CN115850792B - 一种高载量阴离子交换层析介质的制备方法 - Google Patents
一种高载量阴离子交换层析介质的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115850792B CN115850792B CN202211213909.6A CN202211213909A CN115850792B CN 115850792 B CN115850792 B CN 115850792B CN 202211213909 A CN202211213909 A CN 202211213909A CN 115850792 B CN115850792 B CN 115850792B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- anion exchange
- exchange chromatography
- chromatography medium
- groups
- carboxyl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000011068 loading method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 14
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims abstract description 45
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 25
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- -1 amino, carboxyl Chemical group 0.000 claims abstract description 16
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000003999 initiator Substances 0.000 claims abstract description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 8
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 claims abstract description 8
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 claims abstract 6
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 17
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 15
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 13
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- JKNCOURZONDCGV-UHFFFAOYSA-N 2-(dimethylamino)ethyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CN(C)CCOC(=O)C(C)=C JKNCOURZONDCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- DPBJAVGHACCNRL-UHFFFAOYSA-N 2-(dimethylamino)ethyl prop-2-enoate Chemical compound CN(C)CCOC(=O)C=C DPBJAVGHACCNRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- RPNUMPOLZDHAAY-UHFFFAOYSA-N Diethylenetriamine Chemical compound NCCNCCN RPNUMPOLZDHAAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 claims description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 5
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 claims description 5
- USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L potassium persulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 5
- RRHXZLALVWBDKH-UHFFFAOYSA-M trimethyl-[2-(2-methylprop-2-enoyloxy)ethyl]azanium;chloride Chemical compound [Cl-].CC(=C)C(=O)OCC[N+](C)(C)C RRHXZLALVWBDKH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 4
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 claims description 4
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 3
- VILCJCGEZXAXTO-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-tetramine Chemical compound NCCNCCNCCN VILCJCGEZXAXTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 2
