CN105056914A - 一种链结构可控聚合物接枝的高容量琼脂糖色谱介质及制备方法 - Google Patents
一种链结构可控聚合物接枝的高容量琼脂糖色谱介质及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种链结构可控聚合物接枝的高容量琼脂糖色谱介质及其制备方法,该色谱介质是在平均粒径介于30–300μm且表面偶联引发剂α-溴异丁酰溴的琼脂糖凝胶粒子内通过原子转移自由基聚合单体化合物,制备得到链结构可控聚合物接枝的高容量琼脂糖离子交换色谱介质。本发明聚合物链长通过单体化合物用量加以调控、介于4–25nm之间并表现为离子交换容量的高低;溶菌酶的饱和吸附容量超过410mg/mL,在10%穿透条件下DBC接近200mg/mL;色谱介质表现出良好的无机盐耐受性,在氯化钠浓度为0.2mol/L时溶菌酶的饱和吸附容量仍维持在150mg/mL以上,适合于大规模的生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种链结构可控聚合物接枝的高容量琼脂糖色谱介质及其制备方法,属于生物技术领域的蛋白质色谱技术。
背景技术
色谱介质是蛋白质色谱技术的材料基础,色谱介质的蛋白结合容量是评价其性能的核心指标。在过去的三十年中,以基因工程蛋白质药物为代表的生物医药技术取得了长足的发展,细胞培养和微生物发酵的生产规模和产能大幅提高;而与此相对应的是,下游加工技术的处理能力严重滞后。以离子交换色谱介质为例,蛋白质的动态结合容量(dynamicbindingcapacity,DBC)仍旧不足100mg/mL。离子交换色谱介质结合容量已经成为蛋白质色谱过程高效化的“瓶颈”。
离子交换色谱中,蛋白质DBC往往受限于蛋白质分子在色谱介质内的传质速率。为了促进蛋白质分子在色谱介质内传质,研究人员先后开发了具有穿透孔和扩散孔两类孔道结构的灌注色谱介质【申请号:US5019270】、液固联合致孔的高容量超大孔琼脂糖色谱介质【公开号:CN1472002A】以及整体柱色谱材料【公开号:CN101464439A】等。但DBC不仅取决于蛋白质孔内传质速率,更以饱和吸附容量为上限。因此,提高蛋白质饱和吸附容量是开发高容量色谱介质的根本途径。
蛋白质饱和吸附容量通常取决于色谱介质的表面积。充分利用色谱介质孔道空间而非仅仅孔道表面无疑是获得高蛋白质饱和吸附容量的必然选择。1994年,Horvath等人报道了孔道内填充聚丙烯酰胺凝胶的刚性聚苯乙烯-硅胶杂化微球Hyper色谱介质分离蛋白质的研究【JournalofChromatographyA,1994,679:11】,其特征在于灌注于孔道内的聚丙烯酰胺凝胶构成的立体“脚手架”结构均布于整个孔道空间。结果表明,Hyper色谱动态结合容量甚至较灌注色谱介质的动态结合容量成倍提高。默克公司公开了一种聚合物接枝的FractogelTMEMD色谱介质,其技术特征是铈(IV)离子催化载体内含羟基的孔道表面上共聚生成聚合物分子【公开号:CN1036516A】。但后续的研究则显示,这种接枝方法对离子交换色谱介质DBC和蛋白质孔内传质速率无明显改善【JournalofChromatographyA,2006,1118:168】。此后,法玛西亚公司(现属通用医疗集团)开发了葡聚糖接枝的琼脂糖离子交换色谱介质Sepharose其主要特征在于将10~40k乃至更大分子量的葡聚糖分子直接接枝于琼脂糖载体上,继而偶联离子交换配基获得葡聚糖接枝离子交换色谱介质【JournalofChromatographyA,2011,1218:8748】。上述色谱介质的溶菌酶和抗体饱和吸附容量分别达到了350和300mg/mL【JournalofChromatographyA,2009,1216:7774】。余林玲和孙彦近期报道了聚乙烯亚胺接枝琼脂糖离子交换色谱介质的制备方法,其特征在于将带电的聚乙烯亚胺直接接枝于Sepharose介质表面。该介质的牛血清白蛋白饱和吸附容量可达274mg/mL【JournalofChromatographyA,2013,1305:76.】。但上述聚合物接枝色谱介质存在着一些共同的缺陷:(1)聚合物接枝量有限:鉴于葡聚糖、聚乙烯亚胺等聚合物分子的空间位阻作用,聚合物的接枝量有限,葡聚糖接枝琼脂糖离子交换色谱介质的离子交换容量较低;(2)接枝过程不可控:聚合物分子的接枝为多位点结合,接枝聚合物分子形态难以控制;(3)孔道结构不可预测:接枝的孔道结构更加复杂,蛋白质的传质机制不清。
针对聚合物接枝色谱介质的上述问题,发展链结构规整、聚合物链可控的琼脂糖离子交换色谱介质成为当务之急。本发明利用原子转移自由基聚合(ATRP)技术在琼脂糖色谱介质表面接枝单体化合物制备得到链结构可控聚合物接枝的高容量琼脂糖离子交换色谱介质。合成的链结构可控聚合物接枝琼脂糖离子交换色谱介质具有聚合物链结构规整、链长和链密度可控,合成步骤简单、条件温和、操作简便、放大容易,介质性能稳定,介质的离子交换容量、蛋白质饱和吸附容量和动态结合容量高等特点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种链结构可控聚合物接枝的高容量琼脂糖离子交换色谱介质及其制备方法。所述的聚合物接枝琼脂糖离子交换色谱介质具有聚合物链结构规整、聚合物链长和链密度可控、离子交换容量大、饱和吸附容量及动态结合容量高、合成步骤简单、合成条件温和等特点。
本发明是通过下述技术方案加以实现的。一种用于蛋白质分离纯化的链结构可控聚合物接枝琼脂糖离子交换色谱介质,其特征在于,该色谱介质是在平均粒径介于30–300μm且表面偶联引发剂α-溴异丁酰溴的琼脂糖凝胶粒子内通过原子转移自由基聚合单体化合物,制备得到链结构可控聚合物接枝的高容量琼脂糖离子交换色谱介质。
上述的链结构可控聚合物接枝的高容量琼脂糖色谱介质的制备方法,步骤如下:
(1)在琼脂糖色谱介质上偶联引发剂α-溴异丁酰溴的介质溴化过程;
(2)通过原子转移自由基聚合引发单体化合物在介质表面聚合反应,得到聚合物接枝琼脂糖离子交换色谱介质的合成过程。
所述的单体化合物是一端含酸性基团或其衍生物以及另一末端为丙烯酰基或甲基丙烯酸基的化合物分子。
所述的单体化合物优选自2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸、甲基丙烯酸3-磺酸丙酯或β-(丙烯酰氧)丙酸一种。
所述的介质溴化过程,其特征是平均粒径介于30–300μm的琼脂糖凝胶粒子经溶剂替换再悬浮于N,N’-二甲基甲酰胺溶液中,向悬浮液中加入三乙胺并混合均匀后置于冰水浴中冷却;在冰水浴条件下向悬浮液中滴加α-溴异丁酰溴;滴加结束后,转移至室温下反应,得到链密度介于10–100μmol/g湿粒子的溴化凝胶粒子;溴化凝胶粒子产物依次经N,N’-二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水清洗后,用于后续的色谱介质合成反应。
所述的介质溴化过程,其特征是N,N’-二甲基甲酰胺的体积用量为2–7mL/g湿粒子,三乙胺的体积用量为0.06–0.6mL/g湿粒子,α-溴异丁酰溴体积用量为0.05–0.5mL/g湿粒子。
优选的三乙胺的体积用量为0.12–0.36mL/g湿粒子,α-溴异丁酰溴体积用量为0.1–0.3mL/g湿粒子。
所述的色谱介质合成过程,其特征是溴化凝胶粒子悬浮于含有单体化合物、溴化铜和2,2’-联吡啶的甲醇水溶液后,通入氮气除去溶液中氧分子;向悬浮液中加入溴化亚铜并继续通氮气后密封;上述反应物在溴化亚铜、溴化铜和配体2,2’-联吡啶催化作用下于室温无氧环境中反应0.5–24h;最后,反应液暴露于空气中并加入螯合剂除去铜离子;反应产物依次用乙醇和去离子水清洗后,得到链结构可控聚合物接枝的琼脂糖离子交换色谱介质。
所述的色谱介质合成过程,其特征是反应体系中甲醇水溶液体积用量为2–20mL/g湿粒子,溶液中甲醇的体积含量为50–100%,单体化合物加入量为0.5–10.0mmol/g湿粒子,溴化亚铜加入量为0.2mmol/g湿粒子,溴化亚铜、溴化铜与联吡啶的摩尔比为1:0.1:2;。
优选的单体化合物加入量为1.0–4.0mmol/g湿粒子。
所述的色谱介质合成过程,其特征是在溴化亚铜、溴化铜和配体2,2’-联吡啶催化作用下单体化合物聚合是通过原子转移自由基聚合实现的,聚合物链长是可控的。
本发明提供了一种链结构可控聚合物接枝的高容量琼脂糖离子交换色谱介质,该色谱介质具有如下显著的特点:(1)率先在琼脂糖凝胶粒子材料上通过ATRP接枝聚合物分子,获得了链结构可控聚合物接枝的高容量琼脂糖离子交换色谱介质;(2)本发明提供的链结构可控聚合物接枝琼脂糖离子交换色谱介质中,聚合物分子链结构规整、链长及密度可控,聚合物链密度介于10–100μmol/g湿粒子之间并通过α-溴异丁酰溴的体积用量加以调控,聚合物链长通过单体化合物用量加以调控、介于4–25nm之间并表现为离子交换容量的高低;(3)本发明提供的链结构可控聚合物接枝琼脂糖离子交换色谱介质中溶菌酶的饱和吸附容量超过410mg/mL,在10%穿透条件下DBC接近200mg/mL,显著高于现有离子交换色谱介质的性能;(4)本发明提供的链结构可控聚合物接枝琼脂糖离子交换色谱介质表现出良好的无机盐耐受性,在氯化钠浓度为0.2mol/L时溶菌酶的饱和吸附容量仍维持在150mg/mL以上;(5)本发明提供的链结构可控聚合物接枝琼脂糖离子交换色谱介质合成方法简单、条件温和、过程可控、成本较低,适合于大规模的生产。
附图说明
图1为以本发明实施例1–4所制备的聚合物接枝琼脂糖凝胶色谱介质在20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)中对溶菌酶的吸附等温线。图中圆形代表实施例1制备的色谱介质的吸附等温线,正方形代表实施例2制备的色谱介质的吸附等温线,三角形代表实施例3制备的色谱介质的吸附等温线。
图2为以本发明实施例1–3所制备的聚合物接枝琼脂糖凝胶色谱介质在20mmol/LNaAc-HAc缓冲液(pH5.0)中对γ球蛋白的吸附等温线。图中圆形代表实施例1制备的色谱介质的吸附等温线,正方形代表实施例2制备的色谱介质的吸附等温线,三角形代表实施例3制备的色谱介质的吸附等温线。
图3为以本发明实施例1所制备的聚合物接枝琼脂糖凝胶色谱介质在含有不同浓度氯化钠(0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mol/L)的20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)中对溶菌酶的吸附等温线。
图4为以本发明实施例1和2所制备的聚合物接枝琼脂糖凝胶介质在含有不同浓度氯化钠(0、0.05、0.1、0.2mol/L)的20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)中对溶菌酶的动态吸附容量。图中深色柱代表实施例1制备的介质对溶菌酶的动态吸附量;浅色柱代表实施例2制备的介质对溶菌酶的动态吸附量。
具体实施方式
下面的实例将对本发明的方法予以进一步的说明。
实施例1
取一定量平均粒径为90μm的琼脂糖凝胶粒子在砂滤漏斗用去离子水洗净乙醇,抽干后,依次用25%、50%、75%和99.5%的N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)浸泡冲洗,抽干后称取6.0g置于100mL三口烧瓶中,加入42mLDMF形成悬浮液,向悬浮液中加入1.2mL三乙胺,混匀,继而在冰浴条件下向悬浮液中逐滴加入1mLα-溴异丁酰溴(用10mLDMF稀释),升温至30℃反应12小时。反应结束后用DMF、无水乙醇和去离子水依次清洗,得到链密度(溴含量)为33μmol/g的活化介质。
称取1g活化介质置于10mL体积比为1:1的甲醇和水的混合溶液中,向其中加入甲基丙烯酸3-磺酸丙酯钾盐0.49g(2mmol),2,2’-联吡啶62.5mg(0.4mmol),溴化铜4.5mg(0.02mmol),充分混匀后通氮气除氧30分钟,在氮气保护下加入溴化亚铜28.69mg(0.2mmol),继续通氮气30分钟后密封,25℃恒温水浴反应6小时。将反应液暴露于空气中,反应终止。介质用砂滤漏斗抽干后,用0.1mol/LEDTA清洗除去铜离子,然后用无水乙醇和去离子水依次清洗,得到离子交换容量为364mmol/L的聚合物接枝琼脂糖离子交换介质。
实施例2
实施例1中甲基丙烯酸3-磺酸丙酯钾盐加入量0.25g(1mmol),其他条件不变的情况下,得到离子交换容量为209mmol/L的聚合物接枝离子交换色谱介质。
实施例3
实施例1中甲基丙烯酸3-磺酸丙酯钾盐加入量0.99g(4mmol),其他条件不变的情况下,得到离子交换容量为757mmol/L的聚合物接枝离子交换色谱介质。
实施例4
实施例1中DMF的体积用量为12mL,三乙胺加入量0.72mL,α-溴异丁酰溴加入量为0.6mL,其他条件不变的情况下,得到链密度(溴含量)为69μmol/g的活化介质。
合成过程中,甲基丙烯酸3-磺酸丙酯钾盐加入量2.5g(10mmol),得到离子交换容量为628mmol/L的聚合物接枝离子交换色谱介质。
实施例5
取一定量平均粒径为297μm的琼脂糖凝胶粒子在砂滤漏斗用去离子水洗净乙醇,抽干后,依次用25%、50%、75%和99.5%的DMF浸泡冲洗,抽干后称取6.0g置于100mL三口烧瓶中,加入30mLDMF形成悬浮液,向悬浮液中加入2.16mL三乙胺,混匀,继而在冰浴条件下向悬浮液中逐滴加入1.8mLα-溴异丁酰溴(用10mLDMF稀释),升温至室温下反应。反应结束后用DMF、无水乙醇和去离子水依次清洗,得到链密度(溴含量)为83μmol/g的活化介质。
称取1g活化介质置于2mL的甲醇溶液中,向其中加入2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸0.10g(0.5mmol),2,2’-联吡啶62.5mg(0.4mmol),溴化铜4.5mg(0.02mmol),充分混匀后通氮气除氧30分钟,在氮气保护下加入溴化亚铜28.69mg(0.2mmol),继续通氮气30分钟后密封,室温下水浴中反应0.5小时。将反应液暴露于空气中,反应终止。介质用砂滤漏斗抽干后,用0.1mol/LEDTA清洗除去铜离子,然后用无水乙醇和去离子水依次清洗,得到离子交换容量为95mmol/L的聚合物接枝离子交换介质。
实施例6
取一定量平均粒径为30μm的琼脂糖凝胶粒子在砂滤漏斗用去离子水洗净乙醇,抽干后,依次用25%、50%、75%和99.5%的DMF浸泡冲洗,抽干后称取6.0g置于100mL三口烧瓶中,加入36mLDMF形成悬浮液,向悬浮液中加入0.36mL三乙胺,混匀,继而在冰浴条件下向悬浮液中逐滴加入0.3mLα-溴异丁酰溴(用10mLDMF稀释),升温至室温下反应。反应结束后用DMF、无水乙醇和去离子水依次清洗,得到链密度(溴含量)为11μmol/g的活化介质。
称取1g活化介质置于20mL的纯甲醇溶液中,向其中加入β-(丙烯酰氧)丙酸0.47mL(4mmol),2,2’-联吡啶62.5mg(0.4mmol),溴化铜4.5mg(0.02mmol),充分混匀后通氮气除氧30分钟,在氮气保护下加入溴化亚铜28.69mg(0.2mmol),继续通氮气30分钟后密封,室温下水浴中反应12小时。将反应液暴露于空气中,反应终止。介质用砂滤漏斗抽干后,用0.1mol/LEDTA清洗除去铜离子,然后用无水乙醇和去离子水依次清洗,得到离子交换容量为230mmol/L的聚合物接枝离子交换介质。
实施例7
实施例6中DMF的体积用量为42mL,三乙胺加入量为3.6mL,α-溴异丁酰溴加入量为3.0mL,得到链密度(溴含量)为99μmol/g的活化介质。;合成过程中,1g活化介质置于15mL体积比为1.5:1的甲醇和水的混合溶液中,甲基丙烯酸3-磺酸丙酯钾盐加入量0.13g(0.5mmol),其他条件不变的情况下,得到离子交换容量为303mmol/L的聚合物接枝离子交换介质。
实施例8
实施例1-4制备的聚合物接枝琼脂糖离子交换色谱介质,经20mmol/LTris-HCl(pH8.0)缓冲液预平衡12小时,抽干后,准确称取0.05g置于25mL锥形瓶中,加入5mL已知浓度的蛋白质(溶菌酶)溶液中。将锥形瓶置于摇床中,25℃,100转/分钟振荡24小时。取出,4000转/分钟离心5分钟,在280nm下以未加蛋白质的空白缓冲液为参比,测定上清液的吸光值。根据物料恒算,利用标准曲线和质量守恒定律计算得到介质的吸附量。并使用Langmuir模型来描述蛋白的吸附平衡行为。结果显示,溶菌酶的饱和静态吸附容量介于330–413mg/mL湿介质之间(如图1所示)。
实施例9
实施例8中缓冲液改为20mmol/LNaAC-HAC(pH5.0),蛋白质为γ-球蛋白,其他操作不变,结果显示γ-球蛋白的饱和静态吸附量介于30–237mg/g湿介质之间(如图2所示)。
实施例10
实施例1制备的聚合物接枝琼脂糖离子交换介质,分别经含有不同浓度氯化钠(0、0.05、0.1、0.2、0.5mol/L)的20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡后,抽干,准确称取0.05g置于25mL锥形瓶中,加入5mL已知浓度的溶菌酶溶液中。将锥形瓶置于摇床中,25℃,100转/分钟振荡24小时。取出,4000转/分钟离心5分钟,在280nm下以未加蛋白质的空白缓冲液为参比,测定上清液的吸光值。根据物料恒算,利用标准曲线和质量守恒定律计算得到介质的吸附量。并使用Langmuir模型来描述蛋白的吸附平衡行为。结果显示,溶菌酶的静态吸附容量随离子强度的增加而下降(如图3所示)
实施例11
取1.0mL实施例2制备的聚合物接枝来琼脂糖离子交换色谱介质装填与TricornTM5/50色谱柱中,分别用含有不同浓度氯化钠(0、0.05、0.1、0.2mol/L)的20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡后,以迎头分析模式上样考察溶菌酶的动态吸附量(在10%穿透点下计算的动态吸附量)。结果显示,溶菌酶的动态吸附量基于138-192mg/mL柱体积,随离子强度的增加先增加后缓慢下降(如图4所示)。
本发明公开和提出的一种链结构可控聚合物接枝的高容量琼脂糖色谱介质及其制备方法,本领域技术人员可通过借鉴本文内容,适当改变条件路线等环节实现,尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述,相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合,来实现最终的制备技术。特别需要指出的是,所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
Claims (10)
1.一种链结构可控聚合物接枝的高容量琼脂糖色谱介质;其特征是色谱介质是在平均粒径介于30–300μm且表面偶联引发剂α-溴异丁酰溴的琼脂糖凝胶粒子内通过原子转移自由基聚合单体化合物,制备得到链结构可控聚合物接枝的高容量琼脂糖离子交换色谱介质。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征是步骤如下:
(1)在琼脂糖色谱介质上偶联引发剂α-溴异丁酰溴的介质溴化过程;
(2)通过原子转移自由基聚合引发单体化合物在介质表面聚合,得到聚合物接枝琼脂糖离子交换色谱介质的合成过程。
3.如权利要求2所述的方法,其特征是所述的单体化合物是一端含酸性基团或其衍生物以及另一末端为丙烯酰基或甲基丙烯酸基的化合物分子。
4.如权利要求3所述的方法,其特征是所述的所述的单体化合物优选自2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸、甲基丙烯酸3-磺酸丙酯或β-(丙烯酰氧)丙酸一种。
5.如权利要求2所述的方法,其特征是所述的溴化过程是:将平均粒径介于30–300μm的琼脂糖凝胶粒子经溶剂替换再悬浮于N,N’-二甲基甲酰胺溶液中,向悬浮液中加入三乙胺并混合均匀后置于冰水浴中冷却;在冰水浴条件下向悬浮液中滴加α-溴异丁酰溴;滴加结束后,转移至室温下反应,得到链密度介于10–100μmol/g湿粒子的溴化凝胶粒子;溴化凝胶粒子产物依次经N,N’-二甲基甲酰胺、乙醇和去离子水清洗后,用于后续的色谱介质合成反应。
6.如权利要求5所述的方法,其特征是所述的N,N’-二甲基甲酰胺的体积用量为2–7mL/g湿粒子,三乙胺的体积用量为0.06–0.6mL/g湿粒子,α-溴异丁酰溴体积用量为0.05–0.5mL/g湿粒子。
7.如权利要求5所述的方法,其特征是所述的三乙胺的体积用量为0.12–0.36mL/g湿粒子,α-溴异丁酰溴体积用量为0.1–0.3mL/g湿粒子。
8.如权利要求2所述的方法,其特征是所述的色谱介质的合成过程是:溴化凝胶粒子悬浮于含有单体化合物、溴化铜和2,2’-联吡啶的甲醇水溶液后,通入氮气除去溶液中氧分子;向悬浮液中加入溴化亚铜并继续通氮气后密封;上述反应物在溴化亚铜、溴化铜和配体2,2’-联吡啶催化作用下于室温无氧环境中反应0.5–24h;最后,反应液暴露于空气中并加入螯合剂除去铜离子;反应产物依次用乙醇和去离子水清洗后,得到链结构可控聚合物接枝的琼脂糖离子交换色谱介质。
9.如权利要求8所述的方法,其特征是所述的甲醇水溶液体积用量为2–20mL/g湿粒子,溶液中甲醇的体积含量为50–100%,单体化合物加入量为0.5–10.0mmol/g湿粒子,溴化亚铜加入量为0.2mmol/g湿粒子,溴化亚铜、溴化铜与联吡啶的摩尔比为1:0.1:2。
10.如权利要求8所述的方法,其特征是所述的单体化合物加入量为1.0–4.0mmol/g湿粒子。
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