JP5210551B2 - 赤血球標識用磁性粒子 - Google Patents

Description

本発明は、赤血球を磁性標識するための磁性粒子に関する。

免疫検査の分野では、磁性体に抗原や抗体を結合させ、検体中の目的の抗原や抗体を捕捉して測定する方法が広く知られている。また、磁性体に各種の抗体を結合して磁石で分離することによって、細胞の選別やＢ／Ｆ分離を行う方法も知られている（例えば、特許文献１）。

そこで、赤血球を磁性標識化することができれば、赤血球の凝集反応における沈降パターンを磁力によって迅速に形成させたり、２次標識抗体を用いて赤血球に結合した抗体を発色させたりすることが可能になり、免疫検査における操作を簡便・迅速にすることができる。

しかしながら、赤血球を磁性標識化し、免疫学的検査に利用する方法は知られていない。唯一DiaGast社が、ナノ磁性粒子を用いて磁性標識化しているが、使用している粒子について公開されておらず、技術的内容が全く不明である。
特開平２００１−９１５２１号

そこで本発明では、赤血球を磁性標識化するための磁性粒子を提供することを目的とする。

本発明によれば、磁性体を含有する担体と、前記担体に担持された赤血球結合物質とを含み、前記赤血球結合物質は、エニシダレクチン（ＣＳＡ）及びチョウセンアサガオレクチン（ＤＳＡ）からなる群から選択される赤血球標識用磁性粒子が提供される。一つの態様において、前記磁性体を含有する担体は、磁性体が封入されたゼラチンアラビアゴムコアセルベートである。

本発明の磁性粒子を用いることによって、赤血球を磁性標識化することができる。これにより、免疫検査における操作を簡便・迅速にすることができる。

免疫検査等で使用される一般的な磁性粒子の担体には、ポリスチレン粒子などが用いられている。また、医用磁性ナノビーズの新しい作製技術（応用物理７４巻１２；1580-2005を参照）による担体も用いられている。このようなナノサイズの磁性粒子担体は、小さな抗原や抗体と結合するためには好ましい。しかし、赤血球のような大きな粒子（約８μｍ）を磁力で迅速に動かすためには、小さなナノ粒子担体では、赤血球の表面を全て覆うほどに結合させなければならない可能性があり、赤血球の抗原がマスクされてしまう恐れがある。

そこで本発明では、ゼラチンアラビアゴムコアセルベートを担体として用い、これに磁性体を封入して磁性粒子として用いた。ゼラチンアラビアゴムコアセルベートは、ゼラチンと水溶性多糖類であるアラビアゴムを主成分として形成された複合コアセルベートである。これは例えば、「HG Bundenberg de Jong. In Colloid Science 1949 Vol.2, Amsterdam」によって紹介されている。ゼラチンアラビアゴムコアセルベートは天然成分に由来するため容易に分解され、環境に優しいという利点がある。また免疫学的な非特異反応が少ないという利点もある。さらに、簡単な設備があれば容易に安価で製造できるため好適に用いることができる。さらに、ゼラチンアラビアゴムコアセルベートは、任意の粒径を有するように調製することができるため、赤血球に適するように粒径を大きくすることができる。

ゼラチンアラビアゴムコアセルベートは、粒子内に封入される磁性体の量を容易に調整することができる。従って、この磁性粒子で標識された赤血球の移動速度を磁力によって調整するために、封入される磁性体の量を増減させることも可能である。

ここで述べたように、ゼラチンアラビアゴムコアセルベートは赤血球標識用の磁性粒子に都合よく用いることができるが、現在までにこれを使用して赤血球を磁性標識化した例は報告されていない。

ゼラチンアラビアゴムコアセルベートは、既知の方法によって製造し、所望の量の磁性粒子を含有するように製造することができる。製造された磁性粒子には、赤血球結合物質を担持させる。ここで赤血球結合物質は、赤血球と抗原抗体反応をし、赤血球を凝集させるリガンドであることが好ましい。

以下に、磁性体封入ゼラチンアラビアゴムコアセルベートの作成方法を説明するが、さらなる詳細は、特開2004-157040号公報を参照されたい。まず、ゼラチンのゲル化温度以上（好ましくは３５℃以上、例えば約４０℃）において、0.01〜2重量％のゼラチンと0.01〜2重量％のアラビアゴムを、Ｇ／Ａ＝0.5〜1.5、好ましくは0.5〜1.1、より好ましくは0.5〜1.0、更に好ましくは0.6〜0.9になるように、29〜65重量％の水溶性有機溶媒中で混合する。ここで水溶性有機溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン等が使用可能であるが、毒性等を考慮すればエタノールが望ましい。また、Ｇ／Ａが1.6を超えるとコアセルベート径の調製は困難となる。コアセルベートの調製液中には、当該分野で公知のとおり、コアセルベート粒子の凝集を防止するために、界面活性剤を添加しておくことが好ましい。界面活性剤の種類および添加量については、その効果を奏する範囲内において当業者であれば適宜設定することができる。

次いで、酸（例えば酢酸、プロピオン酸、希塩酸、希硫酸）の添加により、ゼラチンアラビアゴムコアセルベートを析出させる。ここで酸の添加量は、作製したいコアセルベート径に応じて適宜設定する。その後ゲル化温度以下（好ましくは３５℃以下、例えば約１０℃）に冷却し、グルタルアルデヒド、ホルマリン等のアルデヒドで架橋する。

また、コアセルベートの形態を有する担体の作製にあたっては、芯物質を加えて、芯物質をコアセルベートで包んだいわゆるマイクロカプセルとすることもできる。所望の芯物質を用いることにより、コアセルベートの比重調整、コアセルベートの磁性化、着色等を行うことが可能である。その際には適当な界面活性剤（例えばTween20、Tween80、Triton Ｘ-100など）を添加して、分散性を上げておくことが望ましい。芯物質としては、ＳｉＯ_２（ガラス）、ＴｉＯ_２、ＣｕＯ、ＣｏＯ、Ｆｅ_２Ｏ_３などの金属酸化物の微粉末、カーボン、タルクなど種々のものを利用することができる。磁性体を含有させた担体は、適宜の磁気発生手段（永久磁石、電磁石等）により、液体中での攪拌、洗浄、測定等の各種処理工程を短時間で行うことができる。なお、当業者であれば、担体を所望の性質とするために適切な芯物質の種類および芯物質の使用量について適宜選択することができる。

本発明のゼラチンアラビアゴムコアセルベートは、赤血球を標識するために用いるので、その粒径が0.1〜200μｍであることが好ましく、1〜30μｍであることがより好ましく、2〜12μｍであることが最も好ましい。

次に、リガンドを磁性粒子に担持させるには、既知の方法を用いることができる。例えば、特開2004-157040号公報に記載されたＥＤＡＣ／ＮＨＳ法を用いることができる。その概要を簡単に説明する。

コアセルベートをアルデヒドで架橋し、これを純水で洗浄後、必要に応じて染色を行い、公知のＮ−ヒドロキシスクシンイミド法を適用する。まず、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとカルボジイミドを溶かした水溶液（ＭＥＳ（２−Morpholinoethanesulfonic acid溶液））に、先の架橋済みコアセルベートを懸濁し、室温で１〜３時間反応させる。反応後、コアセルベートを遠心洗浄し、目的とするリガンドを適切なバッファー（例えば純水、酢酸バッファー、ＭＥＳバッファー）に適切な濃度で溶解したものを加え、室温あるいは冷蔵（２〜８℃）で２時間から一晩反応させる。反応後、ＢＳＡ（bovine serum albumin）やゼラチン、動物血清などで、未反応の官能基をブロックし（ブロッキング）、所望のリガンドを担持したコアセルベートが作製される。作製されたコアセルベートは、そのまま目的とする免疫学的反応用の溶液に置換して目的の反応に利用してもよいし、バイアル瓶等に分注して凍結乾燥し、長期保存をすることも可能である。

このようなＮ−ヒドロキシスクシンイミド法は、担体のカルボキシル基とリガンドのアミノ基を結合させる方法であるが、担体のカルボキシル基を活性化させる物質として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド以外に、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジンを含むＮ−ヒドロキシ化合物等を使用することができる。また、リガンドの担体への結合反応時に脱水剤として機能するカルボジイミドとして、ＥＤＡＣ；１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ＤＩＰＣ；ジイソプロピルカルボジイミド等を使用することができる。

赤血球を凝集させるリガンドは種々のものが知られており、赤血球を非特異的或いは特異的に凝集させるレクチンも数多く市販化されている（例えば、豊年コーポレーションのカタログを参照されたい）。

しかしながら、通常では赤血球凝集能を有するリガンドであっても、本発明の磁性粒子に固定化すると、赤血球の凝集能力が著しく減少するものがあることが明らかになった。例えば、特許02532670に記載されたＷＧＡを、特開2004-157040号公報に示した方法により、ゼラチンとアラビアゴムのコアセルベートに固定化したところ、赤血球を凝集させることが出来なかった。

そこで、本発明者は、本発明の磁性粒子に固定化した場合に赤血球凝集能を示すリガンドを選択するための試験を行った。その詳細を以下に記載する。

（１）磁性体封入ゼラチンアラビアゴムコアセルベート（磁性粒子）の作成
上記のような方法でゼラチンとアラビアゴムのコアセルベートを作成し、磁性体を取り込ませ、粒径2-12μｍの磁性粒子を作成した。

（２）磁性粒子へのリガンドの固定化
上記のような方法により、表１に示した各種のリガンドを、上記（１）で作成した磁性粒子に固定化した。全ての物質速度は10μｇ／ｍＬで反応を行った。反応後、ＢＳＡ（ウシアルブミン）でブロッキングを行い、0.1％ＢＳＡ／ＰＢＳ ｐＨ7.2に５％濃度で浮遊させた。

（３）赤血球凝集能力の測定
上記リガンドが固定された磁性粒子の５％浮遊液１滴（25μＬ）に、Ｏ、Ａ又はＢ型の赤血球（試薬血球Ortho社セレクトジェン、アファーマジェン）１滴を加えて、時計皿上で撹拌した。３分後に血球凝集を目視観察した。その結果を表１に示す。

表１において、0、＋、＋＋、及び＋＋＋とある表示は、図１に示すような凝集状態を表すものとする。即ち、（ａ）0は磁性粒子と赤血球が反応しない状態を表す。（ｂ）＋は、磁性粒子と赤血球が弱く凝集し、細かい凝集を生じた状態を表す。（ｃ）＋＋は、磁性粒子と赤血球が強く凝集し、比較的大きな凝集を生じた状態を表す。（ｄ）＋＋＋は、磁性粒子と赤血球が強く凝集し、大きい凝集塊を生じた状態を表す。

表１に示したように、本発明の磁性粒子に固定化した状態で、赤血球を凝集させる能力を有するリガンドは、抗グリコフォリン抗体、ニシダレクチン（ＣＳＡ）及びチョウセンアサガオレクチン（ＤＳＡ）であった。特にＤＳＡの凝集力が強く、最も好適に用いられることが示された。そのほかのリガンドは、通常では凝集能を有するにもかかわらず、本発明の磁性粒子に固定化した状態では凝集能を示さなかった。

（４）ドナー由来の血漿が混入した状態における赤血球凝集能力の測定
上記（３）と同じ方法を用いて、血清が25％混入した状態における赤血球凝集力を観察した。Ｏ型ドナー赤血球を使用した。その結果を表１に示した。上記（３）で凝集力を有したリガンドは、血漿成分の混入があっても赤血球を強く凝集することが確認された。

以上の試験から、赤血球を標識するための磁性粒子に用いることができるリガンドは、抗グリコフォリン抗体、ニシダレクチン（ＣＳＡ）及びチョウセンアサガオレクチン（ＤＳＡ）であることが明らかになった。従って、本発明の赤血球標識用磁性粒子としては、ゼラチンアラビアゴムコアセルベートを担体とする磁性粒子に、抗グリコフォリン抗体、ニシダレクチン（ＣＳＡ）及びチョウセンアサガオレクチン（ＤＳＡ）から選択されるリガンドが固定化されたものが好適に用いられる。

本発明に従った赤血球標識用磁性粒子を用いることにより、血液型判定などの免疫検査において、赤血球を磁性標識化することができる。例えば血液型判定では、反応容器内で赤血球を凝集反応させて沈降させ、そのパターンによって陽性か陰性かを判定するが、この沈降には通常３０〜６０分程度の時間を要する。しかしながら、赤血球を磁性標識化すると、磁力により沈降速度を著しく速めることができ、わずか３分程度で沈降パターンを観察することができる。

さらに、本発明の磁性粒子を用いて赤血球を標識化することにより、Ｂ／Ｆ分離を簡単に行うことができる。未反応物の洗浄が簡単に行えるため、ＥＩＡやＣＬＥＩＡのような蛍光標識などによる観察を行うことができる。これらの測定では、結果を数値化することが可能であるため、血液型などの免疫検査を全自動で行うのに好適である。

磁性粒子による赤血球の凝集の強度を表す概念図。

Claims (2)

1. 磁性体を含有する担体と、前記担体に担持された赤血球結合物質とを含み、前記赤血球結合物質は、エニシダレクチン（ＣＳＡ）及びチョウセンアサガオレクチン（ＤＳＡ）からなる群から選択される赤血球標識用磁性粒子。
2. 前記磁性体を含有する担体が、磁性体が封入されたゼラチンアラビアゴムコアセルベートである、請求項１に記載の赤血球標識用磁性粒子。

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