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- PGJHGXFYDZHMAV-UHFFFAOYSA-K azanium;cerium(3+);disulfate Chemical compound [NH4+].[Ce+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O PGJHGXFYDZHMAV-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- HKVFISRIUUGTIB-UHFFFAOYSA-O azanium;cerium;nitrate Chemical compound [NH4+].[Ce].[O-][N+]([O-])=O HKVFISRIUUGTIB-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 2
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 2
- FAGUFWYHJQFNRV-UHFFFAOYSA-N tetraethylenepentamine Chemical compound NCCNCCNCCNCCN FAGUFWYHJQFNRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 abstract description 12
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 12
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 8
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 abstract 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 10
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- XMPZTFVPEKAKFH-UHFFFAOYSA-P ceric ammonium nitrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[Ce+4].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O XMPZTFVPEKAKFH-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- KJFMBFZCATUALV-UHFFFAOYSA-N phenolphthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2C(=O)O1 KJFMBFZCATUALV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FZGFBJMPSHGTRQ-UHFFFAOYSA-M trimethyl(2-prop-2-enoyloxyethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCOC(=O)C=C FZGFBJMPSHGTRQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 3
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 3
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229920000578 graft copolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 2
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- UGIJCMNGQCUTPI-UHFFFAOYSA-N 2-aminoethyl prop-2-enoate Chemical compound NCCOC(=O)C=C UGIJCMNGQCUTPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005562 fading Methods 0.000 description 1
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 1
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000012966 redox initiator Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
本发明公开了一种高载量阴离子交换层析介质的制备方法，首先将带有叔胺或季胺的乙烯基单体和带有氨基、羧基、巯基的端基功能化合物混合，再加入引发剂进行聚合，得到端基具有反应活性的聚叔胺或季胺的预聚长链功能配基；再将得到的预聚长链功能配基化学键合至多孔微球的表面，制备得到高载量阴离子交换层析介质。该方法制备过程操作简便易行、适用范围广，降低了介质制备成本，提高了分离纯化效率。
Description
技术领域
本发明涉及层析介质制备及应用技术领域，尤其涉及一种高载量阴离子交换层析介质的制备方法。
背景技术
生物制药生产规模日益扩大，对其下游的分离纯化提出了新的挑战，发展快速高效的纯化方法是当务之急。层析分离是当前的主流纯化技术之一，其中分离介质是分离纯化技术的核心，提高分离介质的载量，可以显著降低纯化工艺中的料液处理体积、节约流动相的使用量、节省分离介质使用量以及操作空间，减少大型设备的购置和使用，因此提高分离介质的载量对于提高分离效率、降低生产成本有重要作用。
阴离子交换层析介质是当前蛋白类药物纯化过程中应用最为广泛的介质之一，主要是由于天然蛋白大多数其等电点小于7，在通常的中性条件下，其表面带有负电荷而易于和阴离子交换介质相结合，因此提高阴离子交换层析介质的载量对于提高蛋白纯化效率具有重要意义。多孔微球表面键合多胺基的物质，可提高阴离子介质的耐盐性，但现有技术所采用的方法多为将具有多胺基的化合物随机偶联至材料表面，同时其制备过程衍生步骤多，操作繁琐，每步需要原料用量过量等，制备成本较高；另外现有技术方案所制备的产品引入的基团多为伯胺、仲胺或与叔胺的混合物，聚合物链在材料表面呈伏倒状态，其载量提升有限。
