JPS63112604A - 活性化粒子担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皇呈上尖肌里立団 本発明は、重合体粒子がその表面にジスルフィド結合を
有する活性化ラテックスのための重合体粒子からなる担
体に関し、詳しくは、ジスルフィド結合交換反応によっ
て、ジスルフィド結合又はチオール基を有する酵素や抗
体等の生化学反応を行なう生理活性なタンパク質をその
表面に容易に固定化することができると共に、分散安定
性にすぐれる活性化ラテックスのための重合体粒子から
なる担体に関する。

皿來立流上 酵素や抗体等の生理活性タンパク質は、近年、その特異
且つ選択的な生化学的反応を利用して、種々の分野で利
用されている。その代表例として、酵素を水不溶性の担
体に固定化させてなる固定化酵素や、免疫活性物質を固
定化させてなる免疫学的診断試薬が知られている。

このように、酵素や抗体等の生理活性タンパク質を共有
結合によって固定化するための担体粒子として、従来、
その表面にカルボキシル基、アミノ基、水酸基等の官能
基を導入した粒子が知られている。このような担体粒子
にタンパク質を固定化する方法として、例えば、担体粒
子表面又はタンパク質中のカルボキシル基をカルボジイ
ミドにて活性化した後、これをタンパク質又は担体粒子
　−表面のアミノ基と反応させて、ペプチド結合を形成
させる方法や、或いは担体粒子表面の水酸基を臭化シア
ンにてイミドカルボナール誘導体に変換した後、これを
タンパク質の有するアミノ基と反応させる方法等が知ら
れている。しかし、かかる方法によれば、タンパク質の
有するカルボキシル基やアミノ基は、何らの選択性なし
に固定化の反応に関与するので、例えば、酵素の基質に
対する活性部位や抗体の抗原結合部位の高次構造が破壊
されることがあり、その結果、固定化された生理活性タ
ンパク質の活性が低下する。

また、酵素や抗体を固定化するための別の一つの方法と
して、従来、ジスルフィド結合交換反応を用いる方法が
知られている。この方法によるときは、タンパク質は、
それが有するジスルフィド結合又はチオール基の反応に
よってのみ担体に固定化されるので、上記したような酵
素や抗体における高次構造が破壊されることがない。

従来、このようなジスルフィド結合又はこのジスルフィ
ド結合が還元された形態であるチオール基を粒子表面に
有する粒子担体として、例えば、アガロース誘導体に次
の基 Ｃｏｏ）１ −ＯＣＯＮＨＣＨ（ＣＨｇ）ｚｃＯＮＨｃＨｃＴｏｓＨ
Ｃ０ＮＨＣＨ２Ｃ０ＯＨ を結合した活性化チオールセファロース４Ｂ（ファーマ
シア・ファイン・ケミカルズ社製）や、アクリルアミド
ゲルに次の基 −ＣＨｚＣＨＣＯＮＨＣＨＣＨｚＳＨ ＯＯＨ を結合したエンザクリル（Ｅｎｚａｃｒｙｌ）・ポリチ
オール（コツホ−ライト・ラボラトリーズ社製）、ガラ
スピーズにチオール基を含む置換基を結合したもの等が
知られている。しかしながら、上記したような担体粒子
は、主として、アフイニテイ・クロマトグラフィー用の
充填剤として用いられるものであるので、元来、粒子は
水性媒体中で分散安定性をもたない。

従って、上記のような従来の担体粒子は、分散安定性が
要求される用途には用いることが困難である。かかる分
散安定性が要求される用途として、例えば、粒子に抗体
等を固定化した後、血清、尿等の検体と混合して、抗原
抗体反応を起こさせ、その凝集の程度から診断を行なう
診断用検査薬や、粒子に酵素を固定化した後、水性媒体
中に分散させて、基質と反応させる酵素反応等を挙げる
ことができる。

他方、２種以上の単量体成分を選択して乳化共重合を行
なう等の方法によって、分散安定性にすぐれる重合体粒
子を得ることができることは既に知られている。しかし
、適当な単量体が見当たらないところから、表面にジス
ルフィド結合やチオール基を有する重合体粒子は、直接
、乳化重合等の方法によって製造することは困難である
。また、乳化重合等によって得られた重合体粒子に後反
応を施すことによって、重合体粒子にジスルフィド結合
やチオール基を導入することができても、−般には、こ
のようにして得られる重合体粒子は、その分散安定性が
著しく損なわれて、長期保存安定性に劣ることが多い。

更に、仮にジスルフィド結合又はチオール基を導入した
後の重合体粒子がすぐれた分散安定性を有していても、
一般には、酵素や抗体等を固定化した後は、その分散安
定性が損なわれる場合が多い。他方、一般に、チオール
基を表面にもつ重合体粒子は、水性媒体中で保存される
間にチオール基が酸化される結果、保存期間が長期間に
わたる場合は、チオール基数が減少し、或いは遂には消
滅する。

日が解゛　しようとする間　壱 本発明は、従来のジスルフィド結合又はチオール基を粒
子表面に有する粒子担体及びその製造における問題を解
決するためになされたものであって、表面にジスルフィ
ド結合を有し、且つ、分散安定性にすぐれる重合体粒子
からなる活性化粒子担体を提供することを目的とする。

間　点を”°するための手段 本発明による活性化粒子担体は、表面にカルボキシル基
を有する粒径０．０３〜３μｍの重合体粒子に、一般式 ％式％（１） （式中、Ｒ＠及びＲｂはそれぞれ独立に炭素数１〜６の
アルキレン基を示し、このアルキレン基は置換基として
カルボキシル基を有していてもよく、Ｙは水素、アミノ
基又は水酸基を示す。）で表わされるアミノジスルフィ
ド化合物が上記カルボキシル基にアミド結合によって結
合されていることを特徴とする。

従って、本発明による活性化粒子担体は、粒子を構成す
る重合体残基をＰで表わすとき、Ｐ−ＣＯＮＨ−Ｒ”−
５−５−Ｒｈ−Ｙ　　　　　　（ｎ　）（式中、Ｒ”、
　Ｒゝ及びＹは前記と同じである。）で表わされる。

かかる活性化粒子担体は、本発明によれば、カルボキシ
ル基を有する粒径０．０３〜３μｍの水分散型重合体粒
子に一般式 ％式％（） （式中、Ｒ＠、　Ｒ’及びＹは前記と同じである。）で
表わされる水溶性アミノジスルフィド化合物を水溶性脱
水縮合剤の存在下に反応させ、重合体粒子が表面に有す
るカルボキシル基とアミノジスルフィド化合物の有する
アミノ結合にてアミド結合を形成させることによって得
ることができる。

上記水溶性アミノジスルフィド化合物としては、例えば
、式 ％式％ で表わされるシスタミン、式 Ｎｌ２−ＣＯＣＨ２−５−Ｓ−ＣＨ２Ｃｌ−Ｎｌ２で表
わされるシスチン、式 で表わされるホモシスチン、式 ＨＯＯＣＣＨ３ＣＨ３ で表わされるペニシラミンジスルフィド、式で表わされ
るペニシラミンシスティンジスルフィド等を挙げること
ができるが、特に、水への溶解度が大きいシスタミンが
好ましく用いられる。

重合体粒子にアミノジスルフィド化合物をアミド結合に
て結合させるには、水性媒体中で重合体粒子とアミノジ
スルフィド化合物とを水溶性脱水縮合剤の存在下に反応
させる。ここに、上記水溶性脱水縮合剤としては、例え
ば、１−エチル−３−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）プロ
ピルカルボジイミド、ｌ−シクロへキシル−３−（２−
モルホリノエチル）カルボジイミド−メソ−ｐ−）ルエ
ンスルホネート等を挙げることができる。このような水
溶性カルボジイミドを用いて、ラテックス粒子にアミノ
ジスルフィド化合物を結合させるには、従来より知られ
ている通常の方法及び条件によることができる。

このようにして得られるジスルフィド結合を有する担体
粒子は、そのジスルフィド結合を適宜の還元剤にて還元
することによってチオール基とすることができ、かくし
て、チオール基を有する担体粒子を得ることができる。

担体粒子上のジスルフィド結合を還元するには、特に、
限定されるものではないが、例えば、担体粒子のラテッ
クス中に、例えば、２−メルカプトエチルアミン、２−
メルカプトエタノール、ジチオスライドール等のような
還元剤を加え、混合して、放置した後、遠心分離し、上
澄み液を捨て、生成した沈殿に水性媒体を加えて、これ
を再分散させ、この後、遠心分離と再分散とを繰り返せ
ばよい。

従って、本発明による活性化粒子担体によれば、これら
ジスルフィド結合又はチオール基を利用して、ジスルフ
ィド結合又はチオール基を有する生理活性タンパク質を
ジスルフィド結合交換反応にて固定化することができる
。

本発明においては、カルボキシル基を有する重合体粒子
にアミノジスルフィド化合物を結合させたとき、得られ
る粒子担体が水性媒体中にて分散安定性にすぐれるよう
に、重合体粒子は、当初、即ち、アミノジスルフィド化
合物が結合される前は、その表面に０．１〜６０μｍｏ
ｌ／ｍ”のカルボキシル基数を有することが好ましく、
特に好ましくは、０．７〜３０μｍｏｌ／ｍ”の範囲で
ある。重合体粒子の有するカルボキシル基数が余りに少
ないときは、分散安定性に劣ると共に、十分な量のアミ
ノジスルフィド化合物を粒子に固定化することができず
、延いては、得られる活性化粒子担体に十分な量の生理
活性なタンパク質を固定化することができない。他方、
重合体粒子の有するカルボ千シル基数が余りに多いとき
は、水性媒体中にて凝集し、或いは生理活性タンパク質
を固定化したときに、その生化学的反応を阻害するおそ
れがあるからである。

更に、本発明においては、以上のようにして、カルボキ
シル基を有する重合体粒子にアミノジスルフィド化合物
を結合させた後、得られる粒子担体が水性媒体中で分散
安定性にすぐれるように、粒子担体はその表面に尚、カ
ルボキシル基を有することが必要である。本発明におい
ては、重合体粒子にアミノジスルフィド化合物を結合さ
せて得られる活性化粒子担体の有するジスルフィド結合
数は、上記当初のカルボキシル基数の１〜２０％である
ことが好ましい。粒子担体におけるジスルフィド結合の
数が重合体粒子の有する当初のカルボキシル基数の２０
％を越えるときは、得られる粒子担体が水性媒体中での
分散安定性において著しく劣り、例えば、このような粒
子担体に酵素を固定化した場合、粒子が凝集して、酵素
活性が低下したり、或いは抗体を固定化してラテックス
診断試薬とした場合に、自然凝集が生じて、正確な診断
が困難となるからである。特に、本発明においては、活
性化粒子担体の有するジスルフィド結合数は、重合体粒
子の有する当初のカルボキシル基数の１０％以下である
。他方、活性化粒子担体の有するジスルフィド結合数が
前記当初のカルボキシル基数の１％よりも少ないときは
、活性化粒子担体としての機能に乏しく、生理活性タン
パク質を十分な量にて担体粒子に固定化することができ
ない。

本発明において、重合体粒子は、その平均粒径が０．０
３〜３．ｃｒｍ、好ましくは０．０５〜１．５μｍであ
る。粒径が小さすぎると、例えば、これを担体とする固
定化酵素を水中に分散させて酵素反応を行なわせた後の
回収が困難となり、一方、粒径が大きすぎると、単位体
積当りの粒子表面積が小さくなり、例えば、酵素の固定
化量が少なくなると共に、水中に分散させるのが困難と
なるので好ましくない。

また、重合体粒子の比重は０．９〜１．５の範囲にある
ことが好ましい。比重が０．９よりも小さいときは、例
えば、酵素反応において、粒子が分散液媒体表面に浮遊
し、分散安定性に劣るようになり、また、酵素活性も低
下し、一方、１．５よりも大きいときは、粒子が分散液
媒体中に沈降、凝集し、粒子の自由度が失われて、例え
ば、酵素活性が低下するからである。

本発明においては、重合体粒子は、上記した条件を満た
すものであれば、特に限定されるものではないが、しか
し、以下に述べるように、特に、アクリル酸誘導体とア
クリル酸フルオロアルキルエステル誘導体とを含む単量
体混合物を乳化共重合して得られる重合体粒子が好まし
く用いられる。

かかる重合体粒子は、 （ａ）一般式 ％式％ （但し、Ｒ′は水素、低級アルキル基又はカルボキシル
基を示し、Ｒ２は水素又は低級アルキル基を示し、Ｒ１
が水素又は低級アルキル基のときは、Ｒ２はカルボ低級
アルコキシ基であってもよい。）で表わされるアクリル
酸誘導体０．１〜２０重量％、及び （１））一般式 ％式％ （但し、Ｒ３は水素又は低級アルキル基を示し、Ｒ４は −（ＣＨｚ）ｍ−又は−（ＣＨｚ）　ｘ　−ＣＨ−（Ｃ
１ｈ）　ｙ　−ＯＲ’ （但し、ｍはＯ〜１２の整数を示し、ｇ＋ｙ＝ｍ−１で
あり、Ｒ８は水素又はアセチル基を示す。）を示し、Ａ
はそれぞれ独立に水素、フッ素又はＣＦ３を示し、ｎは
０〜１２の整数を示す。）で表わされるアクリル酸フル
オロアルキルエステル誘導体と、上記アクリル酸誘導体
を除くラジカル共重合性ビニル単量体との混合物であっ
て、この混合物に基づいて上記アクリル酸フルオロアル
キルエステル誘導体が１〜１００重景％で重量混合物９
９．９〜８０重量％ からなる単量体混合物を水性媒体中で乳化共重合させて
得ることができる。

上記アクリル酸誘導体としては、例えば、アクリル酸、
メタクリル酸、イタコン酸、クロトン酸、マレイン酸、
フマル酸、モノアルキルマレイン酸、モノアルキルフマ
ル酸、モノアルキルイタコン酸等を好ましい例として挙
げることができるが、特に、アクリル酸、メタクリル酸
及びイタコン酸の１種又は２種以上の混合物が好ましく
用いられる。

また、上記アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体
は、好ましくは、一般式 ％式％（１） （但し、Ｒ３、Ｒ’、　ｍ及びｎは前記と同じである。

）で表わされ、従って、特に、好ましく用いることがで
きるアクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体の具体
例として、例えば、 Ｃ）Ｉｚ＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯＣ）Ｉｔｃｈ　　　　　
　　　　　　（５）ＣＨｚ−Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯＣＨｚ
（ＣｈｈＨ（６）ＣＨｚ＝Ｃ（ＣＨｚ）ＣＯＯＣＨｚ（
ＣＦｘ）Ｊ　　　　　　　　（７）ＣＨｚ＝Ｃ（ＣＨ３
）Ｃｏｏ（ＣＨｚ）　ｚ（ＣＦｚ）ａＦ　　　　　　　
＋ｓ）等を例示することができる。

前記アクリル酸エステル誘導体は、乳化共重合時の重合
安定性にすぐれ、また、水性媒体中での分散安定性にす
ぐれる水分散型高分子重合体粒子を得るためのみならず
、得られる重合体粒子に前記アミノジスルフィド化合物
をアミド結合にて拮合し、固定化するためのカルボキシ
ル基を付与するために必要な単量体であり、単量体組成
において、少なくとも０．１重量％を必要とする。しか
し、過多に共重合単量体成分として用いるときは、却っ
て重合安定性と、得られる重合体粒子の分散安定性を損
なうので、２０重量％以下の範囲で用いる。特に好まし
い範囲は、０．５〜１０重憧％である。

また、前記アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体
は、得られる重合体粒子への前記アミノジスルフィド化
合物の固定化時や分散系において、重合体粒子が水性媒
体中で安定な分散性を保つ効果を有する。特に、重合体
粒子において、アクリル酸フルオロアルキルエステル誘
導体単量体成分は、塩や有機質物質を含む水溶液中にお
いて、例えば、重合体粒子への有害物質の吸着や被覆を
防止する効果を有する。このような効果を有効に得るた
めには、アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体は
、単量体組成において９９．９〜８０重量％、好ましく
は９９．５〜９０重景％重量囲で用いられる。

しかも、かかる単量体成分の所定の割合の混合物を用い
ることにより、特に乳化剤を用いることな（、凝集物の
発生なしに安定に乳化共重合させ得て、粒径が均一であ
り、且つ、水性媒体中で分散状態が安定に保持される水
分散型高分子重合体粒子を得ることができる。

前記アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体の一部
は、前記アクリル酸誘導体を除くラジカル共重合性ビニ
ル単量体に置換されてもよい。

かかるラジカル共重合性ビニル単量体としては、例えば
、それ自体の単独重合体が水不溶性である疎水性単量体
を挙げることができる、具体例として、エチレン、プロ
ピレン、塩化ビニル等のα−オレフィン又はそのハロゲ
ン置換体、スチレン、メチルスチレン、エチルスチレン
、ビニルトルエン、クロロスチレン等のアルケニルベン
ゼン、ブタジェン、イソプレン等の共役ジオレフィン、
（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクリル酸メチル
、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロ
ピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸
へキシル、（メタ）アクリル酸オクチル等の（メタ）ア
クリル酸エステル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等
を挙げることができる。上記したラジカル共重合性ビニ
ル単量体のうちでは、特に、メタクリル酸メチルやメタ
クリル酸イソブチル等の（メタ）アクリル酸エステルが
好ましく用いられる。このような単量体は、得られる重
合体粒子の比重を調整し、又は前記したアクリル酸エス
テル誘導体とアクリル酸フルオロアルキルエステル誘導
体との共重合反応性を調整するために好適に用いられる
。

また、必要に応じて、それ自体の単独重合体が水溶性又
は水膨潤性である親水性単量体も用いることができる。

かかる単量体の具体例として、例えば、ヒドロキシメチ
ル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）ア
クリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート
等のヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート、（メタ
）アクリルアミド、グリシジル（メタ）アクリレート等
を挙げることができる。

しかし、上記したラジカル共重合性ビニル単量体は、余
りに多量に使用すると、重合安定性を損じるのみならず
、得られる重合体粒子が水分散安定性に劣るようになる
ので、本発明においては、アクリル酸フルオロアルキル
エステル誘導体と上記ラジカル共重合性ビニル単量体と
の混合物において、アクリル酸フルオロアルキルエステ
ル誘導体を少なくとも１重量％用いることが必要である
。

即ち、本発明においては、上記ラジカル共重合性ビニル
単量体は、このラジカル共重合性ビニル単量体とアクリ
ル酸フルオロアルキルエステル誘導体との混合物の重量
に基づいて、９９１ｉ量％以下、好ましくは９７重量％
以下の範囲で用いられる。有効量の下限は特に制限され
ず、目的に応じて適宜に選ばれるが、通常、アクリル酸
フルオロアルキルエステル誘導体とこのアクリル酸アル
キルエステル誘導体の混合物の重量に基づいて１重量％
以上である。

更に、重合体粒子の製造において、単量体成分として、
内部架橋用官能性単量体を用いることができる。この内
部架橋用多官能性単量体は、重合体に架橋構造を導入す
るので、存在する場合には好ましくない水溶性重合体の
生成を抑制すると共に、得られる重合体粒子のガラス転
移温度を高めることができる。更に、内部架橋剤は、重
合体粒子を非膨潤化して、重合体粒子の水性媒体中での
分散安定性を高めるのに効果がある。

かかる多官能性内部架橋用単量体としては、例えば、脂
肪族多価アルコールのポリ　（メタ）アクリレートが好
ましく用いられる。具体例として、例えば、エチレング
リコールジメタクリレート、ジエチレングリコールジメ
タクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレー
ト、ジプロピレングリコールジメタクリレート、１．３
−ブチレングリコールジメタクリレート、トリエチレン
グリコールジアクリレート、トリメチロールプロパント
リメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリ
レート、テトラメチロールメタンテトラアクリレート等
が好ましく用いられる。また、ジビニルベンゼンやＮ、
Ｎ“−メチレンビスアクリルアミド等も多官能性内部架
橋用単量体として用いることができる。

内部架橋用多官能性単量体は、必要な場合は、通常、単
量体組成において、０．１重量％以上が用いられるが、
しかし、過多に使用するときは、却って重合安定性と得
られる重合体粒子の水性媒体中での分散安定性を損なう
ので好ましくなく、通常、２０重量％以下の範囲で用い
られる。好ましくは０．２〜１０重景％重量囲である。

また、個々の単量体の具体的な種類は、得られる共重合
体のガラス転移点が０℃以上、好ましくは室温以上とな
るように選ばれる。重合体粒子のガラス転移点が０℃よ
りも低いときは、重合体粒子の相互の融着や凝集が生じ
やすく、分散液の分散安定性が低下する傾向があるから
である。

以上のような各単量体を水性媒体中にて、水溶性のラジ
カル重合開始剤を用いて、通常の方法にて乳化共重合さ
せることにより、水不溶性共重合体からなる水性分散液
、即ち、ラテックスを得ることができるが、得られるラ
テックス中に乳化剤が遊離の状態で、或いは重合体粒子
に吸着された状態にて存在するとき、前述したように、
特に、その使用に際して種々の有害な影響が現れること
があるので、乳化共重合に際しては乳化剤を用いないの
が好ましい。前記単量体組成によれば、乳化剤を要せず
して安定に共重合させることができると共に、得られる
ラテックス分散状態が安定に保持される。しかし、前述
したように、重合体粒子を緩衝液や生理食塩水に分散さ
せた場合にも、重合体粒子の凝集や沈降が起こらず、更
には、固定化された生理活性タンパク質の生化学的反応
が妨害されない範囲において、乳化剤を用いることは何
ら妨げられず、また、用途によって乳化剤が有害な影響
を与えないときは、必要に応じて、乳化剤を用いてもよ
い。

上記のような乳化共重合において、単量体成分混合物の
水性媒体中での濃度は、得られる分散液における重合体
粒子の平均粒径とも関連するが、通常、１〜４０重量％
の範囲である。

重合開始剤としては、水溶性ラジカル重合開始剤が用い
られる。通常、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過
硫酸アンモニウム等の過硫酸塩や、これら過硫酸塩と千
オ硫酸ナトリウム、千オ硫酸カリウム、チオ硫酸水素ナ
トリウム等のようなチオ硫酸塩、又は亜硫酸ナトリウム
、亜硫酸カリウム、亜硫酸水素ナトリウム等のような亜
硫酸塩とのレドックス系重合開始剤が好ましく用いられ
るが、これらに限定されるものではない。これら重合開
始剤の使用量は、単量体混合物に対して０．０１〜１重
量％の範囲が好適である。重合の雰囲気も、特に制限さ
れないが、好ましくは酸素を除いた不活性ガス雰囲気が
用いられる。また、重合温度は、特に制限されないが、
通常、２０〜１００℃、好ましくは４０〜９０℃の範囲
である。

ユ里皇座果 以上のように、本発明の活性化粒子担体によれば、ジス
ルフィド結合と共にカルボキシル基を有して、ジスルフ
ィド結合交換反応によって、ジスルフィド結合又はチオ
ール基を有するタンパク賞を容易に固定化することがで
きると共に、水性媒体中での分散安定性及び保存性にす
ぐれる。

更に、粒子担体を構成するための重合体粒子として、ア
クリル酸誘導体とアクリル酸フルオロアルキルエステル
誘導体とからなる共重合体を用いるとき、得られる粒子
担体がその粒径分布において狭（、均一であり、且つ、
水性媒体中での分散性に著しくすぐれるので、生理活性
タンパク質を固定化するに際して、高い活性収率を得る
ことができ、更に、このようにして得られる固定化生理
活性タンパク質においては、反応系に存在する外来の有
機物質の表面への吸着や被覆による表面汚染が実質的に
生じないので、その生理活性が長期間にわたって高く保
持される。

寒旌皿 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例により何ら限定されるものではない。

実施例１ （重合体粒子の製造） メチルメタクリレート７９重量％、ＩＨ，ＩＨ，５）１
−オクタフルオロペンチルメタクリレート１７重量％、
アクリル酸３重量％及びトリエチレングリコールジメタ
クリレート１重量％よりなる単量体混合物９０ｇを蒸留
水３５０ｇに加え、次いで、過硫酸アンモニウム０．３
６　ｇを蒸留水１０ｇに溶解した水溶液を７０℃の温度
で窒素気流下に加え、２５０ｒｐｍで攪拌しつつ、７時
間重合させて、重合率９９％にて平均粒径０．２５μｍ
の重合体粒子の水性ラテックスを得た。

このラテックスを遠心分離し、０．０１　ｍｏ＋／１ホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ７，０）にて５回洗浄した後、０．Ｏ
１ｍｏｌ／１ホウ酸緩衝液（ｐＨ７，０）に再分散させ
た。

このラテックス粒子の表面のカルボキシル基数は電導度
滴定法にて定量したところ、７．３Ｘ１０−’ｍｏｌ／
ｍ”であった。

（重合体粒子へのシスタミンの結合による粒子担体の製
造） 上記ラテックス（固形分５重量％）１００ｍｌとシスタ
ミン水溶液（０，０３ｍｏｌ／ｌ）　　１００ｍｌとを
混合し、ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨを７゜０
に調整した。０．０１　ｍｏｌ／１ホウ酸緩衝液ＣｐＨ
７゜０）に？容解させた１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩溶液（３８ｖ
ｇ／ｍｌ）　　２０　ｍｌを上記シスクミンを含むラテ
ックスに加え、２５℃の温度で５時間、撹拌下に反応さ
せた。

次に、０．０１　ｍｏｌ／１ホウ酸緩衝液（ｐＨ７，０
）にて３回遠心分離洗浄して、シスタミンを結合させた
ラテックス粒子を得、これを０．０１　ｍｏｌ／ｌホウ
酸緩衝液（ｐＨ７，０）に再分散させた。

このラテックス粒子の表面のジスルフィド結合を２−メ
ルカプトエチルアミンにて完全にチオール基に還元した
後、５，５′−ジチオビス（２−二トロ安息香酸）にて
定量したところ、ジスルフィド結合の数は３．　Ｉ　Ｘ
　１０−７ｍｏｌ／ｍ２であって、これはラテックス粒
子の有する当初のカルボキシル基数の４．２５％に相当
する。

上で得たシスタミン結合ラテックスを光学顕微鏡（３０
０倍）にて観察したが、ラテックス粒子を全く見ること
ができず、分散安定性が極めてすぐれていることが確認
された。更に、このラテックスを固形分１重量％（ｐＨ
７，０’）にて温度２５℃で６か月間放置した後、同様
に光学顕微鏡（３００倍）にて観察したが、ラテックス
粒子を全（見ることができず、分散安定性が極めてすぐ
れていることが確認された。

（粒子担体への酵素の固定化） 上で得たシスタミン結合ラテックス（固形分５重量％）
５ｍｌに２−メルカプトエチルアミン水溶液（１ｍｏｆ
／１）　４　ｍｌを加え、攪拌しつつ、室温にて２時間
反応させた後、０．０１　ｍｏｌ／ｌホウ酸緩衝液（ｐ
）Ｉ　７．０　）にて遠心洗浄を５回行ない、上記と同
じ緩衝液に固形分５重量％になるように再分散させた。

このラテックス４ｍｌにβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（４
ｍｇ／ｍｌ、ベーリンガー・マンハイム社製）３ｍｌを
加え、５℃で１０時間、攪拌下に反応させた。次いで、
０．０１　ｍｏｌ／ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ７，０）に分
散させ、かくして、β−Ｄ−ガラクトシダーゼをジスル
フィド結合交換反応によって担体粒子に固定化してなる
ラテックスを得た。

β−Ｄ−ガラクトシダーゼの固定化量は、ラテックス粒
子１ビ当たり１７■であり、また、活性収率は７８％で
あった。尚、ここに、活性収率とは、酵素の活性の理論
量に対する実際の活性の割合として定義されるものであ
って、ラクトースを基質としてＮＡＤ及びガラクトース
デヒドロゲナーゼの共存下で反応させて、生成したＮＡ
ＤＨを３４０　ｎｍの吸光度から酵素活性を測定し、こ
れと等しい活性を有する遊離の酵素量を酵素固定化量で
除して求めた。

また、上で得られたシスタミン結合ラテックスを２５℃
で所定期間放置した後、上記と同様にしてβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼを担体粒子に固定化し、それぞれの場合に
ついて、酵素固定化量及び活性収率を測定した。結果を
第１表に示すように、第１表 本発明のラテックス粒子担体を用いることによって、粒
子表面のジスルフィド結合が４か月後においても酵素の
固定化のために有効に機能することが確認された。

実施例２ 実施例１における、重合体粒子の製造において、アクリ
ル酸を除くすべての単量体をトリフルオロエチルメタク
リレートに代えた以外は、実施例工と全く同じようにし
て、平均粒子径０．３１μｍ、カルボキシル基量５．８
μｍｏｌ／ｍ”のラテックス粒子を得た。

このラテックス粒子に実施例１と同様にしてシスタミン
を結合させたところ、ジスルフィド結合数は３．８　Ｘ
　１０−’ｍｏｌ／ｍ”であり、これは重合体粒子の有
する当初のカルボキシルＭｌの６．５５％に相当する。

上で得たシスタミン結合ラテックスを光学顕微鏡（３０
０倍）にて観察したが、ラテックス粒子を全く見ること
ができず、分散安定性が極めてすぐれていることが確認
された。更に、このラテックスを固形分１重量％（ｐＨ
７，０）にて温度２５℃で６か月間放置した後、同様に
光学顕微鏡（３０Ｏ倍）にて観察したが、ラテックス粒
子を全く見ることができず、分散安定性が極めてすぐれ
ていることが確認された。

比較例１ （重合体粒子の製造） メチルメタクリレート９８．２重量％、アクリル酸０．
８重量％及びトリエチレングリコールジメタクリレート
エ重量％よりなる単量体混合物９０ｇを蒸留水３５０ｇ
に加え、次いで、過硫酸アンモニウム０．３６　ｇを蒸
留水Ｌｏｇに溶解した水溶液を７０℃の温度で窒素気流
下に加え、２５０ｒｐｍで攪拌しつつ、７時間重合させ
て、重合率９９％にて平均粒径０．２９μｍの重合体粒
子の水性ラテックスを得た。

このラテックスを遠心分離し、０．０１　ｍｏｌ／１ホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ７，０）にて３回、次いで、０．０１
ｍｏｌ／１ホウ酸緩衝液（ｐＨ５，５）で２回洗浄した
後、同緩衝液（ｐ）１５．５）に再分散させた。このラ
テックス粒子の表面のカルボキシル基量は、電導度滴定
法にて定量したところ、２．　Ｉ　Ｘ　１０−６ｍｏｌ
／ｍ”であった。

（重合体粒子へのシスタミンの結合） このラテックス（固形分５重量％）１００ｍｌとシスタ
ミン水溶液（０，２０ｍｏｌ／１）　　１００ｍｌとを
混合し、ｐＨを５．５に調整した後、０．０１　ｍｏｌ
／Ｉ　ホウ酸緩衝液（ｐＨ５，５）に溶解させた１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド塩酸塩溶液（２５０ｗ／ｍｌ＞　２０ｍｌを加えて
、２５℃で１５時間、攪拌下に反応させた。

次に、０．０１　ｍｏｌ／１ホウ酸緩衝液（ｐＨ７，０
＞にて３回遠心分離洗浄して、シスタミンを結合させた
ラテックス粒子を得た。このラテックス粒子の表面のジ
スルフィド結合の数を実施例１と同じ方法にて定量した
ところ、５．２　Ｘ　１０−’ｍｏｌ／ｍ”であって、
これはカルボキシル基数の２４．８％に相当する。

上で得たシスタミン結合ラテックスを光学顕微鏡（３０
０倍）にて観察したところ、微細な粒子を見ることがで
きるので、分散安定性に劣ることが確認された。

（粒子担体への酵素の固定化） また、上で得たシスタミン結合ラテックスに、実施例１
と同様にして、β−Ｄ−ガラクトシダーゼを固定化した
ところ、固定化反応中にラテックスの著しい凝集が生じ
た。また、酵素の固定化量は、ラテックス粒子１ピ当た
り１８ｍｇであり、活性収率は４１％であった。

比較例２ （重合体粒子の製造） メチルメタクリレート９６重量％、アクリル酸３重量％
及びトリエチレングリコールジメタクリレート１重量％
よりなる単量体混合物９０ｇを蒸留水３５０ｇに加え、
次いで、過硫酸アンモニウム０．３６ｇを蒸留水１０ｇ
に溶解した水溶液を７０℃の温度で窒素気流下に加え、
２５０ｒｐｍで攪拌しつつ、７時間重合させて、重合率
１００％にて平均粒径０．２８μｍの重合体粒子の水性
ラテックスを得た。

このラテックスを遠心分離し、０．０１　ｍｏｌ／１ホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ７，０）にて５回洗浄した後、ｏ、。

１　ｍｏｌ／１ホウ酸緩衝液（ｐ）１７．０）に再分散
させた。

このラテックス粒子の表面のカルボキシル基数は、電導
度滴定法にて定量したところ、？、８Ｘ１０−６ｍｏｌ
／ｍ”であった。

（重合体粒子へのシスタミンの結合による粒子担体の製
造） 実施例１と同じ方法にて、上記ラテックス（固形分５重
量％）にシスタミンを結合させたラテックス粒子を得た
。この粒子の表面のジスルフィド結合の数は３．３　Ｘ
　１０−’ｍｏｌ／ｍ”であって、これはラテックス粒
子の有する当初のカルボキシル基数の４．２％に相当す
る。

上で得たシスタミン結合ラテックス及び実施例１におい
て得たシスタミン結合ラテックス（それぞれ固形分２重
量％、ｐＨ７，０）１ｍｌに２％塩化ナトリウム水溶液
１ｍｌを加え、よく混合し、２５℃で１日間放置した後
、ラテックスの分散状態を光学顕微鏡（３００倍）にて
観察した。

本比較例によるラテックスの分散状態は、光学顕微鏡に
よれば、明瞭な凝集が認められ、肉眼でもよく見ると、
凝集が認められた。他方、前記実施例１において得たラ
テックスの分散状態は、均一であって、凝集は全く認め
られなかった。

比較例３ （重合体粒子の製造） メチルメタクリレート６５重量％、ＬＨ，ＩＨ，５Ｈ−
オクタフルオロペンチルメタクリレート１７重量％、ア
クリル酸１７重量％及びトリエチレングリコールジメタ
クリレート１重量％よりなる単量体混合物９０ｇを蒸留
水３５０ｇに加え、次いで、過硫酸アンモニウム０．３
６ｇを蒸留水１０ｇに溶解した水溶液を７０℃の温度で
窒素気流下に加え、２５０ｒｐｍで撹拌しつつ、７時間
重合させて、重合率９１％にて平均粒径０．２２μｍの
重合体粒子の水性ラテックスを得た。

このラテックスを遠心分離し、０．０１　ｍｏｌ／１ホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ７，０）にて５回洗浄した後、０．Ｏ
Ｉｍｏｌ／１ホウ酸緩衝液（ｐＨ７，０）に再分散させ
た。

このラテックス粒子の表面のカルボキシル基数は、電導
度滴定法にて定量したところ、３６．０Ｘ１０−’鵬ｏ
１／ｍ”であった。

（重合体粒子へのシスタミンの結合による粒子担体の製
造） 実施例１と同じ方法にて、上記ラテックス（固形分５重
量％）にシスタミンを結合させた。この粒子の表面のジ
スルフィド結合の数は１．４Ｘ１０−’ｍｏｌ／ｍ”で
あって、これはラテックス粒子の有する当初のカルボキ
シル基数の３．９％に相当する。

上で得たシスタミン結合ラテックス（固形分２重量％、
ｐＨ７，０）１ｍｌに２％塩化ナトリウム水溶液１ｍｌ
を加え、よく混合し、２５℃で１日間放置した後、ラテ
ックスの分散状態を観察したところ、肉眼では見えなか
ったが、光学顕微鏡（３００倍）によれば、凝集が認め
られた。

比較例４ （重合体粒子の製造） メチルメタクリレート８１゜９重量％、ＬＨ，ＩＨ，５
）１−オクタフルオロペンチルメタクリレート１７重量
％、アクリル酸０．１重量％及びトリエチレングリコー
ルジメタクリレート１重量％よりなる車量体温合物９０
ｇを蒸留水３５０ｇに加え、次いで、過硫酸アンモニウ
ム０．３６ｇを蒸留水１０ｇに溶解した水溶液を７０℃
の温度で窒素気流下に加え、２５０ｒｐｍで攪拌しつつ
、７時間重合させて、重合率９６％にて平均粒径０．２
７μｍの重合体粒子の水性ラテックスを得た。

このラテックスを遠心分離し、０．０１　ｍｏｌ／ｌホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ７，０）にて５回洗浄した後、０．Ｏ
１ｍｏｌ／１ホウ酸緩衝液（ｐＨ７，０）に再分散させ
た。

このラテックス粒子の表面のカルボキシル基数は、電導
度滴定法にて定量したところ、０．３Ｘ１０−”涌ｏｆ
／ｍ”であった。

（重合体粒子へのシスタミンの結合による粒子担体の製
造） 実施例１と同じ方法にて、上記ラテックス（固形分５重
世％）にシスタミンを結合させた。この粒子の表面のジ
スルフィド結合の数は０．６Ｘ１０−’ｍｏｌ／ｍ”で
あって、これはラテックス粒子の有する当初のカルボキ
シル基数の２０．０％に相当する。

上で得たシスタミン結合ラテックス（固形分２重量％、
ｐＨ７，０）１ｍｌに２％塩化ナトリウム水溶液１ｍｌ
を加え、よく混合し、２５℃で１日間放１した後、光学
顕微鏡（３００倍）にてラテックスの分散状態を観察し
たところ、凝集が認められた。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）表面にカルボキシル基を有する粒径０．０３〜３
   μｍの重合体粒子に、一般式 ＮＨ＿２−Ｒ＾ａ−Ｓ−Ｓ−Ｒ＾ｂ−Ｙ　（ I ）（式
   中、Ｒ＾ａ及びＲ＾ｂはそれぞれ独立に炭素数１〜６の
   アルキレン基を示し、このアルキレン基は置換基として
   カルボキシル基を有していてもよく、Ｙは水素、アミノ
   基又は水酸基を示す。）で表わされるアミノジスルフィ
   ド化合物が上記カルボキシル基にアミド結合によつて結
   合されていることを特徴とする活性化粒子担体。
2. （２）重合体粒子がアミノジスルフィド化合物を結合さ
   れる前に０．１〜６０μｍｏｌ／ｍ＾２のカルボキシル
   基を有し、活性化粒子担体の有するジスルフィド結合が
   上記カルボキシル基数の１〜２０％であることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の活性化粒子担体。
3. （３）重合体粒子が （ａ）一般式 Ｒ＾１ＣＨ＝ＣＲ＾２ＣＯＯＨ （但し、Ｒ＾１は水素、低級アルキル基又はカルボキシ
   ル基を示し、Ｒ＾２は水素又は低級アルキル基を示し、
   Ｒ＾１が水素又は低級アルキル基のときは、Ｒ＾２はカ
   ルボ低級アルコキシ基であつてもよい。） で表わされるアクリル酸誘導体０．１〜２０重量％、及
   び （ｂ）一般式 ＣＨ＿２＝ＣＲ＾３ＣＯＯＲ＾４（ＣＦ＿２）＿ｎＣＦ
   Ａ＿２（但し、Ｒ＾３は水素又は低級アルキル基を示し
   、Ｒ＾４は −（ＣＨ＿２）＿ｍ−又は▲数式、化学式、表等があり
   ます▼ （但し、ｍは０〜１２の整数を示し、ｘ＋ｙ＝ｍ−１で
   あり、Ｒ＾５は水素又はアセチル基を示す。）を示し、
   Ａはそれぞれ独立に水素、フッ素又はＣＦ＿３を示し、
   ｎは０〜１２の整数を示す。） で表わされるアクリル酸フルオロアルキルエステル誘導
   体と、上記アクリル酸誘導体を除くラジカル共重合性ビ
   ニル単量体との混合物であつて、この混合物に基づいて
   上記アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体が１〜
   １００重量％である混合物９９．９〜８０重量％ からなる単量体混合物を水性媒体中で乳化共重合させて
   なる水分散型高分子重合体粒子であることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の活性化粒子担体。