CN102432696A - 一种金属螯合琼脂糖凝胶的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种金属螯合琼脂糖凝胶的制备方法及其应用，属于蛋白质化学领域。本发明制备金属螯合琼脂糖凝胶的方法包括活化和偶联两大步骤，通过将乙二胺二琥珀酸连接到交联琼脂糖凝胶（Sepharose）上形成具有6配位体的琼脂糖螯合介质。该金属螯合琼脂糖凝胶可应用于移除蛋白溶液中Cu、Zn、Mn、Cd等金属离子，结合能力强，结合容量大，移除率达93%。其制备工艺简单，易于放大，使用方便，可更好地应用在复合重金属污染环境下生长的植物蛋白质研究中重金属离子的移除，也可应用于其它需要移除金属离子的蛋白质科学研究上。

Description

一种金属螯合琼脂糖凝胶的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及蛋白质化学领域，具体地说涉及一种金属螯合琼脂糖凝胶的制备方法及其应用。

背景技术

在金属结合蛋白的热力学和动力学分析中，往往需要应用到无金属蛋白。在ESI-MS蛋白质谱分析中，若蛋白中存在金属离子会导致信号压制，影响分析结果；在铜胁迫下铜结合蛋白的差异蛋白质组学研究中，若存在过量的铜在细胞内积累，蛋白质中的铜结合位点会与进入细胞内的铜结合，从而导致有些铜结合蛋白不能被分离或分离不完全。因此在进行固定金属亲和层析前，对蛋白质溶液中的金属离子进行去除是非常重要的，可以大大增加铜结合蛋白的纯化效率。

现有获得脱金属蛋白的方法是加入高浓度的低分子量螯合剂，如EDTA和EGTA等。过量的螯合剂和螯合的金属离子在随后的步骤中去除，往往采用透析的方法。由于透析非常耗时，而且在移除螯合剂金属复合物的同时缓冲液中的金属离子也会重新与蛋白质结合，影响蛋白质脱金属效果。在透析中采用的离子交换剂也不是对所有的蛋白都适用，如市场上的chelex 100可应用于分离蛋白溶液中的金属离子，但分子量大于1000的蛋白完全被排阻在chelex 100的颗粒空隙之外。

琼脂糖是一种从海藻中提取的天然多糖，具有高亲水性、高度多孔性，含较多的可活化羟基，且不与生物大分子发生特异性吸附等特征，因此被广泛应用于蛋白、肽类和糖类等分离。现已知连有NTA(氮川三乙酸)的琼脂糖凝胶可有效移除蛋白中的重金属，如Carrer等于2006年在第385期的“Analytical and Bioanalytical Chemistry”(1409-1413页)上公开了采用NTA(氮川三乙酸)的琼脂糖凝胶移除Ca-ATPase中的钙离子，NTA为4配位体，结合容量略显不足。中国专利申请“四配位体金属螯合层析填料乙二胺二乙酸琼脂糖凝胶制备方法”(申请号CN200910196910.0)公开了一种方法，采用结合了乙二胺二乙酸的琼脂糖凝胶进行金属离子的螯合，该方法制得的琼脂糖凝胶金属螯合能力一般，只有4个配位体，仍不能满足现在蛋白质纯化的要求。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种金属螯合琼脂糖凝胶的制备方法及用该方法制得的金属螯合琼脂糖凝胶，用于建立基于EDDS的新型金属螯合琼脂糖凝胶，制备出金属结合能力强，结合容量大的金属螯合琼脂糖凝胶；本发明还有一个目的是提供上述方法制得的金属螯合琼脂糖凝胶在移除蛋白质中重金属的应用。

技术方案：为实现上述目的，本发明的一种金属螯合琼脂糖凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(1)活化：将琼脂糖凝胶、二甲亚砜、环氧氯丙烷和氢氧化钠溶液混合后加入NaBH₄，缓慢搅拌下再分次加入氢氧化钠和环氧氯丙烷，于27～35℃下缓慢搅拌过夜后洗至中性，吸干后得到吸干的环氧活化琼脂糖；

(2)偶联：向步骤(1)得到的吸干的环氧活化琼脂糖中加入碳酸钠、乙二胺二琥珀酸三钠(EDDS-Na₃)、NaBH₄，30～50℃下缓慢搅拌10～15小时、洗至中性后吸干，得到金属螯合琼脂糖凝胶。

所述步骤(1)中琼脂糖凝胶、二甲亚砜、环氧氯丙烷、氢氧化钠的体积比为1∶1∶0.5∶4，其中，氢氧化钠浓度为0.8mol/L。

所述步骤(1)中NaBH₄的加入量为所述琼脂糖凝胶的2％(w/v)，再次加入的氢氧化钠浓度为2mol/L，加入量为所述琼脂糖凝胶体积的4～5倍，再次加入的环氧氯丙烷为所述琼脂糖凝胶体积的2～3倍。

所述步骤(1)中氢氧化钠和环氧氯丙烷再次加入时在10小时内缓慢加入。具体地说，是将氢氧化钠和环氧氯丙烷在10小时内分5次缓慢加入搅拌中的琼脂糖凝胶中。

所述步骤(2)中每毫升所述吸干的环氧活化琼脂糖中加入2ml碳酸钠溶液，0.1～0.2gEDDS-Na₃，1～2mg NaBH₄，所述碳酸钠溶液的浓度为0.5～3mol/L。

所述步骤(1)中采用的琼脂糖凝胶选用琼脂糖4FF、琼脂糖6FF、琼脂糖CL-4B、琼脂糖CL-6B、琼脂糖4B和琼脂糖6B中的任意一种。

作为本发明的优选方案，所述步骤(1)采用sepharose-6B琼脂糖，所述步骤(2)中每毫升所述吸干的环氧活化琼脂糖中加入2ml 2mol/LNa₂CO₃，0.15g EDDS.Na₃，1.5mgNaBH₄，在50℃下缓慢搅拌12h。

所述步骤(1)和步骤(2)中将琼脂糖凝胶吸干采用经布氏漏斗真空吸滤干燥。所述步骤(1)和步骤(2)中将琼脂糖凝胶洗至中性具体包括：先采用水洗，再用稀醋酸洗，最后进行水洗。

该方法以琼脂糖凝胶为基质，经环氧活化后，与乙二胺二琥珀酸三钠(S，S)-Ethylenediamine-N，N′-disuccinic acid，EDDS-Na₃)偶联，制得连接有EDDS的金属螯合琼脂糖凝胶。该金属螯合琼脂糖凝胶在4℃小保存在30％乙醇中备用。

目前鲜有报道6配位体的金属螯合琼脂糖凝胶，EDTA也未见连接有琼脂糖凝胶。本发明乙二胺二琥珀酸琼脂糖凝胶中的EDDS可以提供四个羧基和二个氮原子形成六配位体，螯合能力强，结合容量大，可以与过渡金属稳定螯合。如EDDS对铜的螯合常数位18.4，而NTA仅为13.0。本发明的金属螯合琼脂糖凝胶可以为Ni、Cu、Mn、Co和Zn配位层上的所有空轨道提供孤对电子，形成的配合物更稳定。

有益效果：本发明的一种金属螯合琼脂糖凝胶的制备方法其制备工艺简单，易于放大，使用方便，可更好地应用在复合重金属污染环境下生长的植物蛋白质研究中重金属离子的移除，也可应用于其它需要移除金属离子的蛋白质科学研究上。本发明提供的金属螯合琼脂糖凝胶可应用于移除蛋白溶液中Cu、Zn、Mn、Cd等金属离子，结合能力强，结合容量大，移除率达93％。

附图说明

图1是本发明琼脂糖凝胶活化，并与EDDS偶联的化学反应示意图。

具体实施方式

实施例1

(1)活化：将琼脂糖凝胶(Sepharose-6B)、二甲亚砜、环氧氯丙烷和0.8mol/L氢氧化钠溶液按照体积比1∶1∶0.5∶4混合，然后加入后加入琼脂糖凝胶2％(w/v)的NaBH₄，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，然后再加入琼脂糖凝胶体积4～5倍的2mol/L的NaOH和2～3倍的环氧氯丙烷，(在缓慢搅拌下10小时内分次加入，每次间隔2小时)，于27～35℃下缓慢搅拌过夜后过夜，然后水洗、稀醋酸洗、水洗，最后用布氏漏斗真空吸滤吸干胶体，得到吸干的环氧活化琼脂糖；

(2)偶联：将吸干的环氧活化琼脂糖放入三角瓶中，每毫升加入2ml 2mol/L碳酸钠、0.15EDDS-Na₃、1.5mg NaBH₄，在50℃下缓慢搅拌12小时。将连接了EDDS的Sapharose-6B在布氏漏斗上真空吸滤吸干，先用水洗，然后稀醋酸洗，最后水洗至中性，再吸干，即得到金属螯合琼脂糖凝胶，保存于4℃下30％的乙醇溶液中。

本发明制备金属螯合琼脂糖凝胶涉及到的化学反应如图1所示。该实施例制得的金属螯合琼脂糖凝胶每毫升吸干胶能吸收59μmolCu²⁺。

实施例2

(1)活化：将琼脂糖凝胶(Sepharose-6B)、二甲亚砜、环氧氯丙烷和0.8mol/L氢氧化钠溶液按照体积比1∶1∶0.5∶4混合，然后加入后加入琼脂糖凝胶2％(w/v)的NaBH₄，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，然后再加入琼脂糖凝胶体积4～5倍的2mol/L的NaOH和2～3倍的环氧氯丙烷，(在缓慢搅拌下10小时内分次加入，每次间隔2小时)，于27～35℃下缓慢搅拌过夜后过夜，然后水洗、稀醋酸洗、水洗，最后用布氏漏斗真空吸滤吸干胶体，得到吸干的环氧活化琼脂糖；

(2)偶联：将吸干的环氧活化琼脂糖放入三角瓶中，每毫升加入2ml 3mol/L碳酸钠、0.2g EDDS-Na₃、2mg NaBH₄，在50℃下缓慢搅拌10小时。将连接了EDDS的Sapharose-6B在布氏漏斗上真空吸滤吸干，先用水洗，然后稀醋酸洗，最后水洗至中性，再吸干，即得到金属螯合琼脂糖凝胶，保存于4℃下30％的乙醇溶液中。

本发明制备金属螯合琼脂糖凝胶涉及到的化学反应如图1所示。该实施例制得的金属螯合琼脂糖凝胶每毫升吸干胶能吸收55μmolCu²⁺。

实施例3

(1)活化：将琼脂糖凝胶(Sepharose-6B)、二甲亚砜、环氧氯丙烷和0.8mol/L氢氧化钠溶液按照体积比1∶1∶0.5∶4混合，然后加入后加入琼脂糖凝胶2％(w/v)的NaBH₄，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，然后再加入琼脂糖凝胶体积4～5倍的2mol/L的NaOH和2～3倍的环氧氯丙烷，(在缓慢搅拌下10小时内分次加入，每次间隔2小时)，于27～35℃下缓慢搅拌过夜后过夜，然后水洗、稀醋酸洗、水洗，最后用布氏漏斗真空吸滤吸干胶体，得到吸干的环氧活化琼脂糖；

(2)偶联：将吸干的环氧活化琼脂糖放入三角瓶中，每毫升加入2ml 2mol/L碳酸钠、0.15g EDDS-Na₃、2mg NaBH₄，在30℃下缓慢搅拌15小时。将连接了EDDS的Sapharose-6B在布氏漏斗上真空吸滤吸干，先用水洗，然后稀醋酸洗，最后水洗至中性，再吸干，即得到金属螯合琼脂糖凝胶，保存于4℃下30％的乙醇溶液中。

本发明制备金属螯合琼脂糖凝胶涉及到的化学反应如图1所示。该实施例制得的金属螯合琼脂糖凝胶每毫升吸干胶能吸收48μmolCu²⁺。

实施例4

(1)活化：将琼脂糖凝胶(Sepharose-4B)、二甲亚砜、环氧氯丙烷和0.8mol/L氢氧化钠溶液按照体积比1∶1∶0.5∶4混合，然后加入后加入琼脂糖凝胶2％(w/v)的NaBH₄，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，然后再加入琼脂糖凝胶体积4～5倍的2mol/L的NaOH和2～3倍的环氧氯丙烷，(在缓慢搅拌下10小时内分次加入，每次间隔2小时)，于27～35℃下缓慢搅拌过夜后过夜，然后水洗、稀醋酸洗、水洗，最后用布氏漏斗真空吸滤吸干胶体，得到吸干的环氧活化琼脂糖；

(2)偶联：将吸干的环氧活化琼脂糖放入三角瓶中，每毫升加入2ml 0.5mol/L碳酸钠、0.1g EDDS-Na₃、1mg NaBH₄，在40℃下缓慢搅拌12小时。将连接了EDDS的Sapharose-6B在布氏漏斗上真空吸滤吸干，先用水洗，然后稀醋酸洗，最后水洗至中性，再吸干，即得到金属螯合琼脂糖凝胶，保存于4℃下30％的乙醇溶液中。

本发明制备金属螯合琼脂糖凝胶涉及到的化学反应如图1所示。该实施例制得的金属螯合琼脂糖凝胶每毫升吸干胶能吸收50μmolCu²⁺。

实施例5

(1)活化：将琼脂糖凝胶(Sepharose-CL-6B)、二甲亚砜、环氧氯丙烷和0.8mol/L氢氧化钠溶液按照体积比1∶1∶0.5∶4混合，然后加入后加入琼脂糖凝胶2％(w/v)的NaBH₄，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，然后再加入琼脂糖凝胶体积4～5倍的2mol/L的NaOH和2～3倍的环氧氯丙烷，(在缓慢搅拌下10小时内分次加入，每次间隔2小时)，于27～35℃下缓慢搅拌过夜后过夜，然后水洗、稀醋酸洗、水洗，最后用布氏漏斗真空吸滤吸干胶体，得到吸干的环氧活化琼脂糖；

(2)偶联：将吸干的环氧活化琼脂糖放入三角瓶中，每毫升加入2ml 2mol/L碳酸钠、0.2g EDDS-Na₃、1.5mg NaBH₄，在40℃下缓慢搅拌15小时。将连接了EDDS的Sapharose-6B在布氏漏斗上真空吸滤吸干，先用水洗，然后稀醋酸洗，最后水洗至中性，再吸干，即得到金属螯合琼脂糖凝胶，保存于4℃下30％的乙醇溶液中。

本发明制备金属螯合琼脂糖凝胶涉及到的化学反应如图1所示。该实施例制得的金属螯合琼脂糖凝胶每毫升吸干胶能吸收51μmolCu²⁺。

实施例6

利用本发明提供的制备金属螯合琼脂糖凝胶的方法制得的琼脂糖凝胶，金属螯合力强，结合容量大，可移除蛋白质中的Cu²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Cd²⁺等重金属离子，相对于同类产品具有更优秀的重金属移除效果。下面通过对比试验来进行证明。

取实施例1的方法制得的金属螯合琼脂糖凝胶(简称为Sepharose-EDDS)作为试验组，与Sepharose-IDA、Sepharose-NTA和Sepharose-TED进行对比，验证对蛋白中重金属离子Cu²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Cd²⁺的移除能力。

生长7d的水稻采用8μmol/L Cu²⁺处理三天，取新鲜水稻根，用液氮充分研磨，然后加入4倍体积含1mmol/LPMSF的平衡缓冲液(20mmol/L磷酸钠，pH 5.8，500mmol/LNaCl、0.1％w/v Triton X-100)。充分混匀后放在4℃下提取30min，在4℃下、15000g离心30min，收集上清，蛋白浓度测定参照Bradford(1976)方法，以BSA作为标准。

