CN105001376A - 原子转移自由基聚合制备高容量蛋白质层析介质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种原子转移自由基聚合制备高容量蛋白质离子交换层析介质的方法。包括在聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球上偶联引发剂2-溴异丁酰溴的微球的溴化过程；通过自由基转移引发单体化合物在微球表面聚合反应，得到层析介质的离子交换聚合物接枝层析介质的合成过程。通过ATRP技术制备聚合物接枝离子交换层析介质的方法，合成的聚合物接枝层析介质具有接枝聚合物密度和链长可控、反应条件温和、作为单体的单体化合物选择余地大，合成的聚合物接枝离子交换层析介质的γ球蛋白饱和吸附容量可高达800mg/g湿介质以上，展现了优秀的吸附性能；在1mg/mL的蛋白溶液中能够在5min之内达到吸附平衡，具有广泛的应用前景。

Description

原子转移自由基聚合制备高容量蛋白质层析介质的方法

技术领域

本发明涉及一种基于原子转移自由基聚合制备高容量蛋白质离子交换层析介质的方法，属于生物技术领域的蛋白质分离纯化技术。

背景技术

蛋白质离子交换层析是基因工程蛋白质药物生产的核心技术。作为该技术的基础的离子交换层析介质则在过去的二、三十年间严重滞后于基因工程蛋白质表达水平和生产能力。例如，迄今常规离子交换层析介质中牛血清白蛋白的结合容量仅为70mg/mL甚至更低。因此，提高蛋白质结合容量(binding capacity)已经成为了当前实现蛋白质离子交换层析过程高效化的重要前提之一。在离子交换层析中，蛋白质的结合容量取决于层析介质的蛋白质饱和吸附容量和层析介质内的传质速率。目前，多糖、硅胶、金属氧化物等常用的蛋白质离子交换层析介质材料中孔道尺寸在100nm左右。这些介质在具备较高比表面积提高蛋白质的饱和吸附容量的同时，蛋白质分子(1～30nm)在孔道内的传质阻力也显著恶化。为了改善这一情况，Afeyan等人率先报道了具有微米级孔道结构的蛋白质层析材料【Journal of chromatography1990,519(1):1-29】，在介质内部引入对流强化介质内传质速率。此后，多种具有类似孔道结构的蛋白质层析介质及其制备方法被先后公开【Advances in BiochemicalEngineering-Biotechnology 2009,113:217-254】。例如，中国发明专利ZL03130027.8公开了一种高容量大孔琼脂糖凝胶介质的制备方法，以碳酸钙颗粒为致孔剂利用油水两相法合成具有微米级超大孔的琼脂糖介质，该介质的传质速率和动态吸附容量等都有明显的提高。但这类层析材料性能的提高是以牺牲部分饱和吸附容量为代价的。上世纪90年代，安玛西亚公司(GEHealthcare的前身)推出了葡聚糖接枝的琼脂糖凝胶离子交换层析介质Sepharose XL。Bowes等人报道，Sepharose XL对单克隆抗体的饱和吸附容量达到330mg/mL【Journal ofChromatography A,2009,1216:7774-7784】。余林玲等人进一步发现，聚乙烯亚胺接枝的琼脂糖离子交换层析介质具有临界的离子交换容量【Journal of Chromatography A 2013,1305:76-84】。在临界离子交换容量以上，聚乙烯亚胺接枝的琼脂糖离子交换层析介质的饱和吸附容量和传质速率出现跳跃式提高。但葡聚糖、聚乙烯亚胺等聚合物存在较宽的分子量分布，聚合物溶液黏度高、聚合物接枝反应属典型的多点接枝，因此接枝过程难以控制，产品性质不稳定。

