CN107267475A - 一种金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白的方法。本发明将硫氧还蛋白重组质粒在大肠杆菌中大量表达完成，加入细胞裂解液，离心去除细胞碎片，在上清液中加入用缓冲溶液平衡好的固定金属钴离子的羧甲基天冬氨酸化的琼脂糖凝胶微球，充分孵育后，离心分离，在离心后的微球介质中采用淋洗液进行梯度淋洗，淋洗后用加入咪唑的上述缓冲溶液充分洗脱，收集洗脱液。本方法实现了采用金属螯合亲和色谱梯度洗脱纯化硫氧还蛋白的效果，具有目标蛋白吸附量大、产品纯度高、洗脱条件温和、成本低、操作简便高效等特点，适合规模化应用。

Description

一种金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白的方法
技术领域
本发明涉及生物医药材料制备技术领域，尤其涉及一种采用金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白的高效制备方法。
背景技术
硫氧还蛋白(Thioredoxin，Trx)是一类高度保守的紧密球形蛋白，由100余个氨基酸残基，形成一个“TRX折叠”的稳定三维结构，广泛分布于各种生物体内。Trx是一个具有氧化还原作用的小分子功能性蛋白，相对分子质量约12kDa,含有一个保守的氧化还原活性位点Cys-Gly-Pro-Cys，其中的两个Cys残基能够通过转移电子还原其他含二硫键的蛋白质，可逆催化许多氧化还原反应，赋予Trx独特的生物学特性，使得生物体内的一系列生理反应得以顺利进行。
Trx具有抗氧化、抗炎症、抗过敏和抗衰老等多种功能，可以调节细胞生长、抑制细胞凋亡、调节基因转录等，对维持生物体内稳定的氧化还原状态具有重要的作用。此外，Trx与植物抗逆性相关，在植物遗传性状改良等方面具有广泛的应用前景，如参与植物抗旱、耐热和抗氧化胁迫过程，调节抗逆基因的表达等。
1964年，Reichard等首次发现在大肠杆菌中，Trx作为核苷酸还原酶的供体参与DNA的合成。大肠杆菌的Trx结构是一种结合紧密的球形蛋白质，由5个β折叠构成一个疏水核心，核心的终末端被4个α螺旋包绕。在酵母中，Trx是DNA快速复制的重要保障。酵母细胞溶质的硫氧还蛋白系统与大肠杆菌的相似，在细菌和酵母菌中，Trx作为PAPS将硫酸盐还原为亚硫酸盐，完成了硫的同化。
在人体中，硫氧还蛋白又称为成人T细胞白血病衍生因子，与NADPH和硫氧还蛋白还原酶共同组成Trx还原系统，对维持体内稳定的氧化还原状态具有重要的作用。人体内的硫氧还蛋白可对多种转录因子如NF，KB，AP1发挥调节作用，并可促进细胞的增殖及抑制细胞的凋亡。Trx也可直接清除活性氧，它可将O-转化为OH-。Trx还能保护内皮细胞和肾脏的缺血再灌注损伤等。
Trx能抑制许多抗病变、抗癌变药物所致的凋亡，保护细胞处于氧化还原状态，免受伤害，并且研究发现，急性HIV感染的细胞中Trx短暂下调，感染后期血浆Trx升高，因此血浆Trx可成为预测和评价某些疾病的重要的生物学指标。硫氧还蛋白对生物体的重要功能，具有其他药物无可替代的作用，但是由于硫氧还蛋白在生物体内的含量特别少，而且只有在应激状态下才会产生硫氧还蛋白，目前世界范围内，还没有能够对硫氧还蛋白进行规模化生产的方法，产率和纯度等方面的瓶颈都不利于对硫氧还蛋白的医学医用方面的开展，本方法在一定程度上可以解决目前硫氧还蛋白制备方法的难题，为其相关的生物医药领域的应用提供基础。
固定金属离子亲和色谱(金属螯合亲和色谱)是近几年发展起来的一种新型分离技术，主要根据蛋白质中组氨酸、色氨酸或半胱氨酸等氨基酸残基与色谱柱上的金属离子螯合作用形成络合物而实现分离蛋白质的目的。固定金属离子亲和色谱(金属螯合亲和色谱)的固定相是由基质、络合剂和金属离子三部分组成。基质用以担载金属螯合配体。络合剂的作用是将金属离子固定在基质上。固定金属与络合剂形成可与蛋白质结合的金属螯合配体。与其他分离蛋白质技术相比，该方法因具有配体稳定，蛋白吸附量大，洗脱条件温和，成本低等优点，已经成为一种重要的蛋白质分离方法。
发明内容
本发明针对目前生物医药领域等应用中，硫氧还蛋白纯化制备技术难度大的瓶颈而导致一定程度上抑制硫氧还蛋白广泛应用的问题，提供了一种金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)将硫氧还蛋白重组质粒(其基因序列如SEQ ID NO.1所示)置于大肠杆菌的细胞中，得菌液；在LB细胞培养液(含有卡那霉素25μg/mL和100μg/mL腺苷一磷酸，溶剂为水)中培养细胞(菌液与细胞培养液体积比为1：100)，使重组质粒表达完成，之后细胞经预冷到4℃的PBS溶液和室温下的双蒸水分别冲洗若干次，加入细胞裂解液，细胞裂解液的加入量与细胞培养液的体积比为1：1～1：20，摇动至溶液成透明状，6000～16000r/min下离心5～60min，去除细胞碎片，分离上清液及菌沉淀，在上清液中加入用缓冲溶液平衡好的固定金属离子的羧甲基天冬氨酸化的琼脂糖凝胶微球，固定金属离子的物质的量与细胞培养液的体积的比例为1：1～1：20(mol：mL)，孵育5～80min后，离心分离；
(2)在离心后余下的微球介质中采用淋洗液(含有NaCl的缓冲溶液)进行梯度淋洗，采用的梯度淋洗方法为：NaCl浓度在0mol/L到0.05mol/L范围内以6mL/min的速度进行线性梯度洗脱)，淋洗之后再采用含有20～400mM咪唑的缓冲溶液进行充分洗脱，收集洗脱液，得到金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白。
进一步地：所述细胞经预冷到4℃的PBS溶液和室温下的双蒸水分别冲洗1～5次。
进一步地：所述细胞裂解液和缓冲溶液组分相同，均含有0.1～200mM Tris-HCl、0.1～10mM EDTA、0.1～200mM NaCl、0.01％～10％(w/v)SDS，其余为无菌水。
进一步地：所述细胞裂解液和缓冲溶液组分相同，均含有：0.1～200mM NaH2PO4、0.1～100mM Tris、0.1～100mM Urea，其余为无菌水。
进一步地：所述离心步骤转速优选为12000r/min，离心时间优选为10min。
进一步地：所述固定金属离子为具有d层空价电子轨道的过渡金属离子，优选Co2+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、Fe3+。
进一步地：所述咪唑的浓度优选为250mM。
进一步地：所述步骤1和步骤2均在2～35℃的操作温度范围下进行。
本发明的有益效果如下：
1.分离介质柱效高。本方法采用高亲水性和高多孔性的固定金属钴离子的琼脂糖凝胶微球分离纯化硫氧还蛋白，分离介质尺寸均一、可控，分辨率高、选择性好、操作简单，分离时压力稳定，流速变化范围广，比其它的分离介质分离效率高；
2.易于规模化实现。目前全球范围内，硫氧还蛋白的规模化纯化制备还属于一片空白，这在一定程度上限制了硫氧还蛋白的广泛应用，本方法操作方便，成本低、制备效率高、产品纯度高、污染小且回收方便，便于规模化生产应用；
3.纯化效果好。采用不同NaCl浓度的梯度淋洗法结合金属螯合亲和色谱的方法来纯化硫氧还蛋白，协调使用，既可以对硫氧还蛋白产品进行有效深度纯化，除去一些难以去除的杂质，又可以提高效率，有效提高硫氧还蛋白产品的纯度；
4.产品品质稳定。本发明采用低温色谱的方法进行分离纯化，并且所用的溶剂不损坏目的蛋白的活性，可以保证产品的品质稳定，便于下一步的广泛应用。
具体实施方式
实施例1
将硫氧还蛋白重组质粒在大肠杆菌细胞中大量表达完成，细胞经预冷的PBS和双蒸水分别冲洗3次，按照与细胞培养液体积比1：1的比例，加入细胞裂解液A溶液(50mMTris-HCl，1.0mM EDTA，150mM NaCl，质量分数0.1％的SDS)，轻摇30min至溶液成透明状，16000r/min下离心60min，去除细胞碎片，分离上清液及菌沉淀，在上清液中加入用缓冲溶液A平衡好的固定金属钴离子的羧甲基天冬氨酸化的琼脂糖凝胶微球，孵育80min后，离心分离，取上清液进行SDS-PAGE分析；在离心后的介质中采用不同NaCl浓度的A溶液进行梯度淋洗，采用的淋洗方法为：NaCl浓度在0mol/L到0.05mol/L范围内以6mL/min的速度进行线性梯度洗脱)，淋洗之后再采用加入含有400mM咪唑的A溶液进行充分洗脱，收集洗脱液，测定其在280nm处的吸光度值并进行SDS-PAGE分析。结果显示，样品中的目的蛋白几乎全部与钴柱结合，泳道中无杂带，表明蛋白纯化效果好，硫氧还蛋白产品的纯度可以达到95％以上。
实施例2
将硫氧还蛋白重组质粒在大肠杆菌细胞中大量表达完成，细胞经预冷的PBS和双蒸水分别冲洗1次，按照与细胞培养液体积比1：20的比例，加入细胞裂解液A溶液(50mMTris-HCl，1.0mM EDTA，150mM NaCl，质量分数0.1％的SDS)，轻摇30min至溶液成透明状，6000r/min下离心60min，去除细胞碎片，分离上清液及菌沉淀，在上清液中加入用缓冲溶液A平衡好的固定金属钴离子的羧甲基天冬氨酸化的琼脂糖凝胶微球，孵育50min后，离心分离，取上清液进行SDS-PAGE分析；在离心后的介质中采用不同NaCl浓度的A溶液进行梯度淋洗，采用的淋洗方法为：NaCl浓度在0mol/L到0.05mol/L范围内以6mL/min的速度进行线性梯度洗脱)，淋洗之后再采用加入含有250mM咪唑的A溶液进行充分洗脱，收集洗脱液，测定其在280nm处的吸光度值并进行SDS-PAGE分析。结果显示，样品中的目的蛋白几乎全部与钴柱结合，泳道中无杂带，表明蛋白纯化效果好，硫氧还蛋白产品的纯度可以达到95％以上。
实施例3
将硫氧还蛋白重组质粒在大肠杆菌细胞中大量表达完成，细胞经预冷的PBS和双蒸水分别冲洗3次，按照与细胞培养液体积比1：10的比例，加入细胞裂解液A溶液(50mMTris-HCl，1.0mM EDTA，150mM NaCl，质量分数0.1％的SDS)，轻摇30min至溶液成透明状，12000r/min下离心10min，去除细胞碎片，分离上清液及菌沉淀，在上清液中加入用缓冲溶液A平衡好的固定金属钴离子的羧甲基天冬氨酸化的琼脂糖凝胶微球，孵育50min后，离心分离，取上清液进行SDS-PAGE分析；在离心后的介质中采用不同NaCl浓度的A溶液进行梯度淋洗，采用的淋洗方法为：NaCl浓度在0mol/L到0.05mol/L范围内以6mL/min的速度进行线性梯度洗脱)，淋洗之后再采用加入含有250mM咪唑的A溶液进行充分洗脱，收集洗脱液，测定其在280nm处的吸光度值并进行SDS-PAGE分析。结果显示，样品中的目的蛋白几乎全部与钴柱结合，泳道中无杂带，表明蛋白纯化效果好，硫氧还蛋白产品的纯度可以达到95％以上。
实施例4
将硫氧还蛋白重组质粒在大肠杆菌细胞中大量表达完成，细胞经预冷的PBS和双蒸水分别冲洗3次，按照与细胞培养液体积比1：10的比例，加入细胞裂解液A溶液(100mMNaH2PO4,10mMtris,8mMUrea)，轻摇30min至溶液成透明状，12000r/min下离心10min，去除细胞碎片，分离上清液及菌沉淀，在上清液中加入用缓冲溶液A平衡好的固定金属钴离子的羧甲基天冬氨酸化的琼脂糖凝胶微球，孵育50min后，离心分离，取上清液进行SDS-PAGE分析；在离心后的介质中采用不同NaCl浓度的A溶液进行梯度淋洗，采用的淋洗方法为：NaCl浓度在0mol/L到0.05mol/L范围内以6mL/min的速度进行线性梯度洗脱)，淋洗之后再采用加入含有250mM咪唑的A溶液进行充分洗脱，收集洗脱液，测定其在280nm处的吸光度值并进行SDS-PAGE分析。结果显示，样品中的目的蛋白几乎全部与钴柱结合，泳道中无杂带，表明蛋白纯化效果好，硫氧还蛋白产品的纯度可以达到95％以上。
实施例5
将硫氧还蛋白重组质粒在大肠杆菌细胞中大量表达完成，细胞经预冷的PBS和双蒸水分别冲洗3次，按照与细胞培养液体积比1：10的比例，加入细胞裂解液A溶液(100mMNaH2PO4,10mMtris,8mMUrea)，轻摇30min至溶液成透明状，12000r/min下离心10min，去除细胞碎片，分离上清液及菌沉淀，在上清液中加入用缓冲溶液A平衡好的固定金属钴离子的羧甲基天冬氨酸化的琼脂糖凝胶微球，孵育60min后，离心分离，取上清液进行SDS-PAGE分析；在离心后的介质中采用不同NaCl浓度的A溶液进行梯度淋洗，采用的淋洗方法为：NaCl浓度在0mol/L到0.05mol/L范围内以6mL/min的速度进行线性梯度洗脱)，淋洗之后再采用加入含有300mM咪唑的A溶液进行充分洗脱，收集洗脱液，测定其在280nm处的吸光度值并进行SDS-PAGE分析。结果显示，样品中的目的蛋白几乎全部与钴柱结合，泳道中无杂带，表明蛋白纯化效果好，硫氧还蛋白产品的纯度可以达到95％以上。
以上所述，对于本领域的普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案和技术构思做出其他各种相应的改变，而所有这些改变都应属于本发明权利要求的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江福斯特新材料研究院有限公司
<120> 一种金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白的方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 503
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 1
ctcccggccg ccatggcggc cgcgggaatt cgattatggt gaagcagatc gagagcaaga 60
ctgcttttca ggaagccttg gacgctgcag gtgataaact tgtagtagtt gacttctcag 120
ccacgtggtg tgggccttgc aaaatgatca agcctttctt tcattccctc tctgaaaagt 180
attccaacgt gatattcctt gaagtagatg tggatgactg tcaggatgtt gcttcagagt 240
gtgaagtcaa atgcatgcca acattccagt tttttaagaa gggacaaaag gtgggtgaat 300
tttctggagc caataaggaa aagcttgaag ccaccattaa tgaattagtc taatcatgtt 360
ttctggaaac ataaccagcc attggctatt taaaacttgt aattttttta atttacaaaa 420
atataaaata tgaagacata accagttgcc aatcactagt gaattcgcgg ccgcctgcag 480
gtcgaccata tgggagagct ccc 503

Claims (8)

1.一种金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将硫氧还蛋白重组质粒(其基因序列如SEQ ID NO.1所示)置于大肠杆菌的细胞中，得菌液；在LB细胞培养液(含有卡那霉素25μg/mL和100μg/mL腺苷一磷酸，溶剂为水)中培养细胞(菌液与细胞培养液体积比为1：100)，使重组质粒表达完成，之后细胞经预冷到4℃的PBS溶液和室温下的双蒸水分别冲洗若干次，加入细胞裂解液，细胞裂解液的加入量与细胞培养液的体积比为1：1～1：20，摇动至溶液成透明状，6000～16000r/min下离心5～60min，去除细胞碎片，分离上清液及菌沉淀，在上清液中加入用缓冲溶液平衡好的固定金属离子的羧甲基天冬氨酸化的琼脂糖凝胶微球，固定金属离子的物质的量与细胞培养液的体积的比例为1：1～1：20(mol：mL)，孵育5～80min后，离心分离。
(2)在离心后余下的微球介质中采用淋洗液(含有NaCl的缓冲溶液)进行梯度淋洗，采用的梯度淋洗方法为：NaCl浓度在0mol/L到0.05mol/L范围内以6mL/min的速度进行线性梯度洗脱)，淋洗之后再采用含有20～400mM咪唑的缓冲溶液进行充分洗脱，收集洗脱液，得到金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白的方法，其特征在于：所述细胞经预冷到4℃的PBS溶液和室温下的双蒸水分别冲洗1～5次。
3.根据权利要求1所述的一种金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白的方法，其特征在于：所述细胞裂解液和缓冲溶液组分相同，均含有0.1～200mM Tris-HCl、0.1～10mM EDTA、0.1～200mMNaCl、0.01％～10％(w/v)SDS，其余为无菌水。
4.根据权利要求1所述的一种金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白的方法，其特征在于：所述细胞裂解液和缓冲溶液组分相同，均含有：0.1～200mM NaH2PO4、0.1～100mM Tris、0.1～100mMUrea，其余为无菌水。
5.根据权利要求1所述的一种金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白的方法，其特征在于：所述离心步骤转速优选为12000r/min，离心时间优选为10min。
6.根据权利要求1所述的一种金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白的方法，其特征在于：所述固定金属离子为具有d层空价电子轨道的过渡金属离子，优选Co2+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、Fe3 +。
7.根据权利要求1所述的一种金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白的方法，其特征在于：所述咪唑的浓度优选为250mM。
8.根据权利要求1所述的一种金属螯合亲和色谱纯化硫氧还蛋白的方法，其特征在于：所述步骤1和步骤2均在2～35℃的操作温度范围下进行。
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CN110274973A (zh) * 2019-07-16 2019-09-24 大连润生康泰医学检验实验室有限公司 一种血清中含硫氨基酸的检测方法及其富集材料
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