准确称取0.2g吸干过的上述四种琼脂糖凝胶，置于1.5ml eppendof管中，加入1ml平衡缓冲液平衡4min，在4℃下9000g离心5min弃上清，加入0.5ml提取的蛋白，混匀后在冰浴下30min，并不断混悬，然后在4℃下9,000g 5min，收集上清。加入600μl平衡缓冲液，冰浴下混悬5min，在4℃下9,000g 5min，收集上清，此步骤重复5次。合并收集的上清，终体积为3.5ml，测定其金属和蛋白含量测定。

四种金属螯合琼脂糖凝胶对蛋白中Cu²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺和Cd²⁺的移除率(％)如表1所示。经8μmol/L Cu²⁺处理的水稻根蛋白溶液中Cu为3.68μg/mgprot，四种金属螯合层析胶都显著去除了蛋白溶液中的Cu²⁺，移除率为94.7～97.95％，效果最好的是Sepharose-EDDS；Sepharose-IDA、Sepharose-NTA和Sepharose-EDDS都很显著的移除了铜胁迫蛋白溶液中的Zn²⁺移除率，分别为90.7％、91.84％和93％，且三者差异不显著。进一步对比发现，Sepharose-TED对Zn²⁺的移除效果较差，仅移除61％的Zn²⁺；而Sepharose-EDDS对Mn²⁺的去除效果最好，能去除蛋白中96％的Mn²⁺，Sepharose-NTA能去除89％的Mn²⁺。Sepharose-IDA对Mn²⁺的去除效果最差，仅能去除59％；Sepharose-EDDS和IDA对50μmol Cd²⁺处理三天的水稻根蛋白中的Cd²⁺去除效果较好，分别移除了蛋白中93和90％的Cd²⁺，两者差异不显著。

表1：四种金属螯合琼脂糖凝胶对蛋白中重金属离子的移除率(％)

从以上的分析可以看出，Sepharose-EDDS对蛋白中的Cu²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺和Cd²⁺的去除效果最好，可去除93％以上的以上重金属离子。Sepharose-EDDS可以同时去除以上四种重金属，可应用于几种重金属复合污染植物蛋白研究的重金属离子去除。

实施例7

本实施例对结合EDDS的琼脂糖凝胶的应用进行进一步说明。固定金属亲和层析是应用到脱金属蛋白，对蛋白金属去除率具有一定要求，这里针对植物中含有的铜进行亲和层析并进行分析说明。

本实施例采用的蛋白纯化方法参照Kung等在2006年《蛋白质组学》期刊上发表的《对拟南芥根中铜结合蛋白的螯合金属亲和层析和质谱分析的蛋白质组学调查》(Proteomic survey of copper-binding proteins inArabidopsis roots by immobilized metalaffinity chromatography and mass spectrometry)采用的方法，对水稻根铜结合蛋白进行纯化。

1.装柱：将2ml床体积的Chelating Sepharose Fast Flow(GE Healthcare，USA)沿管壁加入到玻璃管中，待胶沉淀后将活塞推到合适的位置，后用蒸馏水洗，流速为0.5ml/min，直到紫外检达到稳定基线。

2.结合Cu²⁺：加入1倍床体积的0.2M CuSO₄溶液，室温下放置30min，要间歇晃动，使Cu²⁺充分结合到填料上。然后以0.5ml/min的流速用ddH₂O洗至紫外检测达到稳定基线。

3.组装：将连接好的固定金属亲和层析柱分别在柱前串联Sepharose-EDDS，以不连接其它柱子的Cu固定金属亲和层析柱为对照。

4.平衡：用平衡缓冲液洗柱子30min，流速为0.5ml/min，紫外检测基线稳定。

5.上样：以0.25ml/min的流速上样，循环两次，最大限度增加蛋白结合到铜结合柱子上，上样时间取决于蛋白溶液体积。上样完成后用平衡缓冲液洗30min，流速为0.5ml/min。

6.非特异性洗脱：用含10mmol/L咪唑的平衡缓冲液洗脱，洗脱至15min时，紫外检测示数开始增加，开始采集图像，收集非特异洗脱峰。图像采集至24min时，紫外检测基线已经达到稳定，开始进行特异性洗脱。

7.特异性洗脱：用含40mmol/L咪唑的洗脱液(10mmol/L醋酸钠，500mmol/LNaCl，pH5.5)进行特异性洗脱，10min后开始出现特异性洗脱峰，同时收集样品，15min后达到紫外检测基线，停止收集样品。特异洗脱和非特异性洗脱的流速均为0.5ml/min.

将Sepharose-EDDS串连在Cu-IMAC柱前面，水稻根蛋白首先经过金属螯合柱去铜，然后再经Cu-IMAC分离铜结合蛋白。以未串联Sepharose-EDDS的Cu-IMAC柱直接进行铜结合蛋白纯化为对照。去除金属离子的水稻根蛋白(8μmol/L Cu²⁺处理)与未经过去除金属离子的水稻根蛋白(8μmol/L Cu²⁺处理)相比，特异性铜结合蛋白洗脱峰的峰面积显著增加。特异性铜结合蛋白的峰面积由1743250增加到2762483，因与蛋白结合的铜离子的移除，使铜结合蛋白有可利用的铜结合位点与Cu-IMAC柱上的铜离子结合而被分离，铜结合蛋白产率增加了58％。从以上的分析可以看出经过偶联EDDS的金属螯合琼脂糖柱去除与蛋白结合的过多的铜，释放出了铜结合蛋白与铜结合的位点，更有利于对铜结合蛋白的纯化，增加了铜结合蛋白的纯化效率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种金属螯合琼脂糖凝胶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）活化：将琼脂糖凝胶、二甲亚砜、环氧氯丙烷和氢氧化钠溶液混合后加入NaBH₄，缓慢搅拌下再分次加入氢氧化钠和环氧氯丙烷，于27~35℃下缓慢搅拌过夜后洗至中性，吸干后得到吸干的环氧活化琼脂糖；

（2）偶联：向步骤（1）得到的吸干的环氧活化琼脂糖中加入碳酸钠、乙二胺二琥珀酸三钠（EDDS-Na₃）、NaBH₄，30~50℃下缓慢搅拌10~15小时、洗至中性后吸干，得到金属螯合琼脂糖凝胶。

2.根据权利要求1所述的一种金属螯合琼脂糖凝胶的制备方法，其特征在于：

所述步骤（1）中琼脂糖凝胶、二甲亚砜、环氧氯丙烷、氢氧化钠的体积比为1:1:0.5:4，其中，氢氧化钠浓度为0.8mol/L。

3.根据权利要求1所述的一种金属螯合琼脂糖凝胶的制备方法，其特征在于：

所述步骤（1）中NaBH₄的加入量为所述琼脂糖凝胶的2%（w/v），再次加入的氢氧化钠浓度为2mol/L，加入量为所述琼脂糖凝胶体积的4~5倍，再次加入的环氧氯丙烷为所述琼脂糖凝胶体积的2~3倍。

4.根据权利要求1所述的一种金属螯合琼脂糖凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中氢氧化钠和环氧氯丙烷再次加入时在10小时内缓慢加入。

5.根据权利要求1所述的一种金属螯合琼脂糖凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中每毫升所述吸干的环氧活化琼脂糖中加入2ml碳酸钠溶液，0.1~0.2g EDDS-Na₃，1~2mg NaBH₄，所述碳酸钠溶液的浓度为0.5~3mol/L。

6.根据权利要求1所述的一种金属螯合琼脂糖凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中采用的琼脂糖凝胶选用琼脂糖4FF、琼脂糖6FF、琼脂糖CL-4B、琼脂糖CL-6B、琼脂糖4B和琼脂糖6B中的任意一种。

7.一种如权利要求1所述的方法制得的金属螯合琼脂糖凝胶。

8.一种如权利要求1所述的方法制得的金属螯合琼脂糖凝胶在移除蛋白质中重金属的应用。

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