发明内容
本发明的目的是提供一种高载量阴离子交换层析介质的制备方法，该方法制备过程操作简便易行、适用范围广，解决了大孔聚合物层析介质比表面积小、载量低的问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种高载量阴离子交换层析介质的制备方法，所述方法包括：
步骤1、首先将带有叔胺或季胺的乙烯基单体和带有氨基、羧基、巯基的端基功能化合物混合，再加入引发剂进行聚合，得到端基具有反应活性的聚叔胺或季胺的预聚长链功能配基；其中，所得到的预聚长链功能配基的主链上除带有叔胺或季胺功能基团外，端基还含有氨基、羧基、巯基功能基团；
步骤2、将步骤1得到的预聚长链功能配基化学键合至多孔微球的表面，制备得到高载量阴离子交换层析介质。
由上述本发明提供的技术方案可以看出，上述方法制备过程操作简便易行、适用范围广，解决了大孔聚合物层析介质比表面积小、载量低的问题，所制备的阴离子交换层析介质的蛋白载量更高，适合生物大分子的快速分离纯化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。
图1为本发明实施例提供的高载量阴离子交换层析介质的制备方法流程示意图；
图2为本发明实施例所述接枝聚合物功能配基的反应过程示意图；
图3为本发明实施例所述阴离子交换层析介质的电子扫描显微示意图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，这并不构成对本发明的限制。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
如图1所示为本发明实施例提供的高载量阴离子交换层析介质的制备方法流程示意图，所述方法包括：
步骤1、首先将带有叔胺或季胺的乙烯基单体和带有氨基、羧基、巯基的端基功能化合物混合，再加入引发剂进行聚合，得到端基具有反应活性的聚叔胺或季胺的预聚长链功能配基；
其中，所得到的预聚长链功能配基的主链上除带有叔胺或季胺功能基团外，端基还含有氨基、羧基、巯基功能基团。
在该步骤中，所述带有叔胺或季胺的乙烯基单体包括甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵中的一种或多种。
所述带有氨基、羧基、巯基的端基功能化合物包括乙二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺、四乙烯五胺、亚胺基二乙酸、半胱氨酸、胱氨酸、乙二胺四乙酸中的一种或多种。
所加入的引发剂包括过硫酸钾、过硫酸铵、硝酸铈铵、硫酸铈铵中的一种或多种。具体实现中，其他能与多胺、多醇、巯基组成氧化还原引发体系的氧化物也是可行的。
该步骤中，所述带有叔胺或季胺的乙烯基单体、带有氨基、羧基、巯基的端基功能化合物、引发剂的用量比例范围为：100:5:1-200:5:1。
步骤2、将步骤1得到的预聚长链功能配基化学键合至多孔微球的表面，制备得到高载量阴离子交换层析介质。
在该步骤中，将步骤1得到的预聚长链功能配基通过端基的氨基、羧基、巯基功能基团与多孔微球表面的基团反应；
在将所述预聚长链功能配基接枝至所述多孔微球表面时，所述预聚长链功能配基通过一端定点偶联至所述多孔微球表面，如图2所示为本发明实施例所述接枝聚合物功能配基的反应过程示意图，在带有功能基团R1的多孔微球表面及孔道表面进行接枝反应，其中的功能基团R1包括胺基(-NH2)、环氧基、羧基，该功能基团R1分别与预聚长链功能配基的端基R2进行反应，端基R2包括胺基、巯基、羧基；
所述端基R2分别与所述功能基团R1的羧基、环氧基、胺基发生偶联反应，将带有端基R2的预聚长链功能配基通过端基固定于多孔微球表面，因端基R2的基团仅位于预聚物的末端，如图2所示，最后预聚长链功能配基直立于制得的阴离子交换层析介质的表面及孔道表面，具有更好的伸展状态，接枝后的多孔微球表面的离子交换基团数量增加，离子交换容量提高，从而增加了大孔微球的蛋白结合载量。
如图3所示为本发明实施例所述阴离子交换层析介质的电子扫描显微示意图，其中A为接枝后多孔微球的全貌图，B为多孔微球的表面局部放大形貌图，从图3中可以发现接枝后的微球表面依然能够保持较大的开孔状态，有利于蛋白的保持较高的传质速率，从而满足高通量蛋白纯化的需求。
另外，具体实现中，所述多孔微球的孔道表面带有能与氨基、羧基、巯基反应的功能基团，具体包括环氧基、胺基、羧基中的一种或多种。所述多孔微球的孔径范围为30-3000nm，粒径范围为20-200um，操作压力耐受范围为0.3-10MPa。所述多孔微球的基质包括聚丙烯酸酯类、聚苯乙烯类、多糖类材料。
最终所制备得到的阴离子交换层析介质的离子交换容量范围为0.1-4.0mmol/mL；所制备得到的阴离子交换层析介质的蛋白结合载量范围为30-150mg/mL。
下面以具体的实例对上述制备方法的过程进行详细说明：
实例1：
1)二乙烯三胺与过硫酸钾引发甲基丙烯酸二甲氨基乙酯聚合
分别准确称取二乙烯三胺、过硫酸钾1.0g和0.2g放入50mL的锥形瓶中，然后加入去离子水10mL溶解引发剂；然后加入20g甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，在120rpm振荡摇床中室温下振荡2h后，倒入200mL乙醇中进行沉淀得到聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯固体，并用同样体积的乙醇进行洗涤，洗涤后的固体聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯复溶于去离子水中备用。
2)环氧基聚丙烯酸酯微球表面接枝聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯
将步骤1)所制备的端基带有伯胺基的聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯水溶液放入50mL三口瓶中，然后向其中加入10mL表面带有环氧基的多孔微球，微球平均孔径30nm，平均粒径20um，室温下搅拌反应24h，反应完毕后用G4砂芯漏斗进行减压抽滤，并用去离子水进行洗涤至微球无色。
