CN102040674A - 四配位体金属螯合层析填料乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种金属螯合层析填料制备方法，是通过4％-6％琼脂糖凝胶和乙二胺二乙酸结合而成乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶(Ethylenediamine diacetic acid，EDDA琼脂糖凝胶)。本发明首先提供了快速简单制备乙二胺二乙酸方法，进一步提供了乙二胺二乙酸与琼脂糖凝胶结合的方法。乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶作为金属螯合层析填料对过渡金属有特强的金属螯合性，能够与过渡金属离子强烈结合，特别适用于以过渡金属为螯合物的蛋白质提纯。目前次甲基三乙酸琼脂糖凝胶(NTA琼脂糖凝胶)被广泛用于蛋白质提纯，本发明乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶与次甲基三乙酸琼脂糖凝胶(NTA琼脂糖凝胶)一样是四配体金属螯材料，但是本发明的配位体的原子与NTA琼脂糖凝胶不同，本发明比NTA琼脂糖凝胶多出一个氮原子而少一个乙酸根参加金属鳌合，故在蛋白质提纯过程中可以展现出新的特异性，从而给蛋白质纯化提供了新的金属螯合层析填料选择。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白纯化领域，特别地，本发明涉及金属螯合层析填料制备方法。
背景技术
金属螯合层析，也称固定化金属亲和层析是利用金属离子与蛋白质相互作用，特别是过渡金属离子如镍，铜，铁，锌等的离子和蛋白质中特定氨基酸如色氨酸组氨酸半胱氨酸之间的螯合配位作用使蛋白质被金属螯合层析介质吸附从而达到选择分离纯化蛋白质的目的，目前此技术已经广泛应用于带6组氨酸标记的蛋白质(6xHis-tag Protein)纯化，以及其它含有丰富色氨酸组氨酸半胱氨酸的蛋白质纯化。其中NTA琼脂糖应用最为广泛。
金属螯合层析填料分两大部分，1。填料基质：主要有琼脂糖凝胶，葡聚糖凝胶等作为载体，2。填料金属螯合分子：目前在蛋白纯化中广泛应用的亚氨基二乙酸(IDA琼脂糖)，次甲基三乙酸琼脂糖凝胶(NTA琼脂糖)，通过化学方法使金属螯合分子与填料基质结合形成金属螯合层析填料。亚氨基二乙酸(IDA)的螯合配位特点是两个酸基和一个氮原子(提供一个电子对供螯合)与配位金属离子螯合形成三个配位体。次甲基三乙酸(NTA)的螯合配位特点是三个酸基和一个氮原子形成四个配位体(三个酸带有三个负电荷)与配位金属离子螯合。
本发明乙二胺二乙酸琼脂糖是全新螯合配位物体，特点是乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶中的乙二胺二乙酸可以提供二个酸基和二个氮原子形成四个配位体(二个酸带有二个负电荷)与配位过渡金属离子Ni，Cu，Mn，Co，Zn等作用时可以形成一个四配位鳌合中心。本发明乙二胺二乙酸琼脂糖与现在广泛应用的次甲基三乙酸琼脂糖凝胶(NTA琼脂糖)同为四配位金属鳌合物，但由于配位原子不同和所带负电荷量不同故与蛋白质结合能力特点也有不同，本发明乙二胺二乙酸琼脂糖为蛋白质纯化提供了新的选择。
发明内容
本发明乙二胺二乙酸琼脂糖是新型金属螯合层析填料，为蛋白质纯化提供了新的层析填料选择，乙二胺二乙酸琼脂糖凝(EDDA琼脂糖凝胶)制备包括下列步骤：
乙二胺二乙酸制备：
1)在5-20℃控制温度下，制备乙二胺10-80％水溶液，然后往10-80％乙二胺水溶液定量慢慢加入溴乙酸(BrCH2COOH)，搅拌均匀制备成乙二胺与溴乙酸水溶液，乙二胺与溴乙酸摩尔浓度准确控制在1∶2，溴乙酸摩尔浓度准确控制非常重要。乙二胺与溴乙酸的化学反应式为：
NH2-CH2-CH2-NH2+2BrCH2COOH→
NH(CH2COOH)-CH2-CH2-N(CH2COOH)+2Br
2)慢慢调节乙二胺与溴乙酸混合水溶液PH值至9-11，搅拌，控温，使乙二胺与入溴乙酸反应生成乙二胺二乙酸，乙二胺与溴乙酸混合水溶液在碱性条件下反应激烈，整个反应应当在通风橱中进行。反应完全后用旋转蒸发仪浓缩结晶。
3)反应检测和除去杂质，薄膜层析(TLC)和茚三酮(茚三酮Ninhydrin是灵敏的氨基显色试剂)可以作为检测方法，反应副产物溴可以化学方法除去，例如加硝酸银，沉淀，过滤。
乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶制备方法，包括以下步骤：
