JPH07118340A - エチレンアミン類で修飾した親水性ゲル粒子 - Google Patents
エチレンアミン類で修飾した親水性ゲル粒子Info
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- JPH07118340A JPH07118340A JP29134393A JP29134393A JPH07118340A JP H07118340 A JPH07118340 A JP H07118340A JP 29134393 A JP29134393 A JP 29134393A JP 29134393 A JP29134393 A JP 29134393A JP H07118340 A JPH07118340 A JP H07118340A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 免疫学的診断薬材料に適した親水性ゲル粒子
を提供する。 【構成】 粒子表面にカルボキシル基またはエポキシ基
を有している親水性ゲル粒子のカルボキシル基またはエ
ポキシ基をエチレンジアミン類により修飾する。
を提供する。 【構成】 粒子表面にカルボキシル基またはエポキシ基
を有している親水性ゲル粒子のカルボキシル基またはエ
ポキシ基をエチレンジアミン類により修飾する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、免疫学的診断薬材料に
適した親水性ゲル粒子に関する。
適した親水性ゲル粒子に関する。
【０００２】
【従来の技術】現在、診断の重要な手段の一つに担体粒
子を用いた免疫学的検査法がある。これは被検査物質
（抗原または抗体）と反応する物質（抗体または抗原）
を結合させた担体粒子を検体と混合させ、特異的凝集の
有無を判定する検査法である。
子を用いた免疫学的検査法がある。これは被検査物質
（抗原または抗体）と反応する物質（抗体または抗原）
を結合させた担体粒子を検体と混合させ、特異的凝集の
有無を判定する検査法である。
【０００３】従来から、赤血球にツベルクリン多糖体や
蛋白質を固定する受身凝集反応による方法が開発された
（Ｇ．Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ，Ｒ．Ｊ．Ｄｕｂｏｓ、
Ｊ．ＥｘＰ．Ｍｅｄ．、８８、５２１、（１９４
８））。赤血球は大粒径・高比重であるので凝集反応の
時間が短く感度も比較的高いという利点があるものの、
表面に種々の抗原が存在し、個体差が大きいという欠点
があった。このほか、担体粒子としてポリスチレン、ス
チレン−アクリル酸共重合体などのラテックス粒子など
を用いた免疫学的診断薬も開発されている。しかし、こ
れらの粒子は、疎水性の傾向が強い表面のため実際の使
用に際して良好な結果が得られないという問題があっ
た。
蛋白質を固定する受身凝集反応による方法が開発された
（Ｇ．Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ，Ｒ．Ｊ．Ｄｕｂｏｓ、
Ｊ．ＥｘＰ．Ｍｅｄ．、８８、５２１、（１９４
８））。赤血球は大粒径・高比重であるので凝集反応の
時間が短く感度も比較的高いという利点があるものの、
表面に種々の抗原が存在し、個体差が大きいという欠点
があった。このほか、担体粒子としてポリスチレン、ス
チレン−アクリル酸共重合体などのラテックス粒子など
を用いた免疫学的診断薬も開発されている。しかし、こ
れらの粒子は、疎水性の傾向が強い表面のため実際の使
用に際して良好な結果が得られないという問題があっ
た。
【０００４】最近、開発された親水性で粒径分布が均一
な親水性ゲル粒子（特開平１−３１５４０８）はこれら
の欠点を克服した人工担体である。この粒子は、表面に
カルボキシル基やエポキシ基が出ている為、化学結合に
よって蛋白質を固定することが出きるが、化学結合によ
って製造された免疫学的診断薬の感度は、余り高いもの
ではなかった。
な親水性ゲル粒子（特開平１−３１５４０８）はこれら
の欠点を克服した人工担体である。この粒子は、表面に
カルボキシル基やエポキシ基が出ている為、化学結合に
よって蛋白質を固定することが出きるが、化学結合によ
って製造された免疫学的診断薬の感度は、余り高いもの
ではなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、かかる
従来技術の欠点を克服すべく鋭意検討した結果、粒子表
面のカルボキシル基またはエポキシ基をエチレンアミン
類により修飾した親水性粒子を見いだし、本発明を完成
するに至った。
従来技術の欠点を克服すべく鋭意検討した結果、粒子表
面のカルボキシル基またはエポキシ基をエチレンアミン
類により修飾した親水性粒子を見いだし、本発明を完成
するに至った。
【０００６】
【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、粒子表面にカルボキシル基またはエポキシ基を有し
ている親水性ゲル粒子のカルボキシル基またはエポキシ
基をエチレンアミン類により修飾して成る修飾親水性ゲ
ル粒子が提供される。
ば、粒子表面にカルボキシル基またはエポキシ基を有し
ている親水性ゲル粒子のカルボキシル基またはエポキシ
基をエチレンアミン類により修飾して成る修飾親水性ゲ
ル粒子が提供される。
【０００７】本発明で使用される親水性ゲル粒子は、粒
子表面にカルボキシル基またはエポキシ基を有する親水
性のゲル粒子であれば、天然物であっても合成されたも
のであってもよく、天然物としては、ゼラチンなどが例
示され、合成粒子としては、カルボキシル基を有する単
量体化合物単独、またはカルボキシル基を有する重合可
能な単量体化合物やエポキシ基を有する単量体化合物と
親水性基を有する単量体化合物とを常法により重合させ
て得られるものが例示される。カルボキシル基を有する
単量体化合物の具体例としては、アクリル酸、メタクリ
ル酸、クロトン酸、ケイ皮酸、イタコン酸、フマル酸、
マレイン酸、ブテントリカルボン酸、３−ブテン酸、４
−ペンテン酸などが挙げられ、エポキシ基を有する単量
体化合物の具体例としては、グリシジルアクリレート、
グリシジルメタクリレートなどが挙げられる。親水性基
を有する重合可能な単量体化合物は、単官能、多官能の
いずれでもよく、その具体例としては、アクリルアミ
ド、メタクリルアミド、ジアセトアクリルアミド、Ｎ−
ヒドロキシメチルアクリルアミドなどのアクルルアミド
類；メチレンビス（メタ）アクリルアミドなどのビス
（メタ）アクリルアミド類；エチレングリコールジ（メ
タ）アクリレート、トリエチレングリコールジメタクリ
レート、エチレンジメタクリレート、トリメチロールプ
ロパントリメタクリレート等の多官能性（メタ）アクリ
ル酸エステル等が例示され、これらを適当に組み合わせ
て製造することができるものである。とりわけ、特開平
１−３１５４０８公報に開示されているモノエチレン性
不飽和アミド単量体・架橋性エチレン性不飽和単量体・
エチレン性不飽和単量体・（メタ）アクリル酸エステル
単量体から成る親水性ゲル粒子が特に好ましい。ゲル粒
子の粒子径分布は、シャープであることが望ましく特に
望ましくは、水膨潤状態における粒子径が０．１〜１０
μｍ、粒子径分散が１．２以下であるゲル粒子である。
なお、本発明においては、水膨潤状態とは、ゲル粒子を
水に浸漬して膨潤させて平衡に達した、すなわちゲル粒
子が膨潤することによる粒径の増加が止まった状態をい
い、また粒子径分散とは、重量平均粒子径と数平均粒子
径の比であり、前者を後者で割った値をいう。
子表面にカルボキシル基またはエポキシ基を有する親水
性のゲル粒子であれば、天然物であっても合成されたも
のであってもよく、天然物としては、ゼラチンなどが例
示され、合成粒子としては、カルボキシル基を有する単
量体化合物単独、またはカルボキシル基を有する重合可
能な単量体化合物やエポキシ基を有する単量体化合物と
親水性基を有する単量体化合物とを常法により重合させ
て得られるものが例示される。カルボキシル基を有する
単量体化合物の具体例としては、アクリル酸、メタクリ
ル酸、クロトン酸、ケイ皮酸、イタコン酸、フマル酸、
マレイン酸、ブテントリカルボン酸、３−ブテン酸、４
−ペンテン酸などが挙げられ、エポキシ基を有する単量
体化合物の具体例としては、グリシジルアクリレート、
グリシジルメタクリレートなどが挙げられる。親水性基
を有する重合可能な単量体化合物は、単官能、多官能の
いずれでもよく、その具体例としては、アクリルアミ
ド、メタクリルアミド、ジアセトアクリルアミド、Ｎ−
ヒドロキシメチルアクリルアミドなどのアクルルアミド
類；メチレンビス（メタ）アクリルアミドなどのビス
（メタ）アクリルアミド類；エチレングリコールジ（メ
タ）アクリレート、トリエチレングリコールジメタクリ
レート、エチレンジメタクリレート、トリメチロールプ
ロパントリメタクリレート等の多官能性（メタ）アクリ
ル酸エステル等が例示され、これらを適当に組み合わせ
て製造することができるものである。とりわけ、特開平
１−３１５４０８公報に開示されているモノエチレン性
不飽和アミド単量体・架橋性エチレン性不飽和単量体・
エチレン性不飽和単量体・（メタ）アクリル酸エステル
単量体から成る親水性ゲル粒子が特に好ましい。ゲル粒
子の粒子径分布は、シャープであることが望ましく特に
望ましくは、水膨潤状態における粒子径が０．１〜１０
μｍ、粒子径分散が１．２以下であるゲル粒子である。
なお、本発明においては、水膨潤状態とは、ゲル粒子を
水に浸漬して膨潤させて平衡に達した、すなわちゲル粒
子が膨潤することによる粒径の増加が止まった状態をい
い、また粒子径分散とは、重量平均粒子径と数平均粒子
径の比であり、前者を後者で割った値をいう。
【０００８】本発明の修飾親水性ゲル粒子は、上記親水
性ゲル粒子の表面のカルボキシル基またはエポキシ基に
エチレンアミン類を結合させることにより製造される。
本発明で用いられるエチレンアミン類の具体例として
は、エチレンジアミン（ＮＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2）、ジエ
チレントリアミン（ＮＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ
Ｈ2）、トリエチレンテトラミン（（ＣＨ2ＮＨＣＨ2Ｃ
Ｈ2ＮＨ2）2）、テトラエチレンヘキサミン（ＮＨ2（Ｃ
Ｈ2ＣＨ2ＮＨ）3ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2）、ペンタエチレ
ンヘキサミン（ＮＨ2（ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ）4ＮＨＣＨ2Ｃ
Ｈ2ＮＨ2）等を例示することができる。これらのエチレ
ンアミン類のなかでも、１分子中のアミノ基の数が少な
いと再現性が低くなるため、好ましくは４以上、更に好
ましくは５以上のアミノ基を有するエチレンアミン類を
用いるのがよい。
性ゲル粒子の表面のカルボキシル基またはエポキシ基に
エチレンアミン類を結合させることにより製造される。
本発明で用いられるエチレンアミン類の具体例として
は、エチレンジアミン（ＮＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2）、ジエ
チレントリアミン（ＮＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ
Ｈ2）、トリエチレンテトラミン（（ＣＨ2ＮＨＣＨ2Ｃ
Ｈ2ＮＨ2）2）、テトラエチレンヘキサミン（ＮＨ2（Ｃ
Ｈ2ＣＨ2ＮＨ）3ＮＨＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2）、ペンタエチレ
ンヘキサミン（ＮＨ2（ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ）4ＮＨＣＨ2Ｃ
Ｈ2ＮＨ2）等を例示することができる。これらのエチレ
ンアミン類のなかでも、１分子中のアミノ基の数が少な
いと再現性が低くなるため、好ましくは４以上、更に好
ましくは５以上のアミノ基を有するエチレンアミン類を
用いるのがよい。
【０００９】粒子表面にエチレンアミン類を結合させる
方法は特に限定されず、例えば、粒子表面がカルボキシ
ル基である場合、粒子懸濁液にカルボジイミドとエチレ
ンアミン類を加えて、縮合反応させる方法（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ、２０、４８３６−４８４２（１９８
１））などが挙げられる。ここで使用されるカルボジイ
ミドとしては、１−エチル−３（３−ジメチルアミノプ
ロリル）カルボジイミドが例示される。
方法は特に限定されず、例えば、粒子表面がカルボキシ
ル基である場合、粒子懸濁液にカルボジイミドとエチレ
ンアミン類を加えて、縮合反応させる方法（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ、２０、４８３６−４８４２（１９８
１））などが挙げられる。ここで使用されるカルボジイ
ミドとしては、１−エチル−３（３−ジメチルアミノプ
ロリル）カルボジイミドが例示される。
【００１０】また、粒子表面がエポキシ基である場合
は、例えばカルボジイミドの存在下でエチレンアミン類
と反応後、二官能性アルデヒドで抗原または抗体を固定
させる方法（特開昭５３−１１８５１７）や、カルボキ
シル基にエチレンアミンを結合させた後、ヘテロ二官能
性架橋剤で抗体を固定化する方法（特開昭６２−１３２
１７２）などがある。
は、例えばカルボジイミドの存在下でエチレンアミン類
と反応後、二官能性アルデヒドで抗原または抗体を固定
させる方法（特開昭５３−１１８５１７）や、カルボキ
シル基にエチレンアミンを結合させた後、ヘテロ二官能
性架橋剤で抗体を固定化する方法（特開昭６２−１３２
１７２）などがある。
【００１１】このようにして得られた修飾親水性ゲル粒
子は、免疫学的診断薬として利用することができる。本
発明の粒子を免疫学的診断薬、例えば受身凝集反応の担
体として使用する場合、抗原または抗体を担体に固定す
る必要がある。この抗原または抗体を感作する方法は動
物赤血球やラテックスの担体に感作させる常法に従えば
良い。具体例としてはカルボジイミドを使って縮合させ
る方法やグルタルアルデヒドを使って架橋する方法など
が例示できる。本発明の粒子はこの中でも特にカルボジ
イミドによる縮合反応によって抗原や抗体を固定させる
と凝集反応における感度が秀でて向上する。
子は、免疫学的診断薬として利用することができる。本
発明の粒子を免疫学的診断薬、例えば受身凝集反応の担
体として使用する場合、抗原または抗体を担体に固定す
る必要がある。この抗原または抗体を感作する方法は動
物赤血球やラテックスの担体に感作させる常法に従えば
良い。具体例としてはカルボジイミドを使って縮合させ
る方法やグルタルアルデヒドを使って架橋する方法など
が例示できる。本発明の粒子はこの中でも特にカルボジ
イミドによる縮合反応によって抗原や抗体を固定させる
と凝集反応における感度が秀でて向上する。
【００１２】また、本発明の粒子を免疫学的診断薬、例
えば受身凝集反応の担体として使用する場合、粒子を着
色するのが好ましい。これにより親水性ゲル粒子は通常
は白色であり、これを着色することで凝集像の判定を容
易にすることができる。着色処理の段階は、親水性粒子
をエチレンアミン類で修飾する前であっても修飾後であ
っても構わない（以下、前者を前修飾、後者を後修飾と
いう）。着色剤としては、例えば、リアクテブ・バイオ
レット、食用赤色３号、ローズベンガル、ニュートラル
レッドなどの赤色色素、あるいはクリスタルバイオレッ
ト、メチレンブルーなどの青色色素等を用いることが出
来る。
えば受身凝集反応の担体として使用する場合、粒子を着
色するのが好ましい。これにより親水性ゲル粒子は通常
は白色であり、これを着色することで凝集像の判定を容
易にすることができる。着色処理の段階は、親水性粒子
をエチレンアミン類で修飾する前であっても修飾後であ
っても構わない（以下、前者を前修飾、後者を後修飾と
いう）。着色剤としては、例えば、リアクテブ・バイオ
レット、食用赤色３号、ローズベンガル、ニュートラル
レッドなどの赤色色素、あるいはクリスタルバイオレッ
ト、メチレンブルーなどの青色色素等を用いることが出
来る。
【００１３】
【発明の効果】本発明の修飾親水性ゲル粒子は、抗原や
抗体を感作することで感度の高い診断用担体として有用
である。
抗体を感作することで感度の高い診断用担体として有用
である。
【００１４】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。尚、実施例、参考例、試験例、および比較
試験例中の％は特に断りのないかぎり重量基準である。
に説明する。尚、実施例、参考例、試験例、および比較
試験例中の％は特に断りのないかぎり重量基準である。
【００１５】（実施例１） （１）親水性ゲル粒子の製造 攪はん翼、冷却コンデンサー、窒素ガス導入管、温度計
を付した２ｌの反応器を予め窒素置換しておき、この反
応器中にエタノール７５０ｇ、アクリルアミド６７．１
ｇ、グリシジルメタクリレート１０ｇ、メチレンビスア
クリルアミド１６．２ｇ、メタクリル酸１０ｇ、２，
２’−アゾビスイソブチロニトリル０．４２ ｇを添加
して、均一になるまで攪はんした。その後、窒素バブリ
ング下に６０℃に加温し、反応を開始させ、そのまま２
４時間保った後冷却した。得られたゲル微粒子懸濁液か
らエバポレーターにてエタノールを除去し、さらに真空
乾燥器にて１２時間処理して完全にエタノールを除去し
て、ゲル微粒子粉末を得た。蒸留水にこのゲル微粒子粉
末を加え、その懸濁液を０．１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ９に
調製した。水膨潤状態のゲル微粒子の粒子径をコールタ
ーマルチサイザー（コールター社製）を用いて測定した
結果、重量平均粒子径２．０５μｍ、数平均粒子径１．
８２μｍで粒子径分散１．１３の単分散粒子径分布を有
していた。また得られたゲル微粒子の赤外吸収スペクト
ルからカルボキシル基、エポキシ基の存在が確認され
た。
を付した２ｌの反応器を予め窒素置換しておき、この反
応器中にエタノール７５０ｇ、アクリルアミド６７．１
ｇ、グリシジルメタクリレート１０ｇ、メチレンビスア
クリルアミド１６．２ｇ、メタクリル酸１０ｇ、２，
２’−アゾビスイソブチロニトリル０．４２ ｇを添加
して、均一になるまで攪はんした。その後、窒素バブリ
ング下に６０℃に加温し、反応を開始させ、そのまま２
４時間保った後冷却した。得られたゲル微粒子懸濁液か
らエバポレーターにてエタノールを除去し、さらに真空
乾燥器にて１２時間処理して完全にエタノールを除去し
て、ゲル微粒子粉末を得た。蒸留水にこのゲル微粒子粉
末を加え、その懸濁液を０．１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ９に
調製した。水膨潤状態のゲル微粒子の粒子径をコールタ
ーマルチサイザー（コールター社製）を用いて測定した
結果、重量平均粒子径２．０５μｍ、数平均粒子径１．
８２μｍで粒子径分散１．１３の単分散粒子径分布を有
していた。また得られたゲル微粒子の赤外吸収スペクト
ルからカルボキシル基、エポキシ基の存在が確認され
た。
【００１６】（２）修飾親水性ゲル粒子の製造と修飾親
水性ゲル粒子懸濁液の調製 上記（１）で得られたゲル微粒子粉末を、粒子濃度が１
０％になるようにｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸塩緩衝液
（ＰＢＳ）で膨潤させた。水膨潤状態のゲル粒子懸濁液
２５ｇを遠心分離機（日立工機 ０５−ＰＲ２２）を用
いて２，０００Ｇ、４分の遠心で膨潤粒子を沈降させ、
上澄液を捨てた。２．５％チバクロンバイオレット（チ
バガイギー社製）１２．５ｍｌを加え、さらに０．０７
Ｍペンタエチレンヘキサミン水溶液を４ｍｌ加えて４５
℃で２時間振とうした。その後、遠心分離機で粒子を沈
降させ蒸留水４ｍｌで洗浄した。この洗浄操作を３回繰
り返した後、酢酸バッファー（０．１Ｍ酢酸−酢酸ナト
リウム［ｐＨ４．０］、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％
Ｔｗｅｅｎ８０）４０ｍｌで２回、炭酸バッファー
（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3［ｐＨ８．０］、０．５Ｍ
ＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−８０）４ｍｌで２回、
粒子を洗浄した。更に、蒸留水４０ｍｌで３回洗浄し、
粒子を蒸留水４ｍｌに懸濁し、親水性ゲル粒子の表面の
エポキシ基をペンタエチレンヘキサミンで修飾した修飾
