CN101036877A - 从发酵清液直接捕获蛋白质的疏水电荷诱导色谱介质及制备方法 - Google Patents
从发酵清液直接捕获蛋白质的疏水电荷诱导色谱介质及制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101036877A CN101036877A CN 200710056591 CN200710056591A CN101036877A CN 101036877 A CN101036877 A CN 101036877A CN 200710056591 CN200710056591 CN 200710056591 CN 200710056591 A CN200710056591 A CN 200710056591A CN 101036877 A CN101036877 A CN 101036877A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- medium
- volume
- solution
- protein
- gel
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
本发明公开了一种可从发酵清液中直接捕获蛋白质的疏水电荷诱导色谱介质的制备方法，属于生化工程领域中的蛋白质色谱分离技术。该色谱介质为间隔臂末端偶联吲哚化合物作为色谱配基。其制备方法为将琼脂糖凝胶介质中依次加入二甲基亚砜、环氧氯丙烷和氢氧化钠溶液后活化介质；活化后的介质在碱性的二甲基亚砜溶液中与吲哚化合物配基偶联；最后介质表面残余的环氧基经还原后得到所需的色谱介质。该色谱介质偶联的配基属非盐依赖性配基，可直接用于料液中蛋白质的捕获而不需预处理，同时介质具有更温和的洗脱条件；介质在提高分离效率的同时降低了生产成本；介质清洗、除菌简便，易再生，在蛋白等生物大分子分离纯化中将有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种从发酵清液中直接捕获蛋白质的疏水电荷诱导色谱介质及其制备方法，属于生化工程领域中的蛋白质色谱分离技术。
背景技术
生物技术的发展使许多具有重要疗效蛋白质可以借助于基因工程方法在大肠杆菌等宿主细胞中大量生产以服务于人类健康的需求。这些以可溶或包含体形式存在于细胞内的产物往往与宿主细胞的蛋白共存，同时通过高密度发酵而实现的蛋白质规模化生产也使原料液中目标蛋白处于一种较高的离子强度下(一般为0.1-0.4mol/L)。在这种离子强度下，生物分离中通常使用的离子交换色谱或疏水性相互作用色谱的优势均无法得以发挥，由此产物的捕获趋于复杂化。
在色谱操作中，介质对蛋白质等目标产物的捕获通常需要在一定的离子强度下才能获得较高的吸附量，如离子交换色谱一般在低离子强度(＜0.10mol/L)下具有较高的吸附能力；而疏水性相互作用色谱则需在较高的离子强度(＞0.8mol/L)的条件下进行。因此，产物捕获前离子强度的调节(脱盐、稀释或者加盐)是必不可少的步骤，从而导致操作步骤和时间的增加，生产能力的降低；另外，无机盐浓度的改变，特别是无机盐的加入有可能破坏目标蛋白的稳定、引起蛋白质沉淀、干扰后续的分离操作。提高产物的捕获效率成为了生物大分子色谱技术中一个有待解决的关键问题。Porath等人提出了以巯基乙醇为配基的亲硫色谱方法(Porath et al.FEBS Letters，1985，185：306)，但该方法同样需在较高的离子强度下进行。Biosepra公司1998年公布了以含巯基的杂环化合物为配基的色谱方法(US Patent5,719,269)。虽然该介质在较宽的离子强度范围内实现了对抗体的捕获，但这种捕获是通过巯基参与的特异性吸附实现的，因此缺乏普适性。
1998年，Burton和Harding提出了疏水电荷诱导色谱(HCIC)的方法，由配基与蛋白之间疏水作用捕获的产物在静电排斥作用下得以洗脱，其中静电排斥作用通过对溶液PH的调节而获得(Burton SC and Harding DRK.J Chromatogr A，1998，814：71)。在此基础上，Burton等人公布了混合模式色谱分离方法，采用羰基二咪唑活化方法将含吡啶和咪唑基团的配基偶联于纤维素介质表面(US Patent 5,945,520A1)。该介质的吸附容量与离子强度无关。但羰基二咪唑活化方法自身存在着一些缺点(蒋中华，张津辉著.《生物分子固定化技术及应用》)，由此限制了其广泛地应用。近来，GE Healthcare公司推出了一种以苯甲酰胺为配基的Direct CST-1膨胀床色谱介质，该介质在电导率超过30mS/cm的高盐环境下操作。但据报道，吸附于介质上产物的洗脱条件异常苛刻，0.2mol/L氢氧化钠浓度下也仅有60％的蛋白质被洗脱。目前疏水电荷诱导色谱虽然取得了很大的发展，初步实现了无论离子强度高低的条件下均有较好的产物吸附容量，但产物的洗脱回收仍然需要在较强的酸性或碱性条件下进行，苛刻的洗脱条件往往造成的产物的失活。另一方面，配基中某些强疏水性基团也使得蛋白质洗脱变得更加困难。因此，在色谱过程中，具有适当疏水性的配基的引入对于开发商业化色谱分离技术具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于开发一种可从发酵清液中直接捕获蛋白质的疏水电荷诱导色谱介质及其制备方法。所述的色谱介质不仅有较高的吸附容量，而且适用在生理的环境进行洗脱。所述的制备方法过程简单。
本发明是通过下述技术方案加以实现的。一种从发酵清液中直接捕获蛋白质的疏水电荷诱导色谱介质，其特征在于环氧基间隔臂末端偶联吲哚化合物X，
吲哚化合物X结构式如下，
其中R1-R6中的一个基团必为氨基或甲基氨，其余的基团为氢原子，剩余的基团为含有1～4个碳原子的短链烷烃。
上述的色谱介质制备方法包括介质的活化、配基的偶联和介质的还原过程。其特征在于，将平均粒径介于30-300μm的琼脂糖凝胶介质经体积比为20％、50％和70％二甲基亚砜的水溶液依次清洗并抽干后，倒入二甲基亚砜溶液中，二甲基亚砜的体积为凝胶介质体积的0.5-10倍；继而向该悬浮液中加入凝胶体积0.2-6倍的环氧氯丙烷并混合均匀；向混合后的反应体系中加入浓度为0.1-2.0mol/L氢氧化钠溶液，溶液体积为混合液体积的0.1-5倍；上述溶液置于温度为15-60℃的水浴中反应0.3-10小时；反应后的琼脂糖凝胶介质用去离子水冲洗至无游离的环氧基团后，抽干水分的介质悬浮于含有吲哚化合物的二甲基亚砜溶液中，吲哚类化合物的浓度为0.02-10mmol/g湿介质，二甲基亚砜体积为凝胶介质的0.5-10倍；溶液混合并置于水浴中在25-70℃下保温；用NaO小时溶液调节溶液pH值至8.0-13.0后，通过2-20小时的偶联反应将吲哚类化合物键合到凝胶介质表面；所得介质经去离子水清洗后悬浮于0.2-1.0g/L硼氢化钠中于室温下反应12小时还原介质表面残留的环氧基团，从而得到最终产物。
上述的吲哚化合物包括5-氨基吲哚、4-氨基吲哚、6-氨基吲哚、吲哚-5-甲基氨、5-氨基-2-甲基吲哚和5-氨基-4-甲基吲哚。
上述优化条件为：二甲基亚砜的体积为凝胶介质体积的1-5倍；环氧氯丙烷的体积为凝胶介质体积的0.4-4倍，氢氧化钠浓度为0.4-1.4mol/L，体积为混合液体积的0.4-2倍；活化反应温度为30-50℃，反应时间为1-4小时；配基偶联过程中，吲哚类化合物的浓度为0.2-5mmol/g湿介质，偶联反应在pH值10-12、温度为35-60℃下进行，反应时间为4-10小时；所得介质在0.3-0.8g/L硼氢化钠中反应还原介质表面残留的环氧基团。
本发明提供了一种直接捕获发酵清液中蛋白质色谱介质材料，该色谱介质具有如下显著特点：色谱介质偶联的配基属非盐依赖性配基，从而保证了介质可以在高盐或低盐浓度下直接用于料液中蛋白质的捕获而不需预处理；相对于常规的疏水相互作用以及离子交换色谱介质具有更温和的洗脱条件，为蛋白保持活性提高了良好的环境，避免了蛋白的凝聚、变性；偶联高密度配基的介质可以对稀料液进行直接处理，在提高分离效率的同时降低了生产成本；介质清洗、除菌简便，易再生，在蛋白等生物大分子分离纯化中将有广阔的应用前景。
下面对本发明进行详细说明。
本发明的关键技术有七点：首先是配基功能基团的选择，疏水性介于吡啶和苯基间的吲哚基团作为疏水电荷诱导色谱的配基，同时吲哚基团的弱电离特性也提高了蛋白质的选择性；其次是在介质活化反应中引入亲水性有机溶剂二甲基亚砜，促进了环氧氯丙烷在反应体系中溶解和均相反应体系的形成；再者，活化反快速的进入琼脂糖介质内部，而随后催化剂氢氧化钠的加入则能够有力的提高环程而导致环氧基团的水解；关键之五在于配基偶联过程中温度的选择及反应时间的确定，从而提高环氧基团的活性；关键之六是配基偶联步骤中反应体积的控制，从而得到高配基修饰密度的介质；最后是采用适当的还原步骤处理残留的环氧基团，避免其对后续其它操作的影响。
具体实施方式
下面的实例将对本发明提供的方法予以进一步的说明。
实施例1
在50ml三角瓶中称取1.0g经沙滤漏斗冲洗抽干、平均粒径为87μm的琼脂糖凝胶介质SePHarose CL-6B，依次用含20％、50％和70％二甲基亚砜的水溶液清洗，每次清洗后均抽干清洗液；然后按顺序加入2ml的二甲基亚砜和0.5ml环氧氯丙烷，混合均匀后，再加入1.5ml 0.8mol/L的氢氧化钠溶液；凝胶介质悬浮液置于空气浴摇床中在40℃和170rpm下反应2.5小时，即可得到环氧基活化的SePHarose CL-6B琼脂糖凝胶介质。活化介质在砂漏中经反复冲洗除去游离的环氧氯丙烷后，测定凝胶介质的环氧基修饰密度为115.2μmol/ml湿介质。
称取1.0g活化介质置于2.5ml二甲基亚砜中，溶液中含0.6mmol 5-氨基吲哚；用0.5mol/L氢氧化钠将溶液pH值调节到13，置于49℃恒温空气浴中反应20小时；得到的介质依次用0.1mol/L氢氧化钠、20％(v/v)乙醇和蒸馏水彻底冲洗干净后，加入0.5g/L硼氢化钠溶液在室温下还原凝胶介质表面的环氧基团，即可得到产物，介质产物中5-氨基吲哚的偶联密度为85μmol/ml。
实施例2
实施例1中环氧氯丙烷的体积为1.5ml，1.6mol/L氢氧化钠的体积为4.5ml，其它条件不变，所得到活化介质中环氧基修饰密度为142.7μmol/ml湿介质。偶联反应加入5-氨基吲哚的浓度为2.0mmol，介质产物中5-氨基吲哚的偶联密度为102μmol/ml。
实施例3
在50ml三角瓶中称取1.0g经沙滤漏斗冲洗抽干、平均粒径为87μm的琼脂糖凝胶介质SePHarose CL-6B，依次用含30％和65％二甲基亚砜的水溶液清洗，每次清洗后均抽干清洗液；然后按顺序加入3ml的二甲基亚砜和2ml环氧氯丙烷，混合均匀后，再加入4.0ml 1.5mol/L的氢氧化钠溶液；凝胶介质悬浮液置于空气浴摇床中在45℃和170rpm下反应4小时，即可得到环氧基活化的SePHarose CL-6B琼脂糖凝胶介质。活化介质在砂漏中经反复冲洗除去游离的环氧氯丙烷后，测定凝胶介质的环氧基修饰密度为132.2μmol/ml湿介质。
称取1.0g活化介质置于2.5ml二甲基亚砜中，溶液中含1.0mmol 4-甲基-5-氨基吲哚；用0.5mol/L氢氧化钠将溶液pH值调节到12，置于55℃恒温空气浴中反应10小时；得到的介质依次用0.1mol/L氢氧化钠、20％(v/v)乙醇和蒸馏水彻底冲洗干净后，加入1.0g/L硼氢化钠溶液在室温下还原凝胶介质表面的环氧基团，即可得到产物，介质产物中4-甲基-5-氨基吲哚的偶联密度为93μmol/ml。
实施例4
实施例1所制备的介质在含有不同浓度氯化钠(20、50、100、200、500和700mmol/L)的0.01mol/L Tris-小时Cl缓冲液(pH 7.10)中平衡后，经沙滤漏斗抽干去除多余的溶液；分别称取上述抽干介质0.1g加入到10ml含有不同溶菌酶浓度(0.0-2.0mg/ml)的平衡缓冲液中；上述悬浮液在25℃恒温空气浴中反应过夜后，离心后收集的上清液在280nm下测定吸光值，确定介质的吸附量；在0.02-0.7mol/L氯化钠浓度下，介质的静态饱和吸附量介于40-48mg/ml湿介质。
实施例5
实施例1所制备的介质在电导率为20mS/cm的0.05mol/L醋酸盐缓冲液pH 3.0-9.0)中平衡后，经沙滤漏斗抽干去除多余的溶液；分别称取上述抽干介质0.1g加入到10ml含有不同溶菌酶浓度(0.0-2.0mg/ml)的平衡缓冲液中；上述悬浮液在25℃恒温空气浴中反应过夜后，离心后收集的上清液在280nm下测定吸光值，确定介质的吸附量；在PH 3.0、4.0、5.0、7.0和9.0条件下，介质的静态饱和吸附量分别为8.0、9.0、36、45和49mg/ml湿介质。
Claims (4)
1.一种从发酵清液中直接捕获蛋白质的疏水电荷诱导色谱介质，其特征在于，该介质为环氧基间隔臂末端偶联吲哚化合物X，
吲哚化合物X结构式如下，
其中R1-R6中的一个基团必为氨基或甲基氨，其余的基团为氢原子，剩余的基团为含有1～4个碳原子的短链烷烃。
2.按权利要求1所述的从发酵清液中直接捕获蛋白质的疏水电荷诱导色谱介质，其特征在于，吲哚化合物包括5-氨基吲哚、4-氨基吲哚、6-氨基吲哚、吲哚-5-甲基氨、5-氨基-2-甲基吲哚和5-氨基-4-甲基吲哚。
3.一种按权利要求1所述的从发酵清液中直接捕获蛋白质的疏水电荷诱导色谱介质制备方法，其特征在于包括以下过程，将平均粒径介于30-300μm的琼脂糖凝胶介质经体积比为20％、50％和70％二甲基亚砜的水溶液依次清洗并抽干后，倒入二甲基亚砜溶液中，二甲基亚砜的体积为凝胶介质体积的0.5-10倍；继而向该悬浮液中加入凝胶体积0.2-6倍的环氧氯丙烷并混合均匀；向混合后的反应体系中加入浓度为0.1-2.0mol/L氢氧化钠溶液，溶液体积为混合液体积的0.1-5倍；上述溶液置于温度为15-60℃的水浴中反应0.3-10小时；反应后的琼脂糖凝胶介质用去离子水冲洗至无游离的环氧基团后，抽干水分的介质悬浮于含有吲哚化合物的二甲基亚砜溶液中，吲哚类化合物的浓度为0.02-10mmol/g湿介质，二甲基亚砜体积为凝胶介质的0.5-10倍；溶液混合并置于水浴中在25-70℃下保温；用NaOH溶液调节溶液pH值至8.0-13.0后，通过2-20小时的偶联反应将吲哚类化合物键合到凝胶介质表面；所得介质经去离子水清洗后悬浮于0.2-1.0g/L硼氢化钠中于室温下反应12小时还原介质表面残留的环氧基团，从而得到最终产物。
4.根据权利要求3所述的从发酵清液中直接捕获蛋白质的疏水电荷诱导色谱介质的制备方法，其特征在于：二甲基亚砜的体积为凝胶介质体积的1-5倍；环氧氯丙烷的体积为凝胶介质体积的0.4-4倍，氢氧化钠浓度为0.4-1.4mol/L，体积为混合液体积的0.4-2倍；活化反应温度为30-50℃，反应时间为1-4小时；配基偶联过程中，吲哚类化合物的浓度为0.2-5mmol/g湿介质，偶联反应在pH值10-12、温度为35-60℃下进行，反应时间为4-10小时；所得介质在0.3-0.8g/L硼氢化钠中反应还原介质表面残留的环氧基团。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200710056591 CN101036877A (zh) | 2007-01-25 | 2007-01-25 | 从发酵清液直接捕获蛋白质的疏水电荷诱导色谱介质及制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200710056591 CN101036877A (zh) | 2007-01-25 | 2007-01-25 | 从发酵清液直接捕获蛋白质的疏水电荷诱导色谱介质及制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101036877A true CN101036877A (zh) | 2007-09-19 |
Family
ID=38888175
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 200710056591 Pending CN101036877A (zh) | 2007-01-25 | 2007-01-25 | 从发酵清液直接捕获蛋白质的疏水电荷诱导色谱介质及制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101036877A (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102432696A (zh) * | 2011-10-26 | 2012-05-02 | 南京农业大学 | 一种金属螯合琼脂糖凝胶的制备方法及其应用 |
| CN103586009A (zh) * | 2013-11-06 | 2014-02-19 | 天津大学 | 高密度聚乙烯亚胺修饰介质提高蛋白质吸附容量和吸附速率的方法 |
| CN107961768A (zh) * | 2017-12-06 | 2018-04-27 | 苏州博进生物技术有限公司 | 以吲哚-3-乙酰肼为功能配基的层析介质 |
| CN107999025A (zh) * | 2017-12-06 | 2018-05-08 | 苏州博进生物技术有限公司 | 以4-嘧啶基-2-苯胺为功能配基的亲和层析介质 |
| US11034723B2 (en) | 2017-12-25 | 2021-06-15 | Zhejiang University | Hybrid ligand, hybrid biomimetic chromedia and preparing method and use thereof |
| CN113908589A (zh) * | 2021-10-08 | 2022-01-11 | 天津工业大学 | 一种表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质及其制备方法 |
-
2007
- 2007-01-25 CN CN 200710056591 patent/CN101036877A/zh active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102432696A (zh) * | 2011-10-26 | 2012-05-02 | 南京农业大学 | 一种金属螯合琼脂糖凝胶的制备方法及其应用 |
| CN103586009A (zh) * | 2013-11-06 | 2014-02-19 | 天津大学 | 高密度聚乙烯亚胺修饰介质提高蛋白质吸附容量和吸附速率的方法 |
| CN107961768A (zh) * | 2017-12-06 | 2018-04-27 | 苏州博进生物技术有限公司 | 以吲哚-3-乙酰肼为功能配基的层析介质 |
| CN107999025A (zh) * | 2017-12-06 | 2018-05-08 | 苏州博进生物技术有限公司 | 以4-嘧啶基-2-苯胺为功能配基的亲和层析介质 |
| US11034723B2 (en) | 2017-12-25 | 2021-06-15 | Zhejiang University | Hybrid ligand, hybrid biomimetic chromedia and preparing method and use thereof |
| CN113908589A (zh) * | 2021-10-08 | 2022-01-11 | 天津工业大学 | 一种表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101036877A (zh) | 从发酵清液直接捕获蛋白质的疏水电荷诱导色谱介质及制备方法 | |
| CN104096544B (zh) | 以氨基苯并咪唑为功能配基的层析介质及其制备方法 | |
| CN107243336B (zh) | 一种层析介质及其制备方法和应用 | |
| CN105536726A (zh) | 一种去除水溶液中环丙沙星的氧化石墨烯海藻酸钠复合吸附材料的制备方法 | |
| CN101185880B (zh) | 一种用于抗体清除的血液净化吸附剂及其制备方法 | |
| KR20130131409A (ko) | 형질전환 쌀 알곡으로부터 인간 혈청 알부민을 정제하는 방법 | |
| CN104959120B (zh) | 一种用于血液灌流的炎性因子吸附剂及制备方法 | |
| CN104402003B (zh) | 用于偶联含伯氨基生物配基的磁性微球及其制备方法 | |
| CN105664868A (zh) | 血液净化用内毒素吸附材料及其制备方法与应用 | |
| CN110508263B (zh) | 一种用于血液净化的吸附材料及其制备方法 | |
| Vagenende et al. | Amide-mediated hydrogen bonding at organic crystal/water interfaces enables selective endotoxin binding with picomolar affinity | |
| CN101185881B (zh) | 用于免疫球蛋白类蛋白质分离纯化的色谱介质及其制备方法 | |
| CN101185882A (zh) | 大容量疏水电荷诱导色谱介质及制备方法 | |
| CN103028376A (zh) | 一种用于清除血液毒素的血液净化吸附剂及其制备方法 | |
| CN107868120B (zh) | 一种达托霉素的纯化方法 | |
| CN103933947B (zh) | 用于清除类风湿因子的血液净化材料及其制备方法 | |
| CN102743985B (zh) | 一种用于脱除内毒素的聚砜丝氨酸亲和膜的制备方法 | |
| CN103638827B (zh) | 一种铁-贵金属纳米粒子/pvdf杂化膜及其制备方法 | |
| CN103014100B (zh) | 一种重组人粒细胞刺激因子的纯化方法 | |
| CN112717902A (zh) | 一种乙型肝炎病毒吸附剂及其制备方法与应用 | |
| CN108355618B (zh) | 牛来源透明质酸酶亲和介质及其吸附方法 | |
| CN114130369B (zh) | 一种病毒排阻复合型层析介质及其制备方法 | |
| CN109485749A (zh) | 一种层析和超滤分离技术制备依诺肝素钠的方法 | |
| CN102380347B (zh) | 一种胆固醇氧化酶亲和介质及其合成和大规模纯化胆固醇氧化酶方法 | |
| CN1756792A (zh) | 带有阴离子性取代基物质的捕捉剂 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |