JP2007205911A - 金酸化鉄複合磁性粒子、免疫測定用磁性粒子及び免疫測定法 - Google Patents

Abstract

【課題】磁性粒子の表面に抗原、又は、抗体を結合させる際に、磁性粒子の洗浄作業等の煩雑な工程を施す必要が無く、免疫測定に好適に用いることができる金酸化鉄複合磁性粒子、免疫測定用磁性粒子、及び、該免疫測定用磁性粒子を用いる免疫測定法を提供する。
【解決手段】磁性を標識とした免疫測定法に用いる金酸化鉄複合磁性粒子であって、磁性酸化鉄からなる核粒子と、前記磁性酸化鉄からなる核粒子の表面に結合した金粒子とからなる金酸化鉄複合磁性粒子。
【選択図】なし

Description

本発明は、磁性粒子の表面に抗原又は抗体を結合させる際に、磁性粒子の洗浄工程等の煩雑な工程を施す必要が無く、免疫測定に好適に用いることができる金酸化鉄複合磁性粒子、免疫測定用磁性粒子、及び、該免疫測定用磁性粒子を用いる免疫測定法に関する。

測定試料中に含有される被検物質を検出する方法としては、例えば、抗原−抗体反応を利用した酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、ラテックス凝集法、免疫クロマト法等の生物学的反応を利用した種々の方法が提案されている。なかでも、簡便かつ迅速であることから、免疫クロマト法が多用されるようになってきている。
免疫クロマト法では、通常、少なくとも２種類の抗体を利用したサンドイッチ法が採用されている。この方法は、金属コロイドや着色粒子で標識した抗体（標識抗体）を含む試薬と、測定試薬とを反応させ、測定試薬中に含まれる抗原と標識抗体とを結合させ、これをもう１つの抗体が固定化されたクロマト担体に流すことにより、クロマト担体中で抗原を捕捉し、捕捉された抗原の標識をもとに分析するというものである。

このような免疫クロマト法等に供するための標識として、例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３に開示されているように磁性粒子が注目されている。磁性粒子は、もともと、酵素免疫測定法等において磁力により効率よく簡便にＢ／Ｆ分離を行うための担体としての利用が提案されてきたが、磁性粒子の磁性量を標識とすることにより、他の標識物質で標識せずに分析を行うことができる等の利点がある。

免疫測定法に用いられる磁性粒子としては、例えば、特許文献４に開示されているようなポリマー粒子に磁性体を含有させた粒子又は磁性体をマイクロカプセル化したものが挙げられる。現在使用されている磁性粒子は、粒子表面に有機物が存在するものが一般的であるが、例えば、重合による磁性粒子であれば、粒子表面には重合開始剤に起因する界面活性剤や、分散安定性を保つために使用される界面活性剤等が存在する。この界面活性剤等は、抗体が磁性粒子に結合するのを妨害することがある。そのため、磁性粒子表面に抗体を結合させる場合には、界面活性剤を除去するための洗浄作業等の煩雑な工程が必要となり、また、洗浄しても充分に界面活性剤を除去することができず、免疫測定に不具合が生じるという問題があった。
特開平６−１４８１８９号公報 特開平７−２２５２３３号公報 特表２００１−５２４６７５号公報 特開平１０−５０５６３０号公報

本発明は、上記現状に鑑み、磁性粒子の表面に抗原又は抗体を結合させる際に、磁性粒子の洗浄作業等の煩雑な工程を施す必要が無く、免疫測定に好適に用いることができる金酸化鉄複合磁性粒子、免疫測定用磁性粒子、及び、該免疫測定用磁性粒子を用いる免疫測定法を提供することを目的とする。

本発明は、磁性を標識とした免疫測定法に用いる免疫測定用磁性粒子であって、磁性酸化鉄からなる核粒子と、前記磁性酸化鉄からなる核粒子の表面に結合した金粒子とからなる金酸化鉄複合磁性粒子である。
以下に本発明を詳述する。

本発明者らは、鋭意検討の結果、界面活性剤を使用せずに磁性粒子の分散安定性を得るために、磁性粒子に電荷を与えるための官能基を導入するということを考えた。しかしながら、磁性粒子の表面に抗原又は抗体を結合させる場合には、官能基を利用した共有結合により結合させることとなり、一般的なカルボキシル基やアミノ基へ抗原又は抗体を結合させる場合、活性化等の処理が必要になる等、操作が煩雑となるという問題があった。
そこで、本発明者らは更に鋭意検討の結果、磁性粒子表面に金粒子を結合させた複合磁性粒子は、磁性粒子表面に抗原又は抗体を結合させる際にも、界面活性剤を除去する、活性化等の処理等の煩雑な工程を必要とすることなく、免疫測定用として好適に用いることができるということを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明の金酸化鉄複合磁性粒子は、磁性酸化鉄からなる核粒子と、上記磁性酸化鉄からなる核粒子の表面に結合した金粒子とからなるものである。

本発明の金酸化鉄複合磁性粒子では、核粒子として、磁性酸化鉄を用い、表面に金粒子を結合させることにより、抗原又は抗体を結合させるのを妨げる界面活性剤を用いることなく、核粒子を溶液中に分散させることができ、また、粒径及び磁性を均一にしやすいという効果がある。

上記磁性酸化鉄としては特に限定されず、例えば、磁鉱、マグヘマイト、フェライト等のＦｅ_２Ｏ_３を主成分とする磁性酸化鉄や、γ−Ｆｅ_２Ｏ_３、Ｆｅ_３Ｏ_４等の磁性酸化鉄等が挙げられる。

上記磁性酸化鉄からなる核粒子の平均粒子径としては特に限定されないが、好ましい下限は１０ｎｍ、好ましい上限は３００ｎｍである。１０ｎｍ未満であると、磁化が低下してしまい充分な感度が得られないことがあり、３００ｎｍを超えると、水分散液中で沈降する等取扱い性が悪くなることがある。より好ましい下限は４０ｎｍ、より好ましい上限は２５０ｎｍである。

本発明の金酸化鉄複合磁性粒子は、磁性酸化鉄からなる核粒子の表面に金粒子を結合させることにより、表面積を増加させ、抗原又は抗体との結合部位を増加させることができ、結合に有利になる。また、上記核粒子の表面に結合された金粒子は、液性によらず常に負に荷電することから、核粒子の分散安定性を保つことができ、また、不活性かつ安定な金粒子で核粒子を覆うことにより、核粒子の耐久性も高めることができる。
また、金は、表面プラズモン吸収が可視領域にあり、金粒子を結合させて得られる本発明の金酸化鉄複合磁性粒子は、プラズモン観測によってその存在を容易に確認することができる。従って、本発明の金酸化鉄複合磁性粒子は、例えば、抗原抗体反応に利用されると、その反応の進行の有無が目視、又は、表面プラズモン吸収スペクトルの変化を測定することにより容易に確認できるという利点がある。

上記金粒子の平均粒子径としては特に限定されないが、好ましい下限は１ｎｍ、好ましい上限は２０ｎｍである。２０ｎｍを超えると、金の比表面積が充分に得られない。より好ましい下限は２ｎｍ、より好ましい上限は１５ｎｍである。

上記金粒子の存在密度としては特に限定されないが、金酸化鉄複合磁性粒子１個に対して好ましい下限は１個、好ましい上限は粒子表面積に対して金粒子が単層で吸着できる最大個数である。

本発明の金酸化鉄複合磁性粒子の製造方法としては特に限定されず、例えば、金イオン又は金錯体を含有する溶液に磁性酸化鉄からなる核粒子を分散させ、次いで超音波又は電離放射線を照射する方法や、金イオン又は金錯体を含有する液に磁性酸化鉄を与える金属イオンを添加し、次いで超音波又は電離放射線を照射する方法等が挙げられる。
上記照射によれば、上記磁性酸化鉄の表面に、還元された金のナノ粒子が析出する。

上記金イオンを含有する溶液は、例えば、塩化金塩を水、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔ−ブタノール等の含水アルコール又はアルコール、塩酸、硫酸、硝酸等の酸等に溶解させることにより得ることができる。

上記金イオンを含有する溶液における金イオンの濃度としては特に限定されないが、好ましい下限が１μｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限が１ｍｏｌ／Ｌである。１μｍｏｌ／Ｌ未満であると、所望の金酸化鉄複合磁性粒子がほとんど得られず、１ｍｏｌ／Ｌを超えると、金粒子のサイズが大きくなり過ぎたり、金単独の粒子が多量に生じたりする。より好ましい下限は０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は１０ｍｍｏｌ／Ｌである。

上記金錯体を含有する溶液は、例えば、金イオンに適当な配位子が配位した化合物の水溶液、含水アルコール又はアルコール溶液を挙げることができる。
上記配位子としては、非共有電子対又は負電荷を持っていれば特に限定されず、具体的には、例えば、ハロゲン化物イオン（Ｆ⁻、Ｃｌ⁻、Ｂｒ⁻、Ｉ⁻等）、シアン化物イオン（ＣＮ⁻）、アンモニア（ＮＨ_３）、ピリジン等の単座配位子；エチレンジアミン、アセチルアセトンイオン等の二座配位子；エチレンジアミンテトラ酢酸イオン等の六座配位子等が挙げられる。

上記金イオン又は金錯体を含有する溶液には、必要に応じて、例えば、ポリビニルアルコール等の水溶性高分子化合物、界面活性剤、アルコール類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；アルキレングリコール、ポリアルキレングリコール、これらのモノアルキルエーテル又はジアルキルエーテル、グリセリン等のポリオール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類等の各種水混和性有機溶媒等の添加剤を添加してもよい。
このような添加剤は、金属イオンの還元反応速度を促進し、また生成される金属粒子の大きさを整えるのに有効となる。

上記磁性酸化鉄からなる核粒子の製造方法としては特に限定されず、例えば、ＰＶＳ（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）法（Ｃ．Ｊ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｍ．Ｎ．Ａｌｌ，Ｂ．Ｂ．Ｌｙｍｐａｎｙ，ＵＳ公開特許第５５１４３４９Ａ参照）等に記載されている方法に従い製造することができる。
また、上記磁性酸化鉄からなる核粒子は、例えば、Ｎａｎｏｐｈａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製の市販品等を用いることもできる。

本発明の金酸化鉄複合磁性粒子を製造する際には、超音波又は電離放射線の照射を行うことにより磁性酸化鉄からなる核粒子の表面に金粒子を結合させることができる。この理由は、現在なおすべて解明されたわけではなく、理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、照射される超音波又は電離放射線のエネルギーによって、液中の金イオン又は金錯体が還元されて磁性酸化鉄からなる核粒子の表面に原子状の金単体を析出させるものと推定している。なお、核粒子の表面への金単体の析出は、例えば、ＴＥＭ写真撮影結果等からも確認することができる。

より詳しくは、磁性酸化鉄からなる核粒子が、水溶液中で懸濁している状況で、超音波及び電離放射線照射によって、化学エネルギーより遥かに高い励起を受けると、次のようにして本発明の金酸化鉄複合磁性粒子が形成されると推定される。すなわち、超音波及び電離放射線は、周知の通り水溶液中でそれぞれ気泡（キャビティ）発生や電離によって空間的にかつ時間的に限られた領域内で還元力及び酸化力の高い化学種を発生させる。これらの化学種の作用で発生する金ナノ粒子は、生成直後にはその表面の反応性が高く、それゆえ、共存している磁性酸化鉄からなる核粒子と出会うと強く結合する。

上記超音波の照射は、通常、周波数１０ｋＨｚ〜１０ＭＨｚ、出力１Ｗ以上の条件で実施することができる。該超音波照射は、より好ましくは、例えば、アルゴン等の不活性ガス置換雰囲気中で行われる。好ましい照射条件の一例としては、周波数２００ｋＨｚ、出力２００Ｗ、照射時間１〜３００分間の条件を挙げることができる。

上記電離放射線には、直接（一次）電離放射線及び間接（二次）電離放射線が含まれる。上記直接電離放射線とは、電子、陽子、α粒子等の荷電粒子線であり、上記間接電離放射線とは、γ線（電磁波）、Ｘ線、中性子線等の非荷電粒子線である。この電離放射線の波長は、好ましくは１ｎｍ未満、より好ましくは０．１ｎｍ以下、特に好ましくは０．０１ｎｍ以下であるのがよい。特に波長が短いほど、大きさが均一で微細な金粒子が短時間で生成する傾向がある。