親水性着色ゲル粒子の懸濁液を得た。この懸濁液を２５
００×Ｇで５分間遠心分離して、粒子の湿潤重量を求
め、湿潤粒子の５％懸濁液となるように調整した。
水性ゲル粒子懸濁液の調製 上記（１）で得られたゲル微粒子粉末を、粒子濃度が１
０％になるようにｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸塩緩衝液
（ＰＢＳ）で膨潤させた。水膨潤状態のゲル粒子懸濁液
２５ｇを遠心分離機（日立工機 ０５−ＰＲ２２）を用
いて２，０００Ｇ、４分の遠心で膨潤粒子を沈降させ、
上澄液を捨てた。２．５％チバクロンバイオレット（チ
バガイギー社製）１２．５ｍｌを加え、さらに０．０７
Ｍペンタエチレンヘキサミン水溶液を４ｍｌ加えて４５
℃で２時間振とうした。その後、遠心分離機で粒子を沈
降させ蒸留水４ｍｌで洗浄した。この洗浄操作を３回繰
り返した後、酢酸バッファー（０．１Ｍ酢酸−酢酸ナト
リウム［ｐＨ４．０］、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％
Ｔｗｅｅｎ８０）４０ｍｌで２回、炭酸バッファー
（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3［ｐＨ８．０］、０．５Ｍ
ＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−８０）４ｍｌで２回、
粒子を洗浄した。更に、蒸留水４０ｍｌで３回洗浄し、
粒子を蒸留水４ｍｌに懸濁し、親水性ゲル粒子の表面の
エポキシ基をペンタエチレンヘキサミンで修飾した修飾
親水性着色ゲル粒子の懸濁液を得た。この懸濁液を２５
００×Ｇで５分間遠心分離して、粒子の湿潤重量を求
め、湿潤粒子の５％懸濁液となるように調整した。
【００１７】（参考例） （１）非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスゲノムのｃＤＮＡをクロ
ーニングしたプラスミドｐＩＫ４ＣＥの作製 Ｂ型肝炎陰性でＧＰＴ値１００単位以上のヒト血清０．
５ｍｌに５倍量のグアニジウムチオシアネート溶液（４
Ｍグアニジウムチオシアネート、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ
２−メルカプトメタノール、２％ザルコシル）を加
え、フェノール／クロロホルム抽出し、グリコーゲンを
キャリアーとしてエタノール沈澱により血清中の全ＲＮ
Ａを精製した。一方、岡本ら（Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．，６０、第３号、第１６７−１７７頁、１
９９０年）の結果を元に４つのプライマー（ＣＡＴＡ
ＴＧＡＧＣＡＣＧＡＡＴＣＣＴＡＡ、ＣＣＣＡＡＣＧ
ＡＧＣＡＡＧＴＣＧＡＣＧＴ、ＴＧＡＴＣＡＴＧＣＡ
ＴＡＣＴＣＣＣＧＧＧＴ、ＧＣＴＧＣＣＧＴＴＧＧＴ
ＡＴＴＣＡＣＡＡ）を作製した。の合成ＤＮＡをプラ
イマーとして前記ＲＮＡのｃＤＮＡを、ｃＤＮＡ合成シ
ステム（ベーリンガーマンハイム社製）を用いて作製し
た。合成したｃＤＮＡをテンプレートとして、合成した
ｃＤＮＡをテンプレートとして前記〜のプライマー
を使ったＰＣＲを行い、目的とするＤＮＡ断片を増幅し
た。増幅されたＤＮＡ断片の５’末端をＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼによりリン酸化した後、ＳｍａＩで消化
したｐＵＣ１８と連結し、３．４１ｋｂｐのプラスミド
ｐＩＫＣと３．４５ＫｂｐのプラスミドｐＩＫＥを得
た。ｐＩＫＣ中に挿入された非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの
ｃＤＮＡ断片の３’部分とｐＩＫＥ中に挿入された非Ａ
非Ｂ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡ断片の５’部分は一部重
複しているので、ｐＩＫＣとｐＩＫＥを制限酵素Ａｖａ
Ｉで消化した後、連結し、得られた４．０１ｋｂｐのプ
ラスミドをｐＩＫ４ＣＥと命名した。
ーニングしたプラスミドｐＩＫ４ＣＥの作製 Ｂ型肝炎陰性でＧＰＴ値１００単位以上のヒト血清０．
５ｍｌに５倍量のグアニジウムチオシアネート溶液（４
Ｍグアニジウムチオシアネート、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ
２−メルカプトメタノール、２％ザルコシル）を加
え、フェノール／クロロホルム抽出し、グリコーゲンを
キャリアーとしてエタノール沈澱により血清中の全ＲＮ
Ａを精製した。一方、岡本ら（Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．，６０、第３号、第１６７−１７７頁、１
９９０年）の結果を元に４つのプライマー（ＣＡＴＡ
ＴＧＡＧＣＡＣＧＡＡＴＣＣＴＡＡ、ＣＣＣＡＡＣＧ
ＡＧＣＡＡＧＴＣＧＡＣＧＴ、ＴＧＡＴＣＡＴＧＣＡ
ＴＡＣＴＣＣＣＧＧＧＴ、ＧＣＴＧＣＣＧＴＴＧＧＴ
ＡＴＴＣＡＣＡＡ）を作製した。の合成ＤＮＡをプラ
イマーとして前記ＲＮＡのｃＤＮＡを、ｃＤＮＡ合成シ
ステム（ベーリンガーマンハイム社製）を用いて作製し
た。合成したｃＤＮＡをテンプレートとして、合成した
