CN109499555A - 一种制备高配基密度的大孔亲和层析介质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高密度亲和配基的亲和层析介质的制备方法,其方法主要包括:1)在溶剂存在条件下,将乙烯基单体通过原子转移自由基聚合的方法引发接枝聚合至聚苯乙烯微球表面及内部孔道表面;2)在一定温度下,将亲和配基偶联至所述步骤1)所得到的微球表面的间隔臂上,得到亲和层析介质。该方法操作简便、反应条件温和,在大孔微球表面接枝聚合物长链作为间隔臂,大大增加了亲和配基的偶联位点,显著提高了亲和配基的密度,从而制备得到高载量的亲和层析介质,在生化分离领域有很大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生化分离介质制备领域,尤其涉及一种大孔聚合物亲和介质的制备方法,特别是针对大孔聚合物类材料的表面偶联亲和配基。
背景技术
亲和层析是生物制药领域中分离纯化生物活性物质的一种重要方法,亲和层析过程中通过介质上的配基与目标分子之间的特异性吸附和解离来实现纯化目标分子的目的,由于这种特异性的作用力,亲和层析具有高度选择性、高活性回收等特点,对分离含量极少又不稳定的生物活性物质极为有效。随着生物技术的快速发展,对疫苗、抗体类药物的需求与日俱增,因此,如何快速高效地得到纯度较高的生物制品一直是具有挑战性的课题。以抗体生产为例,目前单克隆抗体表达量可达30g/L以上,而亲和层析是单克隆抗体生产的重要纯化工艺,常用层析介质为Protein A亲和层析介质。目前商品化亲和层析介质多以琼脂糖为基质,由于其为多糖基质,质地较软、孔径小,而亲和配基往往是较大尺寸的蛋白分子,受孔径的限制,故其配基密度通常比较低(在5-6mg/mL介质以下),最终导致蛋白载量低。又加之琼脂糖基质机械强度差,难以提高流速,综合以上各因素,导致该类介质难以实现快速、高效分离纯化,不能满足日益增长的生产规模对高通量分离的需求。
聚合物微球作为生化分离介质,其优点在于机械强度(耐压可达10MPa)、化学性质稳定、耐受pH范围宽(1-14范围),能够在高压下操作等。尤其对于具有大孔结构的聚合物微球,具有良好的传质性能。大孔微球具有相互贯穿的孔道结构,但由于聚合物本身特性,其表面常表现为疏水性,限制其在生化分离中的应用,为了改善微球表面性能,提高其亲水性,我们已经将微球表面化学镀层了一层亲水性多糖分子(20121009158.X)或者亲水性聚合物(201510061795.4),充分抑制了蛋白等生物大分子在介质表面的非特异性吸附,修饰后的微球仍能保持较好的通透性;在此基础上,将微球表面的羟基进行选择性氧化为醛基,然后再进行偶联亲和配基(201310507901.5),制备得到超大孔亲和层析介质。
但以往的发明专利及文献报道方法中,偶联亲和配基的间隔臂多为小分子,同时由于采用的介质基质为常规孔径(20-100nm平均孔径),故偶联配基的数量受空间及孔径尺寸的限制,导致配基密度通常较低。在应用大孔微球作为基质时,虽然孔径尺寸大,可以为大尺寸的亲和配基提供较好的构象空间,但限于小分子的间隔臂和有限的配基结合位点,同样导致亲和配基偶联量较低,最终蛋白上载量难以提高。
为了解决以往介质亲和配基偶联量少,蛋白载量低的问题,本发明采用“graftfrom”方式在聚合物微球表面接枝偶联长链间隔臂,每条间隔臂上带有多个用以偶联亲和配基的功能基团,然后在每条长链上偶联亲和配基,从而达到增加配基密度的目的。同时选用具有大孔结构的聚苯乙烯微球为基质,优选表面带有苄氯基团的大孔聚苯乙烯微球。本发明显著特点在于1)采用大分子链间隔臂,增加了偶联配基的位点;2)用表面引发单体聚合方式,同时在大孔聚合物微球表面进行,所得间隔臂分布均匀可控;3)使用的基质材料,与传统的多糖基质的亲和介质相比,该介质具有百纳米级的贯通孔,可以对大尺寸生物分子有很好的传质特性,偶联亲和配基后,可以实现快速、高效、高通量的亲和层析过程。
发明内容
基于上述现有技术所存在的问题,本发明提供一种制备高配基密度的大孔聚合物亲和层析介质的方法,特别针对大孔聚苯乙烯类微球,解决传统方法中短链分子间隔臂造成亲和配基偶联量少,导致层析载量小的问题。
为解决上述技术问题,本发明提供一种制备配基密度的亲和层析介质的方法及相应的亲和层析介质,包括如下步骤:
1)在溶剂存在条件下,将乙烯基单体通过原子转移自由基聚合的方法引发接枝聚合至聚苯乙烯微球表面;
2)在一定温度下,将亲和配基偶联至所述步骤1)所得到的材料表面的间隔臂上,得到亲和层析介质。
上述方法步骤1)中,有机溶剂选自:丙酮、乙醇、二氯甲烷、环己醇中的一种或两种混合物,该溶剂所起作用为原子转移自由基聚合(ATRP)提供溶剂环境。
上述方法步骤1)中,所述有机溶剂的质量用量为反应聚合物材料质量的2~3倍。
上述方法步骤1)中,所述乙烯类单体主要为甲基丙烯醛(MALD)、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)中的一种或两种混合物。
上述方法步骤1)中,所述乙烯类单体按质量用量为聚苯乙烯微球质量的1/2~2倍;
所用的催化剂及配体体系由两种组分组成,分别为卤化物和含氮配体,其中,卤化物选自:氯化亚铜、溴化亚铜中的一种或两种混合物;含氮配体选自:2,2-联二吡啶(Bpy)、四甲基乙二胺(TMEDA)、N,N,N,’N,”N,”’-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)和1,1,4,7,10,10’-六甲基三亚乙基四胺(HMETETA)中的一种或多种的混合物。
所述催化剂及配体体系的卤化物作为所用原子转移自由基聚合引发剂,所述卤化物加入比例为所述乙烯类单体摩尔数的1~3%,所述卤化物与所述含氮配体的摩尔比为1:1;
所述接枝聚合反应温度为20~50℃,反应时间为2~10h,接枝反应完毕后,减压抽滤,并用去离子水进行洗涤去除其他可溶杂质。
上述方法步骤2)中,所用的温度为4~20℃,反应时间为5~12h;
上述方法步骤2)中,所用的亲和配基选自Protein A、Protein G中的一种或两种配基的组合物;
上述方法步骤2)中,所用的亲和配基的质量为被偶联材料质量的0.1~1倍;
上述方法步骤2)中,所用的溶剂环境均为pH=7.0的50mM的磷酸缓冲液。
上述材料中,聚苯乙烯微球:聚乙烯基苄氯与二乙烯基苯共聚物材料。
本发明的技术效果为:该方法能显著提高亲和配基密度,同时偶联配基是在大孔聚苯乙烯微球表面及孔道内部,能够使长链间隔臂和大尺寸亲和配基充分伸展,更好的保留亲和选择性;同时,可以长链间隔臂上的偶联位点得以充分利用,与亲和配基有效偶联,制备得到高密度配基的亲和层析介质,满足目前生化分离对快速、高效、高通量的需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域的普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他附图。
图1为本发明实施例一提供的亲和层析介质扫描电镜示意图;
图2为本发明实施例一提供的亲和介质动态蛋白载量测定色谱图
图3为本发明实施例二提供的亲和层析介质扫描电镜示意图;
图4为本发明实施例二提供的亲和介质动态蛋白载量测定色谱图
图5为本发明实施例三提供的亲和层析介质扫描电镜示意图;
图6为本发明实施例三提供的亲和介质动态蛋白载量测定色谱图
图7为本发明实施例四提供的亲和层析介质扫描电镜示意图;
图8为本发明实施例四提供的亲和介质动态蛋白载量测定色谱图
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明的保护范围。
本发明实施例提供一种高载量亲和层析介质的制备方法,该方法是以大孔聚苯乙烯微球为基质,通过两步来实现,具体包括如下步骤:
1)在溶剂存在条件下,将乙烯基单体通过原子转移自由基聚合的方法引发接枝聚合至聚苯乙烯微球表面及内部孔道表面;
2)在一定温度下,将亲和配基偶联至所述步骤1)所得到的微球的间隔臂上,得到亲和层析介质。
优选地,上述方法步骤1)中所述有机溶剂选自丙酮、乙醇、二氯甲烷、环己醇中的一种或两种混合物,其质量用量优选为:微球质量:溶剂质量=1:2~1:3(g/g)。
优选地,上述方法步骤1)中所述的乙烯基单体选自甲基丙烯醛(MALD)、甲基丙烯酸缩水甘油醚(GMA)中的一种或两种混合物,其质量用量与聚苯乙烯微球质量的比值范围为1:2~2:1。
上述方法步骤1)中所述的催化剂及配体体系由两种组分组成,分别为卤化物和含氮配体,其中,卤化物选自:氯化亚铜、溴化亚铜中的一种或两种混合物;含氮配体选自:2,2-联二吡啶(Bpy)、四甲基乙二胺(TMEDA)、N,N,N,’N,”N,”’-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)和1,1,4,7,10,10’-六甲基三亚乙基四胺(HMETETA)中的一种或多种的混合物。
上述方法步骤1)中,原子转移自由基聚合引发剂中的卤化物(如氯化亚铜)的加入比例为所述乙烯基单体摩尔数的1~3%,且所述卤化亚铜和催化剂配体的摩尔比为1:1。
上述方法步骤1)中所述接枝聚合反应温度为20~50℃,反应时间为2~10h,接枝反应完毕后,减压抽滤,并用去离子水进行洗涤,去除其他可溶杂质,然后50℃真空干燥24h,以质量法计算每克接枝后材料的(连接间隔臂后)表面的功能团的数量(偶联亲和配基反应位点数量)计算公式如下:
上述方法步骤2)中,所用的温度为4~20℃,反应时间为5~12h;
上述方法步骤2)中,所用的亲和配基选自Protein A、Protein G中的一种或两种配基的组合物,但不仅限于以上几种亲和配基,凡是带有氨基的亲和配基均可;
上述方法步骤2)中,所用的亲和配基的质量为微球质量的0.1~0.3倍;
上述方法步骤2)中,所用的溶剂环境均为pH=7.0的50mM的磷酸缓冲液。
上述方法步骤2)制备的亲和层析介质的蛋白载量测定按如下方法进行:
动态吸附载量测定:将自制介质装填于色谱柱中,50mM pH 7.0磷酸缓冲液作为平衡缓冲液,pH 3.0的0.1mol/L盐酸-甘氨酸缓冲液作为洗脱液,先用平衡缓冲液将色谱柱平衡至基线平稳,泵头上样蛋白溶液(1mg/mL人Ig G 50mmol/L pH 7.0磷酸缓冲溶液),当穿透曲线高度达到最高点后停止进样,先用平衡缓冲液冲洗色谱柱使色谱曲线回到基线,然后用洗脱液对蛋白进行洗脱。记录5%穿透体积,按下式计算动态载量值(Q5%):
其中C0为人Ig G样品浓度,V5%为5%流穿体积,V为介质体积。
上述方法中,聚苯乙烯微球为交联大孔乙烯基苄氯与二乙烯基苯共聚微球。
本发明的方法通过原子转移自由基聚合的方法,在聚苯乙烯类材料表面接枝聚合物长链间隔臂,该间隔臂具有大量的官能团(与亲和配基反应位点),能够显著提高亲和配基密度,从而提高亲和层析介质的载量。
下面结合具体实施例对本发明的方法及材料作进一步说明。
实施例一
1)大孔PCMS-DVB微球接枝聚甲基丙烯酸缩水甘油酯间隔臂
准确称取PCMS-DVB微球1.0g放入50mL的三口瓶中,然后加入丙酮2mL、0.5g甲基丙烯醛单体,加入催化剂0.07g CuCl(0.7mmol)和0.12g Bpy(0.3mmol)配体,保持温度50℃,在此温度下保持反应2h,反应结束后趁热,用G4砂芯漏斗进行减压抽滤,同时用500mL去离子水进行洗涤至微球无色,50℃下真空干燥24h,称重计算表面醛基含量为9.3mmol/g。
2)连接间隔臂后的微球表面偶联Protein A
将步骤1)制得的微球放入反应釜中,然后向其中加入0.1g Protein A溶于pH=7.0的磷酸缓冲液配制而成的反应液中,摇床中进行震荡反应,4℃反应20h,反应结束后,离心取上清测定溶液中剩余Protein A浓度,计算配基HSA的偶联量为20mg/g干燥微球。用G4砂芯漏斗进行减压抽滤,同时用500mL去离子水进行洗涤。所得介质用电子扫面显微镜观察所得结果如图1所示,可以微球表面仍保留较大的通孔,保持其较好的通透性。图2所示测定其人Ig G动态载量为75mg/mL。
实施例二:
1)大孔PCMS-DVB微球接枝聚甲基丙烯酸缩水甘油酯间隔臂
准确称取PCMS-DVB微球1.0g放入50mL的三口瓶中,然后加入乙醇3mL、2g甲基丙烯酸缩水甘油酯单体,加入催化剂0.08g CuBr(0.6mmol)和0.31g PMDETA(1.8mmol)配体,保持温度20℃,在此温度下保持反应10h,反应结束后用G4砂芯漏斗进行减压抽滤,同时用500mL去离子水进行洗涤至微球无色,50℃下真空干燥24h,称重计算表面环氧基含量为13mmol/g。
2)连接间隔臂后的微球表面偶联Protein G
将步骤1)制得的微球放入反应釜中,然后向其中加入由0.3g Protein G溶于pH=7.0的磷酸缓冲溶液所配制的反应液,于震荡摇床中进行反应,20℃反应2h,反应结束后,离心取上清测定溶液中剩余Protein G浓度,计算配基Protein G的偶联量为60mg/g干燥微球。用G4砂芯漏斗进行减压抽滤,同时用500mL去离子水进行洗涤。所得介质用电子扫面显微镜观察所得结果如图3所示,可以微球表面仍保留较大的通孔,保持其较好的通透性。图4所示测定其人Ig G动态载量为85mg/mL。
实施例三:
1)大孔PCMS-DVB微球接枝聚甲基丙烯酸缩水甘油酯间隔臂
准确称取PCMS-DVB微球1.0g放入50mL的三口瓶中,然后加入二氯甲烷3g、2.0g甲基丙烯酸缩水甘油醚(GMA)单体,加入催化剂0.10g CuBr(0.7mmol)和0.16g四甲基乙二胺(TMEDA,1.4mmol)配体,保持温度35℃,在此温度下保持反应5h,反应结束后趁热,用G4砂芯漏斗进行减压抽滤,同时用500mL去离子水进行洗涤至微球无色,50℃下真空干燥24h,称重计算表面环氧基含量为10mmol/g。
2)连接间隔臂后的微球表面偶联Protein A
将步骤1)制得的微球放入反应釜中,然后向其中加入由0.2g Protein A溶于pH=7.0的磷酸缓冲溶液所配制的反应液,于震荡摇床中进行反应,10℃反应8h,反应结束后,离心取上清测定溶液中剩余Protein A浓度,计算配基Protein A的偶联量为70mg/g干燥微球。用G4砂芯漏斗进行减压抽滤,同时用500mL去离子水进行洗涤。所得介质用电子扫面显微镜观察所得结果如图5所示,可以微球表面仍保留较大的通孔,保持其较好的通透性。图6所示测定其人Ig G动态载量为101mg/mL。
实施例四:
1)大孔PCMS-DVB微球接枝聚甲基丙烯酸缩水甘油酯间隔臂
准确称取PCMS-DVB微球1.0g放入50mL的三口瓶中,然后加入环己醇1.5g、1.2g甲基丙烯酸缩水甘油醚(GMA)单体,加入催化剂0.15g CuBr(1.05mmol)和0.24g 1,1,4,7,10,10’-六甲基三亚乙基四胺(HMETETA,1.05mmol)配体,保持温度30℃,在此温度下保持反应6h,反应结束后趁热,用G4砂芯漏斗进行减压抽滤,同时用乙醇、去离子水各洗涤500mL至微球无色,50℃下真空干燥24h,称重计算表面环氧基含量为9.7mmol/g。
2)连接间隔臂后的微球表面偶联Protein G
将步骤1)制得的微球放入反应釜中,然后向其中加入由0.15g Protein G溶于pH=7.0的磷酸缓冲溶液所配制的反应液,于震荡摇床中进行反应,15℃反应10h,反应结束后,离心取上清测定溶液中剩余Protein G浓度,计算配基Protein G的偶联量为85mg/g干燥微球。用G4砂芯漏斗进行减压抽滤,同时用500mL去离子水进行洗涤。所得介质用电子扫面显微镜观察所得结果如图7所示,可以微球表面仍保留较大的通孔,保持其较好的通透性。图8所示测定其人Ig G动态载量为126mg/mL。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (8)
1.一种配基密度亲和层析介质的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)在溶剂存在条件下,将乙烯基单体通过原子转移自由基聚合的方法引发接枝聚合至聚苯乙烯微球表面及内部孔道表面;
2)在一定温度下,将亲和配基偶联至所述步骤1)所得到的材料表面的长链间隔臂上,得到亲和层析介质。
2.根据权利要求1所述的步骤1)中,其特征在于,所述有机溶剂选自:丙酮、乙醇、二氯甲烷、环己醇中的一种。
3.根据权利要求1所述步骤1)中,所述乙烯基单体选自甲基丙烯醛(MALD)、甲基丙烯酸缩水甘油醚(GMA)中的一种或两种混合物,其质量用量为聚苯乙烯微球质量的1/2~2倍。
4.根据权利要求1所述步骤1)中,所述接枝聚合反应温度为20~50℃,反应时间为2~10h。
5.根据权利要求1所述步骤2)中,所用的温度为4~20℃,反应时间为5~12h。
6.根据权利要求1所述步骤2)中,所用的亲和配基选自Protein A、Protein G中的一种或两种配基的组合物,其质量用量为被偶联材料质量的0.1~0.3倍。
7.根据权利要求1-6所述的聚苯乙烯微球亲和介质其特征在于配基密度高,其范围为20~85mg亲和配基/g干介质。
8.根据权利要求1-7所述的聚苯乙烯微球亲和介质其特征在于对人Ig G动态载量高,其范围在75~126mg IgG/mL湿态介质。
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