JPH06277500A - トリアミンで修飾した親水性ゲル粒子 - Google Patents
トリアミンで修飾した親水性ゲル粒子Info
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- JPH06277500A JPH06277500A JP9095293A JP9095293A JPH06277500A JP H06277500 A JPH06277500 A JP H06277500A JP 9095293 A JP9095293 A JP 9095293A JP 9095293 A JP9095293 A JP 9095293A JP H06277500 A JPH06277500 A JP H06277500A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 免疫学的診断薬材料に適した親水性ゲル粒子
を提供する。 【構成】 粒子表面にカルボキシル基またはエポキシ基
を有している親水性ゲル粒子のカルボキシル基またはエ
ポキシ基をトリアミンにより修飾する。
を提供する。 【構成】 粒子表面にカルボキシル基またはエポキシ基
を有している親水性ゲル粒子のカルボキシル基またはエ
ポキシ基をトリアミンにより修飾する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、免疫学的診断薬材料に
適した親水性ゲル粒子に関する。
適した親水性ゲル粒子に関する。
【０００２】
【従来の技術】現在、診断の重要な手段の一つに担体粒
子を用いた免疫学的検査法がある。これは被検査物質
（抗原または抗体）と反応する物質（抗体または抗原）
を結合させた担体粒子を検体と混合させ、特異的凝集の
有無を判定する検査法である。
子を用いた免疫学的検査法がある。これは被検査物質
（抗原または抗体）と反応する物質（抗体または抗原）
を結合させた担体粒子を検体と混合させ、特異的凝集の
有無を判定する検査法である。
【０００３】従来から、赤血球にツベルクリン多糖体や
蛋白質を固定する受身凝集反応による方法が開発された
（Ｇ．Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ，Ｒ．Ｊ．Ｄｕｂｏｓ、
Ｊ．ＥｘＰ．Ｍｅｄ．、８８、５２１、（１９４
８））。赤血球は大粒径・高比重であるので凝集反応の
時間が短く感度も比較的高いという利点があるものの、
表面に種々の抗原が存在し、個体差が大きいという欠点
があった。このほか、担体粒子としてポリスチレン、ス
チレン−アクリル酸共重合体などのラテックス粒子など
を用いた免疫学的診断薬も開発されている。しかし、こ
れらの粒子は、疎水性の傾向が強い表面のため実際の使
用に際して良好な結果が得られないという問題があっ
た。
蛋白質を固定する受身凝集反応による方法が開発された
（Ｇ．Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ，Ｒ．Ｊ．Ｄｕｂｏｓ、
Ｊ．ＥｘＰ．Ｍｅｄ．、８８、５２１、（１９４
８））。赤血球は大粒径・高比重であるので凝集反応の
時間が短く感度も比較的高いという利点があるものの、
表面に種々の抗原が存在し、個体差が大きいという欠点
があった。このほか、担体粒子としてポリスチレン、ス
チレン−アクリル酸共重合体などのラテックス粒子など
を用いた免疫学的診断薬も開発されている。しかし、こ
れらの粒子は、疎水性の傾向が強い表面のため実際の使
用に際して良好な結果が得られないという問題があっ
た。
【０００４】最近、開発された親水性で粒径分布が均一
な親水性ゲル粒子（特開平１−３１５４０８）はこれら
の欠点を克服した人工担体である。この粒子は、表面に
カルボキシル基やエポキシ基が出ている為、化学結合に
よって蛋白質を固定することが出きるが、化学結合によ
って製造された免疫学的診断薬の感度は、余り高いもの
ではなかった。
な親水性ゲル粒子（特開平１−３１５４０８）はこれら
の欠点を克服した人工担体である。この粒子は、表面に
カルボキシル基やエポキシ基が出ている為、化学結合に
よって蛋白質を固定することが出きるが、化学結合によ
って製造された免疫学的診断薬の感度は、余り高いもの
ではなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、かかる
従来技術の欠点を克服すべく鋭意検討した結果、粒子表
面のカルボキシル基またはエポキシ基をトリアミンによ
り修飾した親水性粒子を見いだし、本発明を完成するに
至った。
従来技術の欠点を克服すべく鋭意検討した結果、粒子表
面のカルボキシル基またはエポキシ基をトリアミンによ
り修飾した親水性粒子を見いだし、本発明を完成するに
至った。
【０００６】
【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、粒子表面にカルボキシル基またはエポキシ基を有し
ている親水性ゲル粒子のカルボキシル基またはエポキシ
基をトリアミンにより修飾して成る修飾親水性ゲル粒子
が提供される。
ば、粒子表面にカルボキシル基またはエポキシ基を有し
ている親水性ゲル粒子のカルボキシル基またはエポキシ
基をトリアミンにより修飾して成る修飾親水性ゲル粒子
が提供される。
【０００７】本発明で使用される親水性ゲル粒子は、粒
子表面にカルボキシル基またはエポキシ基を有する親水
性のゲル粒子であれば、天然物であっても合成されたも
のであってもよく、天然物としては、ゼラチンなどが例
示され、合成粒子としては、カルボキシル基を有する単
量体化合物単独、またはカルボキシル基を有する重合可
能な単量体化合物やエポキシ基を有する単量体化合物と
親水性基を有する単量体化合物とを常法により重合させ
て得られるものが例示される。カルボキシル基を有する
単量体化合物の具体例としては、アクリル酸、メタクリ
ル酸、クロトン酸、ケイ皮酸、イタコン酸、フマル酸、
マレイン酸、ブテントリカルボン酸、３−ブテン酸、４
−ペンテン酸などが挙げられ、エポキシ基を有する単量
体化合物の具体例としては、グリシジルアクリレート、
グリシジルメタクリレートなどが挙げられる。親水性基
を有する重合可能な単量体化合物は、単官能、多官能の
いずれでもよく、その具体例としては、アクリルアミ
ド、メタクリルアミド、ジアセトアクリルアミド、Ｎ−
ヒドロキシメチルアクリルアミドなどのアクルルアミド
類；メチレンビス（メタ）アクリルアミドなどのビス
（メタ）アクリルアミド類；エチレングリコールジ（メ
タ）アクリレート、トリエチレングリコールジメタクリ
レート、エチレンジメタクリレート、トリメチロールプ
ロパントリメタクリレート等の多官能性（メタ）アクリ
ル酸エステル等が例示され、これらを適当に組み合わせ
て製造することができるものである。とりわけ、特開平
１−３１５４０８公報に開示されているモノエチレン性
不飽和アミド単量体・架橋性エチレン性不飽和単量体・
エチレン性不飽和単量体・（メタ）アクリル酸エステル
単量体から成る親水性ゲル粒子が特に好ましい。ゲル粒
子の粒子径分布は、シャープであることが望ましく特に
望ましくは、水膨潤状態における粒子径が０．１〜１０
μｍ、粒子径分散が１．２以下であるゲル粒子である。
子表面にカルボキシル基またはエポキシ基を有する親水
性のゲル粒子であれば、天然物であっても合成されたも
のであってもよく、天然物としては、ゼラチンなどが例
示され、合成粒子としては、カルボキシル基を有する単
量体化合物単独、またはカルボキシル基を有する重合可
能な単量体化合物やエポキシ基を有する単量体化合物と
親水性基を有する単量体化合物とを常法により重合させ
て得られるものが例示される。カルボキシル基を有する
単量体化合物の具体例としては、アクリル酸、メタクリ
ル酸、クロトン酸、ケイ皮酸、イタコン酸、フマル酸、
マレイン酸、ブテントリカルボン酸、３−ブテン酸、４
−ペンテン酸などが挙げられ、エポキシ基を有する単量
体化合物の具体例としては、グリシジルアクリレート、
グリシジルメタクリレートなどが挙げられる。親水性基
を有する重合可能な単量体化合物は、単官能、多官能の
いずれでもよく、その具体例としては、アクリルアミ
ド、メタクリルアミド、ジアセトアクリルアミド、Ｎ−
ヒドロキシメチルアクリルアミドなどのアクルルアミド
類；メチレンビス（メタ）アクリルアミドなどのビス
（メタ）アクリルアミド類；エチレングリコールジ（メ
タ）アクリレート、トリエチレングリコールジメタクリ
レート、エチレンジメタクリレート、トリメチロールプ
ロパントリメタクリレート等の多官能性（メタ）アクリ
ル酸エステル等が例示され、これらを適当に組み合わせ
て製造することができるものである。とりわけ、特開平
１−３１５４０８公報に開示されているモノエチレン性
不飽和アミド単量体・架橋性エチレン性不飽和単量体・
エチレン性不飽和単量体・（メタ）アクリル酸エステル
単量体から成る親水性ゲル粒子が特に好ましい。ゲル粒
子の粒子径分布は、シャープであることが望ましく特に
望ましくは、水膨潤状態における粒子径が０．１〜１０
μｍ、粒子径分散が１．２以下であるゲル粒子である。
【０００８】本発明の修飾親水性ゲル粒子は、上記親水
性ゲル粒子の表面のカルボキシル基またはエポキシ基に
トリアミンを結合させることにより製造される。本発明
で用いられるトリアミンとしては、スペルミジン［ＮＨ
2（ＣＨ2）3ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ2］、ジプロピレントリ
アミン［ＮＨ2（ＣＨ2）3ＮＨ（ＣＨ2）3ＮＨ2］、ジエ
チレントリアミン［ＮＨ2（ＣＨ2）2ＮＨ（ＣＨ2）2Ｎ
Ｈ2］、ジブチレントリアミン［ＮＨ2（ＣＨ2）3ＮＨ
（ＣＨ2）4ＮＨ2］等を例示することができる。この中
で特に好ましくはスペルミジンである。
性ゲル粒子の表面のカルボキシル基またはエポキシ基に
トリアミンを結合させることにより製造される。本発明
で用いられるトリアミンとしては、スペルミジン［ＮＨ
2（ＣＨ2）3ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ2］、ジプロピレントリ
アミン［ＮＨ2（ＣＨ2）3ＮＨ（ＣＨ2）3ＮＨ2］、ジエ
チレントリアミン［ＮＨ2（ＣＨ2）2ＮＨ（ＣＨ2）2Ｎ
Ｈ2］、ジブチレントリアミン［ＮＨ2（ＣＨ2）3ＮＨ
（ＣＨ2）4ＮＨ2］等を例示することができる。この中
で特に好ましくはスペルミジンである。
【０００９】粒子表面にトリアミンを結合させる方法は
特に限定されず、例えば、粒子表面がカルボキシル基で
ある場合、粒子懸濁液にカルボジイミドとトリアミンを
加えて、縮合反応させる方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、２０、４８３６−４８４２（１９８１））などが挙
げられる。ここで使用されるカルボジイミドとしては、
１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロリル）カルボ
ジイミドが例示される。
特に限定されず、例えば、粒子表面がカルボキシル基で
ある場合、粒子懸濁液にカルボジイミドとトリアミンを
加えて、縮合反応させる方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、２０、４８３６−４８４２（１９８１））などが挙
げられる。ここで使用されるカルボジイミドとしては、
１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロリル）カルボ
ジイミドが例示される。
【００１０】また、粒子表面がエポキシ基である場合
は、例えばカルボジイミドの存在下でジアミンと反応
後、二官能性アルデヒドで抗原または抗体を固定させる
方法（特開昭５３−１１８５１７）や、カルボキシル基
に直鎖アルキレンジアミンを結合させた後、ヘテロ二官
能性架橋剤で抗体を固定化する方法（特開昭６２−１３
２１７２）などがある。
は、例えばカルボジイミドの存在下でジアミンと反応
後、二官能性アルデヒドで抗原または抗体を固定させる
方法（特開昭５３−１１８５１７）や、カルボキシル基
に直鎖アルキレンジアミンを結合させた後、ヘテロ二官
能性架橋剤で抗体を固定化する方法（特開昭６２−１３
２１７２）などがある。
【００１１】このようにして得られた修飾親水性ゲル粒
子は、免疫学的診断薬として利用することができる。本
発明の粒子を免疫学的診断薬、例えば受身凝集反応の担
体として使用する場合、抗原または抗体を担体に固定す
る必要がある。この抗原または抗体を感作する方法は動
物赤血球やラテックスの担体に感作させる常法に従えば
良い。具体例としてはカルボジイミドを使って縮合させ
る方法やグルタルアルデヒドを使って架橋する方法など
が例示できる。本発明の粒子はこの中でも特にカルボジ
イミドによる縮合反応によって抗原や抗体を固定させる
と凝集反応における感度が秀でて向上する。
子は、免疫学的診断薬として利用することができる。本
発明の粒子を免疫学的診断薬、例えば受身凝集反応の担
体として使用する場合、抗原または抗体を担体に固定す
る必要がある。この抗原または抗体を感作する方法は動
物赤血球やラテックスの担体に感作させる常法に従えば
良い。具体例としてはカルボジイミドを使って縮合させ
る方法やグルタルアルデヒドを使って架橋する方法など
が例示できる。本発明の粒子はこの中でも特にカルボジ
イミドによる縮合反応によって抗原や抗体を固定させる
と凝集反応における感度が秀でて向上する。
【００１２】また、本発明の粒子を免疫学的診断薬、例
えば受身凝集反応の担体として使用する場合、粒子を着
色するのが好ましい。これにより親水性ゲル粒子は通常
は白色であり、これを着色することで凝集像の判定を容
易にすることができる。着色処理の段階は、親水性粒子
をトリアミンで修飾する前であっても修飾後であっても
構わない（以下、前者を前修飾、後者を後修飾とい
う）。着色剤としては、例えば、リアクテブ・バイオレ
ット、食用赤色３号、ローズベンガル、ニュートラルレ
ッドなどの赤色色素、あるいはクリスタルバイオレッ
ト、メチレンブルーなどの青色色素等を用いることが出
来る。
えば受身凝集反応の担体として使用する場合、粒子を着
色するのが好ましい。これにより親水性ゲル粒子は通常
は白色であり、これを着色することで凝集像の判定を容
易にすることができる。着色処理の段階は、親水性粒子
をトリアミンで修飾する前であっても修飾後であっても
構わない（以下、前者を前修飾、後者を後修飾とい
う）。着色剤としては、例えば、リアクテブ・バイオレ
ット、食用赤色３号、ローズベンガル、ニュートラルレ
ッドなどの赤色色素、あるいはクリスタルバイオレッ
ト、メチレンブルーなどの青色色素等を用いることが出
来る。
【００１３】
【発明の効果】本発明の修飾親水性ゲル粒子は、抗原や
抗体を感作することで感度の高い診断用担体として有用
である。
抗体を感作することで感度の高い診断用担体として有用
である。
【００１４】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。尚、実施例、参考例、試験例、および比較
試験例中の％は特に断りのないかぎり重量基準である。
に説明する。尚、実施例、参考例、試験例、および比較
試験例中の％は特に断りのないかぎり重量基準である。
【００１５】（実施例１） （１）親水性ゲル粒子の製造 攪はん翼、冷却コンデンサー、窒素ガス導入管、温度計
を付した２ｌの反応器を予め窒素置換しておき、この反
応器中にエタノール７５０ｇ、アクリルアミド６７．１
ｇ、グリシジルメタクリレート１０ｇ、メチレンビスア
クリルアミド１６．２ｇ、メタクリル酸１０ｇ、２，
２’−アゾビスイソブチロニトリル０．４２ ｇを添加
して、均一になるまで攪はんした。その後、窒素バブリ
ング下に６０℃に加温し、反応を開始させ、そのまま２
４時間保った後冷却した。得られたゲル微粒子懸濁液か
らエバポレーターにてエタノールを除去し、さらに真空
乾燥器にて１２時間処理して完全にエタノールを除去し
て、ゲル微粒子粉末を得た。蒸留水にこのゲル微粒子粉
末を加え、その懸濁液を０．１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ９に
調製した。水中での膨潤した状態のゲル微粒子は重量平
均粒子径２．０５μｍ、数平均粒子径１．８２μｍで分
散１．１３の単分散粒子径分布を有していた。また得ら
れたゲル微粒子の赤外吸収スペクトルからカルボキシル
基、エポキシ基の存在が確認された。
を付した２ｌの反応器を予め窒素置換しておき、この反
応器中にエタノール７５０ｇ、アクリルアミド６７．１
ｇ、グリシジルメタクリレート１０ｇ、メチレンビスア
クリルアミド１６．２ｇ、メタクリル酸１０ｇ、２，
２’−アゾビスイソブチロニトリル０．４２ ｇを添加
して、均一になるまで攪はんした。その後、窒素バブリ
ング下に６０℃に加温し、反応を開始させ、そのまま２
４時間保った後冷却した。得られたゲル微粒子懸濁液か
らエバポレーターにてエタノールを除去し、さらに真空
乾燥器にて１２時間処理して完全にエタノールを除去し
て、ゲル微粒子粉末を得た。蒸留水にこのゲル微粒子粉
末を加え、その懸濁液を０．１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ９に
調製した。水中での膨潤した状態のゲル微粒子は重量平
均粒子径２．０５μｍ、数平均粒子径１．８２μｍで分
散１．１３の単分散粒子径分布を有していた。また得ら
れたゲル微粒子の赤外吸収スペクトルからカルボキシル
基、エポキシ基の存在が確認された。
【００１６】（２）修飾親水性ゲル粒子の製造と修飾親
水性ゲル粒子懸濁液の調製 上記（１）で得られたゲル微粒子粉末を、粒子濃度が１
０％になるようにｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸塩緩衝液
（ＰＢＳ）で膨潤させた。膨潤させたゲル粒子懸濁液２
５ｇを遠心分離機（日立工機 ０５−ＰＲ２２）で１，
６００Ｇで４分の遠心で膨潤粒子を沈降させ、上澄液を
捨てた。１Ｍスペルミジン水溶液（ＮＨ2（ＣＨ2）3Ｎ
Ｈ（ＣＨ2）4ＮＨ2・３ＨＣｌを水に溶かし、ＮａＯＨ
でｐＨを１３に調製）を４０ｍｌ加えて４５℃で２時間
振とうした。その後、遠心分離機で粒子を沈降させ蒸留
水４０ｍｌで洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した
後、酢酸バッファー（０．１Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム
［ｐＨ４．０］、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅ
ｅｎ８０）４０ｍｌで２回、炭酸バッファー（０．１Ｍ
ＮａＨＣＯ3［ｐＨ８．０］、０．５Ｍ ＮａＣｌ、
０．５％Ｔｗｅｅｎ−８０）４０ｍｌで２回、粒子を洗
浄した。更に、蒸留水４０ｍｌで３回洗浄し、粒子を蒸
留水４０ｍｌに懸濁し、親水性ゲル粒子の表面のエポキ
シ基をスペルミジンで修飾した修飾親水性ゲル粒子の懸
濁液を得た。
水性ゲル粒子懸濁液の調製 上記（１）で得られたゲル微粒子粉末を、粒子濃度が１
０％になるようにｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸塩緩衝液
（ＰＢＳ）で膨潤させた。膨潤させたゲル粒子懸濁液２
５ｇを遠心分離機（日立工機 ０５−ＰＲ２２）で１，
６００Ｇで４分の遠心で膨潤粒子を沈降させ、上澄液を
捨てた。１Ｍスペルミジン水溶液（ＮＨ2（ＣＨ2）3Ｎ
Ｈ（ＣＨ2）4ＮＨ2・３ＨＣｌを水に溶かし、ＮａＯＨ
でｐＨを１３に調製）を４０ｍｌ加えて４５℃で２時間
振とうした。その後、遠心分離機で粒子を沈降させ蒸留
水４０ｍｌで洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した
後、酢酸バッファー（０．１Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム
［ｐＨ４．０］、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅ
ｅｎ８０）４０ｍｌで２回、炭酸バッファー（０．１Ｍ
ＮａＨＣＯ3［ｐＨ８．０］、０．５Ｍ ＮａＣｌ、
０．５％Ｔｗｅｅｎ−８０）４０ｍｌで２回、粒子を洗
浄した。更に、蒸留水４０ｍｌで３回洗浄し、粒子を蒸
留水４０ｍｌに懸濁し、親水性ゲル粒子の表面のエポキ
シ基をスペルミジンで修飾した修飾親水性ゲル粒子の懸
濁液を得た。
【００１７】（実施例２）染色した修飾親水性ゲル粒子
の製造と修飾親水性ゲル粒子懸濁液の調製 実施例１（１）で得られたゲル微粒子粉末を、粒子濃度
が１０％になるようにｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸塩緩
衝液（以下、ＰＢＳという）で膨潤させた。膨潤させた
ゲル粒子懸濁液２５ｇを遠心分離機（日立工機 ０５−
ＰＲ２２）で１，６００Ｇで４分の遠心で膨潤粒子を沈
降させ、上澄液を捨てた。得られた膨潤粒子に染色溶液
（２．５％チバクロンバイオレット）１２．５ｍｌを加
え、更に７％炭酸ナトリウム液を１２．５ｍｌ加えて４
５℃で１時間振とうした後、着色した粒子を蒸留水で６
回洗浄した。これに０．７Ｍスペルミジン水溶液（ＮＨ
2（ＣＨ2）3ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ2・３ＨＣｌを水に溶か
し、ＮａＯＨでｐＨを１３に調製）を４０ｍｌ加えて４
５℃で２時間振とうした。その後、遠心分離機で粒子を
沈降させ蒸留水４０ｍｌで洗浄した。この洗浄操作を３
回繰り返した後、酢酸バッファー（０．１Ｍ酢酸−酢酸
ナトリウム［ｐＨ４．０］、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．
５％Ｔｗｅｅｎ８０）４０ｍｌで２回、炭酸バッファー
（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3［ｐＨ８．０］、０．５Ｍ
ＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−８０）４０ｍｌで２
回、粒子を洗浄した。更に蒸留水４０ｍｌで３回洗浄
し、粒子を蒸留水４０ｍｌに懸濁した。こうして得られ
たスペルミジンで修飾した修飾親水性ゲル粒子の懸濁液
４０ｍｌから遠心分離機で粒子を沈降させ、上澄み液を
捨てた後、１０ｍＭ ＰＢＳで５％の粒子濃度になるよ
うに調製し、前染色された修飾親水性ゲル粒子の懸濁液
を得た。
の製造と修飾親水性ゲル粒子懸濁液の調製 実施例１（１）で得られたゲル微粒子粉末を、粒子濃度
が１０％になるようにｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸塩緩
衝液（以下、ＰＢＳという）で膨潤させた。膨潤させた
ゲル粒子懸濁液２５ｇを遠心分離機（日立工機 ０５−
ＰＲ２２）で１，６００Ｇで４分の遠心で膨潤粒子を沈
降させ、上澄液を捨てた。得られた膨潤粒子に染色溶液
（２．５％チバクロンバイオレット）１２．５ｍｌを加
え、更に７％炭酸ナトリウム液を１２．５ｍｌ加えて４
５℃で１時間振とうした後、着色した粒子を蒸留水で６
回洗浄した。これに０．７Ｍスペルミジン水溶液（ＮＨ
2（ＣＨ2）3ＮＨ（ＣＨ2）4ＮＨ2・３ＨＣｌを水に溶か
し、ＮａＯＨでｐＨを１３に調製）を４０ｍｌ加えて４
５℃で２時間振とうした。その後、遠心分離機で粒子を
沈降させ蒸留水４０ｍｌで洗浄した。この洗浄操作を３
回繰り返した後、酢酸バッファー（０．１Ｍ酢酸−酢酸
ナトリウム［ｐＨ４．０］、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．
５％Ｔｗｅｅｎ８０）４０ｍｌで２回、炭酸バッファー
（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3［ｐＨ８．０］、０．５Ｍ
ＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−８０）４０ｍｌで２
回、粒子を洗浄した。更に蒸留水４０ｍｌで３回洗浄
し、粒子を蒸留水４０ｍｌに懸濁した。こうして得られ
たスペルミジンで修飾した修飾親水性ゲル粒子の懸濁液
４０ｍｌから遠心分離機で粒子を沈降させ、上澄み液を
捨てた後、１０ｍＭ ＰＢＳで５％の粒子濃度になるよ
うに調製し、前染色された修飾親水性ゲル粒子の懸濁液
を得た。
【００１８】（参考例） （１）非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスゲノムのｃＤＮＡをクロ
ーニングしたプラスミドｐＩＫ４ＣＥの作製 Ｂ型肝炎陰性でＧＰＴ値１００単位以上のヒト血清０．
５ｍｌに５倍量のグアニジウムチオシアネート溶液（４
Ｍグアニジウムチオシアネート、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ
２−メルカプトメタノール、２％ザルコシル）を加
え、フェノール／クロロホルム抽出し、グリコーゲンを
キャリアーとしてエタノール沈澱により血清中の全ＲＮ
Ａを精製した。一方、岡本ら（Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．，６０、第３号、第１６７−１７７頁、１
９９０年）の結果を元に４つのプライマー（ＣＡＴＡ
ＴＧＡＧＣＡＣＧＡＡＴＣＣＴＡＡ、ＣＣＣＡＡＣＧ
ＡＧＣＡＡＧＴＣＧＡＣＧＴ、ＴＧＡＴＣＡＴＧＣＡ
ＴＡＣＴＣＣＣＧＧＧＴ、ＧＣＴＧＣＣＧＴＴＧＧＴ
ＡＴＴＣＡＣＡＡ）を作製した。の合成ＤＮＡをプラ
イマーとして前記ＲＮＡのｃＤＮＡを、ｃＤＮＡ合成シ
ステム（ベーリンガーマンハイム社製）を用いて作製し
た。合成したｃＤＮＡをテンプレートとして、合成した
ｃＤＮＡをテンプレートとして前記〜のプライマー
を使ったＰＣＲを行い、目的とするＤＮＡ断片を増幅し
た。増幅されたＤＮＡ断片の５’末端をＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼによりリン酸化した後、ＳｍａＩで消化
したｐＵＣ１８と連結し、３．４１ｋｂｐのプラスミド
ｐＩＫＣと３．４５ＫｂｐのプラスミドｐＩＫＥを得
た。ｐＩＫＣ中に挿入された非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの
ｃＤＮＡ断片の３’部分とｐＩＫＥ中に挿入された非Ａ
非Ｂ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡ断片の５’部分は一部重
複しているので、ｐＩＫＣとｐＩＫＥを制限酵素Ａｖａ
Ｉで消化した後、連結し、得られた４．０１ｋｂｐのプ
ラスミドをｐＩＫ４ＣＥと命名した。
ーニングしたプラスミドｐＩＫ４ＣＥの作製 Ｂ型肝炎陰性でＧＰＴ値１００単位以上のヒト血清０．
５ｍｌに５倍量のグアニジウムチオシアネート溶液（４
Ｍグアニジウムチオシアネート、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ
２−メルカプトメタノール、２％ザルコシル）を加
え、フェノール／クロロホルム抽出し、グリコーゲンを
キャリアーとしてエタノール沈澱により血清中の全ＲＮ
Ａを精製した。一方、岡本ら（Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．，６０、第３号、第１６７−１７７頁、１
９９０年）の結果を元に４つのプライマー（ＣＡＴＡ
ＴＧＡＧＣＡＣＧＡＡＴＣＣＴＡＡ、ＣＣＣＡＡＣＧ
ＡＧＣＡＡＧＴＣＧＡＣＧＴ、ＴＧＡＴＣＡＴＧＣＡ
ＴＡＣＴＣＣＣＧＧＧＴ、ＧＣＴＧＣＣＧＴＴＧＧＴ
ＡＴＴＣＡＣＡＡ）を作製した。の合成ＤＮＡをプラ
イマーとして前記ＲＮＡのｃＤＮＡを、ｃＤＮＡ合成シ
ステム（ベーリンガーマンハイム社製）を用いて作製し
た。合成したｃＤＮＡをテンプレートとして、合成した
ｃＤＮＡをテンプレートとして前記〜のプライマー
を使ったＰＣＲを行い、目的とするＤＮＡ断片を増幅し
た。増幅されたＤＮＡ断片の５’末端をＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼによりリン酸化した後、ＳｍａＩで消化
したｐＵＣ１８と連結し、３．４１ｋｂｐのプラスミド
ｐＩＫＣと３．４５ＫｂｐのプラスミドｐＩＫＥを得
た。ｐＩＫＣ中に挿入された非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの
ｃＤＮＡ断片の３’部分とｐＩＫＥ中に挿入された非Ａ
非Ｂ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡ断片の５’部分は一部重
複しているので、ｐＩＫＣとｐＩＫＥを制限酵素Ａｖａ
Ｉで消化した後、連結し、得られた４．０１ｋｂｐのプ
ラスミドをｐＩＫ４ＣＥと命名した。
【００１９】 （２）非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスのコア抗原の調製 上記（１）で得たプラスミドｐＩＫ４ＣＥを制限酵素Ｎ
ｄｅＩとＣｌａＩで切断後、酵素クレノウフラグメント
で平滑末端にし、０．３７ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロ
ースゲルから回収した。プラスミドｐＫＫ２２３−３
（ファルマシア社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、
酵素クレノウフラグメントで平滑末端にし、先に回収し
た０．３７ｋｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲースを使
って挿入した。このＤＮＡで大腸菌ＪＭ１０９を形質転
換し、出現したアンピシリン耐性の形質転換菌から挿入
ＤＮＡが正方向（挿入されたコアタンパク質が本来翻訳
されるべき方向とｐＫＫ２２３−３のｔａｃプロモータ
ーの転写方向とが同一方向の場合を正方向とする）に挿
入されているプラスミドを持ったコロニーを選択する。
なお、正方向のプラスミド（これをｐＫＫＣｌａと命
名）の選択は制限酵素ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断
した時、約０．３４ｋｂｐ断片が出現する事で容易に選
択出来る。
ｄｅＩとＣｌａＩで切断後、酵素クレノウフラグメント
で平滑末端にし、０．３７ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロ
ースゲルから回収した。プラスミドｐＫＫ２２３−３
（ファルマシア社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、
酵素クレノウフラグメントで平滑末端にし、先に回収し
た０．３７ｋｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲースを使
って挿入した。このＤＮＡで大腸菌ＪＭ１０９を形質転
換し、出現したアンピシリン耐性の形質転換菌から挿入
ＤＮＡが正方向（挿入されたコアタンパク質が本来翻訳
されるべき方向とｐＫＫ２２３−３のｔａｃプロモータ
ーの転写方向とが同一方向の場合を正方向とする）に挿
入されているプラスミドを持ったコロニーを選択する。
なお、正方向のプラスミド（これをｐＫＫＣｌａと命
名）の選択は制限酵素ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断
した時、約０．３４ｋｂｐ断片が出現する事で容易に選
択出来る。
【００２０】５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した
ＬＢ培地（”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ”６８
頁）８ｌに先に選択された形質転換ＪＭ１０９を６６０
ｎｍでの濁度が０．１５になるように植菌した。これを
３７℃で２時間振とう培養後、１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導
し、さらに３７℃で４時間振とう培養した。遠心分離に
よって２０ｇの湿菌体を得た。これを６０ｍｌのＰＢＳ
（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、０．８５％塩化ナト
リウム）に懸濁後、フレンチプレス（大岳製作所５６１
５型、１５００ｋｇｆ／ｃｍ2）で破砕し、１５，００
０×ｇで２０分の遠心分離で沈澱を集めた。次に６０ｍ
ｌの可溶化バッファー（７Ｍ尿素、２０ｍＭジチオスレ
イトール、１％トリトンＸ−１００、５０ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ８．０））に懸濁し、超音波破砕機（Ｂｒａｎ
ｓｏｎ，ｓｏｎｉｆｉｅｒＩＩ）にて分散後、室温で一
晩振とうさせ、可溶画分として粗蛋白液を得た。これを
ＣＭ−トヨパール（東ソー社製）のカラム（直径２ｃｍ
×１６ｃｍ）に吸着させ、６Ｍ尿素存在下で０．２−
０．８Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配（４００ｍｌ）で溶出を
行い、純度が９９％以上の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスのコ
ア蛋白質を約１０ｍｇ得た。これをＰＢＳで透析した
後、コア蛋白の濃度をローリー法で測定したところ１．
５ｍｇ／ｍｌであった。この液を抗原原液とした。
ＬＢ培地（”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ”６８
頁）８ｌに先に選択された形質転換ＪＭ１０９を６６０
ｎｍでの濁度が０．１５になるように植菌した。これを
３７℃で２時間振とう培養後、１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導
し、さらに３７℃で４時間振とう培養した。遠心分離に
よって２０ｇの湿菌体を得た。これを６０ｍｌのＰＢＳ
（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、０．８５％塩化ナト
リウム）に懸濁後、フレンチプレス（大岳製作所５６１
５型、１５００ｋｇｆ／ｃｍ2）で破砕し、１５，００
０×ｇで２０分の遠心分離で沈澱を集めた。次に６０ｍ
ｌの可溶化バッファー（７Ｍ尿素、２０ｍＭジチオスレ
イトール、１％トリトンＸ−１００、５０ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ８．０））に懸濁し、超音波破砕機（Ｂｒａｎ
ｓｏｎ，ｓｏｎｉｆｉｅｒＩＩ）にて分散後、室温で一
晩振とうさせ、可溶画分として粗蛋白液を得た。これを
ＣＭ−トヨパール（東ソー社製）のカラム（直径２ｃｍ
×１６ｃｍ）に吸着させ、６Ｍ尿素存在下で０．２−
０．８Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配（４００ｍｌ）で溶出を
行い、純度が９９％以上の非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスのコ
ア蛋白質を約１０ｍｇ得た。これをＰＢＳで透析した
後、コア蛋白の濃度をローリー法で測定したところ１．
５ｍｇ／ｍｌであった。この液を抗原原液とした。
【００２１】（試験例） （１）後染色した粒子を用いた免疫学的診断 実施例１に従って調製したスペルミジンで修飾した親水
性ゲル粒子の懸濁液４０ｍｌから遠心分離機で粒子を沈
降させ、上澄み液を捨てた後、染色溶液（２．５％チバ
クロンバイオレット（チバガイギー社製））１２．５ｍ
ｌを加え、更に７％炭酸ナトリウム液を１２．５ｍｌ加
えて４５℃で１時間振とうした。着色した粒子を蒸留水
で６回洗浄し、１０ｍＭ ＰＢＳで５％の粒子濃度にな
るように調製した。この５％粒子懸濁液１ｍｌをとり、
遠心分離機で粒子を沈降させ、上澄み液を捨てた後、調
製例に従って作製した抗原原液をＰＢＳで５０μｇ／ｍ
ｌに希釈した液を４ｍｌ加えた。市販の２５％グルタル
アルデヒド液０．４ｍｌをゆっくりと滴下した。室温で
１時間攪はんして反応させ抗原を粒子に固定させた。こ
の粒子を冷ＰＢＳで５回洗浄し、凝集反応希釈液（１０
ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ６．４）、０．３％正常兎血清、
０．０２％ＮａＮ3）５ｍｌに懸濁した（これを１％感
作粒子液と呼ぶ）。Ｖ底マイクロプレート（バイオテッ
ク社製；９６Ｖ−Ｒ）の各ウエルに非Ａ非Ｂ型肝炎患者
血清または正常人血清を凝集反応希釈液で２倍ずつ段階
希釈したものを２５μｌ加え、１％感作粒子液２５μｌ
加え、２時間室温に放置した。２時間後各ウエルの凝集
像の有無を観察した。
性ゲル粒子の懸濁液４０ｍｌから遠心分離機で粒子を沈
降させ、上澄み液を捨てた後、染色溶液（２．５％チバ
クロンバイオレット（チバガイギー社製））１２．５ｍ
ｌを加え、更に７％炭酸ナトリウム液を１２．５ｍｌ加
えて４５℃で１時間振とうした。着色した粒子を蒸留水
で６回洗浄し、１０ｍＭ ＰＢＳで５％の粒子濃度にな
るように調製した。この５％粒子懸濁液１ｍｌをとり、
遠心分離機で粒子を沈降させ、上澄み液を捨てた後、調
製例に従って作製した抗原原液をＰＢＳで５０μｇ／ｍ
ｌに希釈した液を４ｍｌ加えた。市販の２５％グルタル
アルデヒド液０．４ｍｌをゆっくりと滴下した。室温で
１時間攪はんして反応させ抗原を粒子に固定させた。こ
の粒子を冷ＰＢＳで５回洗浄し、凝集反応希釈液（１０
ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ６．４）、０．３％正常兎血清、
０．０２％ＮａＮ3）５ｍｌに懸濁した（これを１％感
作粒子液と呼ぶ）。Ｖ底マイクロプレート（バイオテッ
ク社製；９６Ｖ−Ｒ）の各ウエルに非Ａ非Ｂ型肝炎患者
血清または正常人血清を凝集反応希釈液で２倍ずつ段階
希釈したものを２５μｌ加え、１％感作粒子液２５μｌ
加え、２時間室温に放置した。２時間後各ウエルの凝集
像の有無を観察した。
【００２２】 （２）前染色した粒子を用いた免疫学的診断 実施例２で得られた５％の前染色粒子懸濁液を１ｍｌ試
験管にとり遠心分離機で粒子を沈降させ上澄みを捨てた
後、参考例に従って調製した抗原原液をＰＢＳで２５μ
ｇ／ｍｌに希釈した液を４ｍｌ加えた。更に１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミド
をＰＢＳで５０ｍｇ／ｍｌに溶かし、この液を０．２ｍ
ｌ添加した。３７℃で９０分間反応させ、抗原を粒子に
固定させた。この粒子を冷ＰＢＳで５回洗浄し、凝集反
応希釈液（１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ６．４）、０．３％
正常兎血清、０．０２％ＮａＮ3）５ｍｌに懸濁した
（１％感作粒子液）。Ｖ底マイクロプレートの各ウエル
に非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清を凝集反応希釈液で２倍ずつ
段階希釈したものを25μl 加え、１％感作粒子液25μl
加え、２時間室温に放置した。２時間後各ウエルの凝集
像の有無を観察した。
験管にとり遠心分離機で粒子を沈降させ上澄みを捨てた
後、参考例に従って調製した抗原原液をＰＢＳで２５μ
ｇ／ｍｌに希釈した液を４ｍｌ加えた。更に１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミド
をＰＢＳで５０ｍｇ／ｍｌに溶かし、この液を０．２ｍ
ｌ添加した。３７℃で９０分間反応させ、抗原を粒子に
固定させた。この粒子を冷ＰＢＳで５回洗浄し、凝集反
応希釈液（１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ６．４）、０．３％
正常兎血清、０．０２％ＮａＮ3）５ｍｌに懸濁した
（１％感作粒子液）。Ｖ底マイクロプレートの各ウエル
に非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清を凝集反応希釈液で２倍ずつ
段階希釈したものを25μl 加え、１％感作粒子液25μl
加え、２時間室温に放置した。２時間後各ウエルの凝集
像の有無を観察した。
【００２３】（比較試験例） （１）非修飾粒子を用いた診断 実施例２においてスペルミジンで修飾する操作を省略す
ること以外は実施例２と全く同様にして調製した１％感
作粒子液を用いて評価した。
ること以外は実施例２と全く同様にして調製した１％感
作粒子液を用いて評価した。
【００２４】 （２）ジアミンで修飾した粒子を用いた診断 実施例２においてスペルミジンの代わりにヘプタメチレ
ンジアミンを用いること以外は実施例２と全く同様にし
て調製した１％感作粒子液を用いて評価した。
ンジアミンを用いること以外は実施例２と全く同様にし
て調製した１％感作粒子液を用いて評価した。
【００２５】以上の試験例および比較試験例の結果を表
１に示す。
１に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】表１の結果から、本発明のゲル粒子はトリ
アミン処理をしない粒子やジアミン処理の粒子に比べ、
診断薬としての鋭敏性が優れていることが分かった。
アミン処理をしない粒子やジアミン処理の粒子に比べ、
診断薬としての鋭敏性が優れていることが分かった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 安田 斡司 神奈川県川崎市川崎区夜光１−２−１ 日 本ゼオン株式会社研究開発センター内 (72)発明者 鴨川 幸市 神奈川県川崎市川崎区夜光１−２−１ 日 本ゼオン株式会社研究開発センター内
Claims (2)
- 【請求項１】 粒子表面にカルボキシル基またはエポキ
シ基を有している親水性ゲル粒子のカルボキシル基また
はエポキシ基をトリアミンにより修飾して成る修飾親水
性ゲル粒子。 - 【請求項２】 親水性ゲル粒子が、水膨潤状態における
粒子径０．１〜１０μｍ、粒子径分散が１．２以下の微
粒子であるところの請求項１記載の親水性ゲル粒子
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9095293A JPH06277500A (ja) | 1993-03-25 | 1993-03-25 | トリアミンで修飾した親水性ゲル粒子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9095293A JPH06277500A (ja) | 1993-03-25 | 1993-03-25 | トリアミンで修飾した親水性ゲル粒子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06277500A true JPH06277500A (ja) | 1994-10-04 |
Family
ID=14012823
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9095293A Pending JPH06277500A (ja) | 1993-03-25 | 1993-03-25 | トリアミンで修飾した親水性ゲル粒子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06277500A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003210970A (ja) * | 2002-01-17 | 2003-07-29 | Tokuyama Corp | コロイド状微粒子スラリーの製造方法 |
| JP2008239874A (ja) * | 2007-03-28 | 2008-10-09 | Jsr Corp | ビニルポリマー、ブロッキング剤、およびこれを用いたプローブ結合粒子の製造方法 |
-
1993
- 1993-03-25 JP JP9095293A patent/JPH06277500A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003210970A (ja) * | 2002-01-17 | 2003-07-29 | Tokuyama Corp | コロイド状微粒子スラリーの製造方法 |
| JP2008239874A (ja) * | 2007-03-28 | 2008-10-09 | Jsr Corp | ビニルポリマー、ブロッキング剤、およびこれを用いたプローブ結合粒子の製造方法 |
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