针对上述的缺陷，Unsal等人率先报道了采用原子转移自由基聚合(ATRP)方法制备蛋白质层析介质的方法【Analytical Chemistry 2006,78(16):5868-5875】。该方法的特征在于，以3-(2-Bromoisobutyramido)propyl(triethoxy)silane(BIBAPTES)为引发剂在平均孔径50nm的甲基丙烯酸二羟基丙酯(dihydroxypropyl methacrylate)与二甲基丙烯酸乙酯(ethylenedimethacrylate)共聚微球上接枝单体化合物磺丙基甲基丙烯酸3-磺酸丙酯合成聚合物接枝离子交换层析介质。合成的离子交换层析介质在较宽聚合度范围(2.2–25.1)内具备稳定的蛋白质分离作用，但未见对蛋白质饱和吸附容量的改善。中国发明专利201410142858.1公开了通过ATRP技术在超大孔聚苯乙烯微球表面接枝温敏聚合物刷制备聚合物接枝蛋白质分离介质的方法，其优势在于利用该介质分离蛋白质的过程中很好地维持了蛋白质活性，但蛋白质饱和吸附容量仅为每克干球37.1mg。美国GE Healthcare公司公开了一种利用ATRP技术合成聚合物整体柱的方法【US Patent，US2009/0095668 A1】。该方法的特征在于，整体柱的合成在相对温和环境中进行，经表面改性获得的吸附材料可用于分离细胞、质粒DNA和蛋白质等生物大分子。

蛋白质在层析介质上的饱和吸附容量是提高离子交换层析介质性能的基石，其核心在于为层析介质提供尽可能多的有效结合位点。基于上述的思路，本发明利用ATRP技术在聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球粒子表面接枝单体化合物合成用于具有较高蛋白质饱和吸附容量的离子交换层析介质。这种离子交换层析介质具有蛋白质吸附容量高、聚合物链长和密度可控、产品性能稳定等特点，在蛋白质的分离方面具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于原子转移自由基聚合制备高容量蛋白质离子交换层析介质的方法，所述聚合物接枝离子交换层析介质具有吸附容量大、制备工艺简单、接枝的聚合物链密度和长度可控、条件温和、价格低廉等特点。

本发明是通过下述技术方案加以实现的：

一种原子转移自由基聚合制备高容量蛋白质层析介质的方法；其特征在于：

1)在聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球上偶联引发剂2-溴异丁酰溴的微球的溴化过程；

2)通过自由基转移引发单体化合物在微球表面聚合反应，得到层析介质的离子交换聚合物接枝层析介质的合成过程。

所述的单体化合物是一端含季铵基团和另一末端为丙烯酰基或甲基丙烯酸基的化合物分子。

所述的单体化合物优选自甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酰胺丙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酰胺乙基三甲基氯化铵或丙烯酰胺乙基三甲基氯化铵一种。

所述的溴化过程为：聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球加入到含三乙胺的正己烷溶液中，混合溶液置于冰水浴中冷却后滴加含2-溴异丁酰溴的正己烷溶液，冰浴反应0.5–3.0小时后转移至室温下继续反应3–36h，得到溴含量为10-150.6μmol/g干燥微球的溴化微球；反应得到的溴化微球经用正己烷、无水乙醇和去离子水依次清洗后收集。

优选正己烷的体积用量为5-15mL/g微球，三乙胺的体积用量为0.12–1.2mL/g微球，2-溴异丁酰溴体积用量为0.1–1.0mL/g微球。

所述的合成过程为：溴化微球悬浮于异丙醇–水的混合溶液后，向其中加入单体化合物；混匀后的悬浮液在氮气保护下加入由溴化亚铜、溴化铜以及配体化合物2,2’-联吡啶构成的催化剂；反应体系中，异丙醇–水混合溶液体积用量为3-30mL/g微球，其中异丙醇和水的体积比为1:10–2:1；单体化合物加入量为1.0-50.0mmol/g微球。

所述的溴化亚铜、溴化铜、联吡啶与单体化合物的摩尔比为1:0.1:2:100。

所述的反应物在室温无氧条件下反应0.5–24h；反应产物用异丙醇、无水乙醇和去离子水依次清洗，得到用于蛋白质分离纯化的聚合物接枝离子交换层析介质。

上述微球溴化过程，优选的三乙胺的体积用量为0.20-0.60mL/g微球，优选的2-溴异丁酰溴体积用量为0.20-0.50mL/g微球；上述微球聚合过程，优选的单体化合物加入量为5.4–32.0mmol/g微球。

与传统离子交换层析介质和其他聚合物接枝离子交换层析介质相比，本发明提供了用于蛋白质分离纯化的聚合物接枝离子交换层析介质及其制备方法具有如下显著的特点：(1)本发明涉及一种通过ATRP技术制备聚合物接枝离子交换层析介质的方法，该方法合成的聚合物接枝层析介质具有接枝聚合物密度和链长可控、反应条件温和、作为单体的单体化合物选择余地大等优点；(2)聚合物分子的接枝密度可通过调节微球表面溴的含量获得高(H：>90μmol/g)、中(M：30–90μmol/g)和低(L：<30μmol/g)密度的聚合物链，链长可通过单体化合物的加入量和反应时间调控得到；(3)合成的聚合物接枝离子交换层析介质的γ球蛋白饱和吸附容量可高达800mg/g湿介质以上，显著高于目前已有报道值，展现了优秀的吸附性能；(4)蛋白质的传质在聚合物链进行，表观传质速度更快，在1mg/mL的蛋白溶液中能够在5min之内达到吸附平衡，操作时间大大缩短；(5)聚合物接枝离子交换层析介质内吸附蛋白质的洗脱条件更加温和、蛋白质易于回收，回收蛋白质的生物活性更高。由此，基于本发明提供离子交换聚合物接枝层析介质制备方法合成的层析介质具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为以本发明实施例1-3所制备的聚合物接枝离子交换层析介质在20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)γ球蛋白的静态吸附容量比较图。图中正方形代表实施例1制备得到的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-M-DMCH的吸附等温线，三角形代表实施例2制备得到的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-M-DMCM的吸附等温线，菱形代表实施例3制备得到的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-M-DMCL的吸附等温线。

图2为以本发明实施例1-3所制备的聚合物接枝离子交换层析介质在20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)牛血清白蛋白的静态吸附容量比较图。图中正方形代表实施例1制备得到的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-M-DMCH的吸附等温线，三角形代表实施例2制备得到的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-M-DMCM的吸附等温线，菱形代表实施例3制备得到的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-M-DMCL的吸附等温线。

图3为以本发明实施例1制备得到的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-M-DMCH在不同浓度氯化钠(0、20、50、100、200mmol/L)20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)对γ球蛋白的静态吸附容量随离子强度变化图。

图4为以本发明实施例1制备得到的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-M-DMCH在20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)对γ球蛋白和牛血清白蛋白的吸附动力学图。图中正方形代表γ球蛋白的吸附动力学曲线，三角形代表牛血清白蛋白的吸附动力学曲线。

图5为以本发明实施例1-3所制备的聚合物接枝离子交换层析介质在水中的粒径分布图。图中点划线代表实施例1制备得到的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-M-DMCH的粒径分布，虚线代表实施例2制备得到的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-M-DMCM的粒径分布，实线代表实施例3制备得到的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-M-DMCL的粒径分布。

图6为以本发明实施例1制备得到的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-M-DMCH经过二氧化碳超临界干燥后的扫描电子显微镜图像。

具体实施方式

下面的实例将对本发明的方法予以进一步的说明。

实施例1聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-M-DMCH的制备

称取4g羟基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球(pGMA)置于含40mL正己烷的100mL三口烧瓶中制得悬浮液后，向其中加入1.2mL三乙胺；混合均匀后的溶液置于冰浴后，继续向悬浮液中滴加1.0mL 2-溴异丁酰溴和5.0mL正己烷的混合溶液；上述悬浮液冰浴反应3h后，置于室温下继续反应20h；获得的溴化pGMA介质经正己烷、无水乙醇和去离子水依次清洗若干次后，测得溴化pGMA微球中溴含量为38.0μmol/g干燥微球；该溴化pGMA介质命名为pGMA-M。

称取pGMA-M介质2g置于30mL体积比为1:1的异丙醇和水的混合溶液中；然后，加入64mmol甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(DMC)，充分混匀后通入氮气30min；继而在氮气保护下依比例加入溴化亚铜0.640mmol、溴化铜0.064mmol和联吡啶0.128mmol，并继续通入氮气30min后密封；上述溶液在25℃恒温水浴反应为6h。聚合反应后的微球用异丙醇、无水乙醇和去离子水依次清洗，得到用于蛋白质分离纯化的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-M-DMCH。介质的粒径为13.4μm，离子交换容量为2681±30μmol/g干燥微球。

实施例2

实施例1中单体化合物DMC加入量为32mmol，溴化亚铜、溴化铜、联吡啶的加入量分别为0.320mmol、0.032mmol、0.640mmol，其他条件不变的情况下，可以得到粒径为5.8μm的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-M-DMCM，离子交换容量为2496±117μmol/g干燥微球。

实施例3

实施例1中单体化合物DMC加入量为10.8mmol，溴化亚铜、溴化铜、联吡啶的加入量分别变为0.110mmol、0.011mmol、0.220mmol，其他条件不变的情况下，可以得到粒径为2.44μm的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-M-DMCL，离子交换容量为1972±63μmol/g干燥微球。

实施例4

实施例1中的正己烷的体积为60mL，三乙胺加入量0.48mL，2-溴异丁酰溴加入量变为0.4mL，冰浴时间为0.5h，其后室温下反应3h；其他条件不变的情况下，可得到溴含量为10.1μmol/g干燥微球,该微球命名为pGMA-L。其后，2g介质在60mL异丙醇与水体积比为1:10的混合溶液中与100mmol的单体化合物DMC进行聚合，反应时间为0.5h，反应后得到粒径为2.6μm的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-L-DMCH，离子交换容量为2338±158μmol/g干燥微球。

实施例5

称取羟基化聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球(pGMA)4g置于含20mL正己烷的100mL三口烧瓶中制得悬浮液后，向其中加入2.4mL三乙胺；混合均匀后的溶液置于冰浴后，继续向悬浮液中滴加2.0mL 2-溴异丁酰溴和5.0mL正己烷的混合溶液；上述悬浮液冰浴反应2h后，置于20℃的恒温水浴中继续反应36h；获得的溴化pGMA介质经正己烷、无水乙醇和去离子水依次清洗若干次后，测得溴化pGMA微球中溴含量为为150.6μmol/g干燥微球；该溴化pGMA介质命名为pGMA-H。

称取pGMA-H介质2g置于6mL异丙醇和水体积比为2:1的混合溶液中；然后，加入64mmol单体化合物DMC，充分混匀后通入氮气30min；继而在氮气保护下加入溴化亚铜0.640mmol、溴化铜0.064mmol和联吡啶0.128mmol，并继续通入氮气30min后密封；并继续通入氮气30min后密封；上述溶液在25℃恒温水浴反应为24h。聚合反应后的微球用异丙醇、无水乙醇和去离子水依次清洗，得到用于蛋白质分离纯化的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-H-DMCH，介质的粒径为15.64μm，离子交换容量为3945±45μmol/g干燥微球。

实施例6

实施例5中三乙胺的加入量为4.8mL，2-溴异丁酰溴的加入量为4.0mL，室温下反应时间为16小时，测得溴化pGMA微球中溴含量为为127μmol/g干燥微球；单体化合物丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(AEM)加入量为64mmol，溴化亚铜、溴化铜、联吡啶的加入量分别变为0.640mmol、0.064mmol、0.128mmol，其他条件不变的情况下，得到用于蛋白质分离纯化的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-H-AEMH。介质的粒径为13.64μm，离子交换容量为3721±34μmol/g干燥微球。

实施例7

实施例5中单体化合物甲基丙烯酰胺丙基三甲基氯化铵(APM)加入量为2mmol，溴化亚铜、溴化铜、联吡啶的加入量分别变为0.02mmol、0.002mmol、0.04mmol，其他条件不变的情况下，得到用于蛋白质分离纯化的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-H-APML。介质的粒径为2.32μm，离子交换容量为150±22μmol/g干燥微球。

实施例8

实施例5中三乙胺的加入量为0.8mL，2-溴异丁酰溴的加入量为0.8mL，室温下反应时间为36小时，测得溴化pGMA微球中溴含量为为45μmol/g干燥微球；单体化合物为甲基丙烯酰胺乙基三甲基氯化铵(APE)。得到用于蛋白质分离纯化的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-M-APEH。介质的粒径为10.37μm，离子交换容量为2318±61μmol/g干燥微球。

实施例9

实施例5中单体化合物为丙烯酰胺乙基三甲基氯化铵(AMA)。得到用于蛋白质分离纯化的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-H-AMAH。介质的粒径为15.63μm，离子交换容量为3854±27μmol/g干燥微球。

实施例10

实施例1制备的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-M-DMCH、实施例2制备的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-M-DMCM和实施例3制备的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-M-DMCL，分别用不同浓度氯化钠(0、0.02、0.05、0.1、0.2mol/L)20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)平衡后，离心弃上清，准确称取取0.05g介质于25mL锥形瓶中，加入10mL已知浓度的蛋白质溶液中。将锥形瓶置于摇床中，25℃、100r/min水浴摇床振荡24h，取出，8000r/min离心5min。在280nm下以未加蛋白质的空白缓冲液为参比，测定上清液的吸光值，最后根据物料平衡计算蛋白质的吸附量，并使用Langmuir模型来描述蛋白的吸附平衡行为。结果显示，γ球蛋白的静态吸附容量介于80-807mg/g湿介质之间(如图1所示)，而牛血清白蛋白的静态吸附量介于34-115mg/g湿介质之间(如图2所示)。且静态吸附容量随着离子强度的增加吸附量显著下降(如图3所示)。

实施例11

将实施例1中制备的聚合物接枝离子交换层析介质pGMA-M-DMCH用20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH 8.5)平衡。将100mL一定浓度的蛋白质溶液置于100mL三口圆底烧瓶中，并插入半月形搅拌桨，三口烧瓶放在25℃恒温水浴中，开启搅拌保持搅拌转速为280r/min。将一个孔径2μm的不锈钢滤头连接到蠕动泵，蛋白质溶液通过蠕动泵注入Explorer 100的紫外检测器检测溶液并返回三口烧瓶。当280nm紫外吸收稳定后，量取取一定体积的已知浓度的实施例1制备的聚合物接枝离子交换层析介质悬浮液加入三口烧瓶，开始计时。在线检测蛋白质溶液在280nm的吸光值，从而确定主体液相蛋白质浓度随时间变化的曲线。结果表明溶液主体中的蛋白浓度在5min中内就达到了平衡(如图4所示)。

本发明公开和提出的原子转移自由基聚合制备高容量蛋白质层析介质的方法，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变原料和工艺路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

Claims (10)

1.一种原子转移自由基聚合制备高容量蛋白质层析介质的方法；其特征在于：

1)在聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球上偶联引发剂2-溴异丁酰溴的微球的溴化过程；

2)通过自由基转移引发单体化合物在微球表面聚合反应，得到层析介质的离子交换聚合物接枝层析介质的合成过程。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的单体化合物是一端含季铵基团和另一末端为丙烯酰基或甲基丙烯酸基的化合物分子。

3.如权利要求2所述的方法，其特征是所述的单体化合物选自甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酰胺丙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酰胺乙基三甲基氯化铵或丙烯酰胺乙基三甲基氯化铵一种。

4.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的溴化过程为：聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球加入到含三乙胺的正己烷溶液中，混合溶液置于冰水浴中冷却后滴加含2-溴异丁酰溴的正己烷溶液，冰浴反应0.5–3.0小时后转移至室温下继续反应3–36h，得到溴含量为10-150.6μmol/g干燥微球的溴化微球；反应得到的溴化微球经用正己烷、无水乙醇和去离子水依次清洗后收集。

5.如权利要求4所述的方法，其特征是正己烷的体积用量为5-15mL/g微球，三乙胺的体积用量为0.12–1.2mL/g微球，2-溴异丁酰溴体积用量为0.1–1.0mL/g微球。

6.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的合成过程为：溴化微球悬浮于异丙醇–水的混合溶液后，向其中加入单体化合物；混匀后的悬浮液在氮气保护下加入由溴化亚铜、溴化铜以及配体化合物2,2’-联吡啶构成的催化剂；反应体系中，异丙醇–水混合溶液体积用量为3-30mL/g微球，异丙醇和水的体积比为1:10-2:1；单体化合物加入量为1.0-50.0mmol/g微球。

7.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的溴化亚铜、溴化铜、联吡啶与单体化合物的摩尔比为1:0.1:2:100。

8.如权利要求6所述的方法，其特征是所述的反应物在室温无氧条件下反应0.5–24h；反应产物用异丙醇、无水乙醇和去离子水依次清洗，得到用于蛋白质分离纯化的聚合物接枝离子交换层析介质。

9.如权利要求5所述的方法，其特征是三乙胺的体积用量为0.20-0.60mL/g微球；2-溴异丁酰溴体积用量为0.20-0.50mL/g微球。

10.如权利要求6所述的方法，其特征是单体化合物加入量为5.4–32.0mmol/g微球。