JPS63116695A - 再分散性生理活性物質固定化用担体粒子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 渡」しトｑ利−用−分野 本発明は、再分散性生理活性物質固定化用担体粒子に関
し、詳しくは、酵素、抗体等のような生理活性物質を共
有結合にて固定化するための再分散性担体粒子に関する
。

１来の技術 生理活性物質、例えば、酵素を水不溶性のラテックス粒
子に固定化してなる固定化酵素は、その回収が容易であ
ると共に、酵素の変性や失活が起こり難いために、近年
、工業的な酵素反応に広く用いられている。また、生理
活性物質としてレクチンをラテックス粒子に固定化した
ものは、レクチンの糖類との結合能力を利用して、糖類
の分離や精製に用いられる。更に、生理活性物質として
抗原若しくはハブテン、又は抗体をラテックス粒子に結
合したものは、対応する抗体、又は抗原若しくはハプテ
ンをラテックス凝集反応として検出するための免疫学的
診断試薬として広く実用化されている。

このように、生理活性物質をラテックス粒子に結合する
ための方法とし、て、従来、代表的には、ポリス千ｌノ
ンラデツクス粒子の表面に生理活性物質を物理吸着さ−
Ｕる方法と、カルボキシル基を有する重合体粒子の水性
分散液、即ち、カルボキシル化ラテックスを構成する＊
：ｆ　Ｉ−に生理活性物質を共有結合にて結合させる方
法とが知られている。

上記物理吸着法は、操作が簡ｔｐであり、特別な試薬を
必要とセす、更に、固定化に際しζも、生理活性物質の
活性の低下が殆ど生じない利点を有するところから、従
来、広く用いられている。

しかし、物理吸着法においては、４理活性物η”は単に
ラテックス粒子の表面に吸着されζいるのみであるので
、生理活性物質がラテックス粒子から容易に解離し、例
えば、前記した免疫学的診断試薬として用いた場合に、
ラテックス凝集反応を阻害し２、或いは自然凝集を牛じ
たりして、診断の精度を低下さ・ｌる問題がある。また
、生理活性物質によっては、ラテックス粒子に吸着せず
、或いは吸着量が少なく、所要の活性を有するラテック
ス粒子を／ｊ）ることができない場合もあり、更に、ｐ
Ｈ等の環境条件に敏感である等の問題もある。

他方、共有結合法によれば、生理活性物質はラテックス
粒子に強固に結合されているので、容易に解離すること
はないが、反面、固定化操作が煩瑣であり、且つ、高度
の技術を必要とし、更に、生理活性物質が結合されたラ
テックス粒子は、−般には、分散性がよくない。特に、
共有結合法にてカルボ−Ｖシル化ラテラテックス粒子理
活性物質を結合する際に、水溶性縮合脱水剤としてのカ
ルボジイミドにて活性化したラテックス粒子は、水性媒
体中での保存性に劣るために、生理活性物質の固定化操
作の都度、ラテックス粒子の活性化を行なう必要がある
ので、再現性よく生理活性物質を固定化することが困難
である。

カルボキシル化ラテックス粒子をＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミドにて活性化する方法も知られている。この方法
による活性化ラテックス粒子は、上記カルボジイミドに
よる活性化ラテックス粒子に比べて、その水性媒体中で
の分散性は幾分は改善されているものの、長期の保存に
耐えるほどの安定性をもつには至らない。

そこで、活性基が乾燥状態においては保存安定性が高い
ことを利用して、例えば、アガロースゲルを活性化し、
乾燥し、粒子状とした活性化担体粒子、例えば、アガロ
ースゲルの水酸基を臭化シアンにて活性化したＣＮＢｒ
−活性化セファロース４Ｂ、各種の官能基を付与した活
性化ＣＨ−セファロース４Ｂやエポキシ活性化セファロ
ース６Ｂ（いずれもファーマシア・ファイン・ケミカル
ズ社製）等が既に知られている。

しかし、これら活性化担体粒子は、４５〜２００μｍの
粒径を有し、主としてアフイニテイ・クロマトグラフィ
ー用の充填剤として用いられるものであって、元来、分
散性はもたないので、水性媒体中での分散安定性が要求
される用途には用いることかできない。かかる分散安定
性が要求される用途として、例えば、前記したような免
疫学的診断試薬や、或いは相体粒子に酵素を固定化し、
水性媒体中に分散させて、基質と反応させる酵素反応等
を挙げることができる。

このような分散安定性が要求される用途には、従来、一
般に粒径０．０３〜３μｍの微細なラテックス粒子が用
いられている。しかし、これらラテックス粒子は、乾燥
すれば、相互に融着凝集するので、水性媒体中に再分散
させても、当初の微細な粒子として分散しない。

１表解決しよう一ζ↓る問題点 そこで、生理活性物質を結合したラテックスに乳糖のよ
うな分散剤を加え、これを凍結乾燥して、再分散性を有
する粉末物質を得る方法が特開昭５２−１１７４．２０
号公報に記載されている。また、特開昭５８−１２３４
５９号公報には、生理活性物質を固定化したラテックス
を保護剤としてのグリセリンの水溶液で処理した後に、
自然乾燥又は通気乾燥して、保存性にずくれる乾燥粒子
を製造する方法が記載されている。

しかし、従来、生理活性物質を固定化すべき担体粒子自
体を水性媒体中で再分散性を有する乾燥担体粒子とする
方法は知られておらず、他方、乾燥担体粒子と共に分散
剤や保護剤が存在するときは、乾燥担体粒子を水性媒体
中に再分散さセ、生理活性物質を固定化する際にその固
定化を妨げ、或いは固定化された生理活性物質の活性を
低トさせることがあるので、分散剤や保護剤を用いる前
記方法は、再分散性を有する乾燥担体粒子を得る場合に
は適用し得ない。

本発明は、生理活性物質を固定化すべきラテックス担体
粒子を乾燥するに際して、上記のような分散剤や保護剤
のような薬剤を用いることなくして、保存性、水性媒体
中での再分散性及び生理活性物質の固定化部の再現性に
ずくれる生理活性物質固定化用担体粒子を提供すること
を目的とする。

訓澗博子１すυシＩ翻か９手−段 本発明による再分散↑（Ｉ生理活性物質固定化用担体粒
子の第１は、カルボキシルＪ５を有する重合体粒子を含
むラテックスを一般式 ％式％ （式中、Ｒａ及びＲｈはそれぞれ独立に炭素数５又は６
のシクロアルキル基、炭素数１〜１２のアルキル基、モ
ノアリール基、モノアリール置換低級アルキル基、モル
ホリノ基、ピペリジル基、低級アルキル置換モルポリニ
ル基、低級ア／ｌバ１−ル置換ピペリジル基、ジ低級ア
ルキルアミノ低級アルキル基又は低級アルキル置換ピリ
ジル基を示す。）で表わされる水溶性カルボジイミドで
活性化した後、凍結乾燥してなることを特徴とする。

また、本発明による再分散性生理粘性物質固定化用粒子
担体の第２は、カルボキシル基各自する重合体粒子を含
むラテックスをＮ　トート１コキシスクシンイミドで活
性化し７だ後、凍結乾燥してなることを特徴２−する。

本発明において、生理活性物質とは、前述した酵素、補
酵素や、抗体若しくはバブテン、抗原、ホルモン等のよ
うに、生物学的又は生化学的な反応活性を佇する有機物
質、通常、高分子量タンパク質を意味する。

本発明において活性化剤として用いる水溶性カルボジイ
ミドは前記一般式で表わされ、また、これらの酸付加塩
や第４級アミンも用いることができる。前記−゛般式に
おいて、シフ１コアルキル基としては例えばシクロヘキ
シル基を、アルキル基としては例えばエチル、ｎ−プロ
ピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、５ｅｃ−ブチル、イ
ソブチル、ｔｅｒ　ｔ−ブチル、アミル、ヘキシル、ヘ
プチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデ
シル等ヲ、モノアリール基として例えばフェニル基を、
モノアリール置換低級アルキル基として例えばベンジル
基を、低級アルキル置換モルポリニル基として例えばエ
チルモルポリニル基を、低級アルキル置換ピペリジル基
として例えばエチルピペリジル基を、低級アルキル置換
ピリジル基として例えばα。

β又はγ−メチル又はエチルピリジル基をそれぞれ挙げ
ることができる。尚、上記において、低級アルキル基と
は、炭素数１〜４のアルキル基を意味するものとする。

本発明による担体粒子を製造するための重合体粒子は、
水分散型高分子重合体粒子であ・つて、カルボキシル基
を有することが必要であり、特に、水溶性カルボジイミ
ド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化し、凍結
乾燥してなる粉末を水性媒体中に再分散させたときにず
（れた分散性を存するように、重合体粒子は、当初、即
ち、活性化前は、その表面に０．１〜６０μｍｏｌ／ｍ
２のカルボキシル基数を有することが好ましい。特に好
ましくは０．７〜３０μｍｏｌ／ｍ”の範囲である。重
合体粒子の有するカルボキシル基数が余りに少ないとき
は、凍結乾燥し７た粉末が水性媒体中での再分散性に劣
り、水性媒体中に再分散させてときに凝集を起こすと共
に、十分な量のカルボジイミドやＮ　−ヒドロキシスク
シンイミドを結合させることができず、延いては、得ら
れる活性化担体粒子に十分な量の生理活性物質を固定化
することができない。

他方、重合体粒子の有するカルボキシル基数が余りに多
いときも、再分散させたときに水性媒体中にて凝集する
ことがあり、或いは生理活性物質を固定化したときに、
その生化学的反応を阻害するおそれがある。

尚、後注するように、重合体粒子は好ましくは遊離カル
ボキシル基を有する所謂スペーサ基が結合されるが、重
合体粒子表面のカルボキシル基と巳ンＩ、重合体粒子が
このようにスペーサ基が結合されているときは、重合体
粒子が木来有するカルボキシル基とスペーサ基の有する
カルボキシル基との合計量を意味するものとする。

重合体粒子上のカルボキシル基量は、後述するように、
乳化共重合における所定の単量体組成のうち、アクリル
酸誘導体の使用量によって任意にＩＫ＋整することがで
きる。

本発明において、重合体粒子は、その平均粒径が０．０
３〜３．ｕｍ、好ましくは０゜０５〜１．５μｍである
。粒径が小さずぎると、例えば、これを担体とする固定
化酵素を水中に分散させて酵素反応を行なわせた後の回
収が困難となり、一方、粒径が大きすぎると、単位体積
当りの粒子表面積が小さくなり、例えば、酵素の固定化
量が少なくなると共に、水１喝こ分散させるのが困難と
なるので好ましくない。

また、重合体粒子の比重は０．９〜１．５の範囲にある
ことが好ましい。比重が０．９よりも小さいときは、例
えば、酵素反応において、粒子が水性媒体の表層に浮遊
し、分散安定性に劣るようになり、また、酵素活性も低
下し、一方、１．５よりも大きいときは、粒子が水性媒
体中に沈降、凝集し、粒子の自由度が失われて、例えば
、酵素活性が低下するからである。

生理活性物質は、本発明による再分散性活性化担体粒子
に共有結合にて結合されるが、特に、生理活性物質は、
担体粒子に共有結合にてスペーサ基を介して固定化され
ることが好ましい。このように、担体粒子に共有結合に
よってスペーサ基が結合され、このスペーサ基に共有結
合によって生理活性物質が固定化されることにより、固
定化された生理活性物質の担体粒子−Ｌでの自由度が高
められるからである。換言すれば、本発明による再分散
性生理活性物質固定化用担体粒子は、重合体粒子に遊離
カルボキシル基を有するスペーサ基が共有結合にて結合
され、このスペーサ基の有する上記カルボキシル基がカ
ルボジイミド又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドにて活
性化されていることが好ましい。

上記スペーサ基として用い得る化合物は、アミノ基とカ
ルボキシル基とを有する少なくとも二官能性の有機化合
物であり、多官能性の重合体を排除するものではないが
、特に、炭素数１〜１２の炭素鎖基を有し、アミノ基と
カルボキシル基とを有する二官能性の有機化合物が好ま
しい。このようなスペーサ基として機能する化合物の具
体例として、例えば、グリシン、β−アミノプロピオン
酸、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸、ε−アミ
ノカプリル酸等のアミノアルキルカルボン酸、リジン、
グルタミン酸、β−アラニン、アルギニン、グリシルグ
リシルグリジン等のアミノ酸類等が好ましく用いられる
が、これらに限定されるものではない。

カルボキシル基を有する重合体粒子に前記したスペーサ
基を結合させるには、水溶性カルボジイミドの存在下に
重合体粒子にスペーサ基のための化合物を反応させ、重
合体粒子の有するカルボキシル基とスペーサの存するア
ミノ基との間にアミド結合を形成させればよい。このよ
うに、カルボキシル基にアミノ基を反応させて、スペー
サ基を結合させる方法は、既によく知られている。

カルボキシル基を有する重合体粒子又は前述したような
スペーサ基が結合された重合体粒子（Ｍ離カルボキシル
基を有する。）を水溶性カルボジイミドにて活性化する
には、例えば、千畑一部ほか著「実験と応用アフイニテ
ィ・クロマトグラフィーＪ　　（１９７６年講談社発行
）に記載されているように、一般に、カルボキシル基を
カルボジイミドにて活性化する通常の方法及び条件によ
ればよい。

例えば、カルボキシル基を有する重合体粒子又はスペー
サ基が結合された重合体粒子を含むラテックスに適宜量
、例えば、ラテックスの単位容量当りに０．０１〜１０
ｍｇ／ｍｌとなるように水溶性カルボジイミドを添加し
、通常の条件、例えばｐｌ＋を４〜９に保持して、５〜
６０℃程度の温度で数分乃至数十時間、通常、１〜５時
間程度反応させればよい。特に、得られる活性化担体粒
子が凍結乾燥後にすぐれた再分散を有するためには、用
いるカルボジイミドの量をラテックスの単位容量当りに
］〜１０　ｍＢ／ｍｌとし、ｐｌ＋７〜９、温度５〜２
０℃で数時間反応させるのが好適である。

また、カルボキシル基を有する重合体粒子又は遊離カル
ボキシル基を有するスペーサ基が結合された重合体粒子
をＮ−ヒ］・ロキシスクシンイミドで活性化するには、
適宜の水溶性脱水縮合剤の存在下にＮ−ヒドロキシスク
シンイミドを反応させ、−１ｘ記カルポー１−シル基と
の間にエステル結合を形成させればよい。上記水溶性脱
水縮合剤としては、通常、水溶性カルボジイミドが好適
であり、例えば、】−エチル−３（３−ジメチルアミ、
ノプロビル）カルボジイミド塩酸塩、１−シクロへキジ
ルー：３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド−
メトーｐ−トルエンスルポネー１〜等が用いられる。

このように、カルボキシル基を有する重合体粒子又はス
ペーリー基を結合された重合体粒子にＮ−ヒドロキシス
クシンイミドを結合させる場合にも、前記文献に記載さ
れているように、通常の方法及び条件によることができ
、通常は、カルボキシル基を有する重合体粒子又はスベ
ー４Ｊ基が結合された重合体粒子をカルボジイミドで活
性化する場合と同し条件によればよい。

このようにして重合体粒子又はスペーサ基を結合された
重合体粒子をカルボジイミド又はＮ−ヒドロキシスクシ
ン・イミドにて活性化し２だ後、遠心分離、透析又は濾
過等の適宜の方法によって、活性化重合体校了から未反
応の活性化剤や縮合剤、副生物等を除去することが好ま
しい。これらが残存するときは、活性化ラテックス粒子
の凍結乾燥品が水性媒体中での再分散性に劣ることとな
るからである。

本発明において、ラテックスの凍結乾燥方法は、特に、
Ｈ定されるものではないが、通常は、ラテックスを一７
０°Ｃから一８０℃の温度で凍結乾燥さ・Ｕる。この後
、減圧下に水分を除去ずイ）ことによって、本発明によ
る再分散性にすぐれる活性化担体粒子を得ることができ
る。かかる本発明による活性化担体粒子は、これを水性
媒体中に再分散させ、生理活性物質を反応させることに
よって、直ちに且つ容易にこれを固定化することができ
る。

本発明においては１、重合体粒子は、前述した条件を満
たずものであれば、特に限定されるものではないが、し
かし、以下に述べるように、特に、アクリル酸誘導体と
アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体とを含む単
量体混合物を乳化共重合して得られる重合体粒子が好ま
しく用いられる。

かかる重合体粒子は、 （ａｌ一般式 ％式％ （但し、ｐ＋は水素、低級アルキル基又はカルボキシル
基を示し、Ｒ２は水素又は低級アルキル基を示し、Ｒ１
が水素又は低級アルキル基のときは、Ｒ２はカルボ低級
アルコキシ基であってもよい。）で表わされるアクリル
酸誘導体０．１〜２０重量％、及び （ｂｌ一般式 ％式％ （但し、Ｒ″は水素又は低級アルキル基を示し、Ｒ４は （但し、ｍはＯ〜１２の整数を示し、ｘ　−ｔ−ｙ　＝
ｍ−１であり、Ｒ５は水素又はアセチル基を示す。）を
示し、Ａはそれぞれ独立に水素、フッ素又はＣＦ３を示
し、ｎば０〜１２の整数を示す。）で表わされるアクリ
ル酸フルオロアルキルエステル誘導体と、上記アクリル
酸誘導体を除くラジカル共重合性ビニル単量体との混合
物であって、この混合物に基づいて上記アクリル酸フル
オロアルキルエステル誘導体が１〜１００重量％である
混合物９９．９〜８０重量％ からなる単量体混合物を水性媒体中で乳化共重合させて
得ることができる。

上記アクリル酸誘導体としては、例えば、アクリル酸、
メタクリル酸、イタコン酸、クロトン酸、マレイン酸、
フマル酸、モノアルキルマレイン酸、モノアルキルフマ
ル酸、モノアルキルイタコン酸等を好ましい例として挙
げることができるが、特に、アクリル酸、メタクリル酸
及びイタコン酸の１種又は２種以上の混合物が好ましく
用いられる。

また、上記アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体
は、好ましくは、一般式 ％式％（１１ （但し、ＩＮ３、Ｐ５、ｍ及びｎは前記と同じである。

）で表わされ、従って、特に、好ましく用いることがで
きるアクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体の具体
例として、例えば、 Ｃ１ｈ＝Ｃ（Ｃ１ｌｌ）ＣＯＯＣＩＩｚＣＦ３　　　　
　　　　　　　（５１Ｃ１１，＝Ｃ（Ｃ１１，）ＣＯＯ
Ｃ１１２（ＣＦ２）　２１１　　　　　　　　　（６）
ＣＩ＋２＝Ｃ（Ｃ１１，］）ＣＯＯＣＩ＋。（ＣＦ２）
４８　　　　　　　　　（７１Ｃ１ｌ□−Ｃ（Ｃ１ｌ　
３）　Ｃｏｏ　（ＣＩｌ　２）　２　（ＣＦ　Ｚ）　［
ｌＦ　　　　　　　（８１等を例示することができる。

前記アクリル酸誘導体は、乳化共重合時の重合安定性に
すぐれ、また、水性媒体中での分散安定性にすぐれる水
分散型高分子重合体粒子を得るためのみならず、得られ
る重合体粒子を前記したようにカルボジイミドやＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドにて活性化し、或いはスペーサ
基を結合するためのカルボキシル基を重合体粒子に付与
するために必要な単量体であり、単量体組成において、
少なくとも０．１重置％を必要とする。しかし、過多に
共重合単量体成分として用いるときは、却って重合安定
性と、得られる重合体粒子の分散安定性を損なうので、
２０重量％以ドの範囲で用いられる。特に好ましい範囲
は、０．５〜１０重量％である。

また、前記アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体
は、得られる重合体粒子の活性化時や、或いは活性化担
体粒子への生理活性物質の固定化時の水性分散系におい
て、粒子に水性媒体中で安定な分散性を保たしめる効果
を有する。特に、重合体粒子において、アクリル酸フル
オロアルキルエステル誘導体単量体成分は、塩や有機質
物質を含む水溶液中において、例えば、重合体粒子への
有害物質の吸着や被覆を防止する効果を有する。

ごのような効果を有効に得るためには、アクリル酸フル
オロア月バドルエステル誘導体は、単量体組成において
９９３９〜８０重量％、好ましくは９９゜５〜９０重量
％の範囲で用いられる。

しかも、かかる単量体成分の所定の割合の混合物を用い
ることにより、特に乳化剤を用いることなく、凝集物の
発生なしに安定に乳化共重合させ得て、粒径が均一であ
り、且つ、水性媒体中で分散状態が安定に保持されろ水
分散型高分子重合体粒子を得ることができる。

前記アクリル酸フルオロアルキルコニステル誘導体の一
部は、前記アクリル酸誘導体を除（ラジカル共重合性ビ
ニル単量体に置換されてもよい。

かかるラジカル共重合性ビニル単量体としては、例えば
、それ自体の用型重合体が水不溶性である疎水性−１イ
、量体を挙げることができる、具体例として、エチレン
、プロピレン、塩化ビニル等のα−オレフィン又はその
ハＩＪゲン置換体、スチレン、メチルスチレン、エヂル
ス千しン、ビニルトルエン、クロロスチレン等のアルケ
ニルベンゼン、ブタジエン、イソプレン等の共役ジオレ
フィン、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクリル
酸メチル、（メタ）アクリル酸エヂル、（メタ）アクリ
ル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）ア
クリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸オクチル等の（
メタ）アクリル酸エステル、酢酸ビニル、プロピオン酸
ビニル等を挙げることができる。上記したラジカル共重
合性ビニル単量体のうちでは、特に、メタクリル酸メチ
ルやメタクリル酸イソブチル等の（メタ）アクリル酸エ
ステルが好ましく用いられる。このようなｑｔ量体は、
得られる重合体粒子の比重を調整し、又は前記したアク
リル酸誘導体とアクリル酸フルオロアルキルエステル誘
導体との共重合反応性を調整するために好適に用いられ
る。

また、必要に応じて、それ自体のｊ■独重重合体水溶性
又は水膨潤性である親水性単量体も用いることができる
。かかる単量体の具体例として、例えば、ヒドロキシメ
チル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）
アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレ−
！・笠のヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート、（
メタ）アクリルアミド、グリシジル（メタ）アクリレー
ト等を挙げることができる。

しかし、」−記したラジカル共重合性ビニル単量体は、
余りに多量に使用すると、重合安定性を損じるのみなら
ず、得られる重合体粒子が水分散安定性に劣るようにな
るので、本発明においては、アクリル酸フルオロアルキ
ルエステル誘導体と上記ラジカル共重合性ビニル単量体
との混合物において、アクリル酸フルオロアルキルエス
テル誘導体を少なくとも１重量％用いることが必要であ
る。

即ち、本発明において６才、上記ラジカル共重合性ビニ
ルミ量体は、このラジカル共重合性ビニル単量体とアク
リル酸フルオロアルキルエステル誘導体との混合物の重
量に基づいて、９９重重量以下、好ましくは９７重量％
以下の範囲で用いられる。有効量の下限は特に制限され
ず、目的に応じて適宜に選ばれるが、通常、アクリル酸
フルオロアルキルエステル誘導体とこのアクリル酸アル
キ２フ ルエステル誘導体の混合物の重量に基づいて１重量％以
−トである。

更に、重合体粒子の製造において、単量体成分として、
内部架橋用官能性単量体を用いることができる。この内
部架橋用多官能性中、量体ば、重合体に架橋構造を導入
するので、存在する場合には好ましくない水溶性重合体
の生成を抑制すると共に、得られる重合体粒子のガラス
転移温度を高めることができる。更に、内部架橋剤は、
重合体粒子を非膨潤化して、重合体粒子の水性媒体中で
の分散安定性を高めるのに効果がある。

かかる多官能性内部架橋用単量体としては、例えば、脂
肪族多価アルコールのポリ　（メタ）アクリレートが好
ましく用いられる。具体例として、例えば、エチレング
リコールジメタクリレ−１・、ジエチレングリコールジ
メタクリレ−１・、トリエチレングリコールジアクリレ
ー誘 ングリコールジメタクリレート、１，３−ブチレングリ
コールジメタクリレート、トリエチレングリコールジア
クリレート、トリメチロールプロバントジメタクリレー
ト、トリメチロールプロパントリアクリレート、テトラ
メヂロールメタンテトラアクリレート等が好ましく用い
られる。また、ジビニルベンゼンやＮ、　Ｎ’−メヂレ
ンビスアクリルアミド等も多官能性内部架橋用単量体と
して用いることができる。

内部架橋用多官能性単量体は、必要な場合は、通常、単
量体組成において、０．１重量％以上が用いられるが、
しかし、過多に使用するときは、却って重合安定性と得
られる重合体粒子の水性媒体中での分散安定性を損なう
ので好ましくなく、通常、２０重重量以下の範囲で用い
られる。好ましくは０．２〜１０重景％装置囲である。

また、個々の単量体の具体的な種類は、得られる共重合
体のガラス転移点が０℃以上、好ましくは室温以上とな
るように選ばれる。重合体粒子のガラス転移点が０℃よ
りも低いときは、重合体粒子の相互の融着や凝集が生じ
ゃすく、分散液の分散安定性が低下する傾向があるから
である。

以」二のような各単量体を水性媒体中にて、水溶性のラ
ジカル重合開始剤を用いて、通常の方法にて乳化共重合
させることにより、水不溶性共重合体からなる水性分散
液、即ち、ラテックスを得ることができるが、得られる
ラテックス中に乳化剤が遊離の状態で、或いは重合体粒
子に吸着された状態にて存在するとき、前述したように
、特に、その使用に際して種々の有害な影響が現れるこ
とがあるので、乳化共重合に際しては乳化剤を用いない
のが好ましい。前記単量体組成によれば、乳化剤を要せ
ずして安定に共重合させることができると共に、得られ
るラテックス粒子の分散状態が安定に保持される。しか
し、前述したように、重合体粒子を緩衝液や生理食塩水
に分散させた場合にも、重合体粒子の凝集や沈降が起こ
らず、更には、固定化された生理活性物質の生化学的反
応が妨害されない範囲において、乳化剤を用いることは
何ら妨げられず、また、乳化剤が有害な影響を与えない
場合には、必要に応じて、乳化剤を用いてもよい。

上記のような乳化共重合において、単量体成分混合物の
水性媒体中での濃度は、得られるラテックスにおりる重
合体粒子の平均粒径とも関連するが、通常、１〜４０重
量％の範囲である。

重合開始剤としては、水溶性ラジカル重合開始剤が用い
られる。通常、過硫酸カリウム、過硫酸すトリウム、過
硫酸アンモニウム等の過硫酸塩や、これら過硫酸塩とチ
オ硫酸すトリウム、チオ硫酸カリウム、千オ硫酸水素ナ
トリウム等のよ・うなチオ硫酸塩、又は亜硫酸すトリウ
ム、亜硫酸カリウム、亜硫酸水素すＩ・リウム等のよ・
うな亜硫酸塩とのレドックス系重合開始剤が好ましく用
いられるが、これらに限定されるものではない。これら
重合開始剤の使用量は、単量体混合物に対して０．０１
〜１重量％の範囲が好適である。重合の雰囲気も、特に
制限されないが、好ましくは酸素を除いた不活性ガス雰
囲気が用いられる。また、重合温度は、特に制限されな
いが、通常、２０〜１００°Ｃ１好ましくは４０〜９０
℃の範囲である。

溌を勲カー米 以−Ｆのよ・うに、本発明によれば、何ら特別な薬剤を
用いることなくして、活性化された担体粒子を含むラテ
ックスを凍結乾燥して、保存性、分散性、再現性にすぐ
れる再分散性生理活性物質固定化用担体粒子を得ること
ができ、しかも、かかる担体粒子は、それ自体既に活性
化されているので、水性媒体に再分散させて、直ちに生
理活性物質を固定化することができると共に、・活性化
担体粒子は、ｍ位重量当たり非常に大きい表面積を有す
るので、高活性の固定化生理活性物質を得ることができ
る。

また、粒子担体を構成するための重合体粒子として、前
述したようなアクリル酸誘導体とアクリル酸フルオロア
ルキルエステル誘導体とからなる共重合体を用いるとき
、得られる担体粒子がその粒径分布において狭く、均一
であり、■一つ、水性媒体中での分散性に著しくすぐれ
るので、生理活性物質を固定化するに際して、高い活性
収率を得ることができる。

去覇護１１ 以下Ｑこ実施例を挙げて本発明を説明するが、木発明は
これら実施例によって何ら制限されるものではない。

濯り廿買七済ＩＶζ３イ二ζ−カー界色≧ぜ一ンーイー
スー士剋施Ｍ実施例１〜８及び比較例１〜４ 第１表に示す組成の単量体混合物９０ｇを蒸留水３５０
ｇに加え、次いで、これに過硫酸アンモニウム０．３６
　ｇを蒸留水Ｌｏｇに溶解させた水溶液を７０℃の温度
で窒素気流下に加えた後、２５０　ｒｐｍにて攪拌しつ
つ、７時間重合させて、カルボキシル化ラテックスを得
た。重合状態、重合率、得られたラテックス粒子の平均
粒径及び粒子表面のカルボキシル基量を第１表に示す。

次に、上記実施例１及び２において得たラテックス（固
形分５重量％）５０ｍｌに１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド２００ｍｇを蒸留
水１．０ｍｌに溶解させた水溶液を加え、室温にて１時
間反応させた後、スベーザ基としてのε−アミノカプロ
ン酸の水溶液（０，０３ｍｏｌ／］）　５０　ｍｌを加
え、更に、室温にて５時間反応させた。この後、反応混
合物を遠心分離洗浄して、第　　１ （注）１）ＭＭＡ−メチルメタクリレート、８　Ｆ　Ｍ
　＝　ＩＩＩ、　ｌ１ｌＡＡ−アクリル酸、ＴＧＤ＝　
ｌ−リエチレングリ：２）凝集物を蒸留水中に再分散さ
せ、超音波分散さ−１の値である。

、５１１−オクタフルオｌコベンチルメタクリレ−１・
、１−ルジメタクリレ−１・。

Ｊ゛た後、濾紙（ｍｌ＞で濾過したものに・ついて未反
応のε−アミノカプロン酸を除去し、スペーサ化ラテッ
クス粒子を得た。

上記スペーサ化反応によって得られたスペーサ化ラテッ
クス粒子は、いずれも分散状態が安定であった。また、
実施例１のラテックス粒子からのスペーサ化ラテックス
粒子（これを実施例３とする。）の表面のカルボキシル
基量は１．９μｍｏｌ／ｍ２であり、実施例２のラテッ
クス粒子からのスペーサ化ラテックス粒子（これを実施
例４とする。）の表面のカルボキシル基量は６．８μｍ
ｏｌ／ｍ２であった。

次に、以上のようにして得た実施例１〜４及び比較例１
及び２のラテックス（固形分５重量％）１０ｍｌに１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド１０■をホウ酸緩衝液（０，１ｍｏｌ／　７＋、
ｐＨ８，０）１ｍｌに溶解させた水溶液を加え、１０℃
にて１時間攪拌して反応させた。

この後、得られた活性化ラテックスを遠心分離し、上記
と同じホウ酸緩衝液にて２回洗浄し、上記と同じホウ酸
緩衝液に固形分２．５重量％となるように再分散させた
。また、このようにして得たそれぞれのラテックスを一
７０℃に凍結し、減圧下に乾燥した。

これらラテックスの凍結乾燥品と当初のままのラテック
スについて、所定期間保存した後、その保存安定性を以
下のようにして評価した。即ち、ウシ血清アルブミン（
アーマ−社製）４０■をホウ酸緩衝液（０，１ｍｏｌ／
］、　ｐＨ８，０）　　１０ｍｌに溶解した水溶液を当
初のままのラテックス又は凍結乾燥品に蒸留水を加えて
当初の固形分濃度に戻したラテックスに加え、４　’ｃ
にて一晩放置した後、遠心分離にて未反応ウシ血清アル
ブミンを除去し、ラテックス粒子へのウシ血清アルブミ
ンの固定化量にて、それぞれの保存安定性を評価した。

結果を第２表及び第１図から第５図に示す。尚、第２表
は、活性化ラテックスの調製直後の分散状態及びウシ血
清アルブミンの固定化量と共に、これら活性化ラテック
スの調製直後にその凍結乾燥品を調製し、これを水性媒
体中に再分散させたときの分散状態及びウシ血清アルブ
ミンの固定化量を示し、他方、第１図から第５図は、活
性化ラテックス及びその凍結乾燥品について、所定期間
保存後に上記と同様にして調べた分散状態及びウシ血清
アルブミンの固定化量を示す。

これらの結果から、本発明による活性化ラテックス粒子
の凍結乾燥品は、３か月後も、これを水性媒体中に再分
散させたとき、当初とほぼ同じ固定化量を示し、保存安
定性にすぐれることが示される。

実施例９ 実施例４として得たラテックス（固形分５重量％）１０
ｍｌに１−シクロへキシル−３−（２−モルホリノエチ
ル）カルボジイミド−メト−ｐ−４ルエンスルポネート
１０■をホウ酸緩衝液（０，１ｍｏｌ／Ｉ　、　ｐｌ＋
８．０　）　　Ｉ　ｍｌに溶解した溶液を加え、１０℃
にて１時間、攪拌下に反応させた。この後、得られた活
性化ラテックスを遠心分離し、」１記と同じ緩衝液にて
２回洗浄し、」１記と同じ緩衝液に固形分２．５重量％
となるように再分散させた。これを−７０°Ｃに凍結し
、減圧下に乾燥した。

この凍結乾燥品を藤留水にて当初の固形分濃度に戻し、
これにペルオキシダーゼ（シグマ社製Ｔｙｐｅ　ＩＶ）
　４０ｍｇをホウ酸緩衝液（０，１ｍｏｌ／］、ｐｌ＋
８．０）　　１０ｍｌに溶解させた溶液を加え、４°Ｃ
にて一晩放置した後、遠心分離にて未反応のペルオキシ
ダーゼを除去した。

このよ・うにして得たラテックス粒子にはペルオキシダ
ーゼ７曙が固定化されていた。このラテックスを光学顕
微鏡（２００倍）にて観察したところ、均一であって、
凝集は全く認められなかった。

また、このラテックスは、フェニレンジアミン（５ｍｍ
ｏｌ／Ｉ）と過酸化水素（１，５ｍｍｏｌ／ｌ）の混合
水溶液にて発色し、酵素活性が保持されていることが確
認された。

実施例１０ 実施例７として得たラテックス凍結乾燥品に蒸留水を加
えて当初の固形分濃度とし、これに抗ヒ１−ＩｇＧ　（
Ｄａｋｏ社製、４　ｎａ／ｍｌ＞　　１０ｍｌを加え、
４℃で一晩放置した。遠心分離によって未反応抗ヒ１１
ｇＧを除去し、洗浄した後、０．　Ｏ１，ｍｏｌ／Ｉ　
ボウ酸緩衝液（ｐＨ８，０）にて固形分１重量％６ごな
るように希釈した。このラテックスにば抗ヒｌ−１ｇＧ
３■が結合されており、これを光学顕微鏡にて観察した
が、完全に均一であって、凝集は全く認められなかった
。

上記ラテックスとヒｌｉｇＧ熔液（シグマ社製の凍結乾
燥品を０．０１ｍｏｌハホウ酸緩衝液（ｐ）Ｉ　８．０
　）で希釈したもの）を等量混合したところ、ヒｈ１ｇ
ＧＯ３１μｇ／ｍｌまで、ラテックスの凝集が認められ
た。

盾判匙刃−ζレスー＊二層−Ｖ−リ：！ｌＬンスク２−
Ｙイー逮Ｊヤ（■公（失薯■ 実施例１１〜１４及び比較例５〜６ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド１０■及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド１
０■をホウ酸緩衝液（０，］、　ｍｏｌ／ＬｐＨ８，Ｏ
）　　１　ｍｌに溶解させた水溶液を前述した実施例１
〜４及び比較例１及び２のそれぞれのラテックス（固形
分５重量％）１０ｍｌに加え、１０°Ｃにて１時間攪拌
して反応させた。この後、得られた活性化ラテックスを
遠心分離し、Ｊ−記と同じ、」クラ酸緩衝液にて２回洗
浄し、上記と同じホウ酸緩衝液に固形分２．５重量％と
なるように再分散させた。

また、この３１ンうにして得たそれぞれのラテックスを
一７０℃に凍結し、減圧下に乾燥した。

これらラテックスの凍結乾燥品と当初のままのラテック
スについて、その保存安定性を分散状態とウシ血清アル
ブミンの固定化量にて評価する前述した方法によって調
べた。結果を第３表及び第６図から第１０図に示す。尚
、第３表は、活性化ラテックスの調製直後の分散状Ｉ！
■及びウシ血？Ｈアルブミンの固定化量と共に、これら
活性化ラテックスのＩＩ調製直後その凍結乾燥品を調製
し、これを水性媒イ（＼中に再分散さ−Ｕたときの分散
状態及びウシ血清アルブミンの固定化量を示し７、他方
、第６図から第１０図は、活性化ラテックス及びその凍
結乾燥品について、所定１■間保存後に−１−記と同様
にして調べた分散状態及びウシ血清アルブミンの固定化
量を示す。

本発明による活性化ラテックスの凍結乾燥品は、３か月
後に水性媒体中に再分散させたときも、当初とほぼ同じ
分散状態及び固定化量を示し、保存安定性にすぐれるこ
とが示される。

実施例１５ 実施例４として得たラテックス（固形分５重量％）１０
ｎ＋１に１−シクロへキシル−３−（モルホリノエチル
）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンスルホネート１
０■及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド１０■をホウ酸
緩衝液（０，１ｍｏｌ／］　、ｐＨ８，０）１ｍｌに溶
解した溶液を加え、１０°Ｃにて１時間、攪拌下に反応
させた。この後、得られた活性化ラテックスを遠心分離
し、上記と同じ緩衝液にて２回洗浄し、上記と同じ緩衝
液に固形分２．５重量％となるように再分散させた。こ
れを−７０℃に凍結し、減圧下に乾燥した。

このラテックスの凍結乾燥品を蒸留水にて当初の固形分
濃度に戻し、これにペルオキシダーゼ（シグマ社製Ｔｙ
ｐｅ　ＩＶ）　４０■をホウ酸緩衝液（０，１ｍｏｌ／
Ｉ　、　ｐＨ８，０）　　１０ｍｌに溶解させた溶液を
加え、４℃にて一晩放置した後、遠心分離にて未反応の
ペルオキシダーゼを除去した。

このようにして得たラテックス粒子にはペルオキシダー
ゼ９■が固定化されていた。このラテックスを光学顕微
鏡（２００倍）にて観察したところ、均一であって、凝
集は全く認められなかった。

また、このラテックスは、フェニレンジアミン（５ｍｍ
ｏｌ／１）と過酸化水素（１，５ｍｍｏｌ／Ｉ）の混合
水溶液にて発色し、酵素活性が保持されていることが確
認された。

実施例１６ 実施例１３として得たラテックス凍結乾燥品に蒸留水を
加えて当初の固形分濃度とし、これに抗ヒ目ｇＧ　（Ｄ
ａｋｏ社製、４ｍｇ／ｍ＋）　　１０ｍｌを加え、４°
Ｃで一晩放置した。遠心分離によって未反応抗ヒトｒｇ
Ｇを除去し、洗浄した後、ホウ酸緩衝液（０，０１ｍｏ
ｌ／　Ｉｔ、ｐＨ８，０）にて固形分１重量％になるよ
うに希釈した。このラテックスには抗ヒ）ＩｇＧ１１■
が結合されており、これを光学顕微鏡にて観察したが、
完全に均一であって、凝集は全く認められなかった。

」１記ラテックスとヒｔｉｇＧ溶液（シグマ社製の凍結
乾燥品をホウ酸緩衝液（０，０１ｍｏｌ／１、ｐＨ７゜
０）で希釈したもの）を等量混合したところ、ヒ１−１
ｇＧ０．１μｇ／ｍ＋まで、ラテックスの凝集が認めら
れた。

【図面の簡単な説明】

第１図から第５図は、活性化剤としてカルボジイミドを
用いて得た本発明による担体粒子と比較例としての担体
粒子の保存期間とウシ血清アルブミンの固定化量との関
係を示すグラフ、第６図から第１０図は、活性化剤とし
てＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて得た本発明に
よる担体粒子と比較例としての担体粒子の保存期間とウ
シ血清アルブミンの固定化量との関係を示すグラフであ
る。 特許出願人　日東電気工業株式会社 代理人　弁理士　　牧　野　逸　部 薪、６−右同 肘、イも−＝蝮且１百Ａ パ１右−Ｊ１？１ 符、蒔ｎ闇

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）カルボキシル基を有する重合体粒子を含むラテッ
   クスを一般式 Ｒ＾ａ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ＾ｂ （式中、Ｒ＾ａ及びＲ＾ｂはそれぞれ独立に炭素数５又
   は６のシクロアルキル基、炭素数２〜１２のアルキル基
   、モノアリール基、モノアリール置換低級アルキル基、
   モルホリノ基、ピペリジル基、低級アルキル置換モルホ
   リニル基、低級アルキル置換ピペリジル基、ジ低級アル
   キルアミノ低級アルキル基又は低級アルキル置換ピリジ
   ル基を示す。） で表わされる水溶性カルボジイミドで活性化した後、凍
   結乾燥してなることを特徴とする再分散性生理活性物質
   固定化用担体粒子。
2. （２）重合体粒子が０．１〜６０μｍｏｌ／ｍ＾２のカ
   ルボキシル基を有することを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の再分散性生理活性物質固定化用担体粒子。
3. （３）重合体粒子が平均粒子径０．０３〜３μｍを有す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の再分散
   性生理活性物質固定化用担体粒子。
4. （４）重合体粒子が （ａ）一般式 Ｒ＾１ＣＨ＝ＣＲ＾２ＣＯＯＨ （但し、Ｒ＾１は水素、低級アルキル基又はカルボキシ
   ル基を示し、Ｒ＾２は水素又は低級アルキル基を示し、
   Ｒ＾１が水素又は低級アルキル基のときは、Ｒ＾２はカ
   ルボ低級アルコキシ基であつてもよい。） で表わされるアクリル酸誘導体０．１〜２０重量％、及
   び （ｂ）一般式 ＣＨ＿２＝ＣＲ＾３ＣＯＯＲ＾４（ＣＦ＿２）＿ｎＣＦ
   Ａ＿２（但し、Ｒ＾３は水素又は低級アルキル基を示し
   、Ｒ＾４は ▲数式、化学式、表等があります▼ （但し、ｍは０〜１２の整数を示し、ｘ＋ｙ＝ｍ−１で
   あり、Ｒ＾５は水素又はアセチル基を示す。）を示し、
   Ａはそれぞれ独立に水素、フッ素又はＣＦ＿３を示し、
   ｎは０〜１２の整数を示す。） で表わされるアクリル酸フルオロアルキルエステル誘導
   体と、上記アクリル酸誘導体を除くラジカル共重合性ビ
   ニル単量体との混合物であつて、この混合物に基づいて
   上記アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体が１〜
   １００重量％である混合物９９．９〜８０重量％ からなる単量体混合物を水性媒体中で乳化共重合させて
   なる水分散型高分子重合体粒子であることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の再分散性生理活性物質固定
   化用担体粒子。
5. （５）カルボキシル基を有する重合体粒子を含むラテッ
   クスをＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化した後、
   凍結乾燥してなることを特徴とする再分散性生理活性物
   質固定化用担体粒子。
6. （６）重合体粒子が０．１〜６０μモル／ｍ＾２のカル
   ボキシル基を有することを特徴とする特許請求の範囲第
   ５項記載の再分散性生理活性物質固定化用担体粒子。
7. （７）重合体粒子が平均粒子径０．０３〜３μｍを有す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第５項記載の再分散
   性生理活性物質固定化用担体粒子。
8. （８）重合体粒子が （ａ）一般式 Ｒ＾１ＣＨ＝ＣＲ＾２ＣＯＯＨ （但し、Ｒ＾１は水素、低級アルキル基又はカルボキシ
   ル基を示し、Ｒ＾２は水素又は低級アルキル基を示し、
   Ｒ＾１が水素又は低級アルキル基のときは、Ｒ＾２はカ
   ルボ低級アルコキシ基であつてもよい。） で表わされるアクリル酸誘導体０．１〜２０重量％、及
   び （ｂ）一般式 ＣＨ＿２＝ＣＲ＾３ＣＯＯＲ＾４（ＣＦ＿２）＿ｎＣＦ
   Ａ＿２（但し、Ｒ＾３は水素又は低級アルキル基を示し
   、Ｒ＾４は −（ＣＨ＿２）＿ｍ−又は−（ＣＨ＿２）＿ｘ−ＣＨ−
   （ＣＨ＿２）＿ｙ−ＯＲ＾５ （但し、ｍは０〜１２の整数を示し、ｘ＋ｙ＝ｍ−１で
   あり、Ｒ＾５は水素又はアセチル基を示す。）を示し、
   Ａはそれぞれ独立に水素、フッ素又はＣＦ＿３を示し、
   ｎは０〜１２の整数を示す。） で表わされるアクリル酸フルオロアルキルエステル誘導
   体と、上記アクリル酸誘導体を除くラジカル共重合性ビ
   ニル単量体との混合物であつて、この混合物に基づいて
   上記アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体が１〜
   １００重量％である混合物９９９．９〜８０重量％ からなる単量体混合物を水性媒体中で乳化共重合させて
   なる水分散型高分子重合体粒子であることを特徴とする
   特許請求の範囲第５項記載の再分散性生理活性物質固定
   化用担体粒子。