ｃＤＮＡをテンプレートとして前記〜のプライマー
を使ったＰＣＲを行い、目的とするＤＮＡ断片を増幅し
た。増幅されたＤＮＡ断片の５’末端をＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼによりリン酸化した後、ＳｍａＩで消化
したｐＵＣ１８と連結し、３．４１ｋｂｐのプラスミド
ｐＩＫＣと３．４５ＫｂｐのプラスミドｐＩＫＥを得
た。ｐＩＫＣ中に挿入された非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの
ｃＤＮＡ断片の３’部分とｐＩＫＥ中に挿入された非Ａ
非Ｂ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡ断片の５’部分は一部重
複しているので、ｐＩＫＣとｐＩＫＥを制限酵素Ａｖａ
Ｉで消化した後、連結し、得られた４．０１ｋｂｐのプ
ラスミドをｐＩＫ４ＣＥと命名した。
【００１８】（２）非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスのコア抗原
の調製 上記（１）で得たプラスミドｐＩＫ４ＣＥを制限酵素Ｎ
ｄｅＩとＣｌａＩで切断後、酵素クレノウフラグメント
で平滑末端にし、０．３７ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロ
ースゲルから回収した。プラスミドｐＫＫ２２３−３
（ファルマシア社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、
酵素クレノウフラグメントで平滑末端にし、先に回収し
た０．３７ｋｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲースを使
って挿入した。このＤＮＡで大腸菌ＪＭ１０９を形質転
換し、出現したアンピシリン耐性の形質転換菌から挿入
ＤＮＡが正方向（挿入されたコアタンパク質が本来翻訳
されるべき方向とｐＫＫ２２３−３のｔａｃプロモータ
ーの転写方向とが同一方向の場合を正方向とする）に挿
入されているプラスミドを持ったコロニーを選択した。
なお、正方向のプラスミド（これをｐＫＫＣｌａと命
名）の選択は制限酵素ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断
した時、約０．３４ｋｂｐ断片が出現する事で容易に選
択出来る。
の調製 上記（１）で得たプラスミドｐＩＫ４ＣＥを制限酵素Ｎ
ｄｅＩとＣｌａＩで切断後、酵素クレノウフラグメント
で平滑末端にし、０．３７ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロ
ースゲルから回収した。プラスミドｐＫＫ２２３−３
（ファルマシア社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、
酵素クレノウフラグメントで平滑末端にし、先に回収し
た０．３７ｋｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲースを使
って挿入した。このＤＮＡで大腸菌ＪＭ１０９を形質転
換し、出現したアンピシリン耐性の形質転換菌から挿入
ＤＮＡが正方向（挿入されたコアタンパク質が本来翻訳
されるべき方向とｐＫＫ２２３−３のｔａｃプロモータ
ーの転写方向とが同一方向の場合を正方向とする）に挿
入されているプラスミドを持ったコロニーを選択した。
なお、正方向のプラスミド（これをｐＫＫＣｌａと命
名）の選択は制限酵素ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断
した時、約０．３４ｋｂｐ断片が出現する事で容易に選
択出来る。
【００１９】５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した
ＬＢ培地（”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ”６８
頁、発行元名コールド・スプリング・ハーバー研究所、
１９８２年発行）８ｌに先に選択された形質転換ＪＭ１
０９を６６０ｎｍでの濁度が０．１５になるように植菌
した。これを３７℃で２時間振とう培養後、１ｍＭＩＰ
ＴＧで誘導し、さらに３７℃で４時間振とう培養した。
遠心分離によって２０ｇの湿菌体を得た。これを６０ｍ
ｌのＰＢＳ（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、０．８５
％塩化ナトリウム）に懸濁後、フレンチプレス（大岳製
作所５６１５型、１５００ｋｇｆ／ｃｍ2）で破砕し、
１５，０００×ｇで２０分の遠心分離で沈澱を集めた。
次に６０ｍｌの可溶化バッファー（７Ｍ尿素、２０ｍＭ
ジチオスレイトール、１％トリトンＸ−１００、５０ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０））に懸濁し、超音波破砕機
（Ｂｒａｎｓｏｎ，ｓｏｎｉｆｉｅｒＩＩ）にて分散
後、室温で一晩振とうさせ、可溶画分として粗蛋白液を
得た。これをＣＭ−トヨパール（東ソー社製）のカラム
（直径２ｃｍ×１６ｃｍ）に吸着させ、６Ｍ尿素存在下
で０．２〜０．８Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配（４００ｍ
ｌ）で溶出を行い、純度が９９％以上の非Ａ非Ｂ型肝炎
ウイルスのコア蛋白質を約１０ｍｇ得た。これをＰＢＳ
で透析した後、コア蛋白の濃度をローリー法で測定した
ところ１．５ｍｇ／ｍｌであった。この液を抗原原液と
した。
ＬＢ培地（”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ”６８
頁、発行元名コールド・スプリング・ハーバー研究所、
１９８２年発行）８ｌに先に選択された形質転換ＪＭ１
０９を６６０ｎｍでの濁度が０．１５になるように植菌
した。これを３７℃で２時間振とう培養後、１ｍＭＩＰ
ＴＧで誘導し、さらに３７℃で４時間振とう培養した。
遠心分離によって２０ｇの湿菌体を得た。これを６０ｍ
ｌのＰＢＳ（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、０．８５
％塩化ナトリウム）に懸濁後、フレンチプレス（大岳製
作所５６１５型、１５００ｋｇｆ／ｃｍ2）で破砕し、
１５，０００×ｇで２０分の遠心分離で沈澱を集めた。
次に６０ｍｌの可溶化バッファー（７Ｍ尿素、２０ｍＭ
ジチオスレイトール、１％トリトンＸ−１００、５０ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０））に懸濁し、超音波破砕機
（Ｂｒａｎｓｏｎ，ｓｏｎｉｆｉｅｒＩＩ）にて分散
後、室温で一晩振とうさせ、可溶画分として粗蛋白液を
得た。これをＣＭ−トヨパール（東ソー社製）のカラム
（直径２ｃｍ×１６ｃｍ）に吸着させ、６Ｍ尿素存在下
で０．２〜０．８Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配（４００ｍ
ｌ）で溶出を行い、純度が９９％以上の非Ａ非Ｂ型肝炎
ウイルスのコア蛋白質を約１０ｍｇ得た。これをＰＢＳ
で透析した後、コア蛋白の濃度をローリー法で測定した
ところ１．５ｍｇ／ｍｌであった。この液を抗原原液と
した。
【００２０】（試験例） 免疫学的診断 実施例１で得られた濃度５％の染色粒子懸濁液を０．２
５ｍｌを試験管にとり、遠心分離機で粒子を沈降させ上
澄みを捨てた後、参考例に従って調製した抗原原液をＰ
ＢＳで１００μｇ／ｍｌに希釈した液を１ｍｌ加えた。
更に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロリル）
カルボジイミドをＰＢＳで５０ｍｇ／ｍｌに溶かし、こ
の液を０．２ｍｌ添加した。３７℃で９０分間反応さ
せ、抗原を粒子に固定させた。この粒子を冷ＰＢＳで５
回洗浄し、凝集反応希釈液（１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ
６．０）、０．３％正常兎血清、０．０２％ＮａＮ3）
５ｍｌに懸濁し、濃度１％の感作粒子液を得た。Ｖ底マ
イクロプレート（バイオテック社製；９６Ｖ−Ｒ）の各
ウエルに非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清を凝集反応希釈液で２
倍ずつ段階希釈したものを２５μｌ加え、濃度１％の感
作粒子液２５μｌ加え、２時間室温に放置した。２時間
後各ウエルの凝集像の有無を観察した。
５ｍｌを試験管にとり、遠心分離機で粒子を沈降させ上
澄みを捨てた後、参考例に従って調製した抗原原液をＰ
ＢＳで１００μｇ／ｍｌに希釈した液を１ｍｌ加えた。
更に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロリル）
カルボジイミドをＰＢＳで５０ｍｇ／ｍｌに溶かし、こ
の液を０．２ｍｌ添加した。３７℃で９０分間反応さ
せ、抗原を粒子に固定させた。この粒子を冷ＰＢＳで５
回洗浄し、凝集反応希釈液（１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ
６．０）、０．３％正常兎血清、０．０２％ＮａＮ3）
５ｍｌに懸濁し、濃度１％の感作粒子液を得た。Ｖ底マ
イクロプレート（バイオテック社製；９６Ｖ−Ｒ）の各
ウエルに非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清を凝集反応希釈液で２
倍ずつ段階希釈したものを２５μｌ加え、濃度１％の感
作粒子液２５μｌ加え、２時間室温に放置した。２時間
後各ウエルの凝集像の有無を観察した。
【００２１】（比較試験例） （１）非修飾粒子を用いた診断 実施例１においてペンタエチレンヘキサミンの代わりに
等量の蒸留水で同様の処理をした後、実施例１と同様に
して調製した濃度１％の感作粒子液を用いて、上記試験
例と同様の評価を行った。
等量の蒸留水で同様の処理をした後、実施例１と同様に
して調製した濃度１％の感作粒子液を用いて、上記試験
例と同様の評価を行った。
【００２２】（２）エチレン基を有さないアミンで修飾
した粒子を用いた診断 実施例１においてペンタエチレンヘキサミンの代わりに
６Ｍヒドラジンを用いること以外は実施例１と同様にし
て調製した濃度１％の感作粒子液を用いて、上記試験例
と同様の評価を行った。
した粒子を用いた診断 実施例１においてペンタエチレンヘキサミンの代わりに
６Ｍヒドラジンを用いること以外は実施例１と同様にし
て調製した濃度１％の感作粒子液を用いて、上記試験例
と同様の評価を行った。
【００２３】以上の試験例および比較試験例の結果を表
１に示す。
１に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】表１の結果から、本発明のゲル粒子はペン
タエチレンヘキサミンで処理をしない粒子に比べ、診断
薬としての鋭敏性が優れていることが分かった。
タエチレンヘキサミンで処理をしない粒子に比べ、診断
薬としての鋭敏性が優れていることが分かった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 安田 斡司 神奈川県川崎市川崎区夜光１−２−１ 日 本ゼオン株式会社研究開発センター内
Claims (2)
- 【請求項１】 粒子表面にカルボキシル基またはエポキ
シ基を有している親水性ゲル粒子のカルボキシル基また
はエポキシ基をエチレンアミン類により修飾して成る修
飾親水性ゲル粒子。 - 【請求項２】 親水性ゲル粒子が、水膨潤状態における
粒子径０．１〜１０μｍ、粒子径分散が１．２以下の微
粒子であるところの請求項１記載の修飾親水性ゲル粒
子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29134393A JPH07118340A (ja) | 1993-10-26 | 1993-10-26 | エチレンアミン類で修飾した親水性ゲル粒子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29134393A JPH07118340A (ja) | 1993-10-26 | 1993-10-26 | エチレンアミン類で修飾した親水性ゲル粒子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07118340A true JPH07118340A (ja) | 1995-05-09 |
Family
ID=17767699
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29134393A Pending JPH07118340A (ja) | 1993-10-26 | 1993-10-26 | エチレンアミン類で修飾した親水性ゲル粒子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07118340A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002090990A1 (en) * | 2001-05-09 | 2002-11-14 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Biopolymer-containing gel |
| JP2008239874A (ja) * | 2007-03-28 | 2008-10-09 | Jsr Corp | ビニルポリマー、ブロッキング剤、およびこれを用いたプローブ結合粒子の製造方法 |
| JP2010031081A (ja) * | 2008-07-25 | 2010-02-12 | Gifu Ichi | リン脂質膜を有する高分子基材及びその製造方法 |
| US7746207B2 (en) | 2003-11-05 | 2010-06-29 | Tdk Corporation | Coil device |
| WO2011114993A1 (ja) * | 2010-03-15 | 2011-09-22 | 日立化成工業株式会社 | 架橋ポリマー粒子及びその製造方法 |
-
1993
- 1993-10-26 JP JP29134393A patent/JPH07118340A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002090990A1 (en) * | 2001-05-09 | 2002-11-14 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Biopolymer-containing gel |
| US7746207B2 (en) | 2003-11-05 | 2010-06-29 | Tdk Corporation | Coil device |
| JP2008239874A (ja) * | 2007-03-28 | 2008-10-09 | Jsr Corp | ビニルポリマー、ブロッキング剤、およびこれを用いたプローブ結合粒子の製造方法 |
| JP2010031081A (ja) * | 2008-07-25 | 2010-02-12 | Gifu Ichi | リン脂質膜を有する高分子基材及びその製造方法 |
| WO2011114993A1 (ja) * | 2010-03-15 | 2011-09-22 | 日立化成工業株式会社 | 架橋ポリマー粒子及びその製造方法 |
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