CN103586009A

CN103586009A - 高密度聚乙烯亚胺修饰介质提高蛋白质吸附容量和吸附速率的方法

Info

Publication number: CN103586009A
Application number: CN201310547177.9A
Authority: CN
Inventors: 孙彦; 余林玲; 史清洪
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2013-11-06
Filing date: 2013-11-06
Publication date: 2014-02-19

Abstract

本发明公开了一种高密度聚乙烯亚胺修饰介质提高蛋白质吸附容量和吸附速率的方法；该介质为平均粒径50-170μm的琼脂糖凝胶颗粒表面通过环氧基间隔臂修饰高密度聚乙烯亚胺（PEI）的介质。其制备方法为采取环氧氯丙烷活化色谱基质，活化介质与PEI中氨基反应完成配基的偶联。该色谱介质在离子强度从0.01–1mol/L的范围内对蛋白质具有较强的吸附能力，表现出了较高的吸附容量和吸附速率；同时，蛋白质的吸附表现出较好的盐浓度耐受性，保证了料液无需预处理而直接与色谱介质接触快速捕获的目标蛋白质。该介质在蛋白质高效快速分离纯化中将有广阔的应用前景。

Description

高密度聚乙烯亚胺修饰介质提高蛋白质吸附容量和吸附速率的方法

技术领域

本发明涉及一种高密度聚乙烯亚胺修饰介质在提高蛋白质吸附容量和吸附速率中的应用，属于生物技术领域中的蛋白质色谱分离技术。

背景技术

聚乙烯亚胺（poly(ethylenimine)，PEI）是一种价格低廉、毒性低、带有支状结构的长链阳离子聚电解质。PEI聚合物分子中伯、仲、叔胺的理论比例为1:2:1，完全质子化时电荷密度可达23.3mEq/g，是目前电荷密度最高的物质。PEI在较宽的pH值范围内都带正电荷，可以可逆性吸附带负电荷的物质。PEI具有较好的生物相容性，已广泛地应用于基因转移和生物制品的分离纯化，例如提取肝素、移除细菌内毒素等。近年来，研究者发现PEI有利于保持酶的活性及增加稳定性，因此也将PEI偶联于多种基质上用于α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、乙醇脱氢酶等多种酶的固定化。另外，由于PEI的电荷密度极高，PEI修饰介质在促进同电荷溶菌酶氧化复性中也有较好的应用。这些发现均表明，PEI非常适用于活性蛋白质的分离纯化，为PEI应用于蛋白质色谱分离纯化中提供基础。

PEI分子量较大，含有大量高反应活性的伯氨基团，容易与色谱基质偶联而获得高PEI接枝密度的色谱介质。此外，PEI含有大量可用于离子交换的伯、仲、叔胺基团，因此可直接合成高离子交换容量的接枝型离子交换剂，而无需后续配基偶联反应。因此，PEI十分适用于色谱基质的接枝修饰。

然而，目前对PEI修饰介质在蛋白质吸附中的应用主要集中于通过PEI改性羟基磷灰石以改变蛋白质在色谱柱上的保留行为、修饰色谱基质通过固相萃取捕获蛋白质。此外，目前用于蛋白质捕获的PEI修饰介质，其蛋白质捕获量均较低，且PEI修饰量未知。尚未有研究涉及在色谱基质上接枝修饰PEI以改变蛋白质在离子交换剂上的吸附容量和吸附速率。

虽然，研究者们也已经开发了一系列的聚合物接枝修饰介质应用于提高蛋白质的吸附容量和传质速率。然而，这些接枝型介质多是通过先在基础介质上连接不带电的葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯等中性长链聚合物，再偶联较短的离子交换配基而得到的。这类介质修饰方法需要两步偶联反应，合成工艺较为复杂。同时，葡聚糖价格昂贵，介质合成成本较高，而聚甲基丙烯酸酯的单体毒性较大，合成危险性较大。此外，这些接枝型介质的操作范围较窄，通常只能在较低盐浓度的环境中使用。

本专利即为将高密度聚乙烯基亚胺修饰的色谱介质应用于蛋白质的快速高效吸附中，该介质同时具有高吸附容量和高传质速率，应用范围宽，合成工艺简单，成本低廉，生物相容性好，安全低毒。因此，高密度聚乙烯基亚胺修饰介质非常适用于蛋白质的快速高效吸附中。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，进而提供一种高密度聚乙烯亚胺修饰介质提高蛋白质吸附性能。上述介质不但具有较高的吸附容量，同时具有较快的传质速率，而且也可在较宽的盐浓度范围内使用。

本发明的技术方案概述如下：

一种用高密度聚乙烯亚胺修饰介质提高蛋白质吸附容量和吸附速率的方法，该介质为平均粒径50-170μm的琼脂糖凝胶颗粒，表面通过环氧基间隔臂修饰高密度聚乙烯亚胺（PEI）的介质。

上述高密度PEI修饰色谱介质的结构表达如下：

上述PEI的分子量（MW）为1200–750000Da，结构式如下。

本发明的高密度聚乙烯亚胺修饰方法，其步骤如下：

1)介质的环氧化反应

将平均粒径为50-170μm的琼脂糖凝胶的介质，加入到二甲基亚砜中，制备介质悬浮液，二甲基亚砜体积用量为介质体积量的2倍。再向上述介质悬浮液中加入环氧氯丙烷，环氧氯丙烷体积与介质体积相等，混合均匀，制得混合悬浮液。最后向混合悬浮液中加入浓度为1.0mol/L的氢氧化钠溶液，氢氧化钠溶液体积为介质体积的2倍，置于20-35℃的恒温水浴，120-200rpm活化1-4h，之后用去离子水冲洗介质至无游离环氧氯丙烷，制得活化介质。

2)活化介质的PEI偶联

将上述活化介质加入到PEI水溶液中，PEI水溶液浓度1–25%（w/w）、体积与介质体积相等。介质悬浮液置于20-35℃的恒温水浴，在120-200rpm下混合1–12h，确保PEI充分扩散到介质孔道内。上述PEI充分扩散的介质悬浮液中加入体积为介质体积的0.1–2倍、浓度为0.1–2mol/L的氢氧化钠溶液后，置于20-35℃和120-200rpm下反应2–60h。反应产物经去离子水反复冲洗至中性后，加入0.5g/L硼氢化钠溶液中，在室温反应12h还原介质表面残留环氧基，还原后的介质再经离子水反复冲洗后，制得高PEI接枝密度的离子交换剂。

本发明的关键技术有四点：首先，接枝用PEI分子量的选择，分子量较高的PEI有利于获得较高PEI接枝密度的介质；其次，PEI水溶液浓度的控制，从而获得较好的PEI接枝形态和较高PEI接枝量；再次，偶联PEI前的扩散时间的确定，以保证PEI大分子充分进入介质孔道，有利于偶联反应。最后，偶联PEI反应时间、温度和偶联用氢氧化钠浓度、体积的确定，从而得到高PEI接枝密度的介质。

本发明的优点：

经实验证明，高密度PEI修饰的离子交换色谱介质在离子强度从0.01–1mol/L的范围内对蛋白质均具有较强的吸附特性，表现出了较高的吸附容量和吸附速率，而且对盐浓度具有较好的耐受性。从而保证了介质可在高盐或低盐浓度下直接用于料液中蛋白质的快速捕获而不需要预处理。高PEI密度的介质同时具有较高的吸附容量和吸附速率，提高了分离效率。该介质具有温和的吸附和洗脱条件，且偶联的PEI有利于保持蛋白质的活性和增加稳定性，为保持蛋白质活性提供了良好的环境。介质清洗、除菌方便，易于再生，生物相容性好，制备方法简单、低毒、价格低廉，在蛋白质高效快速分离纯化中将有广阔的应用前景。

具体实施方式

下面的实例将对本发明提供的方法予以进一步的说明。

实施例1：

取G3漏斗抽干的1g Sepharose FF（平均粒径为90μm）放入50mL锥形瓶中，依次加入2mL的二甲基亚砜，1mL的环氧氯丙烷，2mL的NaOH（1mol/L），25℃，170rpm摇床反应2.5h，用去离子水反复冲洗，直到清洗液用酚酞–Na₂S₂O₃溶液检测不变色，制得表面带有活性环氧基的活化介质。活化介质的环氧基修饰密度为60mmol/L。

将1mL的PEI（MW1200Da）水溶液（25%w/w）加入到活化介质（1g）中，25℃，170rpm，4h，使PEI充分扩散到介质孔道内，加入0.5mL的NaOH（2mol/L），25℃，170rpm反应48h以使PEI偶联到琼脂糖上，用去离子水反复冲洗，直到清洗液用酚酞检测不变色，再将介质置于0.5g/L的硼氢化钠溶液中，室温反应12h还原介质表面残留环氧基，用去离子水反复冲洗，制得介质的离子交换容量为420mmol/L。

实施例2：

将用G3漏斗抽干的1g实施例1中的活化介质加入到1mL的PEI（MW750000Da）水溶液（6%w/w）中，25℃，170rpm，4h，使PEI充分扩散到介质孔道内，加入1mL的NaOH（1mol/L），25℃，170rpm反应48h以使PEI偶联到琼脂糖上，用去离子水反复冲洗，直到清洗液用酚酞检测不变色，再将介质置于0.5g/L的硼氢化钠溶液中，室温反应12h还原介质表面残留环氧基，用去离子水反复冲洗，制得介质的离子交换容量为520mmol/L。

实施例3：

将用G3漏斗抽干的1g实施例1中的活化介质加入到1mL的PEI（MW750000Da）水溶液（12%w/w）中，25℃，170rpm，8h，使PEI充分扩散到介质孔道内，加入1mL的NaOH（1mol/L），25℃，170rpm反应48h以使PEI偶联到琼脂糖上，用去离子水反复冲洗，直到清洗液用酚酞检测不变色，再将介质置于0.5g/L的硼氢化钠溶液中，室温反应12h还原介质表面残留环氧基，用去离子水反复冲洗，制得介质的离子交换容量为740mmol/L。

实施例4：

将用G3漏斗抽干的1g实施例1中的活化介质加入到1mL的PEI（MW750000Da）水溶液（25%w/w）中，25℃，170rpm，12h，使PEI充分扩散到介质孔道内，加入1mL的NaOH（1mol/L），25℃，170rpm反应60h以使PEI偶联到琼脂糖上，用去离子水反复冲洗，直到清洗液用酚酞检测不变色，再将介质置于0.5g/L的硼氢化钠溶液中，室温反应12h还原介质表面残留环氧基，用去离子水反复冲洗，制得介质的离子交换容量为1230mmol/L。

实施例5：

取G3漏斗抽干的1g Sepharose FF（平均粒径为90μm）放入50mL锥形瓶中，依次加入2mL的二甲基亚砜，1mL的环氧氯丙烷，2mL的NaOH（1mol/L），30℃，180rpm摇床反应1h，用去离子水反复冲洗，直到清洗液用酚酞–Na₂S₂O₃溶液检测不变色，制得表面带有活性环氧基的活化介质。活化介质的环氧基修饰密度为65mmol/L。

将1mL的PEI（MW750000Da）水溶液（20%w/w）加入到活化介质（1g）中，30℃，180rpm，1h，加入0.5mL的NaOH（0.1mol/L），30℃，180rpm反应2h以使PEI偶联到琼脂糖上，用去离子水反复冲洗，直到清洗液用酚酞检测不变色，再将介质置于0.5g/L的硼氢化钠溶液中，室温反应12h还原介质表面残留环氧基，用去离子水反复冲洗，制得介质的离子交换容量为920mmol/L。

实施例6：

取G3漏斗抽干的1g SA-L（平均粒径为170μm）放入50mL锥形瓶中，依次加入2mL的二甲基亚砜，1mL的环氧氯丙烷，2mL的NaOH（1mol/L），35℃，120rpm摇床反应2h，用去离子水反复冲洗，直到清洗液用酚酞–Na₂S₂O₃溶液检测不变色，制得表面带有活性环氧基的活化介质。活化介质的环氧基修饰密度为75mmol/L。

将1mL的PEI（MW60000Da）水溶液（6%w/w）加入到活化介质（1g）中，20℃，120rpm，8h，使PEI充分扩散到介质孔道内，加入2mL的NaOH（0.5mol/L），20℃，120rpm反应48h以使PEI偶联到琼脂糖上，用去离子水反复冲洗，直到清洗液用酚酞检测不变色，再将介质置于0.5g/L的硼氢化钠溶液中，室温反应12h还原介质表面残留环氧基，用去离子水反复冲洗，制得介质的离子交换容量为440mmol/L。

