JP4291572B2 - 分子プルダウンおよび免疫沈降用途のための視感度を強化した改善親和性マトリックス - Google Patents
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Description
発明の目的の中に、親和性に基づく分子プルダウン実験中により容易にモニターできて分離中における親和性マトリックスの意図しない損失を回避しそれにより親和性複合体の定量的回収を改善する、相対的に低い非特異的タンパク質結合能を有する親和性マトリックスの提供がある。
ここで使用する「着色ポリマー」または「着色ポリマー支持体」は、染料類を付着させたポリマー性材料を意味する。これらの染料類は好ましくは本質的にタンパク質結合性が低いか、またはタンパク質結合性が低いように修飾された染料類である。「非着色ポリマー」または「非着色ポリマー支持体」は、染料類を付着させていない、架橋アガロースのようなポリマー支持体を意味する。「着色ポリマー」または「着色ポリマー支持体」は、染料を付着させたポリマー支持体を意味する。「着色親和性マトリックス」は、着色ポリマー支持体を含有する親和性マトリックスである。
着色が差異のおよび非−着色のマトリックスの適合性の比較
着色が差異のおよび非−着色のマトリックスを混合し、続いて遠心分離しそして得られたマトリックスペレットを目視観察することによって比較した。
タンパク質によるブロックおよび架橋
公知のタンパク質製品を用いてマトリックスビーズを飽和とし且つタンパク質をアガロースビーズ上に架橋させることにより、染料のタンパク質結合部位を遮蔽し、従って着色性アガロースマトリックスと結合することができるであろう非特異的なライセートタンパク質の量が減少するかどうかを調べた。
管A 水中、5mg/mLのアルブミン溶液(4mL)。
管B 4M NaCl中、20mg/mLのアルブミン溶液(4mL)。
管C 水中、20mg/mLのゼラチン(4mL)。
管D 水中、20mg/mLのカゼイン加水分解物(4mL)。
管E 水中、40mg/mLのゼラチン加水分解物(4mL)。
管F タンパク質混合物(5mg/mLのアルブミン溶液(1mL)、20mg/mLのゼラチン(1mL)、20mg/mLのカゼイン加水分解物(1mL)および40mg/mLのゼラチン加水分解物(1mL))(4mL)。
1.マイクロチューブ(1.5mL)中でアガロースビーズ混合物を調製して、非−着色アガロースとの10%染色アガロース混合物の管当たり50μLのパックドゲルを得る。染色アガロースの50%スラリー(10μL)を非−着色アガロースの50%スラリー(90μL)中に加え、渦巻き、そして氷上にセットする。
2.アガロースビーズをRIPA溶解緩衝液(50mM トリスHCl、pH 8.0、150mM NaCl、1% NP−40、0.5% DOC、0.1% SDS)中で洗浄し/平衡とする:各管にRIPA緩衝液(750μL)を加え、渦巻き、そして微量遠心機中で30秒間遠心分離(8,000×g)する。上清を注意深く吸引し(または、マイクロピペットを用いて取り出す)、そしてビーズペレットを有する管を氷上にセットする。上記の通り、洗浄を繰り返す。最終的なペレットを氷上にセットする。
3.細胞ライセート(100mm組織培養プレート由来の新しい集密の組織培養セルラインのRIPAライセート(1mL))を解凍し、そして氷上にセットする。存在するならば、変性DNA凝集物をピペットを用いて除く。各ライセートをマイクロチューブに移し、低温室(4℃)内の微量遠心機中で10分間遠心分離(8,000×g)して、細胞デブリおよび不溶性の変性タンパク質をペレットする。透明な上清をとり出しそして氷上の管中で合わせる。
4.合わせたライセートを混合し、そして1mLを各々の洗浄したアガロースビーズ管に氷上で加える。簡単に渦巻き、低温室内に置いてインキュベートし、回転ホイール(wheeling)を用いてゆっくりと1時間混合する。
5.微量遠心機中で30秒間遠心分離(8,000×g)する。氷上にセットする。上清を注意深く吸引し(または、マイクロピペットを用いてとり出す)、そしてビーズペレットを有する管を氷上にセットする。
6.各管にRIPA(750μL)を加えることによって、ビーズペレットを洗浄する。簡単に渦巻き、低温室内に置き、インキュベートし、回転ホイールを用いてゆっくりと5分間混合する。低温室(4℃)内の微量遠心機中で30秒間遠心分離(8,000×g)する。上清を注意深く吸引し(または、マイクロピペットを用いてとり出す)、そしてビーズペレットを有する管を氷上にセットする。
7.工程6と同様に、2回以上洗浄を繰り返す。
8.各管にRIPA緩衝液(25μL)を加え、簡単に渦巻き、次いで2×層状(Laemmli)タンパク質ゲル試料緩衝液(25μL)を加える。簡単に渦巻く。直ぐに使用しない場合には、保存のために試料を凍結する。
9.試料を5分間沸騰させ、微量遠心管中で30秒間遠心分離(8,000×g)して、アガロースをペレットする。各上清および分子量標準物質の10μLを変性SDS/PAGEゲル上で実験する。
10.コロイドのブルーおよび/またはシルバー染料を用いて染色して、タンパク質バンドを可視化する。考証および/または定量化のために写真撮影または走査型撮影を行なう。
テューブA樹脂(アルブミンでブロック)の場合には、アルブミンはリアクティブ・レッド120アガロース樹脂と結合したり、架橋した;非特異的なライセートタンパク質との結合は70〜80%だけ減少した。
種々の染料とのアガロース樹脂接合体の非特異的なタンパク質との結合
タンパク質との結合能力について、親和性クロマトグラフィー樹脂を得るのに潜在的に有用である染料をスクリーニングした学術的な文献を参照して、いくつかの染料を選択した。染料の多数が、タンパク質と結合する能力が乏しいために、その利用に不適当であることが分かった。これらの染料のいくつかとのアガロース樹脂接合体を調製し、そして非特異的なタンパク質との結合についてそれらを調べた。
100%プロシオン・レッドMX−5Bアガロースは、非特異的なバックグラウンドタンパク質との結合がコントロールのリアクティブ・レッド120アガロースと比較して70〜80%だけ減少し、そしてゼラチンでブロックされ且つEDACを用いて架橋されたリアクティブ・レッド120アガロース(実施例2を参照)の場合に匹敵することを示した。100%レマゾール・ブリリアント・オレンジ3Rアガロースは、非特異的なバックグラウンドタンパク質との結合がコントロールのリアクティブ・レッド120アガロースと比較して>95%だけ減少することを示した。アガロース中の10%混合物として使用する場合には、レマゾール・ブリリアント・オレンジ3Rアガロースはなお全く可視であるが、非特異的なバックグラウンドタンパク質との結合においては有意な差異は全く示さず、そして非−着色アガロースのみ(100%セファロースCL4B)の場合に匹敵した。
炭酸塩を用いる反応性染料とアガロースとのカップリング反応
染料とアガロースとのカップリング反応の別方法は、炭酸塩中でカップリング反応を実施することを含む。各カップリング反応について、セファロースCL−4Bアガロース(1.75mLのパックドゲル)の50%スラリー(3.5mL)を管に分配し、そしてこれらを卓上用遠心機中、室温で5分間遠心分離(2500×g)した。各上清を吸引によってとり出した。アガロース樹脂ペレットを各々、実施例2に記載する通り、3回水洗(10mL)し、そして最終的な洗液の上清を吸引によってとり出した。アガロース樹脂ペレットを各々、0.4M炭酸ナトリウム(Na2CO3)の0.5パックドゲル容量(0.85mL)中に懸濁した。
結果は、実施例3の結果と非常に類似した。100%プロシオン・レッドMX−5Bアガロースは、非特異的なバックグラウンドタンパク質との結合がコントロールのリアクティブ・レッド120アガロースと比較して70〜80%だけ減少し、そしてゼラチンでブロックされ且つEDACを用いて架橋されたリアクティブ・レッド120アガロースの場合に匹敵することを示した(実施例2を参照)。100%レマゾールブリリアントオレンジ3Rアガロースは、非特異的なバックグラウンドタンパク質との結合がコントロールのリアクティブ・レッド120アガロースの場合と比較して>95%だけ減少することを示した。アガロース中の10%混合物として使用する場合には、レマゾール・ブリリアント・オレンジ3Rアガロースはなお全く可視であるが、非特異的なバックグラウンドタンパク質との結合は全く検出し得ないことを示し、そして非−着色アガロースのみ(100%セファロースCL−4B)の場合に匹敵した。
免疫沈降法における着色した親和性マトリックスの使用
レマゾール・ブリリアント・レッドBBを、実施例4に記載する方法を用いてアガロース(セファロースCL−4B)とカップリングさせた。得られた着色樹脂であるブリリアント・レッドBBアガロースについて、実施例2の擬似免疫沈降プロトコールに記載する通り、哺乳動物組織細胞ライセートと結合した非特異的なバックグラウンドタンパク質の量を調べた。100%レマゾール・ブリリアント・レッドBBアガロースは、非特異的なバックグラウンドタンパク質がコントロールのリアクティブ・レッド120アガロースと比較して>95%だけ減少することを示した。アガロース中の10%混合物として使用する場合には、レマゾール・ブリリアント・レッドBBアガロースはなお全く可視であるが、非特異的なバックグラウンドタンパク質との有意な結合は全く示さず、そして非−着色アガロースのみ(100%セファロースCL−4B)の場合に匹敵した。
レッド・プロテインAアガロースペレットは周囲光で非常に可視であり、一方で非−着色プロテインAアガロースペレットは見るのが困難であった。レッド・プロテインAアガロースの高い視感度は、全ての操作を容易にし、そして吸引間、ペレットの偶発的な除去によって間違いが生じる傾向が少ない。レッド・プロテインアガロースA免疫沈降物は、非−着色プロテインAアガロース免疫沈降物の場合と同程度に、N−FLAG−BAPタンパク質についてのイムノブロット上のシグナル強度を示し、非特異的なバックグラウンドの検出可能な増大は全くなかった。従って、本発明は、標準的な方法と等価な性能を供する一方で、親和性ベースの分子プルダウン法、免疫沈降法を著しく容易にするものである。
Claims (82)
- 水性溶液から分子を分離するための親和性マトリックスであって、粒状ポリマー支持体、その粒状ポリマー支持体の光学的検出を可能とするため該粒状ポリマー支持体の画分に共有結合させた染料、および分子を捕獲するため粒状ポリマー支持体の画分に結合させた、上記染料以外の親和性リガンドを含み、その染料と親和性リガンドが異なる粒状ポリマー支持体の画分に結合していることを特徴とする、親和性マトリックス。
- 該染料が、粒状ポリマー支持体の1%〜50%(重量)に結合し、該親和性リガンドが、粒状ポリマー支持体の50%〜99%(重量)に結合している、請求項1記載の親和性マトリックス。
- 該染料が、粒状ポリマー支持体の1%〜15%(重量)に結合し、該親和性リガンドが、粒状ポリマー支持体の85%〜99%(重量)に結合している、請求項1記載の親和性マトリックス。
- 該染料が、粒状ポリマー支持体の2%〜10%(重量)に結合し、該親和性リガンドが、粒状ポリマー支持体の90%〜98%(重量)に結合している、請求項1記載の親和性マトリックス。
- 染料が対照マトリックスの粒状支持体に結合していないことを除いて、対照マトリックスが親和性マトリックスと実質的に同一であり、生理的な塩およびpH条件下、天然−由来の哺乳動物細胞のライセートに存在する非−特異的結合タンパク質に対する親和性マトリックスの能力が、同一条件下で対照マトリックスの能力の50倍より小である、請求項1記載の親和性マトリックス。
- 粒状支持体の大きさの平均が1,000マイクロメートルより小さい、請求項5記載の親和性マトリックス。
- 粒状支持体の大きさの平均が600マイクロメートルより小さい、請求項5記載の親和性マトリックス。
- 粒状支持体の大きさの平均が400マイクロメートルより小さい、請求項5記載の親和性マトリックス。
- 粒状支持体の大きさの平均が200マイクロメートルより小さい、請求項5記載の親和性マトリックス。
- 染料が、アゾ発色団含有染料、アントロキノン発色団含有染料、またはフタロシアニン発色団含有染料を含む、請求項5記載の親和性マトリックス。
- 染料が、ビニルスルホン含有染料、モノまたはジクロロトリアジン含有染料、またはモノクロロ・ジフルオロ・ピリミジミウム含有染料を含む、請求項5記載の親和性マトリックス。
- 染料が対照マトリックスの粒状支持体に結合していないことを除いて、対照マトリックスが親和性マトリックスと実質的に同一であり、生理的な塩およびpH条件下、天然−由来の哺乳動物細胞のライセートに存在する非−特異的結合タンパク質に対する親和性マトリックスの能力が、同一条件下で対照マトリックスの能力の10倍より小である、請求項1記載の親和性マトリックス。
- 粒状支持体の大きさの平均が1,000マイクロメートルより小さい、請求項12記載の親和性マトリックス。
- 粒状支持体の大きさの平均が600マイクロメートルより小さい、請求項12記載の親和性マトリックス。
- 粒状支持体の大きさの平均が400マイクロメートルより小さい、請求項12記載の親和性マトリックス。
- 粒状支持体の大きさの平均が200マイクロメートルより小さい、請求項12記載の親和性マトリックス。
- 染料が、アゾ発色団含有染料、アントロキノン発色団含有染料、またはフタロシアニン発色団含有染料を含む、請求項12記載の親和性マトリックス。
- 染料が、ビニルスルホン含有染料、モノまたはジクロロトリアジン含有染料、またはモノクロロ・ジフルオロ・ピリミジミウム含有染料を含む、請求項12記載の親和性マトリックス。
- 染料が対照マトリックスの粒状支持体に結合していないことを除いて、対照マトリックスが親和性マトリックスと実質的に同一であり、生理的な塩およびpH条件下、天然−由来の哺乳動物細胞のライセートに存在する非−特異的結合タンパク質に対する親和性マトリックスの能力が、同一条件下で対照マトリックスの能力の3倍より小である、請求項1記載の親和性マトリックス。
- 粒状支持体の大きさの平均が1,000マイクロメートルより小さい、請求項19記載の親和性マトリックス。
- 粒状支持体の大きさの平均が600マイクロメートルより小さい、請求項19記載の親和性マトリックス。
- 粒状支持体の大きさの平均が400マイクロメートルより小さい、請求項19記載の親和性マトリックス。
- 粒状支持体の大きさの平均が200マイクロメートルより小さい、請求項19記載の親和性マトリックス。
- 染料が、アゾ発色団含有染料、アントロキノン発色団含有染料、またはフタロシアニン発色団含有染料を含む、請求項19記載の親和性マトリックス。
- 染料が、ビニルスルホン含有染料、モノまたはジクロロトリアジン含有染料、またはモノクロロ・ジフルオロ・ピリミジミウム含有染料を含む、請求項19記載の親和性マトリックス。
- 染料が、リアクティブ・レッド21を含む、請求項19記載の親和性マトリックス。
- 粒状支持体の大きさの平均が1,000マイクロメートルより小さい、請求項1記載の親和性マトリックス。
- 粒状支持体の大きさの平均が600マイクロメートルより小さい、請求項1記載の親和性マトリックス。
- 粒状支持体の大きさの平均が400マイクロメートルより小さい、請求項1記載の親和性マトリックス。
- 粒状支持体の大きさの平均が200マイクロメートルより小さい、請求項1記載の親和性マトリックス。
- 親和性マトリックスがゼラチン吸着または架橋によって修飾されている、請求項1記載の親和性マトリックス。
- 染料が、アゾ発色団含有染料、アントロキノン発色団含有染料、またはフタロシアニン発色団含有染料を含む、請求項31記載の親和性マトリックス。
- 染料が、ビニルスルホン含有染料、モノまたはジクロロトリアジン含有染料、またはモノクロロ・ジフルオロ・ピリミジミウム含有染料を含む、請求項31記載の親和性マトリックス。
- 染料が、リアクティブ・レッド120、またはリアクティブ・ブラウン10を含む、請求項31記載の親和性マトリックス。
- 染料が、フルオレセイン、クマリン誘導体、ピリジルオキサゾール誘導体、またはランタナイド(lanthanide)金属キレートを含む、請求項31記載の親和性マトリックス。
- 染料が、ナフタレン、ピレン、ローダミン、フルオレセイン・イソチオシアナート、テルビウム錯体、ユーロピウム錯体、またはルテニウム錯体を含む、請求項31記載の親和性マトリックス。
- 粒状ポリマー支持体が、天然アガロース粒子、架橋アガロース粒子、架橋デキストラン粒子、またはポリアクリルアミド粒子を含む、請求項1記載の親和性マトリックス。
- 架橋アガロース粒子が直径20〜300マイクロメートルである、請求項37記載の親和性マトリックス。
- 架橋アガロース粒子が直径30〜250マイクロメートルである、請求項37記載の親和性マトリックス。
- 架橋アガロース粒子が直径40〜165マイクロメートルである、請求項37記載の親和性マトリックス。
- 天然アガロース粒子が直径30〜250マイクロメートルである、請求項37記載の親和性マトリックス。
- 架橋デキストラン粒子が直径20〜400マイクロメートルである、請求項37記載の親和性マトリックス。
- ポリアクリルアミド粒子が直径30〜150マイクロメートルである、請求項37記載の親和性マトリックス。
- 粒状ポリマー支持体に結合している染料の量が、染料0.5マイクロモル/cm3(ポリマー支持体)〜染料20マイクロモル/cm3(ポリマー支持体)を含む、請求項1記載の親和性マトリックス。
- 粒状ポリマー支持体に結合している染料の量が、染料1マイクロモル/cm3(ポリマー支持体)〜染料6マイクロモル/cm3(ポリマー支持体)を含む、請求項1記載の親和性マトリックス。
- 粒状ポリマー支持体に結合している染料の量が、染料2マイクロモル/cm3(ポリマー支持体)〜染料4マイクロモル/cm3(ポリマー支持体)を含む、請求項1記載の親和性マトリックス。
- ポリマーが直径30〜250マイクロメートルの架橋アガロース粒子を含み、上記架橋アガロース粒子が上記染料1マイクロモル/cm3(架橋アガロース)〜上記染料6マイクロモル/cm3(架橋アガロース)を有する、請求項1記載の親和性マトリックス。
- ポリマーが直径40〜165マイクロメートルの架橋アガロース粒子を含み、上記架橋アガロース粒子が上記染料2マイクロモル/cm3(架橋アガロース)〜上記染料4マイクロモル/cm3(架橋アガロース)を有する、請求項1記載の親和性マトリックス。
- 親和性リガンドが、ストレプトアビジン、単量体ストレプトアビジン、ストレプトアビジンの結合特性を有する分子、アビジン、単量体アビジン、アビジンの結合特性を有する分子、ストレプトアクチン、単量体ストレプトアクチン、ストレプトアクチンの結合特性を有する分子、エクストラビジン、単量体エクストラビジン、エクストラビジンの結合特性を有する分子、ニュートラビジン、単量体ニュートラビジン、ニュートラビジンの結合特性を有する分子、プロテインA、プロテインAの結合特性を有する分子、プロテインL、プロテインLの結合特性を有する分子、プロテインG、プロテインGの結合特性を有する分子、プロテインA/G、プロテインA/Gの結合特性を有する分子、プロテインL/A、プロテインL/Aの結合特性を有する分子、カルモデュリン、カルモデュリンの結合特性を有する分子、ビオチン、ビオチンの結合特性を有する分子、金属キレート、グルタチオン、および抗体からなる群から選ばれる、請求項1記載の親和性マトリックス。
- 親和性マトリックスが、700xgより小さい遠心分離によって溶液から集められたものである、請求項1記載の親和性マトリックス。
- 非−着色粒状ポリマー支持体および着色粒状ポリマー支持体の混合物を含み、該着色粒状ポリマー支持体はポリマーとそのポリマーに共有結合した染料を含み、該非−着色粒状ポリマー支持体はポリマーと親和性リガンドを含む、請求項1記載の親和性マトリックス。
- 着色粒状ポリマー支持体が、親和性マトリックスの1%(容量)〜95%(容量)を占める、請求項51記載の親和性マトリックス。
- 着色粒状ポリマー支持体が、親和性マトリックスの2%(容量)〜50%(容量)を占める、請求項51記載の親和性マトリックス。
- 着色粒状ポリマー支持体が、親和性マトリックスの2%(容量)〜10%(容量)を占める、請求項51記載の親和性マトリックス。
- 非−着色親和性マトリックスが抗体結合マトリックスを含む、請求項51記載の親和性マトリックス。
- 抗体結合マトリックスが、プロテインAアガロース、プロテインAの結合特性を有する分子で修飾されたアガロース、プロテインGアガロース、プロテインGの結合特性を有する分子で修飾されたアガロース、プロテインLアガロース、プロテインLの結合特性を有する分子で修飾されたアガロース、プロテインA/Gアガロース、プロテインA/Gの結合特性を有する分子で修飾されたアガロース、プロテインL/Aアガロース、およびプロテインL/Aの結合特性を有する分子で修飾されたアガロースからなる群から選ばれる、請求項55記載の親和性マトリックス。
- 非−着色親和性マトリックスが、結合抗体を有するマトリックスを含む、請求項51記載の親和性マトリックス。
- 結合抗体を有するマトリックスが、特定のタンパク質に対する抗体を有するマトリックスを含む、請求項57記載の親和性マトリックス。
- 結合抗体を有するマトリックスが、融合タンパク質上の特異的ペプチドタグに対する抗体を有するマトリックスを含む、請求項57記載の親和性マトリックス。
- 結合抗体を有するマトリックスが、タンパク質内のエピトープに対する抗体を有するマトリックスを含む、請求項57記載の親和性マトリックス。
- 抗体が、アミノ酸配列DYKDDDDKの少なくとも一部に対して特異性を有する抗体、抗−ポリヒスチジン、抗−グルタチオン−S−トランスフェラーゼ、抗−myc−タグ、抗−Avi−タグ、抗−HA、抗−緑色蛍光タンパク質、抗−ベータ・ガラクトシダーゼ、抗−チオレドキシン、抗−マルトース結合タンパク質、抗−セルロース結合ドメイン、抗−VSVグリコプロテイン、および抗−ルシフェラーゼからなる群から選ばれる、請求項57記載の親和性マトリックス。
- 非−着色親和性マトリックスが、結合親和性リガンドを有するマトリックスを含む、請求項51記載の親和性マトリックス。
- 親和性リガンドが、ストレプトアビジン、単量体ストレプトアビジン、ストレプトアビジンの結合特性を有する分子、アビジン、単量体アビジン、アビジンの結合特性を有する分子、ストレプトアクチン、単量体ストレプトアクチン、ストレプトアクチンの結合特性を有する分子、エクストラビジン、単量体エクストラビジン、エクストラアビジンの結合特性を有する分子、ニュートラビジン、単量体ニュートラビジン、ニュートラビジンの結合特性を有する分子、プロテインA、プロテインAの結合特性を有する分子、プロテインL、プロテインLの結合特性を有する分子、プロテインG、プロテインGの結合特性を有する分子、プロテインA/G、プロテインA/Gの結合特性を有する分子、プロテインL/A、プロテインL/Aの結合特性を有する分子、カルモデュリン、カルモデュリンの結合特性を有する分子、ビオチン、ビオチンの結合特性を有する分子、金属キレート、グルタチオンからなる群から選ばれる、請求項62記載の親和性マトリックス。
- 試料水性溶液から生体分子を分離する方法であって、水性溶液を、粒状ポリマー支持体、親和性マトリックスの光学的検出を可能とするため粒状ポリマー支持体の画分に結合させた染料、および生体分子の捕獲のための粒状ポリマー支持体の画分に結合させた、染料以外の親和性リガンドを含む親和性マトリックスと混合し、試料水性溶液から親和性マトリックスを分離することを特徴とする方法。
- 分離工程中に親和性マトリックスを光学的に観察し、親和性マトリックスの損失を避ける、請求項64記載の方法。
- 分離工程が、手作業で行われ、親和性マトリックスを分離工程中に可視的に観察し、親和性マトリックスの損失を避ける、請求項64記載の方法。
- 親和性リガンドが、ストレプトアビジン、単量体ストレプトアビジン、ストレプトアビジンの結合特性を有する分子、アビジン、単量体アビジン、アビジンの結合特性を有する分子、ストレプトアクチン、単量体ストレプトアクチン、ストレプトアクチンの結合特性を有する分子、エクストラビジン、単量体エクストラビジン、エクストラビジンの結合特性を有する分子、ニュートラビジン、単量体ニュートラビジン、ニュートラビジンの結合特性を有する分子、プロテインA、プロテインAの結合特性を有する分子、プロテインL、プロテインLの結合特性を有する分子、プロテインG、プロテインGの結合特性を有する分子、プロテインA/G、プロテインA/Gの結合特性を有する分子、プロテインL/A、プロテインL/Aの結合特性を有する分子、カルモデュリン、カルモデュリンの結合特性を有する分子、ビオチン、ビオチンの結合特性を有する分子、金属キレート、グルタチオン、および抗体からなる群から選ばれる、請求項64記載の方法。
- 生体分子を含有する試料水性溶液を親和性マトリックスに添加する、請求項64記載の方法。
- 方法が、免疫沈降である、請求項64記載の方法。
- 生体分子が、天然由来の生体分子、合成生体分子、修飾された天然由来の生体分子、または修飾された合成生体分子を含む、請求項64記載の方法。
- 生体分子が、(i)ペプチド、ポリペプチド、種々のタンパク質、グリコプロテイン、酵素、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸ポリマー、炭水化物、脂質、および(ii) 群(i)の生体分子を含有する複合体からなる群から選ばれる、請求項70記載の方法。
- 生体分子が、タンパク質を含む、請求項70記載の方法。
- 試料水性溶液が、ライセート、ライセート画分、未精製生体分子を含有する緩衝液、および精製生体分子を含有する緩衝液からなる群から選ばれる、請求項64記載の方法。
- 試料水性溶液がライセートを含む、請求項64記載の方法。
- 方法が、さらに、親和性マトリックスが試料溶液から分離された後に、親和性マトリックスを洗浄水性溶液で洗浄し、洗浄水性溶液から親和性マトリックスを分離し、洗浄水性溶液から分離するときに、親和性マトリックスを光学的に観察する工程を含む、請求項64記載の方法。
- 洗浄水性溶液が、溶解(lysis)緩衝液を含む、請求項75記載の方法。
- さらに、親和性マトリックスに結合した生体分子を解離させる、請求項64記載の方法。
- さらに、親和性マトリックスに結合した生体分子を解離させる、請求項75記載の方法。
- 生体分子を、さらに分析方法にかける、請求項77記載の方法。
- 生体分子を、さらに分析方法にかける、請求項78記載の方法。
- 分析方法が、SDS−PAGEを含む、請求項80記載の方法。
- 分析方法が、酵素試験法を含む、請求項80記載の方法。
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