上記電離照射線の照射は、通常、吸収線量１Ｊ／ｋｇ以上、好ましくは１〜１００００００Ｊ／ｋｇの条件で実施することができる。特に、電離放射線としてγ線を利用する場合、該γ線は、線量１Ｇｙ以上の条件で実施することが好ましい。γ線照射の好ましい具体例としては、放射線源として、例えば、コバルト６０γ線源（γ線光量子のエネルギー：１．２５ＭｅＶ）を用いて、線量率約３ｋＧｙ／ｈ、照射時間１〜１８時間の条件で実施する例を挙げることができる。
なお、電離放射線の照射は、磁性粒子の分散状態を維持するために、溶液を攪拌しながら実施することが好ましい。超音波照射の場合には、超音波の照射自体が攪拌効果をもつので、特に攪拌操作は不要である。
上記製法としては、好ましくは超音波照射が用いられる。超音波照射では核粒子への金粒子担持率が高くなり、分散性の良い所望の金酸化鉄複合粒子を得ることができる。

上記電離放射線又は超音波照射時の温度条件としては特に限定されず、室温（常温）下で実施されるのが普通であるが、０〜１００℃程度の冷却条件及び加温条件を採用することも可能である。

このようにして得られた本発明の金酸化鉄複合磁性粒子の分散液は、そのまま分散液として各種用途に利用することもできるし、分散液に分散されている本発明の金酸化鉄複合磁性粒子を磁性を利用して適当な磁石等によって磁気分離後、乾燥することによって、粉末製品形態として回収することができる。上記粉末製品は、そのまま又は水等の適当な分散媒中に再分散させて、各種用途に利用することができる。

本発明の金酸化鉄複合磁性粒子は、金粒子の表面に抗原又は抗体を結合することにより、抗原−抗体反応を利用した酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、ラテックス凝集法、免疫クロマト法等の生物学的反応を利用した種々の方法に好適に用いることができる。
また、本発明の免疫測定用磁性粒子は、製造の際に界面活性剤を用いていないことから、磁性粒子の表面、すなわち、上記金粒子の表面に抗原又は抗体を結合させる際に、磁性粒子の洗浄作業等の煩雑な工程を施す必要が無い。
本発明の金酸化鉄複合磁性粒子の金粒子の表面に、抗原又は抗体が結合されてなる免疫測定用磁性粒子もまた、本発明の１つである。

上記金粒子の表面に抗原又は抗体を結合させる方法としては特に限定されず、従来より知られた方法を用いることができる。例えば、抗原又は抗体を含む緩衝液中に金酸化鉄複合磁性粒子を浸漬させ、一定温度で一定時間インキュベートする等の物理的な結合方法や、金とＳＨ基とが化学結合することを利用し、抗原又は抗体にＳＨ基を導入後、金酸化鉄複合粒子と反応させてＡｕ−ＳＨ結合で固定化させる等の化学的な結合方法が挙げられる。なかでも、金粒子と抗原又は抗体との結合が強固となることから化学的な結合が好ましく、この場合には、上記金粒子は例えば、抗原又は抗体のＳＨ基と化学結合することができる。

本発明の免疫測定用磁性粒子の代表的用途としては、医療・診断分野における用途を挙げることができる。この用途には、例えば、ＤＤＳにおける薬剤等医薬品、診断剤；医薬品有効成分化合物、抗原、抗体、レセプター、ハプテン、病原体、毒素当の各種物質の分析薬；細胞標識剤、酵素固定剤、蛋白質精製剤等の細胞等の分離・精製剤等が含まれる。
特に、本発明の免疫測定用磁性粒子は、適当な分散媒に分散可能で、均一系とみなし得る分散剤を提供できるものであり、また粒子形態に基づく広い表面積を有しているため、上記診断薬、分析試薬、分離・精製剤等として、迅速かつ高精度に所望の結果を提供できる。さらに、本発明の免疫測定用磁性粒子は、その分離、回収を磁気により容易に行い得るという利点もある。

本発明の免疫測定用磁性粒子を用いる免疫測定法もまた、本発明の１つである。

本発明の免疫測定法は、金属コロイドや着色粒子で標識した抗体を含む試薬と、測定試薬とを反応させ、測定試薬中に含まれる抗原と標識抗体とを結合させ、これをもう１つの抗体が固定化されたクロマト担体に流すことにより、クロマト担体中で抗原を捕捉し、捕捉された抗原の標識をもとに分析するという免疫クロマト法として特に好適である。

本発明によれば、磁性粒子の表面に抗原又は抗体を結合させる際に、磁性粒子の洗浄作業等の煩雑な工程を施す必要が無く、免疫測定に好適に用いることができる金酸化鉄複合磁性粒子、免疫測定用磁性粒子、及び、該免疫測定用磁性粒子を用いる免疫測定法を提供することができる。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。

（実施例１）
（１）金酸化鉄複合磁性粒子の作製
１重量％ポリビニルアルコール水溶液５０ｍＬ中に、磁性酸化鉄からなる核粒子としてＮａｎｏＴｅｋ Ｉｒｏｎ Ｏｘｉｄｅ（Ｎａｎｏｐｈａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製、Ｆｅ_２Ｏ_３ナノ粒子、平均粒子径２３ｎｍ）５ｍｇ、ＨＡｕＣｌ_４８．５ｍｇ（Ａｕとして４．９ｍｇ、濃度が０．５ｍｍｏｌ／Ｌとなる量）及び２−プロパノール０．４７２ｍＬを加えて分散液を調製した。この分散液をガラス製バイアルビン（容量７０ｍＬ）に封入後、線量率約３ｋＧｙ／ｈで攪拌しながら室温にて３時間γ線を照射した。γ線照射の条件は次の通りとした。
放射線源：コバルト６０γ線源（γ線光量子のエネルギー：１．２５ＭｅＶ）
このようにして金酸化鉄複合磁性粒子が分散した液を得た。
この分散液に、これを収容しているガラス製バイアル瓶の外部から直径３０ｍｍ、高さ１０ｍｍの円柱型磁石（表面磁束密度：４４５ｍＴ）により磁場をかけ、２４時間静置した。その後、バイアル瓶を開封し、上澄み液を回収し残部は再度これに水５０ｍＬを加えて分散液を調製した。また、この残部を乾燥して粉末形態の金酸化鉄複合磁性粒子を得た。

（２）免疫測定用磁性粒子の作製
得られた金酸化鉄複合磁性粒子の水分散液から金酸化鉄複合粒子を１．５ｍｇ相当量分取した。１５０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離後、上清を除去し、得られた金酸化鉄複合磁性粒子に０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液１．０ｍＬを添加し、抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体１００μｇ加え、３７℃恒温槽中で２時間撹拌した。その後、１５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、未反応の抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体を除去した。なお、粒子への抗体結合量は上清のタンパク濃度測定から仕込み濃度の５２％であることを確認した。
得られた金酸化鉄複合磁性粒子を０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍＬに懸濁させ、再度遠心分離を行った。得られた金酸化鉄複合磁性粒子を、牛血清アルブミンが１％（ｗ／ｖ）濃度になるように調整した０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍＬに懸濁させ、３７℃恒温槽で１時間撹拌し、ブロッキング処理を行った。その後、１５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離を行い、牛血清アルブミン１％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）濃度になるように調整した０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬに分散させ、免疫測定用磁性粒子を得た。

（実施例２）
（１）金酸化鉄複合磁性粒子の作製
１重量％ポリエチレングリコールモノステアレート水溶液５０ｍＬ中に、磁性酸化鉄からなる核粒子としてＮａｎｏＴｅｋ Ｉｒｏｎ Ｏｘｉｄｅ（Ｎａｎｏｐｈａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製、Ｆｅ_２Ｏ_３ナノ粒子、平均粒子径２３ｎｍ）５ｍｇ、ＨＡｕＣｌ_４８．５ｍｇ（Ａｕとして４．９ｍｇ、濃度が０．５ｍＭとなる量）を加えて、分散液を調製した。この分散液をガラス製バイアル瓶（容量７０ｍＬ）に封入し、Ａｒガスで容器内の空気を置換した後、３０℃で３０分間超音波を照射した。超音波照射の条件は次の通りとした。
周波数：２００ｋＨｚ
出力：２００Ｗ
このようにして金酸化鉄複合磁性粒子が分散した液を得た。
この分散液に、これを収容しているガラス製バイアル瓶の外部から直径３０ｍｍ、高さ１０ｍｍの円柱型磁石（表面磁束密度：４４５ｍＴ）により磁場をかけ、２４時間静置した。その後、バイアル瓶を開封し、上澄み液を回収し残部は再度これに水５０ｍＬを加えて分散液を調製した。また、この残部を乾燥して粉末形態の金酸化鉄複合磁性粒子を得た。

（２）免疫測定用磁性粒子の作製
まず初めに、抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体にＳＨ基を導入するために、抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体１ｍｇに対して５モル倍量の２−イミノチオラン溶液を添加し、室温で４５分間インキュベートした。その後、フィルター付チューブに移し、１００００ｇで１０分間遠心処理し、未反応の２−イミノチオランを除去した。さらに１０００ｇで３分間逆遠心することによりＳＨ基を導入した抗体を回収し、ＳＨ基導入抗α−ｈＣＧ抗体を得た。
実施例２の（１）で得られた金酸化鉄複合磁性粒子の水分散液から、金酸化鉄複合粒子を１．５ｍｇ相当量分取した。１５０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離後、上清を除去し、得られた金酸化鉄複合磁性粒子に０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液１．０ｍＬを添加し、ＳＨ基導入抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体１００μｇ加え、３７℃恒温槽中で２時間撹拌した。その後、１５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、未反応のＳＨ基導入抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体を除去した。なお、粒子への抗体結合量は上清のタンパク濃度測定から仕込み濃度の６３％であることを確認した。
得られた金酸化鉄複合磁性粒子を０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍＬに懸濁させ、再度遠心分離を行った。得られた金酸化鉄複合磁性粒子を、牛血清アルブミンが１％（ｗ／ｖ）濃度になるように調整した０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍＬに懸濁させ、３７℃恒温槽で１時間撹拌し、ブロッキング処理を行った。その後、１５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離を行い、牛血清アルブミン１％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）濃度になるように調整した０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬに分散させ、免疫測定用磁性粒子を得た。

（比較例１）
（１）磁性体含有粒子の作製
市販の磁性体含有粒子としてＭｅｒｋ社製Ｅｓｔａｐｏｒ（磁性マイクロスフィア、官能基ＣＯＯＨ）を使用した。平均粒子径は２８０ｎｍ、磁性体含有率は５０．５３％（いずれも公称値）である。

（２）免疫測定用磁性粒子の作製
磁性体含有粒子１２．５ｍｇにｐＨ９．５の水酸化カリウム水溶液１ｍＬ添加し、１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離後、上清を除去して分散液に存在する界面活性剤を除去した。続いて、得られた磁性体含有粒子に０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液０．６２５ｍＬ、あらかじめ調製した２％濃度のカルボジイミド溶液（ＰＢＳ）０．６２５ｍＬ添加し、３７℃恒温槽中で１．５時間撹拌した。反応溶液は１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行い、上清を除去後、０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液１．２ｍＬを添加し、超音波で再分散した。この遠心洗浄操作を３回繰り返し、未反応のカルボジイミドを除去した。続いて得られた磁性体含有粒子に１．２ｍＬを添加し、抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体２００μｇ加え、３７℃で一晩撹拌した。翌日、反応溶液に３０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン溶液（ホウ酸緩衝液）５０μＬを添加し、３７℃恒温槽中で３０分間撹拌した。その後、１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行い、未反応の抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体を除去した。なお粒子への抗α−ｈＣＧ抗体の結合量は、上清のタンパク濃度測定から仕込みの６５％であることを確認した。得られた磁性体含有粒子を０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍＬに懸濁させ、再度遠心分離を行った。得られた磁性体含有粒子を、牛血清アルブミンが１％（ｗ／ｖ）濃度になるように調整した０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍＬに懸濁させ、３７℃恒温槽で１時間撹拌し、ブロッキング処理を行った。その後、１５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離を行い、牛血清アルブミン及びグリセロールを各々１％（ｗ／ｖ）、アジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）濃度になるように調整した０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬに分散させ、免疫測定用磁性粒子を得た。

