JPWO2020066654A1 - 免疫クロマトグラフィー用複合粒子及びその製造方法、並びに、免疫クロマトグラフィー - Google Patents

免疫クロマトグラフィー用複合粒子及びその製造方法、並びに、免疫クロマトグラフィー Download PDF

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Abstract

本発明は、展開性に優れる免疫クロマトグラフィー用複合粒子及びその製造方法、並びに、上記免疫クロマトグラフィー用複合粒子を用いた免疫クロマトグラフィーを提供することを目的とする。本発明の免疫クロマトグラフィー用複合粒子は、平均粒子径が500nm以下の磁性粒子と、平均粒子径が500nm以下の金粒子とが、有機物を介して結合した、免疫クロマトグラフィー用複合粒子である。

Description

本発明は、免疫クロマトグラフィー用複合粒子及びその製造方法、並びに、免疫クロマトグラフィーに関する。
免疫クロマトグラフィーは、一般的にイムノクロマトグラフィーと同義に使用されている方法であり、操作が簡便であり短時間で測定可能であることから、昨今頻繁に利用されている。
例えば、インフルエンザウイルス等の抗原を免疫クロマトグラフィーで検出する場合、以下のような操作が行われる。
まず、抗体で修飾された標識(標識抗体)を用意し、抗原を含む試料と混合する。標識抗体は抗原と結合し、複合体を形成する。これを抗原と特異的に反応する抗体が塗布された検出ラインを有する不溶性担体に展開させると、複合体は検出ライン上で抗体と反応して固定化され、目視等により検出が確認される。
このような標識抗体に使用される標識として、例えば特許文献1に、直径約1μmの磁性粒子と直径約50nmの金粒子とがストレプトアビジン/ビオチンを介して結合した複合粒子が開示されている(実施例1等)。
特開2014−62920号公報
免疫クロマトグラフィーは短時間に抗原等の被検物質を検出する必要があるため、使用される標識は不溶性担体中を毛細管現象等を利用することにより速やかに展開することが求められる。すなわち、免疫クロマトグラフィーに用いられる標識は優れた展開性を示すことが求められる。
このようななか、本発明者らが特許文献1の実施例に示されている磁性粒子と金粒子との複合粒子について検討したところ、その展開性は昨今求められているレベルを満たすものではないことが明らかになった。
そこで、本発明は、上記実情を鑑みて、展開性に優れる免疫クロマトグラフィー用複合粒子及びその製造方法、並びに、上記免疫クロマトグラフィー用複合粒子を用いた免疫クロマトグラフィーを提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題について鋭意検討した結果、磁性粒子と金粒子の平均粒子径を特定することで上記課題が解決できることを見出し、本発明に至った。
すなわち、本発明者らは、以下の構成により上記課題が解決できることを見出した。
(1) 平均粒子径が500nm以下の磁性粒子と、平均粒子径が500nm以下の金粒子とが、有機物を介して結合した、免疫クロマトグラフィー用複合粒子。
(2) 上記磁性粒子及び上記金粒子のうち、少なくとも一方の平均粒子径が300nm未満である、上記(1)に記載の免疫クロマトグラフィー用複合粒子。
(3) 上記磁性粒子及び上記金粒子のうち、少なくとも一方の平均粒子径が150nm以下である、上記(2)に記載の免疫クロマトグラフィー用複合粒子。
(4) 上記磁性粒子及び上記金粒子のうち、少なくとも一方の平均粒子径が100nm未満である、上記(3)に記載の免疫クロマトグラフィー用複合粒子。
(5) 1つの上記磁性粒子に上記有機物を介して結合する金粒子の平均の数が、10.0未満である、上記(1)〜(4)のいずれかに記載の免疫クロマトグラフィー用複合粒子。
(6) 1つの上記磁性粒子に上記有機物を介して結合する金粒子の平均の数が、8.0以下である、上記(5)に記載の免疫クロマトグラフィー用複合粒子。
(7) 上記磁性粒子の表面が第1の有機物で修飾され、
上記金粒子の表面が第2の有機物で修飾され、
上記第1の有機物と上記第2の有機物とが、化学結合、アビジン−ビオチン相互作用、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用、疎水性相互作用、静電相互作用、及び、アフィニティ相互作用からなる群より選択される少なくとも1種で接合してなる、上記(1)〜(6)のいずれかに記載の免疫クロマトグラフィー用複合粒子。
(8) 上記(1)〜(7)のいずれかに記載の免疫クロマトグラフィー用複合粒子を製造する、免疫クロマトグラフィー用複合粒子の製造方法であって、
第1の有機物で修飾された平均粒子径が500nm以下の磁性粒子である修飾磁性粒子と、第2の有機物で修飾された平均粒子径が500nm以下の金粒子である修飾金粒子とを準備する、準備工程と、
上記修飾磁性粒子と上記修飾金粒子とを混合することで、上記修飾磁性粒子の第1の有機物と上記修飾金粒子の第2の有機物とが化学結合、アビジン−ビオチン相互作用、疎水性相互作用、静電相互作用、及び、アフィニティ相互作用からなる群より選択される少なくとも1種で接合してなる、免疫クロマトグラフィー用複合粒子を得る、混合工程とを備える、免疫クロマトグラフィー用複合粒子の製造方法。
(9) 上記(1)〜(7)のいずれかに記載の免疫クロマトグラフィー用複合粒子を用いた免疫クロマトグラフィー。
(10) 被検物質を含み得る試料と、上記被検物質と結合し得る第1の結合物質で修飾された上記(1)〜(7)のいずれかに記載の免疫クロマトグラフィー用複合粒子である修飾複合粒子とを混合することで、上記試料中の被検物質と上記修飾複合粒子との複合体を得る、混合工程と、
磁気を用いて上記混合工程後の試料中の上記複合体を捕集する、捕集工程と、
上記捕集工程で捕集された複合体を、上記被検物質と結合し得る第2の結合物質が固定化された反応部位を有する不溶性担体に展開する、展開工程と、
上記不溶性担体の反応部位において、上記複合体を捕捉する、捕捉工程とを備える、上記(9)に記載の免疫クロマトグラフィー。
(11) 上記捕捉工程後に、
捕捉された上記複合体を銀増幅する、銀増幅工程を備える、上記(10)に記載の免疫クロマトグラフィー。
以下に示すように、本発明によれば、展開性に優れる免疫クロマトグラフィー用複合粒子及びその製造方法、並びに、上記免疫クロマトグラフィー用複合粒子を用いた免疫クロマトグラフィーを提供することができる。
以下に、本発明の免疫クロマトグラフィー用複合粒子及びその製造方法、並びに、上記免疫クロマトグラフィー用複合粒子を用いた免疫クロマトグラフィーについて説明する。
なお、本明細書において「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
また、本明細書において各成分は、1種を単独で用いても、2種以上を併用して用いてもよい。ここで、各成分について2種以上を併用する場合、その成分について含有量とは、特段の断りが無い限り、合計の含有量を指す。
[免疫クロマトグラフィー用複合粒子]
本発明の免疫クロマトグラフィー用複合粒子は、平均粒子径が500nm以下の磁性粒子と、平均粒子径が500nm以下の金粒子とが、有機物を介して結合した、免疫クロマトグラフィー用複合粒子(以下、単に「本発明の複合粒子」とも言う)である。
以下では、まず、本発明の複合粒子を構成する各物質について説明し、その後、本発明の複合粒子の製造方法について説明する。
〔磁性粒子〕
本発明の複合粒子を構成する磁性粒子は平均粒子径が500nm以下の磁性粒子であれば特に制限されない。
本発明の複合粒子は磁性粒子を有するため、磁気を用いて容易に捕集することができる。
上記磁性粒子の材料は磁性を有する材料であれば特に制限されないが、具体例としては、鉄、コバルト、ニッケル、これらの酸化物、フェライト、及び、これらの合金等が挙げられる。なかでも、展開性、検出感度、磁気を用いた捕集性により優れ、非特異吸着がより抑えられる理由から、酸化鉄が好ましい。以下、「展開性、検出感度、磁気を用いた捕集性により優れ、非特異吸着がより抑えられる」ことを「本発明の効果等がより優れる」とも言う。
磁性粒子は磁性を有する材料を単独で粒子状に成形した粒子であってもよいし、磁性を有する材料をコアとしてその表面を高分子(例えば、ポリスチレン、シリカゲル等)等で被覆した粒子、又は、磁性を有する材料を用いて高分子等をコアとしたその表面を被覆した粒子であってもよい。
<平均粒子径>
上述のとおり、上記磁性粒子の平均粒子径は500nm以下である。なかでも、本発明の効果等がより優れる理由から、400nm未満であることが好ましく、300nm以下であることがより好ましく、200nm未満であることがさらに好ましく、150nm以下であることが特に好ましい。
上記磁性粒子の平均粒子径の下限は特に制限されないが、磁気を用いた捕集性により優れる理由から、1nm以上であることが好ましく、10nm以上であることがより好ましく、20nm以上であることがさらに好ましい。
なお、磁性粒子の平均粒子径は、透過型電子顕微鏡(TEM)で少なくとも20個の複合粒子を観察し、エネルギー分散型X線分析(EDX)で複合粒子中の磁性粒子を特定し、個々の磁性粒子の投影面積と同一面積を有する円の直径をそれぞれ算出し、それらの算術平均した値とする。
〔金粒子〕
本発明の複合粒子を構成する金粒子は平均粒子径が500nm以下の金粒子であれば特に制限されない。金粒子は金コロイドであることが好ましい。
本発明の複合粒子は金粒子を有するため、後述する捕捉工程において着色する。すなわち、免疫クロマトグラフィー用の標識として利用することができる。また、後述する銀増幅工程では銀イオンを還元する触媒としても働く。
<平均粒子径>
上述のとおり、上記金粒子の平均粒子径は500nm以下である。なかでも、本発明の効果等がより優れる理由から、300nm以下であることが好ましく、200nm以下であることがより好ましく、100nm以下であることがさらに好ましく、50nm以下であることが特に好ましい。
上記金粒子の平均粒子径の下限は特に制限されないが、検出感度及び銀増幅性により優れる理由から、1nm以上であることが好ましく、2nm以上であることがより好ましく、5nm以上であることがさらに好ましい。
なお、金粒子の平均粒子径は、透過型電子顕微鏡で少なくとも20個の複合粒子を観察し、EDXで複合粒子中の金粒子を特定し、個々の金粒子の投影面積と同一面積を有する円の直径をそれぞれ算出し、それらの算術平均した値とする。
〔磁性粒子の平均粒子径と金粒子の平均粒子径との比〕
上記磁性粒子の平均粒子径に対する金粒子の平均粒子径の割合(金粒子の平均粒子径/磁性粒子の平均粒子径)は特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、0.01〜10.0であることが好ましく、0.1〜5.0であることがより好ましく、0.2〜3.0であることがさらに好ましい。金粒子の平均粒子径/磁性粒子の平均粒子径は、本発明の効果等がより優れる理由から、1.0未満であることが好ましい。
〔有機物〕
本発明の複合粒子を構成する有機物は特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、アビジン−ビオチン複合体、ストレプトアビジン−ビオチン複合体、アミンとカルボン酸との縮合物、アミンとエポキシ化合物(エポキシ基を有する化合物)との反応生成物、又は、カルボン酸とエポキシ化合物との反応生成物であることが好ましく、アビジン−ビオチン複合体、又は、ストレプトアビジン−ビオチン複合体であることがより好ましく、アビジン−ビオチン複合体であることがさらに好ましい。
上記有機物の質量は特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、1000kDa以下であることが好ましい。上記有機物の質量の下限は特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、100Da以上である。
〔金粒子担持数〕
本発明の複合粒子において、1つの磁性粒子に有機物を介して結合する金粒子の平均の数(以下、「金粒子担持数」とも言う)は特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、100以下であることが好ましく、50以下であることがより好ましく、10以下であることがさらに好ましく、5.0以下であることが特に好ましく、3.0以下であることが最も好ましい。金粒子担持数の下限は特に制限されず、1である。
なお、上記金粒子担持数は以下のように求められる。
まず、複合粒子についてSEM−EDX解析を行い、磁性粒子に由来する信号強度及びAuの信号強度を測定して、磁性粒子と金粒子の量比を求める。さらに、求められた量比と、上述のとおり測定される磁性粒子及び金粒子の平均粒子径を用いることで、金粒子担持数を算出する。
〔複合粒子の平均粒子径〕
本発明の複合粒子の平均粒子径は特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、10〜600nmであることが好ましく、20〜300nmであることがより好ましく、50〜300nmであることがさらに好ましい。
なお、平均粒子径は、動的光散乱法(測定温度:25℃)で測定されたメジアン径(d=50)である。
〔好適な態様〕
本発明の複合粒子は、本発明の効果等がより優れる理由から、
上述した磁性粒子の表面が第1の有機物で修飾され、
上述した金粒子の表面が第2の有機物で修飾され、
上記第1の有機物と上記第2の有機物とが、化学結合、アビジン−ビオチン相互作用、疎水性相互作用、静電相互作用、及び、アフィニティ相互作用からなる群より選択される少なくとも1種で接合してなる免疫クロマトグラフィー用複合粒子であることが好ましい。
なお、第1の有機物と第2の有機物との接合体が上述した有機物に該当する。
すなわち、上記好適な態様は、平均粒子径が500nm以下の磁性粒子と、平均粒子径が500nm以下の金粒子とが、上記接合体を介して結合した、免疫クロマトグラフィー用複合粒子である。
上記第1の有機物及び上記第2の有機物は特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、アビジンとビオチンとの組み合わせ、ストレプトアビジンとビオチンとの組み合わせ、アミンとカルボン酸との組み合わせ、アミンとエポキシ化合物との組み合わせ、及び、カルボン酸とエポキシ化合物との組み合わせが好ましく、アビジンとビオチンとの組み合わせ、及び、ストレプトアビジンとビオチンとの組み合わせがより好ましく、アビジンとビオチンとの組み合わせがさらに好ましい。
なお、アビジンとビオチンとの組み合わせの場合、第1の有機物と第2の有機物とはアビジン−ビオチン相互作用で接合し、ストレプトアビジンとビオチンとの組み合わせの場合、第1の有機物と第2の有機物とはストレプトアビジン−ビオチン相互作用で接合し、アミンとカルボン酸との組み合わせの場合、第1の有機物と第2の有機物とは化学結合(アミド結合)で接合し、アミンとエポキシ化合物との組み合わせの場合、第1の有機物と第2の有機物とは化学結合で接合し、カルボン酸とエポキシ化合物との組み合わせの場合、第1の有機物と第2の有機物とは化学結合で接合する。
上述した第1の有機物で修飾された磁性粒子は、本発明の効果等がより優れる理由から、第1の有機物で被覆された磁性粒子であることが好ましい。
同様に、上述した第2の有機物で修飾された金粒子は、本発明の効果等がより優れる理由から、第2の有機物で被覆された金粒子であることが好ましい。
〔製造方法〕
上述した本発明の複合粒子を製造する方法は特に制限されないが、得られる複合粒子について本発明の効果等がより優れる理由から、下記(1)〜(2)の工程を備える方法(以下、「本発明の製造方法」とも言う)が好ましい。
(1)準備工程
第1の有機物で修飾された平均粒子径が500nm以下の磁性粒子である修飾磁性粒子と、第2の有機物で修飾された平均粒子径が500nm以下の金粒子である修飾金粒子とを準備する工程
(2)混合工程
上記修飾磁性粒子と上記修飾金粒子とを混合することで、上記修飾磁性粒子の第1の有機物と上記修飾金粒子の第2の有機物とが化学結合、アビジン−ビオチン相互作用、疎水性相互作用、静電相互作用、及び、アフィニティ相互作用からなる群より選択される少なくとも1種で接合してなる、免疫クロマトグラフィー用複合粒子を得る工程
以下、各工程について説明する。
<準備工程>
準備工程は、第1の有機物で修飾された平均粒子径が500nm以下の磁性粒子である修飾磁性粒子と、第2の有機物で修飾された平均粒子径が500nm以下の金粒子である修飾金粒子とを準備する工程である。
磁性粒子、金粒子、第1の有機物、及び、第2の有機物については上述のとおりである。
修飾磁性粒子及び修飾金粒子は、取り扱い易さの観点から、分散液として準備するのが好ましい。
なお、修飾磁性粒子(又はその分散液)及び修飾金粒子(又はその分散液)は市販品を使用してもよい。
<混合工程>
混合工程は、上記修飾磁性粒子と上記修飾金粒子とを混合することで、上記修飾磁性粒子の第1の有機物と上記修飾金粒子の第2の有機物とが化学結合、アビジン−ビオチン相互作用、疎水性相互作用、静電相互作用、及び、アフィニティ相互作用からなる群より選択される少なくとも1種で接合してなる、免疫クロマトグラフィー用複合粒子を得る工程である。
第1の有機物と第2の有機物とを十分に接合させる観点から、修飾磁性粒子と修飾金粒子を混合した後、インキュベートするのが好ましい。
なお、修飾磁性粒子が分散液である場合、混合工程の前に、リン酸緩衝液(PBS)等を用いて、粒子の洗浄とバッファー置換と希釈を行うのが好ましい。
同様に、修飾金粒子が分散液である場合、混合工程の前に、リン酸緩衝液(PBS)等を用いて、粒子の洗浄とバッファー置換と希釈を行うのが好ましい。
また、第1の有機物及び第2の有機物がアミンとカルボン酸との組み合わせの場合、混合工程の前に、カルボン酸で修飾された方の粒子(磁性粒子又は金粒子)については脱水縮合剤(例えば、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)、N,N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)等)と反応させておくのが好ましい。このようにすることで、アミンで修飾された方の粒子(磁性粒子又は金粒子)と効率的に反応することができる。
〔用途〕
本発明の複合粒子は、上述のとおり展開性に優れるため、免疫クロマトグラフィーに有用である。特に、免疫クロマトグラフィー(特に、イムノクロマトグラフィー)の標識に有用である。
本発明の複合粒子は磁性粒子を有するため、磁気を用いて容易に捕集することができる。これにより、被検物質を濃縮した試料を得ることができるため、免疫クロマトグラフィーの検出感度を大幅に向上させることができる。
[免疫クロマトグラフィー]
本発明の免疫クロマトグラフィーは、上述した本発明の複合粒子を用いた免疫クロマトグラフィーである。
本発明の免疫クロマトグラフィーは、下記(1)〜(4)の工程を備える免疫クロマトグラフィー(以下、「本発明のクロマトグラフィー」とも言う)であることが好ましい。
(1)混合工程
被検物質を含み得る試料と、上記被検物質と結合し得る第1の結合物質で修飾された上述した本発明の複合粒子である修飾複合粒子とを混合することで、上記試料中の被検物質と上記修飾複合粒子との複合体を得る工程
(2)捕集工程
磁気を用いて上記混合工程後の試料中の上記複合体を捕集する工程
(3)展開工程
上記捕集工程で捕集された複合体を、上記被検物質と結合し得る第2の結合物質が固定化された反応部位を有する不溶性担体に展開する工程
(4)捕捉工程
上記不溶性担体の反応部位において、上記複合体を捕捉する工程
本発明のクロマトグラフィーは、試料中の被検物質を検出する免疫クロマトグラフィーである。
以下、各工程について説明する。
〔混合工程〕
混合工程は、被検物質を含み得る試料と、上記被検物質と結合し得る第1の結合物質で修飾された上述した本発明の複合粒子である修飾複合粒子とを混合することで、上記試料中の被検物質と上記修飾複合粒子との複合体を得る工程である。
<試料>
混合工程で使用される試料は、被検物質を含み得る試料であれば特に制限されない。そのような試料としては、例えば、生物学的試料、特には動物(特にヒト)の体液(例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰)若しくは排泄物(例えば、糞便)、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる擦過検体(スワブ)、うがい液、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体を挙げることができる。
被検物質としては、例えば、天然物、毒素、ホルモン、農薬等の生理活性物質、環境汚染物質、ウイルス、抗原、抗体などが挙げられる。
(試料の前処理)
上記試料は、試料をそのままで、又は、被検試料を適当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形で、更には、抽出液を適当な希釈剤で希釈して得られる希釈液の形、若しくは抽出液を適当な方法で濃縮した形で、用いることができる。
上記抽出用溶媒としては、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒(例えば、水、生理食塩液、又は緩衝液等)、あるいは、かかる溶媒で希釈することにより直接抗原抗体反応を実施することができる水混和性有機溶媒を用いることもできる。
<修飾複合粒子>
上記修飾複合粒子は、上記被検物質と結合し得る第1の結合物質で修飾された上述した本発明の複合粒子である。すなわち、上記修飾複合粒子は、上述した本発明の複合粒子であって、上記被検物質と結合し得る第1の結合物質で修飾された複合粒子である。
上記修飾複合粒子において、上述した本発明の複合粒子が上記第1の結合物質で修飾されている部分(部位)は特に制限されない。例えば、上述した本発明の複合粒子のうち、磁性粒子が上記第1の結合物質で修飾されていてもよいし、金粒子が上記第1の結合物質で修飾されていてもよいし、有機物が上記第1の結合物質で修飾されていてもよい。なかでも、本発明の効果等がより優れる理由から、磁性粒子又は金粒子が上記第1の結合物質で修飾されているのが好ましく、金粒子が上記第1の結合物質で修飾されているのがより好ましい。
(第1の結合物質)
上記第1の結合物質は、例えば抗原からなる被検物質に特異的に結合する抗体、抗体からなる被検物質に特異的に結合する抗原、たんぱく質、低分子化合物等からなる被検物質に結合するアプタマーなど、被検物質に対して親和性を持つ化合物であれば特に制限はない。
本発明のクロマトグラフィーにおいて、上記被検物質が抗原であり、上記第1の結合物質が抗体であるのが好ましい。
上記抗体は特に制限されないが、例えば、被検物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、被検物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片[例えば、F(ab’)2、Fab、Fab’、又はFv]を用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行うことができる。
<修飾複合粒子の製造方法>
上記修飾複合粒子を製造する方法は特に制限されないが、例えば、下記(1)及び(2)の方法が挙げられる。なかでも、得られる修飾複合粒子について本発明の効果等がより優れる理由から、下記(1)の方法が好ましい。
(1)上述した本発明の製造方法において、磁性粒子又は金粒子として上記第1の結合物質で修飾された磁性粒子又は金粒子を用いる方法
(2)上述した本発明の複合粒子を上記第1の結合物質で修飾する方法
上記(1)において、金粒子を上記第1の結合物質で修飾する方法としては、例えば、以下に記載されている従来公知の方法(例えばThe Journal of Histochemistry and Cytochemistry、30、7(1982)691−696)が挙げられる。具体例としては、金粒子と上記第1の結合物質(例えば抗体)を適当な緩衝液中で室温条件にて5分以上混合する。反応後、遠心分離により得た沈殿を、ポリエチレングリコ−ル等の分散剤を含む溶液中に分散させることにより、上記第1の結合物質で修飾された金粒子を得ることができる。
<試料と修飾複合粒子との混合>
上記混合工程では、上記試料と上記修飾複合粒子とを混合する。
これにより、上記試料が被検物質を含む場合には、試料中の被検物質と上記修飾複合粒子の上記第1の結合物質とが反応し、上記試料中で被検物質と上記修飾複合粒子との複合体が形成される。一方、上記試料が被権物質を含まない場合には、上記複合体は形成されない。
〔捕集工程〕
捕集工程は、磁気を用いて上記混合工程後の試料中の上記複合体を捕集する工程である。
なお、上記混合工程後の試料中に被検物質と反応しなかった本発明の複合粒子(未反応の複合粒子)が存在する場合には、上記未反応の複合粒子も一緒に捕集される。また、上記試料が被検物質を含まない場合には、上記混合工程で上記複合体が形成されず、上記未反応の複合粒子が捕集される。
捕集工程では、上記複合体及び/又は上記未反応の複合粒子(以下、まとめて「複合体等」とも言う)を捕集することで、例えば、試料中の複合体等の濃度を上げる、複合体等を分離する、等の操作を行うことができる。これにより検出感度及びSN比(シグナルノイズ比)を大幅に向上させることができる。
磁気を用いて上記混合工程後の試料中の上記複合体等を捕集する方法は特に制限されず、例えば、磁気スタンドに設置したマイクロチューブに上記混合工程後の試料を入れる方法等が挙げられる。
〔展開工程〕
展開工程は、上記捕集工程で捕集された複合体を、上記被検物質と結合し得る第2の結合物質が固定化された反応部位を有する不溶性担体に展開する工程である。
<不溶性担体>
上記不溶性担体は、上記被検物質と結合し得る第2の結合物質が固定化された反応部位(テストライン)を有する不溶性担体である。
(不溶性担体)
上記不溶性担体としては、多孔性担体が好ましい。特に、ニトロセルロース膜、セルロース膜、アセチルセルロース膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布、または糸等が好ましい。
(第2の結合物質)
上記第2の結合物質の具体例及び好適な態様は上述した第1の結合物質と同じである。上記第2の結合物質は、上述した第1の結合物質と同じであっても、異なっていてもよい。
<複合体の展開>
上記展開工程では、上記複合体を上記不溶性担体に展開する。例えば、捕集工程で濃縮された複合体を含む試料を不溶性担体の一方の端から流すことで、上記複合体を含む試料を不溶性担体の水平方向に展開する。
なお、上述のとおり、上記混合工程後の試料中に被検物質と反応しなかった本発明の複合粒子(未反応の複合粒子)が存在する場合には、上記捕集工程で上記未反応の複合粒子も一緒に捕集されるため、上記複合体とともに上記未反応の複合粒子も展開される。また、上記試料が被検物質を含まない場合には、上記混合工程で上記複合体が形成されず、上記捕集工程では上記未反応の複合粒子のみが捕集されるため、上記未反応の複合粒子が展開される。
〔捕捉工程〕
捕捉工程は、上記不溶性担体の反応部位において、上記複合体を捕捉する工程である。
上述のとおり、不溶性担体の反応部位には被検物質と結合し得る第2の結合物質が固定化されているため、上記展開工程で不溶性担体に展開された複合体(被検物質と修飾複合粒子との複合体)は、不溶性担体の反応部位(テストライン)で捕捉される。
捕捉された複合体は金粒子の表面プラズモン等により着色するため、視認できる。また、画像解析装置等を用いて、捕捉された複合体の濃度を見積もることもできる。このようにして、試料中の被検物質を検出することができる。
なお、試料が被検物質を含まない場合には上記複合体が形成されないため、不溶性担体の反応部位で捕捉されず、着色しない。
〔銀増幅工程〕
本発明のクロマトグラフィーは、上述した捕捉工程後に、さらに銀増幅工程を備えるのが好ましい。
銀増幅工程は、上記捕捉工程後の不溶性担体に銀イオンを付与することで、不溶性担体の反応部位で捕捉された複合体に大きな銀粒子を形成する工程である。より詳細には、上記複合体の金粒子を触媒として銀イオンが還元され、銀粒子(例えば、直径10μm以上)が形成される工程である。
これにより、捕捉された複合体の視認度及びSN比(シグナルノイズ比)が著しく向上する。
<好適な態様>
上記捕捉工程後の不溶性担体に銀イオンを付与する方法は特に制限されないが、視認度及びSN比がより向上する理由から、下記還元剤液及び下記増幅液を使用する方法が好ましい。
(還元剤液)
上記還元剤液は、銀イオンを還元し得る還元剤を含有する。銀イオンを還元し得る還元剤は、銀イオンを銀に還元することができれば、無機・有機のいかなる材料、またはその混合物でも用いることができる。無機還元剤としては、Fe2+、V2+、Ti3+、などの金属イオンで原子価の変化し得る還元性金属塩、還元性金属錯塩を好ましく挙げることができる。無機還元剤を用いる際には、酸化されたイオンを錯形成するか還元して、除去するか無害化する必要がある。例えば、Fe2+を還元剤として用いる系では、クエン酸やエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を用いて酸化物であるFe3+の錯体を形成し、無害化することができる。本発明ではこのような無機還元剤を用いることが好ましく、本発明のより好ましい態様としては、Fe2+の金属塩を還元剤として用いることが好ましい。
なお、湿式のハロゲン化銀写真感光材料に用いられる現像主薬(例えばメチル没食子酸塩、ヒドロキノン、置換ヒドロキノン、3−ピラゾリドン類、p−アミノフェノール類、p−フェニレンジアミン類、ヒンダードフェノール類、アミドキシム類、アジン類、カテコール類、ピロガロール類、アスコルビン酸(またはその誘導体)、およびロイコ色素類)、および本分野での技術に熟練しているものにとって明らかなその他の材料、例えば米国特許第6,020,117号に記載されている材料も用いることができる。
還元剤としては、アスコルビン酸還元剤も好ましい。有用なアスコルビン酸還元剤は、アスコルビン酸とその類縁体、異性体とその誘導体を含み、例えば、D−またはL−アスコルビン酸とその糖誘導体(例えばγ−ラクトアスコルビン酸、グルコアスコルビン酸、フコアスコルビン酸、グルコヘプトアスコルビン酸、マルトアスコルビン酸)、アスコルビン酸のナトリウム塩、アスコルビン酸のカリウム塩、イソアスコルビン酸(又はL−エリスロアスコルビン酸)、その塩(例えばアルカリ金属塩、アンモニウム塩又は当技術分野において知られている塩)、エンジオールタイプのアスコルビン酸、エナミノールタイプのアスコルビン酸、チオエノ−ルタイプのアスコルビン酸等を好ましく挙げることができ、特にはD、LまたはD,L−アスコルビン酸(そして、そのアルカリ金属塩)若しくはイソアスコルビン酸(またはそのアルカリ金属塩)が好ましく、ナトリウム塩が好ましい塩である。必要に応じてこれらの還元剤の混合物を用いることができる。
(増幅液)
上記増幅液は、銀イオンを含む化合物を含有する液である。銀イオンを含む化合物としては、例えば、有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体を用いることができる。好ましく
は、水などの溶媒に対して溶解度の高い銀イオン含有化合物であり、硝酸銀、酢酸銀、乳酸銀、酪酸銀、チオ硫酸銀などが挙げられる。特に好ましくは硝酸銀である。銀錯体としては、水酸基やスルホン基など水溶性基を有する配位子に配位された銀錯体が好ましく、ヒドロキシチオエーテル銀等が挙げられる。
有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体は、銀として増幅液に0.001mol/L〜5mol/L、好ましくは0.005mol/L〜3mol/L、更には0.01mol/
L〜1mol/Lの濃度で含有されることが好ましい。
増幅液の助剤としては、緩衝剤、防腐剤、例えば酸化防止剤または有機安定剤、速度調節剤等が挙げられる。緩衝剤としては、例えば、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウムまたはこれらのどれかの塩、又はトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを用いた緩衝剤、その他一般的化学実験に用いられる緩衝剤を用いることができる。これら緩衝剤を適宜用いて、その増幅溶液に最適なpHに調整することができる。また、カブリ防止剤としてアルキルアミンを助剤として用いることができ、特に好ましくはドデシルアミンである。またこれら助剤の溶解性向上のため、界面活性剤を用いることができ、特に好ましくはC19−C−O−(CHCHO)50Hである。
以下、実施例により、本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔粒子の製造〕
以下のとおり、粒子を製造した。
ここで、実施例1〜17の複合粒子は、平均粒子径が500nm以下の金粒子と平均粒子径が500nm以下の磁性粒子とが有機物を介して結合した複合粒子であるため、上述した本発明の複合粒子に該当する。
一方、比較例1〜2の粒子は、磁性粒子のみの粒子であるため、上述した本発明の複合粒子に該当しない。
また、比較例3の複合粒子は、金粒子と磁性粒子とが有機物を介して結合した複合粒子であるが、磁性粒子の平均粒子径が500nmを超えるため、上述した本発明の複合粒子に該当しない。
<実施例1>
以下のとおり、実施例1の複合粒子を製造した。
(準備工程)
まず、以下のとおり、アビジンで修飾された磁性粒子(修飾磁性粒子)とビオチンで修飾された金粒子(修飾金粒子)とを準備した。
(1)アビジンで修飾された磁性粒子
平均粒子径が30nmの磁性粒子(酸化鉄)の分散液(SIGMA−ALDRICH社製)とアビジンとを混合し、27℃で1時間攪拌することで、アビジン(第1の有機物)で修飾された磁性粒子の分散液を得た。
(2)ビオチンで修飾された金粒子
平均粒子径が50nmの金粒子(金コロイド)の分散液(Cosmo Bio社製)とビオチンとを混合し、27℃で1時間攪拌することで、ビオチン(第2の有機物)で修飾された金粒子の分散液を得た。
(混合工程)
得られたアビジンで修飾された磁性粒子の分散液について、リン酸緩衝液(PBS)を用いて、粒子の洗浄とバッファー置換と希釈を行った。また、得られたビオチンで修飾された金粒子の分散液についても、リン酸緩衝液(PBS)を用いて、粒子の洗浄とバッファー置換と希釈を行った。その後、2つの分散液を混合し、30分間インキュベートした。
その結果、アビジンで修飾された磁性粒子(平均粒子径:30nm)のアビジンとビオチンで修飾された金粒子(平均粒子径:50nm)のビオチンとがアビジン−ビオチン相互作用で接合してなる複合粒子(磁性粒子(平均粒子径:30nm)と金粒子(平均粒子径:50nm)とがアビジン−ビオチン複合体を介して結合した複合粒子)を得た。
なお、得られた複合粒子の分散液から未反応の金粒子を分離するため、磁気スタンドにマイクロチューブを設置して、得られた分散液についてB/F分離を行った。
<実施例2>
以下のとおり、実施例2の複合粒子を製造した。
(準備工程)
まず、以下のとおり、アミンで修飾された磁性粒子(修飾磁性粒子)とカルボン酸で修飾された金粒子(修飾金粒子)とを準備した。
(1)アミンで修飾された磁性粒子
平均粒子径が30nmの磁性粒子(酸化鉄)の分散液(SIGMA−ALDRICH社製)とアミンとを混合し、27℃で1時間攪拌することで、アミン(第1の有機物)で修飾された磁性粒子の分散液を得た。
(2)カルボン酸で修飾された金粒子
平均粒子径が50nmの金粒子(金コロイド)の分散液(Cosmo Bio社製)とカルボン酸とを混合し、27℃で1時間攪拌することで、カルボン酸(第2の有機物)で修飾された金粒子の分散液を得た。
(混合工程)
得られたアミンで修飾された磁性粒子の分散液について、リン酸緩衝液(PBS)を用いて、粒子の洗浄とバッファー置換と希釈を行った。また、得られたカルボン酸で修飾された金粒子の分散液についても、リン酸緩衝液(PBS)を用いて、粒子の洗浄とバッファー置換と希釈を行った。なお、カルボン酸で修飾された金粒子の分散液については、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)を加え、10分ほどゆっくり攪拌した。その後、2つの分散液を混合し、30分間インキュベートした。
その結果、アミンで修飾された磁性粒子(平均粒子径:30nm)のアミンとカルボン酸で修飾された金粒子(平均粒子径:50nm)のカルボン酸とが化学結合で接合してなる複合粒子(磁性粒子(平均粒子径:30nm)と金粒子(平均粒子径:50nm)とがアミンとカルボン酸との縮合物を介して結合した複合粒子)を得た。
なお、得られた複合粒子の分散液から未反応の金粒子を分離するため、磁気スタンドにマイクロチューブを設置して、得られた分散液についてB/F分離を3回行った。
<実施例3>
以下のとおり、実施例3の複合粒子を製造した。
(準備工程)
まず、以下のとおり、カルボン酸で修飾された磁性粒子(修飾磁性粒子)とアミンで修飾された金粒子(修飾金粒子)とを準備した。
(1)カルボン酸で修飾された磁性粒子
平均粒子径が30nmの磁性粒子(酸化鉄)の分散液(SIGMA−ALDRICH社製)とカルボン酸とを混合し、27℃で1時間攪拌することで、カルボン酸(第1の有機物)で修飾された磁性粒子の分散液を得た。
(2)アミンで修飾された金粒子
平均粒子径が50nmの金粒子(金コロイド)の分散液(Cosmo Bio社製)とアミンとを混合し、27℃で1時間攪拌することで、アミン(第2の有機物)で修飾された金粒子の分散液を調製した。
(混合工程)
得られたカルボン酸で修飾された磁性粒子の分散液について、リン酸緩衝液(PBS)を用いて、粒子の洗浄とバッファー置換と希釈を行った。また、得られたアミンで修飾された金粒子の分散液についても、リン酸緩衝液(PBS)を用いて、粒子の洗浄とバッファー置換と希釈を行った。なお、カルボン酸で修飾された磁性粒子の分散液については、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)を加え、10分ほどゆっくり攪拌した。その後、2つの分散液を混合し、30分間インキュベートした。
その結果、カルボン酸で修飾された磁性粒子(平均粒子径:30nm)のカルボン酸とアミンで修飾された金粒子(平均粒子径:50nm)のアミンとが化学結合で接合してなる複合粒子(磁性粒子(平均粒子径:30nm)と金粒子(平均粒子径:50nm)とがカルボン酸とアミンとの縮合物を介して結合した複合粒子)を得た。
なお、得られた複合粒子の分散液から未反応の金粒子を分離するため、磁気スタンドにマイクロチューブを設置して、得られた分散液についてB/F分離を3回行った。
<実施例4〜8>
アビジンで修飾された磁性粒子の分散液の調製に用いる磁性粒子の分散液として表1に記載の磁性粒子(酸化鉄)の分散液を用いた点、及び、ビオチンで修飾された金粒子の分散液の調製に用いる金粒子の分散液として表1に記載の金粒子の分散液を用いた点以外は、実施例1と同様の手順に従って、各複合粒子の分散液を得た。
<実施例9〜17及び比較例3>
カルボン酸で修飾された磁性粒子の分散液の調製に用いる磁性粒子の分散液として表1に記載の磁性粒子(酸化鉄)の分散液を用いた点、及び、アミンで修飾された金粒子の分散液の調製に用いる金粒子の分散液として表1に記載の金粒子の分散液を用いた点以外は、実施例3と同様の手順に従って、各複合粒子の分散液を得た。なお、実施例15については、2つの分散液を混合する際に、金粒子の分散液の割合を増やした。
<比較例1>
平均粒子径が30nmの磁性粒子(酸化鉄)の分散液(SIGMA−ALDRICH社製)とアビジンとを混合し、27℃で1時間攪拌することで、アビジンで修飾された磁性粒子の分散液を得た。得られた磁性粒子を比較例1とする。
<比較例2>
平均粒子径が1000nmの磁性粒子(酸化鉄)の分散液(Nanocs社製)とカルボン酸とを混合し、27℃で1時間攪拌することで、カルボン酸で修飾された磁性粒子の分散液を得た。得られた磁性粒子を比較例2とする。
〔評価〕
得られた粒子について以下の評価を行った。
<金粒子担持数>
得られた複合粒子(実施例1〜17及び比較例3)について、上述した金粒子担持数を求めた。
具体的には、得られた複合粒子の分散液をガラス基板に滴下し、乾燥させ、SEM−EDX解析を行った。そして、Feの信号強度とAuの信号強度から磁性粒子と金粒子の量比を求めた。さらに、求められた量比と、磁性粒子及び金粒子の平均粒子径を用いて、金粒子担持数を求めた。
結果を表1に示す。
<展開性>
得られた粒子について、以下のとおり展開性を評価した。
インフルエンザ検査キットに使用されているメンブレン(不溶性担体)(多孔性担体)を取り外した。その後、実施例及び比較例の粒子の分散液を10個/mlの粒子濃度になるように調整してテスト液(a)とし、上記膜の一方の端からテスト液(a)を200μL流して、300秒経過した後に、膜の他方の端まで到達した粒子を別途回収し、分散バッファー液を200μL加えてテスト液(b)とした。それぞれの液を同量、同じ希釈倍率としてガラス基板に滴下し乾燥した。このガラス基板の走査型電子顕微鏡(SEM)画像から平均の粒子数を算出し、其々の比を解析した。ここで言う平均の粒子数とは、SEM画像のランダムに撮影した10画像の粒子の数の平均値である。
そして、流した粒子数に対する回収された粒子数の割合(通過確率)が、40%以上の場合を「A」、30%以上40%未満の場合を「B」、20%以上30%未満の場合を「C」、20%未満の場合を「D」として、展開性を評価した。
結果を表1に示す。実用上、展開性の観点から、A、B又はCであることが好ましく、A又はBであることがより好ましく、Aであることがさらに好ましい。
<銀増幅性>
得られた粒子について、以下のとおり銀増幅性を評価した。
(還元剤液の作製)
水290gに、硝酸鉄(III)九水和物(品番095−00995、富士フイルム和光社製)を水に溶解して作製した1mol/Lの硝酸鉄水溶液23.6mL及びクエン酸(品番038−06925、富士フイルム和光社製)13.1gを溶解させた。全て溶解した後、スターラーで攪拌しながら硝酸(10重量%)を36mL加え、さらに硫酸アンモニウム鉄(II)六水和物(品番091−00855、富士フイルム和光社製)を60.8g加えこれを還元剤液とした。
(増幅液の作製)
水66gに、硝酸銀溶液8mL(10gの硝酸銀を含む)と1mol/Lの硝酸鉄水溶液24mLを加えた。さらに、この溶液と、硝酸(10重量%)5.9mL、ドデシルアミン(品番123−00246、富士フイルム和光社製)0.1g、界面活性剤C1225−C−O−(CHCHO)50H 0.1gをあらかじめ47.6gの水に溶解した溶液とを混合し、これを増幅液とした。
(銀増幅)
得られた粒子をガラス基板に滴下し、乾燥させ、その後、乾燥後の粒子の上に、上述のとおり作製した還元剤液と増幅液をこの順番で滴下し、乾燥させた。そして、SEM−EDX解析を行い、Agの信号強度がFeの信号強度と同等以上である場合を「A」、Agの信号強度がFeの信号強度の半分以下である場合を「D」として、銀増幅性を評価した。
結果を表1に示す。実用上、銀増幅性の観点から、Aであることが好ましい。
Figure 2020066654
表1から分かるように、磁性粒子の平均粒子径が500nmを超える複合粒子である比較例3と比較して、磁性粒子の平均粒子径が500nm以下の複合粒子である実施例1〜17は、いずれも優れた展開性(通過確率20%以上)(実用に耐え得るレベル)を示した。なかでも、磁性粒子の平均粒子径が300nm未満である実施例1〜15は、より優れた展開性(通過確率30%以上)(測定精度が向上し高感度化が実現可能なレベル)を示した。そのなかでも、金粒子担持数が8.0以下である実施例1〜9、11及び13は、さらに優れた展開性(通過確率40%以上)を示した。

Claims (11)

  1. 平均粒子径が500nm以下の磁性粒子と、平均粒子径が500nm以下の金粒子とが、有機物を介して結合した、免疫クロマトグラフィー用複合粒子。
  2. 前記磁性粒子及び前記金粒子のうち、少なくとも一方の平均粒子径が300nm未満である、請求項1に記載の免疫クロマトグラフィー用複合粒子。
  3. 前記磁性粒子及び前記金粒子のうち、少なくとも一方の平均粒子径が150nm以下である、請求項2に記載の免疫クロマトグラフィー用複合粒子。
  4. 前記磁性粒子及び前記金粒子のうち、少なくとも一方の平均粒子径が100nm未満である、請求項3に記載の免疫クロマトグラフィー用複合粒子。
  5. 1つの前記磁性粒子に前記有機物を介して結合する金粒子の平均の数が、10.0未満である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の免疫クロマトグラフィー用複合粒子。
  6. 1つの前記磁性粒子に前記有機物を介して結合する金粒子の平均の数が、8.0以下である、請求項5に記載の免疫クロマトグラフィー用複合粒子。
  7. 前記磁性粒子の表面が第1の有機物で修飾され、
    前記金粒子の表面が第2の有機物で修飾され、
    前記第1の有機物と前記第2の有機物とが、化学結合、アビジン−ビオチン相互作用、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用、疎水性相互作用、静電相互作用、及び、アフィニティ相互作用からなる群より選択される少なくとも1種で接合してなる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の免疫クロマトグラフィー用複合粒子。
  8. 請求項1〜7のいずれか1項に記載の免疫クロマトグラフィー用複合粒子を製造する、免疫クロマトグラフィー用複合粒子の製造方法であって、
    第1の有機物で修飾された平均粒子径が500nm以下の磁性粒子である修飾磁性粒子と、第2の有機物で修飾された平均粒子径が500nm以下の金粒子である修飾金粒子とを準備する、準備工程と、
    前記修飾磁性粒子と前記修飾金粒子とを混合することで、前記修飾磁性粒子の第1の有機物と前記修飾金粒子の第2の有機物とが化学結合、アビジン−ビオチン相互作用、疎水性相互作用、静電相互作用、及び、アフィニティ相互作用からなる群より選択される少なくとも1種で接合してなる、免疫クロマトグラフィー用複合粒子を得る、混合工程とを備える、免疫クロマトグラフィー用複合粒子の製造方法。
  9. 請求項1〜7のいずれか1項に記載の免疫クロマトグラフィー用複合粒子を用いた免疫クロマトグラフィー。
  10. 被検物質を含み得る試料と、前記被検物質と結合し得る第1の結合物質で修飾された請求項1〜7のいずれか1項に記載の免疫クロマトグラフィー用複合粒子である修飾複合粒子とを混合することで、前記試料中の被検物質と前記修飾複合粒子との複合体を得る、混合工程と、
    磁気を用いて前記混合工程後の試料中の前記複合体を捕集する、捕集工程と、
    前記捕集工程で捕集された複合体を、前記被検物質と結合し得る第2の結合物質が固定化された反応部位を有する不溶性担体に展開する、展開工程と、
    前記不溶性担体の反応部位において、前記複合体を捕捉する、捕捉工程とを備える、請求項9に記載の免疫クロマトグラフィー。
  11. 前記捕捉工程後に、
    捕捉された前記複合体を銀増幅する、銀増幅工程を備える、請求項10に記載の免疫クロマトグラフィー。
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