JPH073426B2 - 診断用凝集反応試薬の担体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は水媒体中で分散安定性のよい親水性の複合重合
体粒子からなる診断用試薬の担体に関する。上記複合重
合体粒子は、酵素や免疫活性物質などの生理活性物質を
固定化する診断用凝集反応試薬の担体として好適に使用
し得る。

〔従来技術及び発明が解決しようとする問題点〕

複合重合体粒子は無機化合物粒子が重合体層で被覆され
た構造であり、電子写真，歯科材料，インキ，イオン交
換樹脂，樹脂成型品，診断用試薬担体，カラムクロマト
グラフイー用担体，あるいは医薬投与用担体のように、
多くの分野において使用されている。特に最近では、生
化学分野への複合重合体粒子の進出がめざましく、生理
活性物質、特に酵素や免疫性物質を担持させた診断用試
薬、特にマイクロタイター法による診断用試薬としての
応用が試みられている。

従来の複合重合体粒子については、例えば高分子論文集
第40巻.697-702頁（1983年）に、ヒドロキシプロピルセ
ルロースを下限臨界共溶温度で飽和吸着させたシリカ粒
子を核に使用すると、スチレンによるシリカ粒子のカプ
セル化が促進することが述べられている。また、高分子
論文集第40巻259-266頁（1983年）には、硫酸バリウム
粉末の存在下にメタクリル酸メチルの重合を行い、生成
ポリマーにより硫酸バリウム粉末をカプセル化したこと
が述べられている。

しかし、これらの方法によると、一粒子の中に複数個の
無機化合物粒子を含んだ複合重合体粒子や無機化合物粒
子を全く含まない重合体のみの粒子が多数生成すること
が、本発明者らの実験により確認された。

ところで、診断用試薬の担体としては、粒度分布が狭
く、また、単粒子性の高い粒子を用いることが、分散安
定性や鋭敏性の上から好ましい。従つて、複合重合体粒
子を診断用試薬の担体として用いる場合には、元の無機
化合物粒子の粒度分布を狭く、単粒子性を高く調製す
る。しかしながら、このように狭い粒度分布や高い単粒
子性を有する無機化合物粒子を用いても、前記した方法
によつて重合を行つた場合には、重合後に得られた複合
重合体粒子の粒度分布や単粒子性は悪化してしまう。

このような複合重合体粒子に蛋白質，酵素，抗原，抗
体，バクテリア，ウイルス，細胞等の生理活性物質を吸
着させて診断用試薬に応用した場合、分散安定性が低い
ために取扱いが困難であり、また、粒度分布が広く凝集
粒子が多いために表面積が小さく吸着効率が低いという
欠点がある。

〔問題を解決するための手段〕

そこで、本発明者らは、診断用試薬の担体として好適に
使用し得る高い単粒子性を有する複合重合体粒子の開発
を続けてきた結果、本発明を完成するに至つたものであ
る。

すなわち、本発明は、無機化合物粒子が、個々に独立し
て重合体層で被覆されてなり、単粒子性が80％以上であ
る複合重合体粒子からなる診断用凝集反応試薬の担体で
ある。

本発明の複合重合体粒子は、無機化合物粒子が夫々独立
して重合体層で被覆されている。すなわち、１個の複合
重合体粒子は基本的に１個の無機化合物粒子を含有して
いることが重要である。２個以上の無機化合物粒子を含
有すると、複合重合体粒子の粒径及び粒度分布が大きく
なるだけでなく、凝集粒子が生じ易くなるので、診断用
試薬の担体として用いる場合には、固定化効率が低下し
好ましくない。

本発明で使用される無機化合物粒子は、公知のものが何
ら制限なく採用することができる。例えば、シリカ，ア
ルミナ，チタニア，ジルコニア，酸化第二鉄，四三酸化
鉄，酸化コバルト，酸化ニツケル等の周期律表第III
族，第IV族または第VIII族の金属または半金属の酸化
物；水酸化アルミニウム，水酸化第二鉄，水酸化クロム
等の水酸化物；臭化銀，塩化銀等のハロゲン化物；硫化
カドミウム等の硫化物；炭酸カルシウム，炭酸マグネシ
ウム等の炭酸塩；硫酸バリウム，硫酸ストロンチウム等
の硫酸塩等を何ら制限なく採用することができる。

本発明において、特に好適に用いられる無機化合物粒子
としては、シリカ，アルミナ，チタニア夫々を主な構成
成分とする無機酸化物か、あるいはシリカと結合可能な
周期律表第Ｉ族，第II族，第III族及び第IV族からなる
群より選ばれた少なくとも１群の金属酸化物及びシリカ
を主な構成成分とする無機酸化物を挙げることができ
る。

上記の各金属酸化物とシリカを主な構成成分とする無機
酸化物はシリカのシリコン原子と第Ｉ族，第II族，第II
I族または第IV族の金属酸化物、例えば酸化リチウム，
酸化ナトリウム，酸化カリウム，酸化マグネシウム，酸
化カルシウム，酸化ストロンチウム，酸化バリウム，酸
化アルミニウム，酸化チタニウム，酸化ジルコニウム，
酸化ハフニウム，酸化錫，酸化鉛等が酸素を仲介に結合
してたものである。そして上記第Ｉ族，第II族，第III
族及び第IV族の金属酸化物（以下単に一般式▲Ｍ¹ ₂▼O,
M²O，▲Ｍ³ ₂▼₃，M⁴O₂（ただし、M¹は第Ｉ族の金属，M²
は第II族の金属，M³は第III族の金属，M⁴は第IV族の金
属）で表示する場合もある）の構成比率は得られる無機
酸化物の形状に大きな影響を与える。勿論、▲Ｍ¹ ₂▼O,
M²O，▲Ｍ³ ₂▼₃，及びM⁴O₂の種類，製造方法，製造条件
等によつてその構成比率が形状に与える影響は変つてく
るが、一般に上記した粒子径の範囲でかつ球形状の無機
酸化物を得ようとする場合は、▲Ｍ¹ ₂▼O,M²O，▲Ｍ³ ₂
▼₃，及びM⁴O₂の合計の構成比率を１〜20モル％の範囲
とすることが好ましく、特に５〜15モル％の範囲の▲Ｍ
¹ ₂▼O,M²O，▲Ｍ³ ₂▼₃及びM⁴O₂の合計の構成比率を選択
するときは粒子径が揃つた真球に近いものとなる。

本発明で使用される無機化合物粒子は、生理食塩水また
は緩衝液に対して難溶性を示すものであることが好まし
い。

本発明に使用される無機化合物粒子及び複合重合体粒子
の平均粒径は、特に限定的ではないが、得られる複合重
合体粒子を後述する種々の用途に用いる場合には、0.05
〜200μｍ、好ましくは0.1〜100μｍの範囲から選択さ
れる。本発明で得られる複合重合体粒子を診断用試薬に
応用する場合には、平均粒径は0.5〜10μｍであること
が好ましい。

本発明の複合重合体粒子に生理活性物質を担持させる場
合は、生理活性物質の高い固定化効率を得るために無機
化合物粒子の粒度分布は狭いほどよい。粒度分布を粒子
径の分散値（平均粒径の標準偏差を平均粒径で除して10
0をかけた値、％表示）で示せば、一般に30％以下、さ
らに20％以下である無機化合物粒子が好ましい。同様
に、本発明の複合重合体粒子の粒径の分散値は30％以
下、さらに20％以下であることが好ましい。

さらに、無機化合物粒子の形状は、使用される無機化合
物の結晶構造，製法によつて異なり、多面体，柱体，両
錐体，球体等が存在し、これらすべて使用可能である
が、好ましくは球体、特に好ましくは真球体がよい。

本発明の複合重合体粒子の単粒子性は80％以上、好まし
くは90％以上である。単粒子性とは非凝集粒子、すなわ
ち、全粒子中に占める単一粒子の個数の割合である。無
機化合物の粒子は、合成時あるいは保存中に２個あるい
はそれ以上凝集し、凝集粒子をつくる。この凝集粒子が
増加すると単粒子性が悪化する。単粒子性は粒子径もし
くは粒子体積と粒子個数を同時に測定する装置を利用し
て測定される。例えばコールターカウンター社製モデル
ZD−１等により測定される。

前記した無機化合物粒子を被覆する重合体層は、下記式
（１） （ただし、R₁は水素原子，アルキル基またはカルボキシ
ル基若しくはその塩型基であり、R₂は水素原子，アルキ
ル基またはハロゲン原子であり、R₃はカルボキシル基，
スルホン酸基，スルホアリール基，スルホアルキル基若
しくはこれらの塩型基，カルバモイル基,N−ヒドロキシ
アルキルカルバモイル基，ヒドロキシアルコキシカルボ
ニル基，ヒドロキシアルキル基またはポリエチレングリ
コールエステル基である。） で示される親水性単量体単位を含んでいることが好まし
い。

前記一般式（１）中、R₁及びR₂で示されるアルキル基
は、その炭素数に特に制限されないが、無機化合物粒子
の被覆を良好に行うためには、炭素数が１〜４であるこ
とが好ましい。また、前記一般式（１）中、R₃で示され
るスルホアルキル基,N−ヒドロキシアルキルカルバモイ
ル基，ヒドロキシアルコキシカルボニル基，ヒドロキシ
アルキル基の各基の中に含まれるアルキル基またはアル
キレン基はその炭素数に特に制限されないが、上記と同
様の理由によつて炭素数は１〜４であることが好まし
い。本発明で好適なスルホアルキル基としては、スルホ
メチル基，スルホエチル基等が挙げられ、Ｎ−ヒドロキ
シアルキルカルバモイル基としては、Ｎ−ヒドロキシメ
チルカルバモイル基,N−ヒドロキシエチルカルバモイル
基等が挙げられ、ヒドロキシアルコキシカルボニル基と
しては、ヒドロキシメトキシカルボニル基，ヒドロキシ
エトキシカルボニル基，ジヒドロキシプロポキシカルボ
ニル基等が挙げられ、ヒドロキシアルキル基としては、
ヒドロキシメチル基，ヒドロキシエチル基等が挙げられ
る。

さらに、前記一般式（１）中、R₃で示されるスルホアリ
ール基としては、スルホフエニル基，スルホナフチル
基，スルホアントラシル基等が挙げられる。また、ポリ
エチレングリコールエステル基は、HOCH₂CH₂O_nCO−
（ただし、ｎは５〜50）で示される基である。

さらに、前記一般式（１）中、R₁及びR₃で示されるカル
ボキシル基，スルホン酸基及びスルホアリール基の塩型
基としては、これらの各基とナトリウムやカリウム等の
アルカリ金属とで構成された塩型基が好適である。

さらにまた、本発明の複合重合体粒子に免疫活性物質を
担持させた免疫診断用試薬として用いる場合には、複合
重合体粒子の表面への免疫活性物質の吸着が行いやすい
ように、複合重合体粒子の表面を疎水性としておくこと
が好ましい。このためには、複合重合体粒子の重合体層
が、下記式（２） （ただし、R₄は水素原子またはアルキル基であり、R₅は
ハロゲン原子，置換若しくは非置換のフエニル基，アル
コキシカルボニル基である。） で示される疎水性単量体単位を含んでいることが好まし
い。

前記一般式（２）中、R₄で示されるアルキル基は、その
炭素数に特に制限されないが、単量体の入手の容易さか
ら、通常は１〜４であることが好ましい。また、フエニ
ル基の置換基としては、単量体単位の疎水性を保持する
ものであれば特に制限されないが、一般にはハロゲン原
子，ハロアルキル基，アルキル基等を挙げることができ
る。

上記の疎水性単量体単位を含む場合には、前記した親水
性単量体単位との比率は、特に制限されるものではない
が、複合重合体粒子の表面を疎水性に保持するために
は、 さらに0.5〜10の範囲であることが好ましい。

本発明の複合重合体粒子の重合体層は、極めて薄いこ
と、一般には５〜500Åさらに10〜100Åの範囲であるこ
とが好ましい。このような薄い重合体層とすることによ
り、無機化合物粒子の粒径とほとんど変わらない粒径の
複合重合体粒子とすることができる。

また、本発明の複合重合体粒子の重合体層は、無機化合
物粒子を完全に被うことが好ましい。無機化合物粒子の
表面が一部露出していてもよいが、本発明の複合重合体
粒子を水中で使用した場合に無機化合物の溶出が低い方
がよい。例えば、本発明の複合重合体粒子を蒸留水中に
一定濃度分散させ、24時間放置後の蒸留水中に溶出した
無機化合物の濃度が1000ppm以下、特に100ppm以下であ
ることが好ましい。

前記した複合重合体粒子の製造方法としては、特に制限
されるものではないが、次の方法が好適に採用される。
すなわち、無機化合物粒子を分散させた水媒体中で、水
溶性ラジカル開始剤の存在下に水100重量部に対する溶
解度が10重量部以上の親水性単量体の重合を行う方法で
ある。

本発明で用いられる親水性単量体としては水100重量部
に対する溶解度が10重量部以上であれば特に制限され
ず、公知の単量体が用いられる。特に、水100重量部に
対する溶解度が15重量部以上である親水性単量体を用い
ることが好ましい。

本発明において、特に好適に用いられる親水性単量体
は、下記一般式（３）で示される単量体である。

（ただし、R₁は水素原子，アルキル基またはカルボキシ
ル基若しくはその塩型基であり、R₂は水素原子，アルキ
ル基またはハロゲン原子であり、R₃はカルボキシル基，
スルホン酸基，スルホアリール基，スルホアルキル基若
しくはこれらの塩型基，カルバモイル基,N−ヒドロキシ
アルキルカルバモイル基，ヒドロキシアルコキシカルボ
ニル基，ヒドロキシアルキル基またはポリエチレングリ
コールエステル基である。） 具体的には、次のような親水性単量体を例示することが
できる。

アクリル酸,1−クロルアクリル酸,2−メチルアクリル
酸，メタクリル酸，マレイン酸，スチレンスルホン酸,2
−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸，ア
クリルアミド,N−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリ
ルアミド,2−ヒドロキシエチルメタアクリレート，グリ
セロールモノメタクリレート，アリルアルコール，ポリ
エチレングリコールモノメタクリレート等である。

本発明において、無機化合物粒子の水媒体中における濃
度は特に限定的でなく、一般に0.1〜50重量％、好まし
くは0.5〜20重量％が好適に採用される。

本発明に用いる水溶性ラジカル開始剤は特に限定的でな
く、公知のものが使用される。例えば、過硫酸ナトリウ
ム，過硫酸カリウム，過硫酸アンモニウム等の過硫酸
塩，または過硫酸塩とチオ硫酸ナトリウム，チオ硫酸カ
リウム，チオ硫酸水素ナトリウム等のチオ硫酸化合物及
び銅イオン，鉄イオン等の分解促進剤を組み合わせたレ
ドツクス系触媒が好適に使用される。水溶性ラジカル開
始剤の濃度は重合温度，単量体濃度に依存するために限
定的でないが、0.05乃至50ミリモル/lの範囲が好適に採
用される。

また水溶性ラジカル開始剤は、親水性単量体重合時に全
量添加することが望ましい。

乳化剤もしくは安定剤の存在は、無機化合物粒子の分散
安定性を低下させ、凝集粒子をつくりやすく、さらに乳
化重合が無機化合物粒子表面外の水媒体中でおこり、被
覆度が低下する場合があるため、本発明においては乳化
剤や安定化剤を使用しない方が好ましい。

本発明において、重合温度は40℃〜80℃、より好ましく
は50℃〜70℃がよい。

本発明において、親水性単量体濃度は、少なくとも無機
化合物粒子の表面を重合体層が一層以上被うことが可能
であるような濃度であることが好ましい。その濃度は、
無機化合物粒子の濃度に依存するため一概に限定できな
いが、一般的には無機化合物粒子に対して0.01〜20重量
％、好ましくは0.1〜５重量％が好適に採用される。

本発明において、重合時間は0.5〜100時間、好ましくは
１〜50時間が好適に採用される。

さらに、本発明の複合重合体粒子に免疫活性物質を担持
させて免疫診断用試薬として用いる場合は、上記の親水
性単量体の重合に引き続いて、水100重量部に対する溶
解度が１重量部以下の疎水性単量体の重合を行うことが
好ましい。疎水性単量体としては、水100重量部に対す
る溶解度が１重量部以下であれば公知の単量体が特に制
限されず用い得る。本発明において、好適に用いられる
疎水性単量体は、下記式（４）で示されるものである。

（ただし、R₄は水素原子またはアルキル基であり、R₅は
ハロゲン原子，置換若しくは非置換のフエニル基または
アルコキシカルボニル基である。） このような疎水性単量体としては、例えばスチレン，ビ
ニルトルエン，クロロメチルスチレン，クロルスチレ
ン，塩化ビニル，臭化ビニル，メチルメタアクリレー
ト，エチルメタアクリレート，プロピルメタアクリレー
ト，エチルビニルエーテル，プロピルビニルエーテル等
が好適に用いられ、特に、スチレン，ビニルトルエン，
塩化ビニル，メチルメタアクリレートが好ましく採用さ
れる。

上記した疎水性単量体の重合は、親水性単量体の重合が
50％以上進行した後に行うことが好ましい。また、疎水
性単量体の濃度は特に制限されないが、一般には無機化
合物粒子に対して0.01〜10重量％、好ましくは0.05〜５
重量％の範囲から採用される。

疎水性単量体の重合は、前記した親水性単量体の重合と
同様に行うことができる。

本発明で複合重合体粒子に固定化できる生理活性物質
は、特に限定的でなく、公知のものが使用できる。例え
ば、酵素として西洋ワサビパーオキシダーゼ，グルコー
ス酸化酵素，スーパーオキサイドデイスムダーゼ，チト
クロームa,b,b₁,c,p450等；ホルモンとして下垂ホルモ
ン（Pituitary horrnones），インシユリン，クルカゴ
ン，サイロイドホルモン等；ハプテンとしてオヒアムカ
ロイド（モルフイネ），アンチピリン，バルビツール
酸；免疫活性物質として変性ガンマグロブリン，抗核因
子，ヒトアルブミン，抗ヒトアルブミン抗体，イムノグ
ロブリンＧ（IgG），抗ヒトIgG抗体，イムノグロブリン
Ａ（IgA），抗ヒトIgA抗体，イムノグロブリンＭ（Ig
M），抗ヒトIgM抗体，抗ヒトIgE抗体等があげられる。

本発明における複合重合体粒子の生理活性物質の固定化
は、単に粒子分散緩衝液中に生理活性物質を添加し吸着
により固定化する方法や、種々のカツプリング剤を用い
表面親水性官能基と共有結合により固定化する方法が採
用される。

〔効果〕

本発明の複合重合体粒子は、無機化合物粒子が夫々独立
して重合体層で被覆されておりしかも、凝集粒子が少な
く単粒子性の高いものである。このため、無機化合物粒
子の粒径，粒度分布及び単粒子性等の物理的特性が、そ
のまま複合重合体粒子に継承される。従つて無機化合物
粒子の粒径，粒度分布及び単粒子性を調製することによ
り、所望の粒径，粒度分布及び単粒子性を有する複合重
合体粒子を得ることができる。さらに、特定の粒径を有
し、粒度分布が狭く、かつ単粒子性が高い複合重合体粒
子は、生理活性物質の固定化能が高く、かつ保存性が良
好である。従つて、本発明の複合重合体粒子は、生理活
性物質の担体、特に診断用試薬の担体、カラムクロマト
グラフイー用担体、あるいは医薬投与用担体として広範
囲な応用が可能である。

以下に、複合重合体粒子の製造例、実施例及び比較例を
挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこ
れらの実施例に限定されるものではない。

なお、以下の製造例又は実施例における無機化合物粒子
及び複合重合体粒子の性状は、以下の方法により測定し
た。

（１）平均粒径 平均粒径は100個以上の粒子を透過型電子顕微鏡で観察
して求めた。また、粒度分布は平均粒径の標準偏差を平
均粒径で除して100をかけた値である分数値（％）で表
示した。

（２）単粒子性 コールターカウンター社製モデルZD−１を用いて測定し
た。

なお、単粒子性を示すグラフ（第１図）中、縦軸は、メ
インピークを999として表示した粒子の相対的な存在割
合を示す。

（３）重合体層の厚み 光電子分光測定によつて求めた。具体的には、製造例1,
2,6,7,9,10,11,12,16,17,19,20については283〜291eVの
炭素の吸収と155eVのケイ素の吸収の比、製造例5,15に
ついては炭素と124eVのアルミニウムの吸収の比、製造
例3,13については炭素と570eVのチタンの吸収の比、製
造例４については炭素と431eVのジルコニウムの吸収の
比よりÅ単位で求めた。

（４）溶出量 各々の複合重合体粒子を蒸留水中に10重量％となるよう
に分散し、この分散液1mlを取り、24時間放置後、上澄
液中の溶出した無機化合物に基づくイオンを原子吸光法
より定量した。

（５）重合体層の組成 光電子分光測定による283eV〜291eVの炭素の吸収に基づ
いて求めた。製造例11,20についてはフエニル基に由来
する吸収とエステル基に由来する吸収の比、製造例12に
ついてはスルホン酸基に由来する吸収とエステル基の吸
収の比、製造例13、17についてはアミド基とフエニル基
の吸収の比、製造例14についてはカルボン酸基と塩素の
吸収比、製造例15はカルボン酸基とフエニル基の吸収の
比、製造例16についてはスルホン酸基とエーテル基の吸
収の比、実施例21についてはアルキル基とフエニル基の
吸収の比、実施例23についてはスルホン酸基とフエニル
基の吸収の比からそれぞれ求めた。

複合重合体粒子の製造例１ （１）シリカ粒子の合成 攪拌機付きガラス製フラスコ中にメタノール2800cc,ア
ンモニア水（25重量％）616cc,水酸化ナトリウム水溶液
（５モル/l）21ccを加え10℃に保つた後に、テトラエチ
ルシリケートのメタノール溶液（22％）1428ccを攪拌し
ながら25.5cc/hrの滴下速度で添加して反応した。その
後シリカ粒子を大量のメタノール中でデカンテーシヨン
を繰り返して精製した。得られたシリカ粒子の平均粒
径，分散値及び単粒子性は第１表に示したとおりであ
る。

得られたシリカ粒子の単粒子性を示すグラフ、すなわ
ち、１個の粒子の体積（横軸）と粒子数の割合（縦軸）
との関係を示すグラフを第１図（ａ）に、また、電子顕
微鏡写真を第２図に示した。

得られたシリカ粒子を沈降させ、上澄をのぞき、蒸留水
を加え、分散させ、さらに沈降させる操作を２回繰り返
し、粒子を洗浄した後、分散濃度10wt％になるように蒸
留水を添加し、シリカ分散液を得た。

（２）親水性単量体の重合 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、
（１）で得られたシリカ分散液100mlを加えて40℃に保
ち、窒素雰囲気下、攪拌下に67ミリモルのグリセロール
メタクリレートと過硫酸カリウムを2.9ミリモル/lとな
るように添加した。次いで40℃に保温し攪拌下第１表に
示す条件で重合を行つた。重合後、遠心分離で上澄を捨
て、沈澱した複合重合体粒子を蒸留水に再分散させた。
この操作を６回繰り返し、沈澱を洗浄し、精製した複合
重合体粒子を得た。得られた粒子の性状を第１表に示し
た。また、単粒子性を示すグラフを第１図（ｂ）に、電
子顕微鏡写真を第３図に示した。

複合重合体粒子の製造例２〜10 複合重合体粒子の製造例１と同様にして、第１表に示し
た種々の無機化合物粒子を分散させた水媒体中で第１表
に示した水溶性ラジカル開始剤と親水性単量体を用いて
重合を行い、その後、得られた複合重合体粒子を洗浄、
精製した。

得られた複合重合体粒子の性状を第１表に示した。

実施例１ 製造例2,6,7,8,9,10で得られた複合重合体粒子を1/15M
リン酸緩衝液（PH7.2）で１重量％濃度となるように分
散した。また、市販の西洋ワサビパーオキシダーゼ（和
光純薬製）（以下、単にHRPともいう）を1/15Mリン酸緩
衝液に10mg/mlとなるように溶解した。次いで、複合重
合体粒子の分散液5mlと、HRP溶液5mlを混合し、室温で
２時間、５分毎に攪拌しながら固定化した。固定化後、
遠心分離して上澄を除き、沈澱を上記リン酸緩衝液5ml
に再分散させ、再度遠心分離し、リン酸緩衝液2mlに再
分散し、HRPを固定化した複合重合体粒子からなる診断
用試薬を得た。得られた診断用試薬の粒径の分散値及び
単粒子性を第２表に示した。

各診断用試薬の分散液0.5mlを取つて遠心分離し、沈澱
を乾燥させた後、微量窒素分析機を用いて担体表面上の
窒素量を求め、それをHRPの量に換算して固定化量を求
め、第２表に併記した。

次いで、診断用試薬の分散液1mlにグライアコール液及
びH₂O₂液を加え、436nmの吸光度より活性を求め、上記
のHRPの固定化量から比活性を求めた。次いで、固定化
前のHRPの比活性を同様に求め、固定化前のHRP比活性を
100％とした時の固定化後の比活性を第２表に示した。

実施例２ 製造例3,4で得られた複合重合体粒子を0.1Mホウ酸緩衝
液（PH8.0）に１％濃度となるように分散した。この分
散液10mlに１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノ
エチル）−カルボジイミド20mgを加え、さらに2mg/mlに
溶解した熱変性ヒトIgGを加え、４℃で振とうしながら1
8時間固定化した。固定化後遠心分離し、上澄を除き、
沈澱を上記ホウ酸緩衝液に再分散した。この操作を３回
繰り返し、最後に0.01％牛血清アルブミン（以下、単に
BSAともいう）及び0.1％界面活性剤を含む1/15Mリン酸
緩衝液に再分散し、熱変性IgGを固定化した複合重合体
粒子からなる診断用試薬を得た。診断用試薬の単粒子
性，分散値及び熱変性ヒトIgGの固定化量を第２表に示
した。次いで、マイクロタイタープレート上にリウマチ
患者のプール血清を20倍希釈から倍数希釈し、熱変性Ig
Gを固定化した診断用試薬の分散液を添加し、攪拌後そ
の凝集像を判定した。それぞれの診断用試薬の鋭敏性及
び判定時間を第２表に示した。

実施例３ 製造例１で得られた複合重合体粒子5gを50mlの蒸留水に
分散させた。次いで200mgの過ヨウ素酸ナトリウムを含
む酢酸溶液を加え、室温で24時間反応後、上澄のPHが中
性になるまで遠心分離により洗浄し、表面にホルミル基
を導入した粒子を得た。この表面にホルミル基を導入し
た粒子5gを50mlのリン酸緩衝液（PH7.2）に分散し、100
mg/ml濃度のヒト絨毛ゴナドトロピン（以下単にHCGとも
いう）10mlを加え、４℃で振とうしながら18時間固定化
した。固定化後の粒子を遠心分離で洗浄し、ヒト絨毛ゴ
ナドトロピンを固定化した診断用試薬を得た。この診断
用試薬の粒径の分散値，単粒子性及びヒト絨毛ゴナドト
ロピンの固定化量を第２表に示した。

この診断用試薬をカラムにつめ、ウサギにHCGを免疫し
て得られた抗HCG血清の50％飽和硫安画分を1/15Mリン酸
緩衝液で溶解し、流したところ、極めて高純度の抗HCG
抗体が得られた。

複合重合体粒子の製造例11 製造例１の（１）で得られたシリカ分散液100mlを攪拌
機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に添加して40
℃に保ち、窒素雰囲気下に攪拌しながら67ミリモルのグ
リセロールメタクリレートと過硫酸カリウムを2.9ミリ
モル/lとなるように添加した。次いで、40℃に保温し、
攪拌しながら第３表に示す条件で第１段目重合を行つ
た。その後、70℃に昇温を行い、70℃に加温したスチレ
ン90ミリモルを滴々添加した後、所定時間攪拌下に第２
段目重合を行つた。重合後、遠心分離で上澄を捨て、沈
澱した複合重合体粒子を蒸留水に再分散した。この操作
を６回繰り返し沈澱を洗浄し、精製した複合重合体粒子
を得た。得られた粒子の性状を第３表に示す。また、単
粒子性を示すグラフを第１図（ｃ）に示した。さらに、
得られた複合重合体粒子の光電子分光測定結果を第５図
（Ａ）及び（Ｂ）に示した。第５図（Ｂ）は、第５図
（Ａ）の炭素のピークの部分を拡大したものである。

複合重合体粒子の製造例12〜20 製造例11と同様にして第３表に示した種々の無機化合物
粒子，親水性単量体及び疎水性単量体を用いて第１段目
重合及び第２段目重合を行つた。得られた複合重合体粒
子の性状を第３表に示した。

実施例４〜13 （１）熱変性ヒトIgGを固定化した複合重合体粒子の調
製 ヒトコーンFII画分（シグマ社製）を1/150Mリン酸緩衝
液（PH7.4）に10mg/mlになるよう溶解し、56℃で２時間
加熱することにより熱変性ヒトIgGを得た。得られた熱
変性ヒトIgGをリン酸緩衝液で40倍に希釈したものを原
液とし、倍数希釈法により希釈した。この熱変性ヒトIg
Gの希釈液1mlと、製造例11〜20で得られたそれぞれの複
合重合体粒子をリン酸緩衝液で１重量％に希釈した分散
液1mlとを攪拌しながら室温で１時間混合した。次い
で、遠心分離して固型分を0.1％Tween80及び0.5％牛血
清アルブミン（BSA）を含むリン酸緩衝液2mlに再分散し
た。かくして得られた熱変性ヒトIgGを固定化した複合
重合体粒子の単粒子性と粒径の分散値を第４表に示す。

（２）抗原・抗体反応 リウマチ患者血清のプール血清をリン酸緩衝液で20倍に
希釈したものを原液とし、倍数希釈法によりリウマチ患
者血清をリン酸緩衝液で希釈して、リウマチ患者血清希
釈液を調製する。抗原・抗体反応を行うためにマイクロ
タイタープレートを用意し、リウマチ患者血清希釈液を
各ホールに25μｌ加える。次いで熱変性ヒトIgG固定化
した複合重合体粒子の分散液を各ホールに25μｌ加えた
後、５分間攪拌し静置した。次いで抗原・抗体反応によ
る凝集状態を観察し、熱変性ヒトIgGを固定化した複合
重合体粒子の性能を評価した。反応開始後の凝集状態を
第６図に示す。粒子がスポツト状に集まり外周縁が均等
でなめらかな円形を示す場合（−）、粒子が小さなリン
グを形成し、外周縁が均等でなめらかなもの（±）、粒
子リングが明らかに大きく、リング内に凝集粒子が膜状
に広がつているもの（＋）、凝集が均一に起こり、凝集
粒子が底全体に膜状に広がつているもの（＋＋）と判定
した。図中Ｃは抗原もしくは抗体を全く含まないことを
示す。第６図の明らかに（＋）像が認められたホールに
おけるリウマチ患者血清希釈液の最高希釈倍数をもつ
て、鋭敏性を評価した。迅速性は明らかな陰性（−）像
が現われ、変化しなくなる時間を尺度とした。また非特
異凝集反応は、Ｃ部分に（±），（＋），（＋＋）のい
ずれか凝集状態が認められたホールの個数を示した。そ
れぞれの熱変性ヒトIgGを固定化した診断用試薬の鋭敏
性，迅速性，及び96個中の非特異凝集の個数を第４表に
示した。

実施例14〜23 （１）アルフアーフエトプロテイン抗体（AFP抗体と略
す）を固定化した複合重合体粒子の調製 ヤギの産生したアルフアーフエトプロテイン（以下、AF
Pともいう）の抗体をアフイニテイクロマトにより精製
して得た精製AFP抗体を1mg/ml濃度に含有するリン酸緩
衝液を調製した後、倍数希釈法により希釈してAFP抗体
希釈液を調製した。このAFP抗体希釈液1mlと、製造例11
〜20で得られたそれぞれの複合重合体粒子をリン酸緩衝
液で１重量％に希釈した分散液1mlとを攪拌しながら室
温で１時間混合した。次いで遠心分離し、固型分を0.25
％Tween80及び0.25％BSAを含むリン酸緩衝液2mlに再分
散した。かくして得られたAFP抗体を固定化した複合重
合体粒子の単粒子性と粒径の分散値を第５表に示す。次
いで、かくして得られたAFP抗体を固定化した複合重合
体粒子と患者血清のプール血清との抗原抗体反応を実施
例24の（２）と同様の方法で調べた。それぞれのAFP抗
体を固定化した複合重合体粒子の鋭敏性，迅速性及び96
個中の非特異凝集の個数を第５表に示した。

比較例１ 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、製造
例１（１）で得られたシリカ分散液100mlを加えて50℃
に保ち、窒素雰囲気下、攪拌しながらメチルメタクリレ
ートを67ミリモルと過硫酸カリウムを2.9ミリモル/lと
なるように添加して４時間重合した。得られた粒子を製
造例１（２）と同様に精製した。得られた粒子の粒子径
は1.32μm,粒子径の分散値は53.9％，単粒子性は50.1％
であつた。また、単粒子性を示すグラフを第１図（ｄ）
に、また電子顕微鏡写真を第４図に示した。このよう
に、単量体として水100重量部に対する溶解度が10重量
部未満のメチルメタクリレートを用いた場合には、元の
無機化合物粒子の単粒子性が良好であつても重合によつ
て凝集粒子が増加するために単粒子性の良好な複合重合
体粒子は得られない。

この複合重合体粒子に、実施例４及び14と同様に熱変性
ヒトIgG及びアルフアーフエトプロテイン抗体を固定化
した。得られた診断用試薬の鋭敏性，迅速性及び96個中
の非特異凝集の数を第４表及び第５表に併記した。

比較例２ 製造例１（１）で得られたシリカ粒子にヒドロキシプロ
ピルセルロース（以下、HPCともいう）を10重量％濃度
になるように添加し攪拌しながら45℃に保温し、４時間
吸着した。吸着後遠心分離を６回繰り返し、未吸着のHP
Cを除去し、10重量％濃度になるように蒸留水に分散し
た。この分散液100mlを攪拌機付きガラス製フラスコに
取り、70℃に加温し、窒素置換後、スチレン96ミリモル
と過硫酸カリウム2.9ミリモル/lを加え16時間重合し
た。重合後、製造例１（２）と同様に精製し、複合重合
体粒子を得た。得られた複合重合体粒子の分散値は56
％，粒子径は2.65μm,単粒子性は42.3％であつた。

この複合重合体粒子に実施例４と同様に熱変性ヒトIgG
を固定化し、抗原抗体反応による凝集像を判定したとこ
ろ96穴すべてが非特異凝集となつた。また、実施例14と
同様にAFP抗体を固定化したところ、96穴すべてが非特
異凝集であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は無機化合物粒子及び複合重合体粒子の単粒子性
を示し、第２図，第３図及び第４図は、夫々製造例１で
得られた無機化合物粒子，複合重合体粒子，及び比較例
１で得られた複合重合体粒子の電子顕微鏡写真である。
第５図（Ａ）及び（Ｂ）は製造例11で得られた複合重合
体粒子の光電子分光装置による測定結果を示し、第６図
は実施例４で得られた診断用試薬の凝集像を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/551 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｚ 6807−4Ｂ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】無機化合物粒子が、個々に独立して重合体
   層で被覆されてなり、単粒子性が80％以上である複合重
   合体粒子からなる診断用凝集反応試薬の担体。