实施例7：

取G3漏斗抽干的1g SA-S（平均粒径为50μm）放入50mL锥形瓶中，依次加入2mL的二甲基亚砜，1mL的环氧氯丙烷，2mL的NaOH（1mol/L），20℃，200rpm摇床反应4h，用去离子水反复冲洗，直到清洗液用酚酞–Na₂S₂O₃溶液检测不变色，制得表面带有活性环氧基的活化介质。活化介质的环氧基修饰密度为70mmol/L。

将1mL的PEI（MW60000Da）水溶液（1%w/w）加入到活化介质（1g）中，35℃，200rpm，6h，使PEI充分扩散到介质孔道内，加入0.1mL的NaOH（1mol/L），35℃，200rpm反应4h以使PEI偶联到琼脂糖上，用去离子水反复冲洗，直到清洗液用酚酞检测不变色，再将介质置于0.5g/L的硼氢化钠溶液中，室温反应12h还原介质表面残留环氧基，用去离子水反复冲洗，制得介质的离子交换容量为100mmol/L。

实验例1：不同的介质对牛血清白蛋白的静态吸附实验

将实施实例3中介质用含有不同浓度（0、20、50、100、150mmol/L）的氯化钠的20mmol/LTris–HCl缓冲液（pH8）平衡后，再将G3漏斗抽干的0.1g平衡后介质加入到10mL含有不同牛血清白蛋白的平衡缓冲液中，上述介质悬浮液置于25℃和170rpm恒温水浴震荡24h后，离心收集上清液在280nm下测吸光值，通过物料衡算确定蛋白质在介质上的吸附量。在0–150mmol/L氯化钠浓度下，介质的静态饱和吸附容量为205–278mg/mL。

将实施实例4中介质用含有不同浓度（0、20、50、100、150mmol/L）的氯化钠的20mmol/LTris–HCl缓冲液（pH8）平衡后，再将G3漏斗抽干的0.1g平衡后介质加入到10mL含有不同牛血清白蛋白的平衡缓冲液中，上述介质悬浮液置于25℃，170rpm恒温水浴震荡24h后，离心收集上清液在280nm下测吸光值，通过物料衡算确定蛋白质在介质上的吸附量。在0–150mmol/L氯化钠浓度下，介质的静态饱和吸附容量为175–278mg/mL。

比较：将商品介质Q Sepharose FF用含有不同浓度（0、20、50、100、150mmol/L）的氯化钠的20mmol/L Tris–HCl缓冲液（pH8）平衡后，再将G3漏斗抽干的0.1g平衡后介质加入到10mL含有不同量牛血清白蛋白的平衡缓冲液中，上述介质悬浮液置于25℃和170rpm恒温水浴震荡24h后，离心收集的上清液在280nm下测吸光值，通过物料衡算确定蛋白质在介质上的吸附量。在0–150mmol/L氯化钠浓度下，介质的静态饱和吸附容量为52–137mg/mL。

由结果可知，在上述实验中的氯化钠浓度下，高密度PEI修饰介质（实施实例3中介质和实施实例4中介质）对牛血清白蛋白的静态饱和吸附容量及其对盐浓度的耐受程度均高于商品介质Q Sepharose FF。这说明高密度PEI修饰介质明显提高了蛋白质的吸附容量。

实验例2：不同的介质对牛血清白蛋白的吸附动力学实验

将实施实例3中介质用含有不同浓度（0、20、50、100、150mmol/L）的氯化钠的20mmol/LTris–HCl缓冲液（pH8）平衡后，经G3漏斗抽干后分别取0.50、0.65、0.78、0.96、1.10g（对应氯化钠浓度0、20、50、100、150mmol/L）加入100mL含有1mg/mL的牛血清白蛋白的相应平衡缓冲液中，上述介质悬浮液置于25℃恒温水浴，搅拌速度为280rpm，通过实时在线检测蛋白质溶液在280nm下的吸光值，从而确定蛋白质溶液浓度随时间变化的曲线，求得蛋白质在介质中的传质速率，用有效孔扩散系数与牛血清白蛋白在自由溶液中扩散系数的比值（D_e/D₀）来代表。在0–150mmol/L氯化钠浓度下，介质的D_e/D₀值为0.49–1.61。

将实施实例4中介质用含有不同浓度（0、20、50、100、150mmol/L）的氯化钠的20mmol/LTris–HCl缓冲液（pH8）平衡后，经G3漏斗抽干后称取0.50、0.65、0.78、0.96、1.10g（对应氯化钠浓度0、20、50、100、150mmol/L）加入100mL含有1mg/mL的牛血清白蛋白的相应平衡缓冲液中，上述介质悬浮液置于25℃恒温水浴，搅拌速度为280rpm，通过实时在线检测蛋白质溶液在280nm下的吸光值，从而确定蛋白质溶液浓度随时间变化的曲线，求得蛋白质在介质中的传质速率，用有效孔扩散系数与牛血清白蛋白在自由溶液中扩散系数的比值（D_e/D₀）来代表。在0–150mmol/L氯化钠浓度下，介质的D_e/D₀值为0.67–1.24。

比较：将商品介质Q Sepharose FF用含有不同浓度（0、20、50、100、150mmol/L）的氯化钠的20mmol/L Tris–HCl缓冲液（pH8）平衡后，经G3漏斗抽干后分别称取0.50、0.65、0.78、0.96、1.10g（对应氯化钠浓度0、20、50、100、150mmol/L）加入100mL含有1mg/mL的牛血清白蛋白的相应的平衡缓冲液中，上述介质悬浮液置于25℃恒温水浴，搅拌速度为280rpm，通过实时在线检测蛋白质溶液在280nm下的吸光值，从而确定蛋白质溶液浓度随时间变化的曲线，求得蛋白质在介质中的传质速率，用有效孔扩散系数与牛血清白蛋白在自由溶液中扩散系数的比值（D_e/D₀）来代表。在0–150mmol/L氯化钠浓度下，介质的D_e/D₀值为0.04–0.81。

由结果可知，在上述实验中的氯化钠浓度下，高密度PEI修饰介质（实施实例3中介质和实施实例4中介质）对牛血清白蛋白的吸附速率及其对盐浓度的耐受程度均高于商品介质Q Sepharose FF。这说明高密度PEI修饰介质明显提高了蛋白质的吸附速率。

本发明提出的高密度聚乙烯亚胺修饰介质在提高蛋白质吸附容量和吸附速率的应用，已通过现场较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

Claims

1.一种高密度聚乙烯亚胺修饰介质，其特征是该介质为平均粒径50-170μm的琼脂糖凝胶颗粒表面通过环氧基间隔臂修饰高密度聚乙烯亚胺PEI的介质；

上述高密度PEI修饰色谱介质的结构表达如下：

上述PEI的重均分子量为1200–750000Da，结构式如下。

2.权利要求1的高密度聚乙烯亚胺修饰方法，其步骤如下：

1)介质的环氧化反应

将平均粒径为50-170μm的琼脂糖凝胶的介质，加入到二甲基亚砜中，制备介质悬浮液，二甲基亚砜体积用量为介质体积量的2倍；再向上述介质悬浮液中加入环氧氯丙烷，环氧氯丙烷体积与介质体积相等，混合制得混合悬浮液；向混合悬浮液中加入浓度为1.0mol/L的氢氧化钠溶液，氢氧化钠溶液体积为介质体积的2倍，置于20-35℃的恒温水浴，120-200rpm活化1-4h，之后用去离子水冲洗介质至无游离环氧氯丙烷，制得活化介质；

2)活化介质的PEI偶联

将上述活化介质加入到PEI水溶液中，PEI水溶液浓度1–25%、体积与介质体积相等；介质悬浮液置于20-35℃的恒温水浴，在120-200rpm下混合1–12h，向上述PEI充分扩散的介质悬浮液中加入体积为介质体积的0.1–2倍、浓度为0.1–2mol/L的氢氧化钠溶液后，置于20-35℃和120-200rpm下反应2–60h；反应产物经去离子水反复冲洗至中性后，加入0.5g/L硼氢化钠溶液中，在室温反应12h还原介质表面残留环氧基，还原后的介质再经离子水反复冲洗后，制得高PEI接枝密度的离子交换剂。

3.如权利要求2所述的方法，其特征是介质的离子交换容量为100–1230mmol/L。