CN111569849A - 一种固定化金属螯合层析介质及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固定化金属螯合层析介质及其制备方法与应用，其制备方法包括：将大孔聚合物微球在酸性条件下进行水解处理，然后在功能单体溶液中进行溶胀处理，再将其与引发剂在溶剂中搅拌混合，并在一定pH值和一定温度下进行接枝聚合反应，之后用去离子水洗掉可溶性物质，再放入一定浓度的金属离子溶液中浸泡一定时间，从而得到固定化金属螯合层析介质。本发明不仅制备方法操作简单，对环境要求不苛刻，而且能够有效提高材料表面功能基团数量，提升介质蛋白载量，减少金属离子泄露，使所制得的固定化金属螯合层析介质机械强度高、非特异性吸附少、特异性结合力强、蛋白结合载量高、操作流速快，适合高通量分离纯化生物大分子。
Description
技术领域
本发明涉及大孔聚合物层析介质的表面改性接枝修饰领域，尤其涉及一种固定化金属螯合层析介质及其制备方法与应用。
背景技术
随着生物制药技术的迅猛发展，蛋白类药物愈发增多，其中蛋白质的上游和下游加工是制造蛋白类药物的关键环节。虽然蛋白质的上游加工产量已经大幅提高，但蛋白质的下游加工纯化仍是限速步骤，占产品制造总成本的50％～90％，因此开发高通量、低成本的蛋白质分离纯化方法是当务之急。
固定化金属螯合层析介质是一种高效分离重组蛋白的技术。目前市面上常用的分离基质多以琼脂糖为基质，该类基质具有本身质地软(耐压小于0.3MPa)、孔径尺寸小(30～50nm)等特点，因而在高通量的分离纯化应用中受到一定限制。为了实现高通量的分离纯化，以大孔聚合物微球为基质的大孔聚合物层析介质成为人们的不二选择。大孔聚合物微球具有机械强度高(耐压可达10MPa)、孔径尺寸范围大(20～500nm)的特点，因此可以实现更高操作流速下的分离纯化，大大缩短了操作时间。此外，与其它介质相比，固定化金属螯合层析介质蛋白载量较低，而且金属离子存在泄露问题，泄露的金属离子会对目标蛋白造成污染。
为了解决蛋白载量低这一问题，通常采用增加材料表面功能基团数量的方法。目前普遍应用的方法是在基质表面引入含溴引发剂(如：2-溴异丁酰溴)，然后采用原子转移自由基聚合(ATRP)的方法引发接枝功能单体，进行介质表面改性。该类方法操作过程繁琐，而且在引入引发剂过程中需要无水环境，条件苛刻，每步难以定量控制，故需要加入过量的反应试剂，造成一定量的浪费，提高了制备成本。因此，开发一种操作简便、能够有效提高材料表面功能基团数量的方法来提升介质的蛋白载量，是生化分离纯化领域中急需的技术。
发明内容
针对现有技术中的上述不足之处，本发明提供了一种固定化金属螯合层析介质及其制备方法与应用，不仅制备方法操作简单，对环境要求不苛刻，而且能够有效提高材料表面功能基团数量，提升介质蛋白载量，减少金属离子泄露，使所制得的固定化金属螯合层析介质机械强度高、非特异性吸附少、特异性结合力强、蛋白结合载量高、操作流速快，适合高通量分离纯化生物大分子。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种固定化金属螯合层析介质的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、将大孔聚合物微球在酸性条件下进行水解处理；
步骤2、将步骤1处理后的大孔聚合物微球在功能单体溶液中进行溶胀处理；
步骤3、将引发剂与步骤2处理后的材料在溶剂中搅拌混合，并在一定pH值和一定温度下进行接枝聚合反应，然后用去离子水洗掉可溶性物质；
步骤4、将步骤3处理后的材料放入一定浓度的金属离子溶液中浸泡一定时间，从而得到固定化金属螯合层析介质。
优选地，所述大孔聚合物微球为聚丙烯酸酯类微球或聚苯乙烯类微球，并且该大孔聚合物微球孔径范围为100～3000nm，粒径为20～200μm，机械强度为1.0MPa以上。
优选地，所述将大孔聚合物微球在酸性条件下进行水解处理包括：将大孔聚合物微球放入0.5mol/L稀硫酸中进行密封振荡3～6h，然后取出所述大孔聚合物微球，用去离子水将微球表面及孔道内的硫酸置换出来。
优选地，所述功能单体溶液是采用以下制备方法制得的复合型单体溶液：将配体分子溶解，然后等摩尔比将该溶液加入到甲基丙烯酸缩水甘油酯中，反应温度为40～70℃，搅拌至变成透明均相溶液，从而得到复合型单体溶液；其中，所述配体分子是与环氧基反应后具有螯合过渡金属离子能力的配体分子；所述将配体分子溶解是将含有羧基的配体分子溶解于碱性溶液中，将不含有羧基的配体分子溶解于水中。
优选地，所述将步骤1处理后的大孔聚合物微球放入功能单体溶液中进行溶胀处理包括：将步骤1处理后的大孔聚合物微球放入浓度为0.05～1mmol/mL的功能单体溶液中密封振荡1～4h，使大孔聚合物微球在功能单体溶液中完全溶胀；所述功能单体溶液的体积用量为步骤1处理后的大孔聚合物微球质量的1～10倍。
优选地，所述引发剂为硫酸铈铵、硝酸铈铵中的一种或两种混合物，并且所述引发剂的浓度为0.005～0.25mmol/mL；所述的溶剂为水。
优选地，所述在一定pH值和一定温度下进行接枝聚合反应是在pH值为1～6、反应温度为20～60℃下反应4～16h。
优选地，所述金属离子溶液中的金属离子为Ni2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Fe3+中的一种或两种混合物，并且所述金属离子溶液的浓度为0.05～0.2mol/L；浸泡时间为1～4h。
一种固定化金属螯合层析介质，采用上述的固定化金属螯合层析介质的制备方法制备而成。
一种固定化金属螯合层析介质的应用，将上述的固定化金属螯合层析介质用于生物大分子分离纯化领域。
由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明所提供的固定化金属螯合层析介质的制备方法以孔径范围为100～3000nm，粒径为20～200μm，机械强度为1.0MPa以上的大孔聚合物微球为基质，以甲基丙烯酸缩水甘油酯与配体分子进行键合得到的复合型单体溶液为功能单体溶液，采用氧化还原溶液接枝聚合的方法引发这种复合型单体在大孔聚合物材料表面及内部孔道表面进行接枝聚合，并螯合金属离子，从而能够有效增加材料表面功能基团数量，提高螯合金属离子的数量，提升大孔聚合物微球的蛋白载量，有效减少金属离子泄露。采用这种方法制得的固定化金属螯合层析介质机械强度高、非特异性吸附少、特异性结合力强、蛋白结合载量高、操作流速快，适合高通量分离纯化生物大分子，在快速分离纯化蛋白质领域有很好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。
图1为本发明实施例1所制得的固定化金属螯合层析介质的扫描电子显微镜照片。
图2为本发明实施例2所制得的固定化金属螯合层析介质的扫描电子显微镜照片。
图3为本发明实施例3所制得的固定化金属螯合层析介质的扫描电子显微镜照片。
图4为本发明实施例4所制得的固定化金属螯合层析介质的扫描电子显微镜照片。
图5为本发明实施例5所制得的固定化金属螯合层析介质的扫描电子显微镜照片。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
下面对本发明所提供的固定化金属螯合层析介质及其制备方法与应用进行详细描述。本发明实施例中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
一种固定化金属螯合层析介质的制备方法，可以包括以下步骤：
步骤1、将大孔聚合物微球在酸性条件下进行水解处理。
步骤2、将步骤1处理后的大孔聚合物微球在功能单体溶液中进行溶胀处理。
步骤3、将引发剂与步骤2处理后的材料在溶剂中搅拌混合，并在一定pH值和一定温度下进行接枝聚合反应，然后用去离子水洗掉可溶性物质。
步骤4、将步骤3处理后的材料放入一定浓度的金属离子溶液中浸泡一定时间，从而得到固定化金属螯合层析介质。
具体地，该固定化金属螯合层析介质的制备方法可以包括以下实施方案：
(1)在步骤1中，所述大孔聚合物微球可以为聚丙烯酸酯类微球或聚苯乙烯类微球；所述聚丙烯酸酯类微球可以为聚丙烯酸酯的改性产物、衍生产物或接枝共聚物；所述聚苯乙烯类微球可以为聚苯乙烯的改性产物、衍生产物或接枝共聚物；例如：所述聚丙烯酸酯类微球优选采用甲基丙烯酸缩水甘油酯与乙二醇二甲基丙烯酸酯的共聚微球或者是乙二醇二甲基丙烯酸酯的自聚微球。这类大孔聚合物微球可采用原子转移自由基聚合方法制备而成；这类大孔聚合物微球为多孔且相互连通结构，孔径范围为100～3000nm，粒径为20～200μm，机械强度为1.0MPa以上，比表面积为5～200m2/g，以这种机械强度高、孔径尺寸范围大、流体传质性能好的大孔聚合物微球为基质来制备固定化金属螯合层析介质，可以使制得的固定化金属螯合层析介质具有载量高、流速快的优点，十分适合应用于高通量分离纯化生物大分子。
(2)在步骤1中，所述酸性条件是指pH值为1～5。所述将大孔聚合物微球在酸性条件下进行水解处理是将大孔聚合物微球放入0.5mol/L稀硫酸中进行密封振荡3～6h，然后取出所述大孔聚合物微球，用去离子水将大孔聚合物微球表面及孔道内的硫酸置换出来。其中，所述稀硫酸的体积用量最好为大孔聚合物微球质量的4～10倍，即大孔聚合物微球质量:所述稀硫酸的体积＝1:4～10(g/mL)。
(3)在步骤2中，所述功能单体溶液为甲基丙烯酸缩水甘油酯与配体分子进行键合得到的复合型单体溶液。所述配体分子是与环氧基反应后具有螯合过渡金属离子能力的配体分子；所述配体分子优选是多齿类配体，最好是采用二齿类配体(例如：2，6-二氨基甲基吡啶)、三齿类配体(例如：亚氨基二乙酸(IDA))、四齿类配体(例如：羧甲基天冬氨酸(CM-Asp))、五齿类配体(例如：三羧甲基乙二胺(TED)、四乙烯五胺(TEPA))。采用这种复合型单体溶液与所述大孔聚合物微球进行接枝聚合，不用考虑后期配体键合的转化率问题。通过将所述大孔聚合物微球在这种复合型单体溶液中进行溶胀处理，再加入引发剂进行接枝聚合，可使大孔聚合物微球表面及内部孔道表面接枝这种复合型单体的聚合物长链，这能够有效增加材料表面功能基团数量，提高螯合金属离子的数量，提升大孔聚合物微球的蛋白载量，有效减少金属离子泄露。在实际应用中，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯与配体分子进行键合是：先将配体分子溶解，然后等摩尔比将该溶液加入到甲基丙烯酸缩水甘油酯中，反应温度为40～70℃，搅拌至变成透明均相溶液，从而得到复合型单体溶液；其中，所述将配体分子溶解是将含有羧基的配体分子溶解于碱性溶液中，将不含有羧基的配体分子溶解于水中。
(4)在步骤2中，所述将步骤1处理后的大孔聚合物微球放入功能单体溶液中进行溶胀处理是将步骤1处理后的大孔聚合物微球放入浓度为0.05～1mmol/mL的功能单体溶液中密封振荡1～4h(优选为2～4h，最好为3～4h)，使大孔聚合物微球在功能单体溶液中完全溶胀。其中，所述功能单体溶液的体积用量可以为步骤1处理后的大孔聚合物微球质量的1～10倍(即步骤1处理后的大孔聚合物微球质量:所述功能单体溶液的体积＝1:1～10(g/mL))，优选为3～10倍(即步骤1处理后的大孔聚合物微球质量:所述功能单体溶液的体积＝1:3～10(g/mL))，最好为5～10倍(即步骤1处理后的大孔聚合物微球质量:所述功能单体溶液的体积＝1:5～10(g/mL))。
(5)在步骤3中，将铈离子引发剂与步骤2处理后的材料(步骤2处理后的材料包括溶胀处理后的大孔聚合物微球及功能单体溶液)在溶剂中搅拌混合，并在pH值为1～6(优选为1～4，最好为1～3)、反应温度为20～60℃(优选为25～37℃，最好为27～35℃)下进行接枝聚合反应，反应时间为4～16h(优选为5～12h，最好为7～10h)，然后进行减压过滤，并在减压过滤的同时用去离子水洗掉可溶性物质。通过控制接枝聚合反应的反应时间，能够有效控制大孔聚合物微球表面及内部孔道表面的接枝链长，从而可以准确控制大孔聚合物微球表面及内部孔道表面的功能基团数量。
(6)在步骤3中，所述引发剂为硫酸铈铵、硝酸铈铵中的一种或两种混合物，并且所述引发剂的浓度为0.005～0.25mmol/mL。所述溶剂为水，并且所述溶剂的体积用量为步骤2处理后的大孔聚合物微球质量的10～30倍(即步骤2处理后的大孔聚合物微球质量:所述溶剂的体积＝1:10～30(g/mL))，优选为15～25倍(即步骤2处理后的大孔聚合物微球质量:所述溶剂的体积＝1:15～25(g/mL))，最好为18～23倍(即步骤2处理后的大孔聚合物微球质量:所述溶剂的体积＝1:18～23(g/mL))。
(7)在步骤4中，所述金属离子溶液中的金属离子为Ni2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Fe3+中的一种或两种混合物，并且所述金属离子溶液的浓度为0.05～0.2mol/L(最好为0.1mol/L)；浸泡时间为1～4h。
进一步地，本发明中的固定化金属螯合层析介质及其制备方法至少具有以下优点：
(1)本发明所提供的固定化金属螯合层析介质的制备方法以孔径范围为100～3000nm，粒径为20～200μm，机械强度为1.0MPa以上的大孔聚合物微球为基质来制备固定化金属螯合层析介质，可以使制得的固定化金属螯合层析介质具有载量高、流速快的优点，十分适合应用于高通量分离纯化生物大分子。
(2)本发明所提供的固定化金属螯合层析介质的制备方法以甲基丙烯酸缩水甘油酯与配体分子进行键合得到的复合型单体溶液为功能单体溶液，通过在大孔聚合物微球表面及内部孔道表面接枝这种复合型单体构成的带有多个官能团的聚合物长链，从而能够有效增加材料表面功能基团数量，提高螯合金属离子的数量，提升大孔聚合物微球的蛋白载量，有效减少金属离子泄露。
(3)本发明所提供的固定化金属螯合层析介质的制备方法通过在大孔聚合物微球表面及内部孔道表面接枝由多齿类配体构成的复合型单体，可以在提升大孔聚合物微球的蛋白载量的同时，有效减少金属离子泄露。
(4)本发明所提供的固定化金属螯合层析介质的制备方法通过控制接枝聚合反应的反应时间，能够有效控制大孔聚合物微球表面及内部孔道表面的接枝链长，从而可以准确控制大孔聚合物微球表面及内部孔道表面的功能基团数量。
(5)本发明所提供的固定化金属螯合层析介质的制备方法以大孔聚合物微球为基础，采用铈离子引发剂在大孔聚合物微球表面及内部孔道表面接枝聚合复合型单体，从而在大孔聚合物微球表面及内部孔道表面生成聚合物长链，通过接枝聚合物长链改性后，大孔聚合物微球表面及内部孔道表面的功能基团数量大大提高，再螯合金属离子，能够显著提升该材料的蛋白结合量，可以用作生物大分子的分离纯化介质，因此在快速分离纯化蛋白质领域有很好的应用前景和优势。
(6)对本发明所制备的未螯合金属离子介质的离子交换容量和螯合金属离子介质的金属离子含量进行了测定，结果表明：该类介质的离子交换容量范围为0.1～0.5mmol/mL，螯合金属离子容量范围为50～200μmol/mL。
(7)本发明所提供的固定化金属螯合层析介质孔径尺寸大(100～3000nm)、粒径大(20～200μm)、离子交换容量高(0.1～0.5mmol/mL)、金属离子容量高(50～200μmol/mL)，该固定化金属螯合层析介质能更好的适应高通量分离纯化生物大分子，可应用于色谱分离领域。
(8)本发明所提供的固定化金属螯合层析介质适合组氨酸标签蛋白及多肽类大分子的快速分离纯化。
综上可见，本发明实施例不仅制备方法操作简单，对环境要求不苛刻，而且能够有效提高材料表面功能基团数量，提升介质蛋白载量，减少金属离子泄露，使所制得的固定化金属螯合层析介质机械强度高、非特异性吸附少、特异性结合力强、蛋白结合载量高、操作流速快，适合高通量分离纯化生物大分子。
为了更加清晰地展现出本发明所提供的技术方案及所产生的技术效果，下面以具体实施例对本发明所提供的固定化金属螯合层析介质及其制备方法与应用进行详细描述。
实施例1
一种固定化金属螯合层析介质，其制备方法可以包括以下步骤：
步骤A1、大孔PGMA-EDMA微球在酸性条件下进行水解处理：
准确称取2.0g大孔PGMA-EDMA微球放入50mL的锥形瓶中，然后加入10mL浓度为0.5mol/L稀硫酸溶液，并在120rpm的振荡摇床中室温下密封振荡3h，再进行抽滤，并用同样体积的去离子水进行洗涤，洗涤后将溶剂抽滤至微球表面中性。
步骤A2、复合型单体溶液的制备：
准确称取氢氧化钠和三齿类螯合配体亚氨基二乙酸(IDA)，其摩尔比为2：1，并加入适量的水，使之完全溶解后，可得到亚氨基二乙酸钠盐溶液；将所述亚氨基二乙酸钠盐溶液缓慢倒入等摩尔比的甲基丙烯酸缩水甘油酯中，加入转子放到加热磁力搅拌器上，调整温度至60℃，强烈搅拌至变成透明均相溶液，从而制得GMA-IDA溶液(即复合型单体溶液)。
步骤A3、溶胀处理：
将步骤A1处理后的大孔聚合物微球放入50mL的锥形瓶中，然后加入10mL浓度为1mmol/mL的步骤A2制得的GMA-IDA溶液，并在120rpm的振荡摇床中室温下密封振荡3h，使大孔聚合物微球在功能单体溶液中完全溶胀。
步骤A4、接枝聚合反应：
称取0.298g(0.5mmol)硫酸铈铵七水化合物放入10mL烧杯中，然后向其中加入5mL浓度为0.5mol/L的稀硫酸作为溶剂，在120rpm下机械搅拌至形成均匀溶液，将其加入到步骤A3的体系中，用浓硫酸调节pH值为2，加去离子水至40mL，保持反应温度为30℃，在此温度下保持反应8h，反应结束后趁热，用G4砂芯漏斗进行减压抽滤，同时用500mL去离子水进行洗涤至大孔聚合物微球无色。
步骤A5、螯合金属离子：
将步骤A4处理后的材料放入浓度为0.1mol/L的硫酸镍溶液中浸泡一定时间，从而得到如图1a和图1b所示的固定化金属螯合层析介质。
具体地，本发明实施例1中步骤A4处理后的材料是接枝后未螯合金属离子的大孔聚合物微球，该接枝后未螯合金属离子的大孔聚合物微球表面及内部孔道表面具有聚甲基丙烯酸-亚氨基二乙酸长链分子，由于该聚合物侧链带有两个羧基和一个次氨基，因此该大孔聚合物微球可以在步骤A5中螯合镍离子，从而步骤A5所制得的固定化金属螯合层析介质可应用于对组氨酸标签蛋白的分离。
进一步地，对本发明实施例1中接枝后未螯合金属离子的大孔聚合物微球的离子交换容量以及螯合金属离子的固定化金属螯合层析介质的金属离子含量进行了测定，从而可以得到下表1所示的结果：
表1
经过测定：本发明实施例1中接枝后未螯合金属离子的大孔聚合物微球的离子交换容量为0.32mmol/mL，其螯合镍离子后的镍离子含量为201μmol/mL。
实施例2
一种固定化金属螯合层析介质，其制备方法可以包括以下步骤：
步骤B1、大孔PGMA-EDMA微球在酸性条件下进行水解处理：
准确称取2.0g大孔PGMA-EDMA微球放入50mL的锥形瓶中，然后加入13mL浓度为0.5mol/L稀硫酸溶液，并在120rpm的振荡摇床中室温下密封振荡4h，再进行抽滤，并用同样体积的去离子水进行洗涤，洗涤后将溶剂抽滤至微球表面中性。
步骤B2、复合型单体溶液的制备：
准确称取二齿类螯合配体2，6-二氨基甲基吡啶，并加入适量的水，使之完全溶解后，将其缓慢倒入等摩尔比的甲基丙烯酸缩水甘油酯中，加入转子放到加热磁力搅拌器上，调整温度至50℃，强烈搅拌至变成透明均相溶液，从而制得复合型单体溶液。
步骤B3、溶胀处理：
将步骤B1处理后的大孔聚合物微球放入50mL的锥形瓶中，然后加入2mL浓度为1mmol/mL的步骤B2制得的复合型单体溶液，并在120rpm的振荡摇床中室温下密封振荡4h，使大孔聚合物微球在功能单体溶液中完全溶胀。
步骤B4、接枝聚合反应：
称取0.1788g(0.3mmol)硫酸铈铵七水化合物放入10mL烧杯中，然后向其中加入3mL浓度为0.5mol/L的稀硫酸作为溶剂，在120rpm下机械搅拌至形成均匀溶液，将其加入到步骤B3的体系中，用浓硫酸调节pH值为1，加去离子水至40mL，保持反应温度为20℃，在此温度下保持反应4h，反应结束后趁热，用G4砂芯漏斗进行减压抽滤，同时用500mL去离子水进行洗涤至大孔聚合物微球无色。
步骤B5、螯合金属离子：
将步骤B4处理后的材料放入浓度为0.1mol/L的硫酸铜溶液中浸泡一定时间，从而得到如图2a和图2b所示的固定化金属螯合层析介质。
具体地，本发明实施例2中步骤B4处理后的材料是接枝后未螯合金属离子的大孔聚合物微球，该接枝后未螯合金属离子的大孔聚合物微球表面及内部孔道表面具有聚甲基丙烯酸-(2，6-二氨基甲基吡啶)，由于该聚合物侧链带有一个次氨基和一个亚氨基，因此该大孔聚合物微球可以在步骤B5中螯合铜离子，从而步骤B5所制得的固定化金属螯合层析介质可应用于对组氨酸标签蛋白的分离。
进一步地，对本发明实施例2中接枝后未螯合金属离子的大孔聚合物微球的离子交换容量以及螯合金属离子的固定化金属螯合层析介质的金属离子含量进行了测定，从而可以得到下表2所示的结果：
表2
经过测定：本发明实施例2中接枝后未螯合金属离子的大孔聚合物微球的离子交换容量为0.1mmol/mL，其螯合铜离子后的铜离子含量为55μmol/mL。
实施例3
一种固定化金属螯合层析介质，其制备方法可以包括以下步骤：
步骤C1、大孔PGMA-EDMA微球在酸性条件下进行水解处理：
准确称取2.0g大孔PGMA-EDMA微球放入50mL的锥形瓶中，然后加入15mL浓度为0.5mol/L稀硫酸溶液，并在120rpm的振荡摇床中室温下密封振荡3h，再进行抽滤，并用同样体积的去离子水进行洗涤，洗涤后将溶剂抽滤至微球表面中性。
步骤C2、复合型单体溶液的制备：
准确称取氢氧化钠和四齿类螯合配体羧甲基天冬氨酸(CM-Asp)，其摩尔比为3：1，并加入适量的水，使之完全溶解后，可得到羧甲基天冬氨酸钠盐溶液；将所述羧甲基天冬氨酸钠盐溶液缓慢倒入等摩尔比的甲基丙烯酸缩水甘油酯中，加入转子放到加热磁力搅拌器上，调整温度至40℃，强烈搅拌至变成透明均相溶液，从而制得GMA-(CM-Asp)溶液(即复合型单体溶液)。
步骤C3、溶胀处理：
将步骤C1处理后的大孔聚合物微球放入50mL的锥形瓶中，然后加入20mL浓度为1mmol/mL的步骤C2制得的GMA-(CM-Asp)溶液，并在120rpm的振荡摇床中室温下密封振荡3h，使大孔聚合物微球在功能单体溶液中完全溶胀。
步骤C4、接枝聚合反应：
称取0.417g(0.7mmol)硫酸铈铵七水化合物放入10mL烧杯中，然后向其中加入7mL浓度为0.5mol/L的稀硫酸作为溶剂，在120rpm下机械搅拌至形成均匀溶液，将其加入到步骤C3的体系中，用浓硫酸调节pH值为3，加去离子水至40mL，保持反应温度为40℃，在此温度下保持反应6h，反应结束后趁热，用G4砂芯漏斗进行减压抽滤，同时用500mL去离子水进行洗涤至大孔聚合物微球无色。
步骤C5、螯合金属离子：
将步骤C4处理后的材料放入浓度为0.1mol/L的氯化钴溶液中浸泡一定时间，从而得到如图3a和图3b所示的固定化金属螯合层析介质。
具体地，本发明实施例3中步骤C4处理后的材料是接枝后未螯合金属离子的大孔聚合物微球，该接枝后未螯合金属离子的大孔聚合物微球表面及内部孔道表面具有聚甲基丙烯酸-羧甲基天冬氨酸长链分子，由于该聚合物侧链带有三个羧基和一个次氨基，因此该大孔聚合物微球可以在步骤C5中螯合钴离子，从而步骤C5所制得的固定化金属螯合层析介质可应用于对组氨酸标签蛋白的分离。
进一步地，对本发明实施例3中接枝后未螯合金属离子的大孔聚合物微球的离子交换容量以及螯合金属离子的固定化金属螯合层析介质的金属离子含量进行了测定，从而可以得到下表3所示的结果：
表3
经过测定：本发明实施例3中接枝后未螯合金属离子的大孔聚合物微球的离子交换容量为0.38mmol/mL，其螯合钴离子后的钴离子含量为150μmol/mL。
实施例4
一种固定化金属螯合层析介质，其制备方法可以包括以下步骤：
步骤D1、大孔PGMA-EDMA微球在酸性条件下进行水解处理：
准确称取2.0g大孔PGMA-EDMA微球放入50mL的锥形瓶中，然后加入15mL浓度为0.5mol/L稀硫酸溶液，并在120rpm的振荡摇床中室温下密封振荡3h，再进行抽滤，并用同样体积的去离子水进行洗涤，洗涤后将溶剂抽滤至微球表面中性。
步骤D2、复合型单体溶液的制备：
准确称取氢氧化钠和五齿类螯合配体三羧甲基乙二胺(TED)，其摩尔比为3：1，并加入适量的水，使之完全溶解后，可得到三羧甲基乙二胺钠盐溶液；将所述三羧甲基乙二胺钠盐溶液缓慢倒入等摩尔比的甲基丙烯酸缩水甘油酯中，加入转子放到加热磁力搅拌器上，调整温度至70℃，强烈搅拌至变成透明均相溶液，从而制得GMA-TED溶液(即复合型单体溶液)。
步骤D3、溶胀处理：
将步骤D1处理后的大孔聚合物微球放入50mL的锥形瓶中，然后加入30mL浓度为1mmol/mL的步骤D2制得的GMA-TED溶液，并在120rpm的振荡摇床中室温下密封振荡3h，使大孔聚合物微球在功能单体溶液中完全溶胀。
步骤D4、接枝聚合反应：
称取0.536g(0.9mmol)硫酸铈铵七水化合物放入25mL烧杯中，然后向其中加入9mL浓度为0.5mol/L的稀硫酸作为溶剂，在120rpm下机械搅拌至形成均匀溶液，将其加入到步骤D3的体系中，用浓硫酸调节pH值为4，加去离子水至40mL，保持反应温度为50℃，在此温度下保持反应12h，反应结束后趁热，用G4砂芯漏斗进行减压抽滤，同时用500mL去离子水进行洗涤至大孔聚合物微球无色。
步骤D5、螯合金属离子：
将步骤D4处理后的材料放入浓度为0.1mol/L的氯化锌溶液中浸泡一定时间，从而得到如图4a和图4b所示的固定化金属螯合层析介质。
具体地，本发明实施例4中步骤D4处理后的材料是接枝后未螯合金属离子的大孔聚合物微球，该接枝后未螯合金属离子的大孔聚合物微球表面及内部孔道表面具有聚甲基丙烯酸-三羧甲基乙二胺长链分子，由于该聚合物侧链带有三个羧基和二个次氨基，因此该大孔聚合物微球可以在步骤D5中螯合锌离子，从而步骤D5所制得的固定化金属螯合层析介质可应用于对组氨酸标签蛋白的分离。
进一步地，对本发明实施例4中接枝后未螯合金属离子的大孔聚合物微球的离子交换容量以及螯合金属离子的固定化金属螯合层析介质的金属离子含量进行了测定，从而可以得到下表4所示的结果：
表4
经过测定：本发明实施例4中接枝后未螯合金属离子的大孔聚合物微球的离子交换容量为0.42mmol/mL，其螯合锌离子后的锌离子含量为120μmol/mL。
实施例5
一种固定化金属螯合层析介质，其制备方法可以包括以下步骤：
步骤E1、大孔PGMA-EDMA微球在酸性条件下进行水解处理：
准确称取2.0g大孔PGMA-EDMA微球放入50mL的锥形瓶中，然后加入20mL浓度为0.5mol/L稀硫酸溶液，并在120rpm的振荡摇床中室温下密封振荡3h，再进行抽滤，并用同样体积的去离子水进行洗涤，洗涤后将溶剂抽滤至微球表面中性。
步骤E2、复合型单体溶液的制备：
准确称取五齿类螯合配体四乙烯五胺(TEPA)，并加入适量的水，使之完全溶解后，将其缓慢倒入等摩尔比的甲基丙烯酸缩水甘油酯中，加入转子放到加热磁力搅拌器上，调整温度至80℃，强烈搅拌至变成透明均相溶液，从而制得GMA-TEPA溶液(即复合型单体溶液)。
步骤E3、溶胀处理：
将步骤E1处理后的大孔聚合物微球放入50mL的锥形瓶中，然后加入40mL浓度为1mmol/mL的步骤E2制得的GMA-TEPA溶液，并在120rpm的振荡摇床中室温下密封振荡3h，使大孔聚合物微球在功能单体溶液中完全溶胀。
步骤E4、接枝聚合反应：
称取0.596g(1mmol)硫酸铈铵七水化合物放入25mL烧杯中，然后向其中加入10mL浓度为0.5mol/L的稀硫酸作为溶剂，在120rpm下机械搅拌至形成均匀溶液，将其加入到步骤E3的体系中，用浓硫酸调节pH值为6，加去离子水至40mL，保持反应温度为60℃，在此温度下保持反应16h，反应结束后趁热，用G4砂芯漏斗进行减压抽滤，同时用500mL去离子水进行洗涤至大孔聚合物微球无色。
步骤E5、螯合金属离子：
将步骤E4处理后的材料放入浓度为0.1mol/L的氯化铁溶液中浸泡一定时间，从而得到如图5a和图5b所示的固定化金属螯合层析介质。
具体地，本发明实施例5中步骤E4处理后的材料是接枝后未螯合金属离子的大孔聚合物微球，该接枝后未螯合金属离子的大孔聚合物微球表面及内部孔道表面具有聚甲基丙烯酸-四乙烯五胺长链分子，由于该聚合物侧链带有一个氨基和四个亚氨基，因此该大孔聚合物微球可以在步骤E5中螯合铁离子，从而步骤E5所制得的固定化金属螯合层析介质可应用于对组氨酸标签蛋白的分离。
进一步地，对本发明实施例5中接枝后未螯合金属离子的大孔聚合物微球的离子交换容量以及螯合金属离子的固定化金属螯合层析介质的金属离子含量进行了测定，从而可以得到下表5所示的结果：
表5
经过测定：本发明实施例5中接枝后未螯合金属离子的大孔聚合物微球的离子交换容量为0.50mmol/mL，其螯合铁离子后的铁离子含量为160μmol/mL。
金属离子含量测定方法
(1)金属离子浓度和吸光值标准曲线
将EDTA(即乙二胺四乙酸)与金属离子形成的配合物溶液在400～700nm波长范围内扫描，找到最大吸收波长；以10mL浓度为0.05mol/L的EDTA+浓度为1mol/L的NaCl为溶液，分别配制标准0.01mol/L、0.02mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L的金属离子溶液，在最大吸收波长处检测吸光值，并以金属离子浓度和吸光值作回归曲线。
Y＝a X+b 公式一
公式一中，Y表示吸光值(A)；X表示金属离子的浓度(μmol/mL)。
(2)螯合金属离子含量测定
准确量取5mL本发明所制得的固定化金属螯合层析介质(即螯合金属离子的大孔聚合物微球)，装入层析柱内，以10mL浓度为0.05mol/L的EDTA+浓度为1mol/L的NaCl为溶液，反复浸泡冲洗2～6h，保证微球表面及内部孔道表面螯合的金属离子被EDTA螯合；收集EDTA螯合金属离子的溶液用紫外分光光度计测定其吸光值，并代入公式一即可得出金属离子含量。本发明实施例所制得的固定化金属螯合层析介质的金属离子含量均采用该方法进行测定。
综上可见，本发明实施例不仅制备方法操作简单，对环境要求不苛刻，而且能够有效提高材料表面功能基团数量，提升介质蛋白载量，减少金属离子泄露，使所制得的固定化金属螯合层析介质机械强度高、非特异性吸附少、特异性结合力强、蛋白结合载量高、操作流速快，适合高通量分离纯化生物大分子。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种固定化金属螯合层析介质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将大孔聚合物微球在酸性条件下进行水解处理；
步骤2、将步骤1处理后的大孔聚合物微球在功能单体溶液中进行溶胀处理；
步骤3、将引发剂与步骤2处理后的材料在溶剂中搅拌混合，并在一定pH值和一定温度下进行接枝聚合反应，然后用去离子水洗掉可溶性物质；
步骤4、将步骤3处理后的材料放入一定浓度的金属离子溶液中浸泡一定时间，从而得到固定化金属螯合层析介质。
2.根据权利要求1所述的固定化金属螯合层析介质的制备方法，其特征在于，所述大孔聚合物微球为聚丙烯酸酯类微球或聚苯乙烯类微球，并且该大孔聚合物微球的孔径范围为100～3000nm，粒径为20～200μm，机械强度为1.0MPa以上。
3.根据权利要求1或2所述的固定化金属螯合层析介质的制备方法，其特征在于，所述将大孔聚合物微球在酸性条件下进行水解处理包括：
将大孔聚合物微球放入0.5mol/L稀硫酸中进行密封振荡3～6h，然后取出所述大孔聚合物微球，用去离子水将微球表面及孔道内的硫酸置换出来。
4.根据权利要求1或2所述的固定化金属螯合层析介质的制备方法，其特征在于，所述功能单体溶液是采用以下制备方法制得的复合型单体溶液：
将配体分子溶解，然后等摩尔比将该溶液加入到甲基丙烯酸缩水甘油酯中，反应温度为40～70℃，搅拌至变成透明均相溶液，从而得到复合型单体溶液；
其中，所述配体分子是与环氧基反应后具有螯合过渡金属离子能力的配体分子；所述将配体分子溶解是将含有羧基的配体分子溶解于碱性溶液中，将不含有羧基的配体分子溶解于水中。
5.根据权利要求1或2所述的固定化金属螯合层析介质的制备方法，其特征在于，所述将步骤1处理后的大孔聚合物微球放入功能单体溶液中进行溶胀处理包括：
将步骤1处理后的大孔聚合物微球放入浓度为0.05～1mmol/mL的功能单体溶液中密封振荡1～4h，使大孔聚合物微球在功能单体溶液中完全溶胀；
所述功能单体溶液的体积用量为步骤1处理后的大孔聚合物微球质量的1～10倍。
6.根据权利要求1或2所述的固定化金属螯合层析介质的制备方法，其特征在于，所述引发剂为硫酸铈铵、硝酸铈铵中的一种或两种混合物，并且所述引发剂的浓度为0.005～0.25mmol/mL；所述的溶剂为水。
7.根据权利要求1或2所述的固定化金属螯合层析介质的制备方法，其特征在于，所述在一定pH值和一定温度下进行接枝聚合反应是在pH值为1～6、反应温度为20～60℃下反应4～16h。
8.根据权利要求1或2所述的固定化金属螯合层析介质的制备方法，其特征在于，所述金属离子溶液中的金属离子为Ni2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Fe3+中的一种或两种混合物，并且所述金属离子溶液的浓度为0.05～0.2mol/L；浸泡时间为1～4h。
9.一种固定化金属螯合层析介质，其特征在于，采用上述权利要求1至8中任一项所述的固定化金属螯合层析介质的制备方法制备而成。
10.一种固定化金属螯合层析介质的应用，其特征在于，将上述权利要求9所述的固定化金属螯合层析介质用于生物大分子分离纯化领域。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114014913A (zh) * | 2022-01-10 | 2022-02-08 | 浙江湃肽生物有限公司南京分公司 | 醋酸曲普瑞林的纯化方法 |
| CN116063733A (zh) * | 2023-02-20 | 2023-05-05 | 苏州赛分科技股份有限公司 | 一种基于ted的高耐受金属螯合试剂亲和填料及其制备方法和应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104558350A (zh) * | 2013-10-12 | 2015-04-29 | 中国石油大学(华东) | 一种亲水性超大孔聚合物微球及其制备方法 |
| CN105111390A (zh) * | 2015-09-16 | 2015-12-02 | 天津大学 | 一种金属螯合纳米介质及制备方法和应用于强化包涵体蛋白复性与集成纯化的方法 |
| CN107754769A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-03-06 | 苏州博进生物技术有限公司 | 一种高载量金属螯合亲和层析介质 |
| CN108329486A (zh) * | 2018-05-09 | 2018-07-27 | 北京化工大学 | 一种介孔杂化结构的金属有机骨架材料的制备方法和应用 |
| WO2018235904A1 (ja) * | 2017-06-22 | 2018-12-27 | 昭和電工株式会社 | オリゴヌクレオチドの混合物の分離分析方法 |
| CN109499555A (zh) * | 2018-12-06 | 2019-03-22 | 苏州楚博生物技术有限公司 | 一种制备高配基密度的大孔亲和层析介质的方法 |
-
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104558350A (zh) * | 2013-10-12 | 2015-04-29 | 中国石油大学(华东) | 一种亲水性超大孔聚合物微球及其制备方法 |
| CN105111390A (zh) * | 2015-09-16 | 2015-12-02 | 天津大学 | 一种金属螯合纳米介质及制备方法和应用于强化包涵体蛋白复性与集成纯化的方法 |
| WO2018235904A1 (ja) * | 2017-06-22 | 2018-12-27 | 昭和電工株式会社 | オリゴヌクレオチドの混合物の分離分析方法 |
| CN107754769A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-03-06 | 苏州博进生物技术有限公司 | 一种高载量金属螯合亲和层析介质 |
| CN108329486A (zh) * | 2018-05-09 | 2018-07-27 | 北京化工大学 | 一种介孔杂化结构的金属有机骨架材料的制备方法和应用 |
| CN109499555A (zh) * | 2018-12-06 | 2019-03-22 | 苏州楚博生物技术有限公司 | 一种制备高配基密度的大孔亲和层析介质的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GALINA TISHCHENKO ET AL.: "Purification of the specific immunoglobulin G1 by immobilized metal ion affinity chromatography using nickel complexes of chelating porous and nonporous polymeric sorbents based on poly(methacrylic esters) Effect of polymer structure", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A》 * |
| HUNG K ET AL.: "Grafting polymerization of glycidyl methacrylate onto capillary-channeled polymer (C-CP) fibers as a ligand binding platform: Applications in immobilized metal-ion affinity chromatography (IMAC) protein separations", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114014913A (zh) * | 2022-01-10 | 2022-02-08 | 浙江湃肽生物有限公司南京分公司 | 醋酸曲普瑞林的纯化方法 |
| CN114014913B (zh) * | 2022-01-10 | 2022-03-29 | 浙江湃肽生物有限公司南京分公司 | 醋酸曲普瑞林的纯化方法 |
| CN116063733A (zh) * | 2023-02-20 | 2023-05-05 | 苏州赛分科技股份有限公司 | 一种基于ted的高耐受金属螯合试剂亲和填料及其制备方法和应用 |
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