1)制备环氧活化琼脂糖凝胶，将购自Novelab.com公司的琼脂糖CL-4B凝胶放在沙芯漏斗吸干后放入烧杯内，加入2M氢氧化钠，加入环氧氯丙烷，混合后在恒温搅拌器上搅拌加热保持温度在45-70℃两个小时，然后添加环氧氯丙烷保持温度在45-70℃三个小时，然后将反应物放入沙芯漏斗吸干。此吸干反应物是环氧活化琼脂糖凝胶。
2)将乙二胺二乙酸接臂到琼脂糖CL-4B凝胶上，将2-3M碳酸钠溶液加入吸干反应物是环氧活化琼脂糖凝胶中，然后加入乙二胺二乙酸溶液，混合后在恒温搅拌器上搅拌加热保持温度在45-70℃十五个小时，然后将混合物放在沙芯漏斗吸干，此吸干混合物即为乙二胺二乙酸琼脂糖凝，可放在30％乙醇溶液4度下保存。
3)加载过渡金属离子，用pH＝7.3缓冲溶液洗去乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶上的乙醇溶液，然后用300mM金属离子浸泡，再升用pH＝7.3缓冲溶液洗涤。
乙二胺二乙酸琼脂糖凝的使用范围主要是用于蛋白质提纯。
1)乙二胺二乙酸与EDTA(乙二胺四乙酸)结构相似差二个乙酸结构，故金属螯合力强但比EDTA弱，乙二胺二乙酸能提供二个酸基和二个配位氮原子对进行金属螯合，乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶作为固相强力金属螯合合剂。
2)乙二胺二乙酸琼脂糖凝比目前广泛应用的次甲基三乙酸琼脂糖凝胶(NTA琼脂糖凝胶)与金属离子作用略有不同，次甲基三乙酸琼脂糖凝胶提供三乙酸和一个氮原子与金属螯合，乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶提供二乙酸和二个氮原子与金属螯合，乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶提供不同的金属螯合手段供蛋白纯化。
本发明采用胶联结构的4％琼脂糖CL-4B为基质是从Novelab.com公司购得。环氧活化琼脂糖，次甲基三乙酸琼脂糖凝胶(NTA琼脂糖凝胶)和其它原料也是从Novelab.com公司购得。
应用实例
结合具体的实施方式对本发明作进一步描述，但以下仅是本发明的较佳实施实例，本发明内容不受下列较佳实例的限制。
实例一
一，制备乙二胺二乙酸：取6.01克乙二胺放入500毫升烧杯内，然后慢慢加入50毫升水，充分溶解，制备成乙二胺水溶液，再取27.8克溴乙酸放入500毫升烧杯内，慢慢加入100毫升的水，制备成溴乙酸水溶液，将盛有乙二胺水溶液的烧杯保持在4℃冰水中降温，然后将溴乙酸水溶液慢慢加入乙二胺水溶液，边加入边搅拌，形成乙二胺溴乙酸混合水溶液。用2摩尔浓度的氢氧化钠调整到pH值到9.5。将2摩尔浓度的氢氧化钠溶液滴入乙二胺溴乙酸混合水溶液直至pH＝9.5，氢氧化钠溶液滴入速度要慢以免反应过热(此反应应当在通风橱中进行，操作人员要带护目镜)。将pH＝9.5乙二胺溴乙酸反应混合液慢慢加热到50℃两个小时，然后冷却到室温，此时乙二胺已经与溴乙酸反应生成乙二胺二乙酸水溶液。二，取购自Novelab.com公司环氧活化琼脂糖(Epoxy-activated Agarose，Novelab.com)，20克，加入100毫升的2M碳酸钠水溶液润湿形成环氧活化琼脂糖凝胶，然后将乙二胺二乙酸水溶液加入到环氧活化琼脂糖凝胶，恒温50℃，缓慢搅拌20小时，搅拌后，将反应产物转移到沙芯漏斗，用真空泵抽干，依次用1000蒸馏水，5％500醋酸，蒸馏水1000毫升洗至中性，此即为制备好的乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶，可在30％乙醇溶液中在4℃保存。
实例二
取购自Novelab.com公司的CL-4B琼脂糖100毫升在沙芯漏斗吸干，称50克吸干的CL-4B琼脂糖放入500毫升的烧杯内，加入2M氢氧化钠100毫升，环氧氯丙烷10毫升，混合后在恒温搅拌器上搅拌加热保持温度在45℃，一个小时，然后添加10毫升环氧氯丙烷保持温度在45C，半个小时，然后将反应物放入沙芯漏斗吸干，再将环氧活化CL-4B琼脂糖转移到500毫升的烧杯内，加入3M碳酸钠100毫升，加入按实例一制备的乙二胺二乙酸混合后在恒温搅拌器上搅拌加热保持温度在55℃，15个小时，将反应产物转移到沙芯漏斗，用真空泵抽干，依次用1000蒸馏水，5％500醋酸，蒸馏水100
0毫升洗至中性，此即为制备好的乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶，可在30％乙醇溶液中在4℃保存。
实例三
二胺二乙酸琼脂糖凝胶加载Ni，Cu和Ag离子，加载Ni离子取制备好的乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶10毫升，转移至层析柱内，用pH7.3缓冲溶液洗去乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶上的乙醇溶液，然后用100毫升，300mM硫酸Ni浸泡，300毫升用pH7.3缓冲溶液洗，此为Ni二胺二乙酸琼脂糖凝胶。加载Cu离子取制备好的乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶10毫升，转移至层析柱内，用pH＝7.3缓冲溶液洗去乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶上的乙醇溶液，然后用100毫升，300mM硫酸Cu浸泡，300毫升用pH＝7.3缓冲溶液洗，此为Cu二胺二乙酸琼脂糖凝胶。加载Ag离子取制备好的乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶10毫升，转移至层析柱内，用pH＝7.3缓冲溶液洗去乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶上的乙醇溶液，然后用100毫升，300mM硝酸Ag浸泡，300毫升用pH＝7.3缓冲溶液洗，此为Ag二胺二乙酸琼脂糖凝胶。
参考文献：
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Claims (3)
1.乙二胺二乙酸快速制备方法，包括以下步骤：
1)在控制温度下，往乙二胺10-80％水溶液中定量慢慢加入溴乙酸(BrCH2COOH)，乙二胺与溴乙酸摩尔浓度准确控制在1∶2，溴乙酸摩尔浓度准确控制非常重要，应当准确的控制在1摩尔乙二胺与2摩尔溴乙酸的比例。
2)慢慢加入30％碳酸钠或其他碱溶液调节pH值至大约9以上，搅拌，控温，使乙二胺与入溴乙酸反应完全生成乙二胺二乙酸，乙二胺与溴乙酸化学反应式为：
NH2-CH2-CH2-NH2+2BrCH2COOH→NH(CH2COOH)-CH2-CH2-N(CH2COOH)+2Br
3)副产物溴可以用物理或化学方法除去。例如，加硝酸银沉淀，过滤。
2.乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶制备方法，包括以下步骤：
1)首先将琼脂糖凝胶环氧活化，向琼脂糖凝胶加入2M的氢氧化钠和环氧氯丙烷，混合，在30-70℃温度下恒温2-9小时，生成环氧活化的琼脂糖凝胶。
2)乙二胺二乙酸与琼脂糖凝胶偶联的具体方法是，先将环氧活化的琼脂糖凝胶吸干，然后加2M碳酸钠溶液，再加适量的乙二胺二乙酸，在50-70℃温度下恒温5-15小时生成乙二胺二乙酸琼脂糖凝。
3)加载过渡金属离子，将乙二胺二乙酸琼脂糖凝用稀醋酸和去离子水洗涤，然后用稀硫酸镍，或稀硫酸铜或其它过渡金属盐溶液浸泡，然后用pH＝7.5的缓冲溶液冲洗，可以得到不同的加载过渡金属离子的乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶。
3.本发明乙二胺二乙酸琼脂糖凝是四配体金属螯材料，用于纯化组胺酸标记(His Tag)的蛋白质和含组胺酸，赖氨酸丰富的蛋白质。
1)乙二胺二乙酸与EDTA(乙二胺四乙酸)的结构相似但相差二个乙酸结构.乙二胺二乙酸比金属螯合力极强的EDTA的金属鳌合力弱，乙二胺二乙酸是四配体金属螯合材料具有一定的金属螯合性同时螯合上的金属也可以在特定的条件下被洗脱.乙二胺二乙酸可以提供二个酸基和由两个氮原子提供两个配位孤电子对进行金属螯合，本发明乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶可以形成稳定固相金属鳌合基质从而能够与蛋白质中的组胺酸，赖氨酸半胱氨酸等形成强烈的鳌合作用。
2)在纯化蛋白中的应用，目前广泛应用的次甲基三乙酸琼脂糖凝胶(NTA琼脂糖凝胶)和亚胺基二乙酸琼脂糖凝胶(IDA琼脂糖凝胶)广泛用于蛋白质提纯[1，2，3]，本发明乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶与次甲基三乙酸琼脂糖凝胶(NTA琼脂糖凝胶)在用于蛋白纯化时基本作用原理一致，但配位体不同，IDA琼脂糖凝胶提供一个氮原子和乙二酸根作为三配位体金属鳌合基质，NTA琼脂糖凝胶提供一个氮原子核三酸根作为四配位体金属鳌合基质，本发明乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶提供二个氮原子和二酸根作为四配位体金属鳌合基质，故在蛋白质提纯过程中可以展现出新的特异性，从而给蛋白质纯化工作提供了新的金属螯合层析填料选择。
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