接枝后微球表面及孔道表面具有聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯长链分子，由于该聚合物侧链带有大量的叔胺基团，因此可以直接用作阴离子交换树脂，应用于离子交换模式下的生化分离，无需后续的衍生功能基团，其离子交换容量为0.1mmol/mL，其蛋白载量为150mg/mL。
实例2：
1)胱胺酸与硝酸铈铵引发甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合
分别准确称取胱胺酸、硝酸铈铵1.0g和0.2g放入50mL的锥形瓶中，然后加入去离子水10mL溶解引发剂，然后加入40g甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵，在120rpm振荡摇床中室温下振荡10h后，倒入200mL乙醇中进行沉淀得到端基带有胺基的聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵固体，并用同样体积的乙醇进行洗涤，洗涤后的固体聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵复溶于去离子水中备用。
2)羧基多糖微球表面接枝聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵
将步骤1)所制备的端基带有胺基的聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵水溶液放入50mL三口瓶中，然后向其中加入10mL表面带有羧基的多孔微球和1g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，微球平均孔径50nm，平均粒径100um，室温下搅拌反应4h，反应完毕后用G4砂芯漏斗进行减压抽滤，并用去离子水进行洗涤至微球无色。
接枝后微球表面及孔道表面具有聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵长链分子，由于该聚合物侧链带有大量的季胺基团，因此可以直接用作阴离子交换树脂，应用于离子交换模式下的生化分离，无需后续的衍生功能基团，其离子交换容量为0.3mmol/mL，其蛋白载量为100mg/mL。
实例3：
1)乙二胺四乙酸与硫酸铈铵引发丙烯酸二甲氨基乙酯聚合
分别准确称取乙二胺四乙酸和硫酸铈铵1.0g和0.2g放入50mL的锥形瓶中，然后加入去离子水10mL溶解引发剂，然后加入25g丙烯酸二甲氨基乙酯，在120rpm振荡摇床中室温下振荡5h后，倒入200mL乙醇中进行沉淀得到端基带有羧基的聚丙烯酸二甲氨基乙酯固体，并用同样体积的乙醇进行洗涤，洗涤后的固体聚丙烯酸二甲氨基乙酯复溶于去离子水中备用。
2)胺基聚苯乙烯微球表面接枝聚丙烯酸二甲氨基乙酯
将步骤1)所制备的端基带有羧基的聚丙烯酸二甲氨基乙酯水溶液放入50mL三口瓶中，然后向其中加入10mL表面带有胺基的多孔聚苯乙烯微球和1g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，微球平均孔径3000nm，平均粒径200um，室温下搅拌反应24h，反应完毕后用G4砂芯漏斗进行减压抽滤，并用去离子水进行洗涤至微球无色。
接枝后微球表面及孔道表面具有聚丙烯酸二甲氨基乙酯长链分子，由于该聚合物侧链带有大量的叔胺基团，因此可以直接用作阴离子交换树脂，应用于离子交换模式下的生化分离，无需后续的衍生功能基团，其离子交换容量为0.3mmol/mL，其蛋白载量为30mg/mL。
然后再对实例1-3制备得到的阴离子交换层析介质的离子交换容量和蛋白载量进行测定，具体为：
首先进行离子交换容量测定
第一步：羟型转型
1)将介质转入交换柱中缓慢沉降直至达10mL体积，通过50mL 1mol/L氢氧化钠溶液，流速为0.8-1.0mL/min；
2)用去离子水流经柱体至流出液对酚酞不显色为止(大约4h)。
第二步：酸碱中和
1)用酸式滴定管准确量取25ml标准盐酸溶液，加入上述交换柱中，使其缓慢滴下，并收集到三角瓶中；
2)再用25mL 1mol/L氯化钠溶液滴加通过柱体，并收集于上述三角瓶中。
第三步：返滴收集的盐酸
1)向第二步所收集的液体中加入2-3滴酚酞指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至微红色并保持15s不褪色为终点，记录所耗碱液体积；
2)介质样品的离子交换容量按照下式进行计算。
E＝(C1 V1-C2 V2)/V(mmol/mL)
其中，C1－盐酸标准溶液浓度(mol/L)；V1－盐酸标准溶液体积(mL)；C2－氢氧化钠标准溶液的浓度(mol/L)；V2－滴定时所耗氢氧化钠标准溶液体积(mL)；V－柱体中介质体积(mL)。
然后进行蛋白载量的测定
被吸附蛋白样品为浓度2mg/mL的牛血清白蛋白(简称BSA)溶液1000mL(pH＝8.0，20mM的Tris-HCl缓冲液)；A泵头进样方式，流速1mL/min；流动相B为1MNaCl pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液溶液，样品和流动相用于以下各色谱测试步骤；
1)测试系统死体积
a.用1M NaCl pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液溶液配制2.0mg/mL的BSA溶液；b.连接色谱柱到液相系统中，以泵头进样方式用a步骤中所配溶液，记录开始穿透时间t0，测试系统死体积V0，并得到样品的最大紫外吸收值A0。
2)测试BSA动态载量
a.以泵头进样方式用2mg/mL的BSA溶液1000mL(pH＝8.0，20mM的Tris-HCl缓冲液)记录5％穿透时间t5％。b.计算BSA的动态吸附量，公式如下：
(F，测试流速，mL/min；C，BSA样品浓度，mg/mL；V，介质体积，mL。)
通过上述测定，结果表明该类介质的离子交换容量范围为0.1-4.0mmol/mL，以牛血清白蛋白为测试对象，测定得到该类介质的蛋白载量范围为30-150mg/mL，其载量大小随多孔微球的孔径尺寸增加而减小。
值得注意的是，本发明实施例中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。本文背景技术部分公开的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。
Claims (4)
1.一种高载量阴离子交换层析介质的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤1、首先将带有叔胺或季胺的乙烯基单体和带有氨基、羧基、巯基的端基功能化合物混合，再加入引发剂进行聚合，得到端基具有反应活性的聚叔胺或季胺的预聚长链功能配基；其中，所得到的预聚长链功能配基的主链上除带有叔胺或季胺功能基团外，端基R2包括胺基、巯基、羧基；
所述带有叔胺或季胺的乙烯基单体包括甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵中的一种或多种；所述带有氨基、羧基、巯基的端基功能化合物包括乙二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺、四乙烯五胺、亚胺基二乙酸、半胱氨酸、胱氨酸、乙二胺四乙酸中的一种或多种；
在步骤1中，所述带有叔胺或季胺的乙烯基单体、带有氨基、羧基、巯基的端基功能化合物、引发剂的用量比例范围为：100:5:1-200:5:1；
步骤2、将步骤1得到的预聚长链功能配基化学键合至多孔微球的表面，制备得到高载量阴离子交换层析介质；所述步骤2的过程具体为：
将步骤1得到的预聚长链功能配基通过端基的氨基、羧基、巯基功能基团与多孔微球表面的基团反应；
在将所述预聚长链功能配基接枝至所述多孔微球表面时，所述预聚长链功能配基通过一端定点偶联至所述多孔微球表面，在带有功能基团R1的多孔微球表面及孔道表面进行接枝反应；其中的功能基团R1包括胺基、环氧基、羧基，该功能基团R1分别与预聚长链功能配基的端基R2进行反应；
所述端基R2分别与所述功能基团R1的羧基、环氧基、胺基发生偶联反应，将带有端基R2的预聚长链功能配基通过端基固定于多孔微球表面，因端基R2的基团仅位于预聚物的末端，最后预聚长链功能配基直立于制得的阴离子交换层析介质的表面及孔道表面，具有更好的伸展状态，接枝后的多孔微球表面的离子交换基团数量增加，离子交换容量提高，从而增加了大孔微球的蛋白结合载量；
其中，所制备得到的阴离子交换层析介质的离子交换容量范围为0.1-4.0mmol/mL；所制备得到的阴离子交换层析介质的蛋白结合载量范围为30-150mg/mL。
2.根据权利要求1所述高载量阴离子交换层析介质的制备方法，其特征在于，在步骤1中，所加入的引发剂包括过硫酸钾、过硫酸铵、硝酸铈铵、硫酸铈铵中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述高载量阴离子交换层析介质的制备方法，其特征在于，
所述多孔微球的孔径范围为30-3000nm，粒径范围为20-200um，操作压力耐受范围为0.3-10MPa。
4.根据权利要求1所述高载量阴离子交换层析介质的制备方法，其特征在于，
所述多孔微球的基质包括聚丙烯酸酯类、聚苯乙烯类、多糖类材料。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211213909.6A CN115850792B (zh) | 2022-09-30 | 2022-09-30 | 一种高载量阴离子交换层析介质的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211213909.6A CN115850792B (zh) | 2022-09-30 | 2022-09-30 | 一种高载量阴离子交换层析介质的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115850792A CN115850792A (zh) | 2023-03-28 |
| CN115850792B true CN115850792B (zh) | 2024-01-30 |
Family
ID=85661314
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211213909.6A Active CN115850792B (zh) | 2022-09-30 | 2022-09-30 | 一种高载量阴离子交换层析介质的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115850792B (zh) |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001030495A1 (en) * | 1999-10-27 | 2001-05-03 | Basf Aktiengesellschaft | Ion exchange resins and methods of making the same |
| CN101497033A (zh) * | 2008-12-19 | 2009-08-05 | 浙江工业大学 | 一种阴离子交换型大孔晶胶介质及其制备方法 |
| WO2013187512A1 (ja) * | 2012-06-15 | 2013-12-19 | 旭化成メディカル株式会社 | アルカリ耐性を有するイオン交換温度応答性吸着材、及びその製造方法 |
| CA2889914A1 (en) * | 2012-11-01 | 2014-05-08 | Santosh RAHANE | Surface modification of porous base supports |
| CN104387517A (zh) * | 2014-11-19 | 2015-03-04 | 辽宁大学 | 一种改性甲基丙烯酸甲酯基微球的制备方法 |
| CN105001376A (zh) * | 2015-06-23 | 2015-10-28 | 天津大学 | 原子转移自由基聚合制备高容量蛋白质层析介质的方法 |
| CN108276526A (zh) * | 2018-01-26 | 2018-07-13 | 北京石油化工学院 | 一种高载量大孔径聚合物阳离子交换层析介质及其制备 |
| CN112756016A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-05-07 | 安徽皖仪科技股份有限公司 | 一种接枝型阴离子交换树脂色谱填料及其制备方法 |
-
2022
- 2022-09-30 CN CN202211213909.6A patent/CN115850792B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001030495A1 (en) * | 1999-10-27 | 2001-05-03 | Basf Aktiengesellschaft | Ion exchange resins and methods of making the same |
| CN101497033A (zh) * | 2008-12-19 | 2009-08-05 | 浙江工业大学 | 一种阴离子交换型大孔晶胶介质及其制备方法 |
| WO2013187512A1 (ja) * | 2012-06-15 | 2013-12-19 | 旭化成メディカル株式会社 | アルカリ耐性を有するイオン交換温度応答性吸着材、及びその製造方法 |
| CA2889914A1 (en) * | 2012-11-01 | 2014-05-08 | Santosh RAHANE | Surface modification of porous base supports |
| CN104387517A (zh) * | 2014-11-19 | 2015-03-04 | 辽宁大学 | 一种改性甲基丙烯酸甲酯基微球的制备方法 |
| CN105001376A (zh) * | 2015-06-23 | 2015-10-28 | 天津大学 | 原子转移自由基聚合制备高容量蛋白质层析介质的方法 |
| CN108276526A (zh) * | 2018-01-26 | 2018-07-13 | 北京石油化工学院 | 一种高载量大孔径聚合物阳离子交换层析介质及其制备 |
| CN112756016A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-05-07 | 安徽皖仪科技股份有限公司 | 一种接枝型阴离子交换树脂色谱填料及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 原子转移自由基聚合法制备强阴离子交换色谱填料及其在蛋白质分离中的应用;王婀娜;段淑静;何锡文;陈朗星;李文友;张玉奎;;化学学报(23);第2424-2428页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115850792A (zh) | 2023-03-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101546543B1 (ko) | 양이온 교환 크로마토그래피용 그래프트 공중합체 | |
| CA2732398C (en) | Graft copolymers for ion exchange chromatography | |
| Khumsap et al. | Epitope-imprinted polymers: applications in protein recognition and separation | |
| JP5250985B2 (ja) | 充填床用新規充填剤及びその用途 | |
| CN102068965B (zh) | 一种适于蛋白纯化的壳聚糖分离介质的制备方法 | |
| CN101193928A (zh) | 亲水性优异的新型填充剂及其制备方法 | |
| CN102164945A (zh) | 蛋白分离应用中的温度响应型聚合物颗粒 | |
| CN108276526B (zh) | 一种高载量大孔径聚合物阳离子交换层析介质及其制备 | |
| WO2015199196A1 (ja) | アフィニティークロマトグラフィー用担体 | |
| AU778045B2 (en) | Process for making fluorinated polymer adsorbent particles | |
| CN101463105B (zh) | 一种蛋白质印迹材料及其在人血清中白蛋白去除方面的应用 | |
| CN102343257A (zh) | 改进的色谱介质的制备方法以及使用方法 | |
| Kumar et al. | Purification of histidine‐tagged single‐chain Fv‐antibody fragments by metal chelate affinity precipitation using thermoresponsive copolymers | |
| Turková | [6] Immobilization of enzymes on hydroxyalkyl methacrylate gel | |
| CN104258826A (zh) | 一种活性/可控介孔材料表面离子印迹聚合物及其制备方法与应用 | |
| CN115850792B (zh) | 一种高载量阴离子交换层析介质的制备方法 | |
| CN101139409A (zh) | 功能化高分子磁性载体及其制备方法与应用 | |
| Mattiasson et al. | Metal-chelate affinity precipitation of proteins using responsive polymers | |
| CN111569849A (zh) | 一种固定化金属螯合层析介质及其制备方法与应用 | |
| CN108003287A (zh) | 一种基于丙烯酰胺族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物的制备方法 | |
| JPH04503408A (ja) | 非多孔質単分散ポリマー充填物質を含む高速アフィニティクロマトグラフカラム | |
| CN110563882B (zh) | 一种靶向心肌肌钙蛋白i的纳米人工抗体的制备方法与用途 | |
| CN111116851A (zh) | 一种核壳结构的多聚季铵盐磁性微球的制备方法 | |
| Yilmaz et al. | The noncovalent approach | |
| CN110551314A (zh) | 一种非生物纳米人工抗体的制备方法和用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |