CN105727911A - 甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝二乙胺修饰琼脂糖凝胶色谱介质及制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝二乙胺修饰的高容量琼脂糖凝胶色谱介质及制备方法与应用。通过表面引发剂α‐溴异丁酰溴和单体甲基丙烯酸缩水甘油酯用量的调控,获得接枝密度和链长度均不同的介质,然后用二乙胺对单体上的环氧基进行修饰,得到阴离子交换色谱介质。本发明合成的甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝二乙胺修饰色谱介质对牛血清蛋白的饱和吸附容量可高达264mg/mL,在10%穿透条件下DBC超过90mg/mL。该介质制备方法简单,接枝条件可控,在蛋白质高效分离纯化中将有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝二乙胺修饰的以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质及制备方法与应用,属于生物技术领域中的蛋白质色谱分离技术。
背景技术
在基因工程和重组DNA等上游生物技术取得巨大进展的同时,生物大分子生产的瓶颈在于下游分离纯化技术。色谱技术尤其是离子交换色谱,因其分离精度高,设备简单,操作方便,广泛用于生物大分子的分离和纯化。离子交换色谱作为一种成熟的色谱分析方法,仍有飞快的发展速度和巨大的发展空间。在蛋白质色谱技术的各项要素中,色谱介质是核心,研究和开发新型高效的色谱介质是提高色谱分离效率的关键。因此,开发高效的新型离子交换剂,是离子交换色谱最具前景的发展趋势。由于目前蛋白质色谱介质的处理能力严重滞后,提高离子交换色谱介质吸附容量已经成为当前实现蛋白质离子交换过程高效化的重要前提之一。其中,接枝型色谱介质作为实现理想化色谱介质的途径,成为了近年来的研究热点。
通过在传统介质表面接枝上带有活性基团的聚合物长链,可以使吸附行为从介质表面扩展到三维空间,形成多层吸附,从而达到提高色谱介质吸附容量的目的。因此,通过接枝聚合反应,可以有效提高大孔型介质对生物大分子的吸附容量。虽然,葡聚糖、聚乙烯亚胺等接枝修饰介质的开发,大幅度提高了蛋白质的吸附容量和传质速率。但是葡聚糖、聚乙烯亚胺等接枝介质为聚合物直接接枝,聚合物分子的分子量不均一且其在基质介质上的接枝为多位点结合,因此接枝过程难以控制和优化,进而限制了其在工业上的应用。
针对上述的缺陷,研究者们采用多种接枝方法应用于离子交换色谱介质的制备。其中,原子转移自由基聚合(ATRP)技术是一种表面引发的自由基聚合方法,具有聚合工艺简单,聚合过程易控制,接枝链分子量分布窄,以及聚合实施方法多样等显著优点,是目前为止最具工业化应用前景的聚合方法之一。近年来,ATRP技术逐渐被用于色谱介质的制备。Unsal等人率先报道了采用ATRP技术制备蛋白质层析介质的方法【AnalyticalChemistry,2006,78(16):5868-5875.】。该方法以3-(2-Bromoisobutyramido)propyl(triethoxy)silane(BIBAPTES)为引发剂在平均孔径约为50nm的甲基丙烯酸二羟基丙酯(dihydroxypropylmethacrylate)与二甲基丙烯酸乙酯(ethylenedimethacrylate)共聚微球上接枝单体化合物甲基丙烯酸3-磺酸丙酯钾盐(3-sulfopropylmethacrylatepotassiumsalt)合成聚合物接枝离子交换色谱介质。合成的离子交换层析介质具有较好的色谱性能,但在较宽聚合度范围(2.2–25.1)内未表现出对蛋白质吸附容量的改善。ShuLi利用ATRP技术合成的接枝型离子交换微球具有高吸附容量以及快速吸附等优点【BiochemicalEngineeringJournal,2015,103:122-129.】。
基于上述的思路,本发明利用ATRP技术在琼脂糖凝胶介质表面接枝单体化合物甲基丙烯酰缩水甘油酯并修饰二乙胺合成用于蛋白质吸附和分离纯化的色谱介质。通过控制反应条件合成不同接枝密度和接枝链长的阴离子交换介质。
发明内容
本发明的目的在于开发一种接枝型阴离子交换色谱介质。所述的分离纯化色谱介质具有吸附容量大的特点,其制备方法过程简单,接枝密度和接枝链长可调节。
本发明的技术方案概述如下:
一种介质表面接枝聚电解质提高蛋白质吸附容量的方法,该色谱介质是平均粒径为50-120μm的琼脂糖凝胶颗粒,接枝链为二乙胺修饰的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯。色谱介质的结构表达形式如下:
本发明的接枝型阴离子交换色谱介质,该色谱介质是在琼脂糖凝胶多孔介质表面接枝带有活性环氧基的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯长链,然后修饰二乙胺获得阴离子交换色谱介质。接枝链的重复单元为二乙胺修饰的甲基丙烯酸缩水甘油酯。
本发明的阴离子交换色谱介质的制备方法,包括以下过程:
1)介质的溴化反应
将平均粒径为50-120μm的琼脂糖凝胶多孔介质经溶剂替换再悬浮于N,N’-二甲基甲酰胺溶液中,N,N’-二甲基甲酰胺的体积用量为介质体积的5-8倍,继而向悬浮液中加入体积用量为介质体积0.2-0.5倍的三乙胺混合,在冰浴条件下向混合悬浮液中滴加入体积用量为介质体积0.025-0.33倍的α-溴异丁酰溴,置于25-40℃的恒温水浴中反应10-16h,之后依次用N,N’-二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水清洗介质,得到溴化介质;
2)介质的ATRP接枝反应
将溴化介质悬浮于N,N’-二甲基甲酰胺与水的混合溶液中,混合溶液的体积用量为溴化介质体积的6-8倍;再向该悬浮液中加入单体甲基丙烯酸缩水甘油酯、溴化铜和2,2’-联吡啶,通氮气除氧,再向悬浮液中加入溴化亚铜,继续通氮气,反应60-120min;将反应液暴露于空气中使溴化亚铜被氧化以终止反应,用EDTA清洗除去铜离子,用乙醇和大量去离子水清洗介质,得到GMA接枝介质;
3)介质的胺基化修饰反应
将GMA接枝介质置于20%二乙胺水溶液中,体积用量为接枝介质体积的7-12倍,20-30℃,170rpm反应5-12h,使接枝链上的环氧基被DEA充分修饰,用去离子水反复冲洗,直到清洗液用酚酞检测不变色,得到聚合物接枝型阴离子交换介质。
所述步骤2中,将溴化介质悬浮于N,N’-二甲基甲酰胺与水的混合溶液中,N,N’-二甲基甲酰胺与水的体积比为1:1。
所述步骤3中,悬浮液中加入量以每毫升介质计:单体甲基丙烯酸缩水甘油酯量为0.15-1.5mmol/mL介质;溴化亚铜加入量为0.02-0.06mmol/mL介质;溴化亚铜、溴化铜与联吡啶的摩尔比为1:0.1:5。
按上述方法所得介质的溴化密度为1-40mmol/L,接枝密度呈现梯度变化;介质的离子交换容量为140-550mmol/L;同一接枝密度的介质离子交换容量各不相同,即同一接枝密度的介质接枝链长不同。
本发明得到的甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝二乙胺修饰的以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质应用于蛋白质分离纯化中,提升蛋白质的静态吸附容量和动态吸附容量。
本发明的关键技术有三点:首先,α-溴异丁酰溴用量的选择,得到接枝密度呈现明显梯度变化的介质;其次,单体甲基丙烯酸缩水甘油酯用量的控制,从而获得在同一接枝密度下不同链长的介质;最后,二乙胺浓度和用量的确定,以保证接枝的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯上的环氧基被充分修饰。
本发明的优点:经实验证明,通过调节甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝二乙胺修饰型介质的接枝密度和接枝链长,可以获得高吸附容量的新型色谱介质。介质清洗、除菌方便,易于再生,生物相容性好,制备方法简单,接枝条件可调节,在蛋白质高效分离纯化中将有广阔的应用前景。
附图说明
图1为以本发明实施例1、2所制备的接枝型阴离子交换色谱介质在20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)中对牛血清蛋白的吸附等温线。
图2为以本发明实施例3、4所制备的接枝型阴离子交换色谱介质在20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)中对牛血清蛋白的吸附等温线。
图3为以本发明实施例5、6所制备的接枝型阴离子交换色谱介质在20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)中对牛血清蛋白的吸附等温线。
图4为以本发明实施例7-9所制备的接枝型阴离子交换色谱介质在20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)中对牛血清蛋白的吸附等温线。
图5为以本发明实施例3所制备的接枝型阴离子交换色谱介质在含有不同浓度氯化钠(0、0.02、0.05、0.1、0.2mol/L)的20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)中对牛血清蛋白的动态吸附容量。
具体实施方式
下面的实例将对本发明的方法予以进一步的说明。
概述方法如下:
1)介质的溴化反应
将平均粒径为50-120μm的琼脂糖凝胶多孔介质,依次用3-5种具有一定浓度梯度的N,N’-二甲基甲酰胺与水的混合溶液浸泡(例如N,N’-二甲基甲酰胺的体积分数分别为25%、50%、75%和99.9%的4种混合溶液),将孔内溶剂置换为N,N’-二甲基甲酰胺,然后将介质放入带有搅拌桨的反应器中,并加入N,N’-二甲基甲酰胺形成介质的悬浮液,N,N’-二甲基甲酰胺的体积用量为介质体积的5-8倍,继而向悬浮液中加入体积用量为介质体积0.2-0.5倍的三乙胺,混合均匀,在冰浴条件下向混合悬浮液中逐滴加入体积用量为介质体积0.025-0.33倍的α-溴异丁酰溴,置于25-40℃的恒温水浴中反应10-16h,之后依次用N,N’-二甲基甲酰胺、乙醇和大量去离子水清洗介质,得到溴化介质;
2)介质的ATRP接枝反应
将上述溴化介质悬浮于N,N’-二甲基甲酰胺与水的混合溶液中,其中N,N’-二甲基甲酰胺与水的体积比为1:1,混合溶液的体积用量为溴化介质体积的6-8倍。再向该悬浮液中加入单体甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)(0.15-1.5mmol/mL介质)、溴化铜(0.002-0.006mmol/mL介质)、2,2’-联吡啶(0.1-0.3mmol/mL介质),通氮气除氧30min,再向悬浮液中加入溴化亚铜(0.02-0.06mmol/mL介质),继续通氮气,反应60-120min。将反应液暴露于空气中使溴化亚铜被氧化以终止反应,用0.1mol/LEDTA清洗除去铜离子,之后用乙醇和大量去离子水清洗介质,得到GMA接枝介质;
3)介质的胺基化修饰反应
将GMA接枝介质置于体积分数为20%二乙胺(DEA)水溶液中,体积用量为接枝介质体积的7-12倍,20-30℃,170rpm反应5-12h,使接枝链上的环氧基被DEA充分修饰,用去离子水反复冲洗,直到清洗液用酚酞检测不变色,得到聚合物接枝的阴离子交换介质。
实施例1
取一定量SepharoseFF(平均粒径约为90μm)在G3漏斗用大量去离子水清洗,抽干后,依次用25%、50%、75%和99.9%的N,N’-二甲基甲酰胺浸泡,抽干后称取6.0g置于100mL三口烧瓶中,依次加入30mLN,N’-二甲基甲酰胺,1.2mL三乙胺,混匀,在冰浴条件下逐滴加入0.15mLα-溴异丁酰溴(用5mLN,N’-二甲基甲酰胺稀释),继而置于25℃的恒温水浴中反应10h。反应结束后用N,N’-二甲基甲酰胺、无水乙醇和去离子水依次清洗,得到溴化介质。溴化介质中溴的含量为1.14mmol/L。
将6.0g溴化介质置于42mL体积比为1:1的N,N’-二甲基甲酰胺和水的混合溶液中,向其中加入0.3mL(2.28mmol)甲基丙烯酸缩水甘油酯,187.4mg(1.2mmol)2,2’-联吡啶,5.4mg(0.024mmol)溴化铜,充分混匀后通氮气除氧30min,在氮气保护下加入34.5mg(0.24mmol)溴化亚铜,继续通氮气,反应90min。将反应液暴露于空气中,反应终止。介质用G3漏斗抽干后,用0.1mol/LEDTA清洗除去铜离子,然后用无水乙醇和去离子水依次清洗,得到甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝介质。
将6.0g甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝介质置于55mL体积分数为20%二乙胺水溶液中,25℃,170rpm反应9h使GMA接枝链上的环氧基被二乙胺(DEA)充分修饰,用去离子水反复冲洗,直到清洗液用酚酞检测不变色,得到阴离子交换介质,离子交换容量为146mmol/L。
实施例2
取一定量SepharoseFF(平均粒径约为90μm)在G3漏斗用大量去离子水清洗,抽干后,依次用25%、50%、75%和99.9%的N,N’-二甲基甲酰胺浸泡,抽干后称取6.0g置于100mL三口烧瓶中,依次加入30mLN,N’-二甲基甲酰胺,1.2mL三乙胺,混匀,在冰浴条件下逐滴加入0.15mLα-溴异丁酰溴(用5mLN,N’-二甲基甲酰胺稀释),继而置于25℃的恒温水浴中反应10h。反应结束后用N,N’-二甲基甲酰胺、无水乙醇和去离子水依次清洗,得到溴化介质。溴化介质中溴的含量为1.14mmol/L。
将6.0g溴化介质置于48mL体积比为1:1的N,N’-二甲基甲酰胺和水的混合溶液中,向其中加入0.45mL(3.42mmol)甲基丙烯酸缩水甘油酯,281.2mg(1.8mmol)2,2’-联吡啶,8.0mg(0.036mmol)溴化铜,充分混匀后通氮气除氧30min,在氮气保护下加入51.6mg(0.36mmol)溴化亚铜,继续通氮气,反应120min。将反应液暴露于空气中,反应终止。介质用G3漏斗抽干后,用0.1mol/LEDTA清洗除去铜离子,然后用无水乙醇和去离子水依次清洗,得到甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝介质。
将6.0g甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝介质置于70mL体积分数为20%二乙胺水溶液中,30℃,170rpm反应12h使GMA接枝链上的环氧基被二乙胺(DEA)充分修饰,用去离子水反复冲洗,直到清洗液用酚酞检测不变色,得到阴离子交换介质,离子交换容量为315mmol/L。
实施例3
取一定量SepharoseFF(平均粒径约为90μm)在G3漏斗用大量去离子水清洗,抽干后,依次用25%、50%、75%和99.9%的N,N’-二甲基甲酰胺浸泡,抽干后称取6.0g置于100mL三口烧瓶中,依次加入36mLN,N’-二甲基甲酰胺,1.8mL三乙胺,混匀,在冰浴条件下逐滴加入0.4mLα-溴异丁酰溴(用5mLN,N’-二甲基甲酰胺稀释),继而置于30℃的恒温水浴中反应12h。反应结束后用N,N’-二甲基甲酰胺、无水乙醇和去离子水依次清洗,得到溴化介质。溴化介质中溴的含量为5.19mmol/L。
将6.0g溴化介质置于42mL体积比为1:1的N,N’-二甲基甲酰胺和水的混合溶液中,向其中加入0.3mL(2.28mmol)甲基丙烯酸缩水甘油酯,187.4mg(1.2mmol)2,2’-联吡啶,5.4mg(0.024mmol)溴化铜,充分混匀后通氮气除氧30min,在氮气保护下加入34.5mg(0.24mmol)溴化亚铜,继续通氮气,反应90min。将反应液暴露于空气中,反应终止。介质用G3漏斗抽干后,用0.1mol/LEDTA清洗除去铜离子,然后用无水乙醇和去离子水依次清洗,得到甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝介质。
将6.0g甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝介质置于55mL体积分数为20%二乙胺水溶液中,25℃,170rpm反应9h使GMA接枝链上的环氧基被二乙胺(DEA)充分修饰,用去离子水反复冲洗,直到清洗液用酚酞检测不变色,得到阴离子交换介质,离子交换容量为330mmol/L。
实施例4
取一定量SepharoseFF(平均粒径约为90μm)在G3漏斗用大量去离子水清洗,抽干后,依次用25%、50%、75%和99.9%的N,N’-二甲基甲酰胺浸泡,抽干后称取6.0g置于100mL三口烧瓶中,依次加入36mLN,N’-二甲基甲酰胺,1.8mL三乙胺,混匀,在冰浴条件下逐滴加入0.4mLα-溴异丁酰溴(用5mLN,N’-二甲基甲酰胺稀释),继而置于30℃的恒温水浴中反应12h。反应结束后用N,N’-二甲基甲酰胺、无水乙醇和去离子水依次清洗,得到溴化介质。溴化介质中溴的含量为5.19mmol/L。
将6.0g溴化介质置于48mL体积比为1:1的N,N’-二甲基甲酰胺和水的混合溶液中,向其中加入0.45mL(3.42mmol)甲基丙烯酸缩水甘油酯,281.2mg(1.8mmol)2,2’-联吡啶,8.0mg(0.036mmol)溴化铜,充分混匀后通氮气除氧30min,在氮气保护下加入51.6mg(0.36mmol)溴化亚铜,继续通氮气,反应120min。将反应液暴露于空气中,反应终止。介质用G3漏斗抽干后,用0.1mol/LEDTA清洗除去铜离子,然后用无水乙醇和去离子水依次清洗,得到甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝介质。
将6.0g甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝介质置于70mL体积分数为20%二乙胺水溶液中,30℃,170rpm反应12h使GMA接枝链上的环氧基被二乙胺(DEA)充分修饰,用去离子水反复冲洗,直到清洗液用酚酞检测不变色,得到阴离子交换介质,离子交换容量为511mmol/L。
实施例5
取一定量SepharoseFF(平均粒径约为90μm)在G3漏斗用大量去离子水清洗,抽干后,依次用25%、50%、75%和99.9%的N,N’-二甲基甲酰胺浸泡,抽干后称取6.0g置于100mL三口烧瓶中,依次加入42mLN,N’-二甲基甲酰胺,2.4mL三乙胺,混匀,在冰浴条件下逐滴加入0.64mLα-溴异丁酰溴(用5mLN,N’-二甲基甲酰胺稀释),继而置于35℃的恒温水浴中反应14h。反应结束后用N,N’-二甲基甲酰胺、无水乙醇和去离子水依次清洗,得到溴化介质。溴化介质中溴的含量为12.17mmol/L。
将6.0g溴化介质置于42mL体积比为1:1的N,N’-二甲基甲酰胺和水的混合溶液中,向其中加入0.3mL(2.28mmol)甲基丙烯酸缩水甘油酯,187.4mg(1.2mmol)2,2’-联吡啶,5.4mg(0.024mmol)溴化铜,充分混匀后通氮气除氧30min,在氮气保护下加入34.5mg(0.24mmol)溴化亚铜,继续通氮气,反应90min。将反应液暴露于空气中,反应终止。介质用G3漏斗抽干后,用0.1mol/LEDTA清洗除去铜离子,然后用无水乙醇和去离子水依次清洗,得到甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝介质。
将6.0g甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝介质置于55mL体积分数为20%二乙胺水溶液中,25℃,170rpm反应9h使GMA接枝链上的环氧基被二乙胺(DEA)充分修饰,用去离子水反复冲洗,直到清洗液用酚酞检测不变色,得到阴离子交换介质,离子交换容量为355mmol/L。
实施例6
取一定量SepharoseFF(平均粒径约为90μm)在G3漏斗用大量去离子水清洗,抽干后,依次用25%、50%、75%和99.9%的N,N’-二甲基甲酰胺浸泡,抽干后称取6.0g置于100mL三口烧瓶中,依次加入42mLN,N’-二甲基甲酰胺,2.4mL三乙胺,混匀,在冰浴条件下逐滴加入0.64mLα-溴异丁酰溴(用5mLN,N’-二甲基甲酰胺稀释),继而置于35℃的恒温水浴中反应14h。反应结束后用N,N’-二甲基甲酰胺、无水乙醇和去离子水依次清洗,得到溴化介质。溴化介质中溴的含量为12.17mmol/L。
将6.0g溴化介质置于48mL体积比为1:1的N,N’-二甲基甲酰胺和水的混合溶液中,向其中加入0.45mL(3.42mmol)甲基丙烯酸缩水甘油酯,281.2mg(1.8mmol)2,2’-联吡啶,8.0mg(0.036mmol)溴化铜,充分混匀后通氮气除氧30min,在氮气保护下加入51.6mg(0.36mmol)溴化亚铜,继续通氮气,反应120min。将反应液暴露于空气中,反应终止。介质用G3漏斗抽干后,用0.1mol/LEDTA清洗除去铜离子,然后用无水乙醇和去离子水依次清洗,得到甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝介质。
将6.0g甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝介质置于70mL体积分数为20%二乙胺水溶液中,30℃,170rpm反应12h使GMA接枝链上的环氧基被二乙胺(DEA)充分修饰,用去离子水反复冲洗,直到清洗液用酚酞检测不变色,得到阴离子交换介质,离子交换容量为543mmol/L。
实施例7
取一定量SepharoseFF(平均粒径约为90μm)在G3漏斗用大量去离子水清洗,抽干后,依次用25%、50%、75%和99.9%的N,N’-二甲基甲酰胺浸泡,抽干后称取6.0g置于100mL三口烧瓶中,依次加入50mLN,N’-二甲基甲酰胺,3.0mL三乙胺,混匀,在冰浴条件下逐滴加入2mLα-溴异丁酰溴(用5mLN,N’-二甲基甲酰胺稀释),继而置于40℃的恒温水浴中反应16h。反应结束后用N,N’-二甲基甲酰胺、无水乙醇和去离子水依次清洗,得到溴化介质。溴化介质中溴的含量为36.07mmol/L。
将6.0g溴化介质置于36mL体积比为1:1的N,N’-二甲基甲酰胺和水的混合溶液中,向其中加入0.2mL(1.52mmol)甲基丙烯酸缩水甘油酯,93.7mg(0.6mmol)2,2’-联吡啶,2.7mg(0.012mmol)溴化铜,充分混匀后通氮气除氧30min,在氮气保护下加入17.2mg(0.12mmol)溴化亚铜,继续通氮气,反应60min。将反应液暴露于空气中,反应终止。介质用G3漏斗抽干后,用0.1mol/LEDTA清洗除去铜离子,然后用无水乙醇和去离子水依次清洗,得到甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝介质。
将6.0g甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝介质置于40mL体积分数为20%二乙胺水溶液中,20℃,170rpm反应5h使GMA接枝链上的环氧基被二乙胺(DEA)充分修饰,用去离子水反复冲洗,直到清洗液用酚酞检测不变色,得到阴离子交换介质,离子交换容量为232mmol/L。
实施例8
取一定量SepharoseFF(平均粒径约为90μm)在G3漏斗用大量去离子水清洗,抽干后,依次用25%、50%、75%和99.9%的N,N’-二甲基甲酰胺浸泡,抽干后称取6.0g置于100mL三口烧瓶中,依次加入50mLN,N’-二甲基甲酰胺,3.0mL三乙胺,混匀,在冰浴条件下逐滴加入2mLα-溴异丁酰溴(用5mLN,N’-二甲基甲酰胺稀释),继而置于40℃的恒温水浴中反应16h。反应结束后用N,N’-二甲基甲酰胺、无水乙醇和去离子水依次清洗,得到溴化介质。溴化介质中溴的含量为36.07mmol/L。
将6.0g溴化介质置于42mL体积比为1:1的N,N’-二甲基甲酰胺和水的混合溶液中,向其中加入0.3mL(2.28mmol)甲基丙烯酸缩水甘油酯,187.4mg(1.2mmol)2,2’-联吡啶,5.4mg(0.024mmol)溴化铜,充分混匀后通氮气除氧30min,在氮气保护下加入34.5mg(0.24mmol)溴化亚铜,继续通氮气,反应90min。将反应液暴露于空气中,反应终止。介质用G3漏斗抽干后,用0.1mol/LEDTA清洗除去铜离子,然后用无水乙醇和去离子水依次清洗,得到甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝介质。
将6.0g甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝介质置于55mL体积分数为20%二乙胺水溶液中,25℃,170rpm反应9h使GMA接枝链上的环氧基被二乙胺(DEA)充分修饰,用去离子水反复冲洗,直到清洗液用酚酞检测不变色,得到阴离子交换介质,离子交换容量为391mmol/L。
实施例9
取一定量SepharoseFF(平均粒径约为90μm)在G3漏斗用大量去离子水清洗,抽干后,依次用25%、50%、75%和99.9%的N,N’-二甲基甲酰胺浸泡,抽干后称取6.0g置于100mL三口烧瓶中,依次加入50mLN,N’-二甲基甲酰胺,3.0mL三乙胺,混匀,在冰浴条件下逐滴加入2mLα-溴异丁酰溴(用5mLN,N’-二甲基甲酰胺稀释),继而置于40℃的恒温水浴中反应16h。反应结束后用N,N’-二甲基甲酰胺、无水乙醇和去离子水依次清洗,得到溴化介质。溴化介质中溴的含量为36.07mmol/L。
将6.0g溴化介质置于48mL体积比为1:1的N,N’-二甲基甲酰胺和水的混合溶液中,向其中加入0.45mL(3.42mmol)甲基丙烯酸缩水甘油酯,281.2mg(1.8mmol)2,2’-联吡啶,8.0mg(0.036mmol)溴化铜,充分混匀后通氮气除氧30min,在氮气保护下加入51.6mg(0.36mmol)溴化亚铜,继续通氮气,反应120min。将反应液暴露于空气中,反应终止。介质用G3漏斗抽干后,用0.1mol/LEDTA清洗除去铜离子,然后用无水乙醇和去离子水依次清洗,得到甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝介质。
将6.0g甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝介质置于70mL体积分数为20%二乙胺水溶液中,30℃,170rpm反应12h使GMA接枝链上的环氧基被二乙胺(DEA)充分修饰,用去离子水反复冲洗,直到清洗液用酚酞检测不变色,得到阴离子交换介质,离子交换容量为474mmol/L。
实施例10:不同的介质对牛血清白蛋白的静态吸附实验
将实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9中甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝二乙胺修饰的介质分别用20mmol/LTris–HCl缓冲液(pH8.0)平衡后,再将G3漏斗抽干的0.05g平衡后介质分别加入到5mL用平衡缓冲液配制的不同浓度的牛血清白蛋白中,上述介质悬浮液置于25℃,170rpm恒温水浴震荡24h后,离心收集上清液在280nm下测吸光值,通过物料衡算确定蛋白质在介质上的吸附量。
实施例中获得的介质分别对牛血清白蛋白的静态饱和吸附容量如表1所示。相应的吸附等温线如图1-4所示。
由结果可知,实施例中不同接枝密度(溴含量)和接枝链长(离子交换容量)的共9种介质均出现较高的静态吸附容量,即在较宽的接枝密度和链长范围内对蛋白质吸附容量均达到180mg/mL以上。其中,实施例3中介质对牛血清白蛋白的饱和吸附容量可高达264mg/mL。在相同的实验条件下,商品化介质QSepharoseFF和DEAESepharoseFF的吸附容量均接近130mg/mL。这说明在合适的接枝密度和链长度条件下,GMA接枝DEA修饰介质明显提高了蛋白质的吸附容量。
表1不同介质对牛血清白蛋白的吸附容量
实施例11:
将取1.0mL实施例3中的阴离子交换介质装填于TricornTM5/50色谱柱中,分别用含有不同浓度氯化钠(0、0.02、0.05、0.1、0.2mol/L)的20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡后,以迎头分析模式上样考察牛血清白蛋白的动态吸附容量(在10%穿透点下计算的动态吸附量)。
实施例3所制备的接枝型阴离子色谱介质在不同氯化钠浓度下对牛血清蛋白的动态吸附容量如图5所示。
结果显示,实施例3所制备的接枝型阴离子色谱介质对牛血清蛋白的动态吸附容量随盐浓度的增加先增加后缓慢下降。在氯化钠浓度为0.05mol/L的缓冲液条件下,动态吸附容量(DBC)达到最大值,为90mg/mL柱体积。相同条件下,商品化介质QSepharoseFF的DBC约为50mg/mL。由此可知,优化合成即接枝密度和接枝链长合适的接枝型介质具有较高的动态吸附容量。
本发明提出的甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝二乙胺修饰琼脂糖凝胶色谱介质及制备方法与应用;在琼脂糖凝胶介质表面接枝单体化合物甲基丙烯酰缩水甘油酯并修饰二乙胺合成的色谱介质在提高蛋白质静态吸附容量和动态吸附容量的应用,已通过现场较佳实验例进行了描述,相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合,来实现本发明技术。特别需要指出的是,所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
Claims (7)
1.一种甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝二乙胺修饰琼脂糖凝胶色谱介质,其特征是该色谱介质是在琼脂糖凝胶多孔介质表面接枝带有活性环氧基的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯长链,然后修饰二乙胺获得阴离子交换色谱介质。
2.按权利要求1所述的色谱介质,其特征在于接枝链的重复单元为二乙胺修饰的甲基丙烯酸缩水甘油酯。
3.制备权利要求1所述的色谱介质的方法,其特征在于包括以下过程:
1)介质的溴化反应
将平均粒径为50-120μm的琼脂糖凝胶多孔介质经溶剂替换再悬浮于N,N’-二甲基甲酰胺溶液中,N,N’-二甲基甲酰胺的体积用量为介质体积的5-8倍,继而向悬浮液中加入体积用量为介质体积0.2-0.5倍的三乙胺混合,在冰浴条件下向混合悬浮液中滴加入体积用量为介质体积0.025-0.33倍的α-溴异丁酰溴,置于25-40℃的恒温水浴中反应10-16h,之后依次用N,N’-二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水清洗介质,得到溴化介质;
2)介质的ATRP接枝反应
将溴化介质悬浮于N,N’-二甲基甲酰胺与水的混合溶液中,混合溶液的体积用量为溴化介质体积的6-8倍;再向该悬浮液中加入单体甲基丙烯酸缩水甘油酯、溴化铜和2,2’-联吡啶,通氮气除氧,再向悬浮液中加入溴化亚铜,继续通氮气,反应60-120min;将反应液暴露于空气中使溴化亚铜被氧化以终止反应,用EDTA清洗除去铜离子,用乙醇和大量去离子水清洗介质,得到GMA接枝介质;
3)介质的胺基化修饰反应
将GMA接枝介质置于20%二乙胺水溶液中,体积用量为接枝介质体积的7-12倍,20-30℃,170rpm反应5-12h,使接枝链上的环氧基被DEA充分修饰,用去离子水反复冲洗,直到清洗液用酚酞检测不变色,得到聚合物接枝型阴离子交换介质。
4.如权利要求4所述的方法,其特征是步骤2中溴化介质悬浮于N,N’-二甲基甲酰胺与水的混合溶液中,N,N’-二甲基甲酰胺与水的体积比为1:1。
5.如权利要求4所述的方法,其特征是步骤3中悬浮液中加入量以每毫升介质计:单体甲基丙烯酸缩水甘油酯量为0.15-1.5mmol/mL介质;溴化亚铜加入量为0.02-0.06mmol/mL介质;溴化亚铜、溴化铜与联吡啶的摩尔比为1:0.1:5。
6.如权利要求2所述的色谱介质,其特征是介质的溴化密度为1-40mmol/L,接枝密度呈现梯度变化;介质的离子交换容量为140-550mmol/L;同一接枝密度的介质离子交换容量各不相同,即同一接枝密度的介质接枝链长不同。
7.权利要求3的甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝二乙胺修饰的以琼脂糖凝胶为基础的色谱介质应用于蛋白质分离纯化中,提升蛋白质的静态吸附容量和动态吸附容量。
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