＜評価＞
実施例１、２及び比較例１で得られた免疫測定用磁性粒子について以下の評価を行った。結果を表１に示した。

（性能評価）
ニトロセルロースメンブレン（ＳＲＨＦ Ｐ ７０、日本ミリポア社製）を幅２０ｃｍ×長さ６ｃｍに裁断し、その長さ方向上端より２ｃｍの部位（反応部位）に、抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体を２．０ｍｇ／ｍＬになるようにトリス塩酸緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解した溶液を幅０．７ｍｍの直線状に塗布した。その後、３７℃で２時間乾燥した後、牛血清アルブミン（和光純薬社製）を１重量％濃度になるようにリン酸緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）に溶解した溶液に１時間浸漬し、ブロッキング処理を行った。さらにその後、ラウリル硫酸ナトリウム０．１重量％濃度になるようにリン酸緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）に溶解した溶液にて洗浄後、シリカゲルデシケーター内で室温下にて乾燥し、抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体を固定した試験片を得た。
得られた試験片を幅５ｍｍに裁断し、長さ方向上端に幅５ｍｍ×長さ２０ｍｍの吸水パッド（ＡＰ２２、日本ミリポア社製）を、下端に幅５ｍｍ×１５ｍｍのコンジュゲートパッド（グラスファイバー、日本ミリポア社製）を重ね、透明なテープで固定して試験片とした。
試験液として、牛血清アルブミン１％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ ０．０３％（ｖ／ｖ）、及び、ｈＣＧが０ｍＩＵ／ｍＬ、１０ｍＩＵ／ｍＬ、５０ｍＩＵ／ｍＬ、１００ｍＩＵ／ｍＬとなるような生理食塩水を調製した。
ついで、各試験液２００μＬに免疫測定用粒子を１０μｇ添加混合後、作製した試験片のコンジュゲートパッドに１００μＬをそれぞれ滴下した。
滴下２０分後、試験片の反応部位の磁性量を、市販のＧＭＲセンサー（ＮＶＥ社製、差動磁界センサ）を用いて測定した。

実施例１、２で作製した免疫測定用磁性粒子では、ｈＣＧ濃度が０ｍＩＵ／ｍＬとした場合を除いた全ての試験片で一定の磁性量が検出された。また、検出された磁性量は、ｈＣＧ濃度に依存していることが確認された。これにより、実施例１及び２で作製した免疫測定用粒子は、磁性を標識とする免疫測定法に有用であることが判った。
一方、比較例１で作製した免疫測定用磁性粒子では、ｈＣＧが存在しない場合（０ｍＩＵ／ｍＬ）にも、磁性量が検出されていることから、非特異的に反応部位に免疫測定用磁性粒子が捕捉されてしまうことが判った。

本発明によれば、磁性粒子の表面に抗原又は抗体を結合させる際に、磁性粒子の洗浄工程等の煩雑な工程を施す必要が無く、免疫測定に好適に用いることができる金酸化鉄複合磁性粒子、免疫測定用磁性粒子、及び、該免疫測定用磁性粒子を用いる免疫測定法を提供することができる。

Claims (5)

1. 磁性を標識とした免疫測定法に用いる金酸化鉄複合磁性粒子であって、磁性酸化鉄からなる核粒子と、前記磁性酸化鉄からなる核粒子の表面に結合した金粒子とからなることを特徴とする金酸化鉄複合磁性粒子。
2. 磁性酸化鉄からなる核粒子の平均粒子径が１０〜３００ｎｍであり、金粒子の平均粒子径が１〜２０ｎｍであることを特徴とする請求項１記載の金酸化鉄複合磁性粒子。
3. 請求項１又は２記載の金酸化鉄複合磁性粒子の金粒子の表面に、抗原又は抗体が結合されてなることを特徴とする免疫測定用磁性粒子。
4. 請求項３記載の免疫測定用磁性粒子を用いることを特徴とする免疫測定法。
5. 免疫クロマト法であることを特徴とする請求項４記載の免疫測定法。