコール濃度との相関性を図５に示す。

図３において、各ウェルは、コアセルベート調製時のMeOH濃度（担体調製液中の最終濃度）が以下のものを示す。

ウェルＡ１〜Ｄ１：０（v/v）％
ウェルＥ１〜Ｈ１：７（v/v）％
ウェルＡ２〜Ｄ２：１４（v/v）％
ウェルＥ２〜Ｈ２：２２（v/v）％
ウェルＡ３〜Ｄ３：２９（v/v）％
ウェルＥ３〜Ｈ３：３５（v/v）％
ウェルＡ４〜Ｄ４：４４（v/v）％
図４において、各ウェルは、コアセルベート調製時のEtOH濃度もしくはMeOH濃度（担体調製液中の最終濃度）が以下のものを示す。

ウェルＡ１〜Ｄ１：EtOH ０（v/v）％
ウェルＥ１〜Ｈ１：EtOH ７（v/v）％
ウェルＡ２〜Ｄ２：EtOH １４（v/v）％
ウェルＥ２〜Ｈ２：EtOH ２２（v/v）％
ウェルＡ３〜Ｄ３：EtOH ２９（v/v）％
ウェルＥ３〜Ｈ３：EtOH ３５（v/v）％
ウェルＡ４〜Ｄ４：MeOH ２２（v/v）％
ウェルＥ４〜Ｈ４：MeOH ２９（v/v）％
ウェルＡ５〜Ｄ５：MeOH ３５（v/v）％
図３および図４に示すように、MeOH、EtOHともに、担体調製液中の最終濃度が15（v/v）％近辺において、コアセルベートの陰性像が一番大きなリング状を呈した。MeOH、EtOHともに、０％においてやや改善されるが、20〜40（v/v）％、好ましくは25〜35（v/v）％において陰性像は小さく締まったものとなった。また、図４からもわかるように、MeOHとEtOHとを比較すると、MeOHの方が陰性像は小さく締まったものとなった。

以上、実施例１および２の結果に示されるとおり、リガンド結合能の向上、陰性像の明瞭化という観点から、ゼラチン/アラビアゴムコアセルベートを調製する際の調製液中に、水溶性有機溶媒の存在は必要である。また、その濃度は、調製液中20〜40（v/v）％、好ましくは25〜35（v/v）％で使用することで、「リガンド結合能の向上」、「陰性像が明瞭化」という２つの課題を解決することができる。従って、本発明の方法により製造される担体を用いて、高感度な免疫反応を行うことが可能である。

コアセルベート径に及ぼすＧ/Ａ比とｐＨ（コアセルベート形成終了時）の関係を示すグラフ。担体調製液中のアルコール濃度が、コアセルベートへの抗体結合量に及ぼす影響を示すグラフ。担体調製液中のMeOH濃度が、未感作粒子の陰性像の大きさに及ぼす影響を示す写真。担体調製液中のEtOH濃度、MeOH濃度が、未感作粒子の陰性像の大きさに及ぼす影響を示す写真。担体調製液中のアルコール濃度が、未感作粒子の陰性像の大きさに及ぼす影響を示すグラフ。

Claims

ゼラチンおよびアラビアゴムを含み、かつリガンドを担持した担体の製造方法であって、
水溶性有機溶媒を２０〜４０（v/v）％の濃度で含む水溶液中でゼラチンおよびアラビアゴムを混合し、リガンド結合用担体を調製する工程と、
調製されたリガンド結合用担体に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法を用いてリガンドを担持させる工程と
を含むことを特徴とする方法。
ゼラチンおよびアラビアゴムを含み、かつリガンドを担持した担体を用いて免疫学的測定を行う方法であって、
水溶性有機溶媒を２０〜４０（v/v）％の濃度で含む水溶液中でゼラチンおよびアラビアゴムを混合し、リガンド結合用担体を調製する工程と、
調製されたリガンド結合用担体に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド法を用いてリガンドを担持させる工程と、
リガンドを担持した担体を用いて、混合受身凝集アッセイ（Mix passive hemagglutination assay）もしくは酵素免疫測定法（enzyme linked immunosorbent assay）を行う工程と
を含むことを特徴とする方法。
前記水溶性有機溶媒がメタノールであり、前記濃度が２５〜３５（v/v）％であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。