CN108003287B - 一种基于丙烯酰胺族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物的制备方法 - Google Patents

一种基于丙烯酰胺族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子印迹聚合物技术领域,特别是一种基于丙烯酰族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物的制备方法。本发明的目的是针对上述技术分析和存在问题,提供一种基于丙烯酰族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物的制备方法。本发明技术方案为:一种基于丙烯酰胺族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物的制备方法,将丙烯酰胺族单体与二价金属离子螯合后,对目标蛋白进行特异性吸附结合、移除后得到的聚合物。本发明具有以下特点:本发明丙烯酰胺类单体带有金属螯合能力;本发明分子印迹水凝胶具有温度和pH双重敏感性;本发明采用反相悬浮技术;本发明为水凝胶聚合物。

Description

一种基于丙烯酰胺族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚 合物的制备方法
技术领域
本发明属于分子印迹聚合物技术领域,特别是一种基于丙烯酰族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物的制备方法。
技术背景
分子印迹技术是指制备对某一结构特定分子(通常称为模板分子或印迹分子)具有选择性识别能力的聚合物的技术,制备获得的聚合物称为分子印迹聚合物,简称 MIP。MIP是一种高化学和pH稳定性的聚合物,能够承受高温、高压和苛刻的酸碱条件,使用寿命长,制备简单,并且在三维空间上与模板分子结构匹配的空穴和与功能单体能形成的特定识别位点(催化或氢键)。
分子印迹聚合物因其优良选择性识别能力,目前已经成功应用在色谱分离、固相萃取、固相微萃取、抗体和受体模拟物、生物传感器等诸多领域,显示出广阔的发展前景。但是由于一系列的限制,目前分子印迹材料的研究和开发一般都是以小分子物质如氨基酸、金属离子、小分子有机物,药物等作为模板分子,而在大分子上的应用相对较少,这就限制了分子印迹技术在生物活性物质如核酸、蛋白、酶方面的应用。分子印迹技术在生物大分子尤其是蛋白质上的应用仍是具有一定难度的领域。
首先在功能单体与模板蛋白连接方式上,常用功能单体与模板蛋白直接通过微弱的氢键形成复合物,这种基于氢键形成的位点的作用力极弱,在水相条件很容易受到水的竞争,从而导致吸附容量下降。
(1)作为改进,Kempe等用表面印迹法制备了分离蛋白质的选择性吸附剂,但是1、该研究以甲基丙烯酸为单体,在Cu2+和核糖核酸酶存在下,核糖核酸酶表面的组氨酸能与金属离子进行螯合,暴露在组氨酸残基表面的咪唑基能够与金属螯合单体结合。2、该研究是表面印迹法,表面印迹法虽能使大分子自由进出键合位点,使表面成为印迹蛋白质的特异性目标位点,但表面印迹需要以通过复杂的制备步骤先获得载体材料,进而以载体材料为支撑进行表面分子印迹反应,该方法制备过程繁琐,成本较高,不适于大规模产业化和应用。3、该研究的铜离子是以离子交换的形式与聚合物上的羧酸基结合,离子交换作用力较弱,离子交换容量很低,容易受到缓冲体系下其他一价阳离子的竞争而流失,降低蛋白质的吸附容量。
其次在引发方式上,对于蛋白分子印迹,其结构特点限制了印迹后需要保留分子自身的生物活性,而蛋白分子对温度和有机溶剂比较敏感,一般分子印迹是以有机溶剂作为反应体系,合成中通常加热引发聚合,导致蛋白二级结构会发生变化,从而失去活性。
另外,传统分子印迹聚合物需要依靠高交联度来保持其印迹结构的刚性,所制备的是高度交联的聚合物,但交联度过高不仅使得分子印迹聚合物的外部形态松散易碎,还导致聚合物中模板分子的传质过程缓慢,吸附和脱附困难,残留的模板分子在使用过程中发生缓慢脱吸附。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术分析和存在问题,提供一种基于丙烯酰族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物的制备方法。
本发明技术方案为:
一种基于丙烯酰胺族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物的制备方法,其特征在于,将丙烯酰胺族单体与二价金属离子螯合后,对目标蛋白进行特异性吸附结合、移除后得到的聚合物。
进一步的,包括以下步骤:
S1取甲基丙烯酸酯类、丙烯酸酯类、丙烯酰氯类中的一种与0.5摩尔比亚氨基二乙酸或氨基三乙酸并搅拌混合,加入无水氢氧化钾进行反应,所述无水氢氧化钾与以上混合物摩尔比为(0.04-0.06):1,缓慢升高温度到60-80℃,反应3-6小时,减压蒸馏除去未反应完全的试剂和反应产物乙醇,调节pH至碱性,加入氯仿,摇晃后静置分层,去上层水溶液,减压干燥,得到丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体;
S2在水相介质中,加入上述步骤制备丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体,并引入0.1-0.3摩尔比的一种或多种二价金属离子,搅拌 30-120min进行螯合反应,所述的单体和二价金属离子形成稳定的八面体络合结构;
S3引入占单体5-25%质量比的蛋白模板分子,使金属螯合单体与蛋白模板分子形成稳定复合物;
S4加入一种或多种可与丙烯酰胺族单体共聚形成凝胶态聚合物的交联剂及引发剂和乳化剂吐温80,交联剂用量为单体物质的量的30-50%,引发剂用量为单体重量的1.3~12%,乳化剂用量为单体重量的0.2~2.5%;
S5将上述水相溶液加入由三氯甲烷、正己烷、司盘80组成的反相悬浮介质,所述水相溶液、三氯甲烷、正己烷、司盘80的体积比为(25~40):(20~40):(1~5):(15~25),通过100-15000转/分钟的搅拌速度搅拌使体系内形成粒径0.1-1000微米的油包水性乳液液滴,待悬浮液滴粒径稳定后,通入氮气;
S6通过加热方式引发或者紫外辐照方式引发使单体与交联剂共聚形成具有亲和印迹水凝胶聚合物。
S7使用乙腈、N,N'-二甲基甲酰胺、竞争络合剂中的一种,使蛋白模板分子从亲和印迹水凝胶聚合物上移除,即可得到基于丙烯酰胺族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物。
进一步的,S1中所述甲基丙烯酸酯类为甲基丙烯酸甲酯,甲基丙烯酸乙酯,甲基丙烯酸丁酯中的一种;所述丙烯酸酯类为丙烯酸甲酯,丙烯酸乙酯,丙烯酸丙酯中的一种;丙烯酰氯类包括甲基丙烯酰氯。
进一步的, S1为在配有搅拌桨,温度计,冷凝管和加料口的四口圆底烧瓶中,加入200ml三氯甲烷,50g甲基丙烯酸乙酯和0.5摩尔比亚氨基二乙酸并搅拌混合,加入1.8g 无水氢氧化钾进行反应,缓慢升高温度到80℃,该温度下反应3小时后,减压蒸馏除去未反应完全的甲基丙烯酸乙酯和反应产物乙醇,然后滴加1mol/l的NaOH调节pH至10,加入100ml的氯仿,摇晃后静置分层,去上层水溶液,旋转蒸发仪上减压干燥,得到丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体甲基丙烯酸基氨基二乙酸钠。
进一步的, S1为在配有搅拌桨,温度计,冷凝管和加料口的四口圆底烧瓶中,加入200ml三氯甲烷,100 g甲基丙烯酰氯和0.5摩尔比氨基三乙酸并搅拌混合,加入5g 无水氢氧化钾进行反应,缓慢升高温度到60℃,该温度下反应6小时后,减压蒸馏除去未反应完全的甲基丙烯酰氯和反应产物乙醇,然后滴加1mol/l的NaOH调节pH至10,加入180ml的氯仿,摇晃后静置分层,去上层水溶液,旋转蒸发仪上减压干燥,得到丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体甲基丙烯酸基氨基三乙酸钠。
进一步的, S2中二价金属离子为Fe2+、Co2+、Cu2+、Ni2+、Zn2+中的一种或多种。
进一步的, S2中二价金属离子用量为10-50mmol。
进一步的, S3中蛋白模板分子为牛血清白蛋白,溶菌酶,核糖核酸酶,血红蛋白中的一种或多种。
进一步的, S4中所述的交联剂为N,N′-亚甲基双丙烯酰胺,N,N′-亚苯基双丙烯酰胺,二丙烯酰胺基苯甲酸中的一种或多种的混合;所述水溶性引发剂为过硫酸铵或过硫酸钾;所述水溶性偶氮引发剂为偶氮二异丁基脒盐酸盐,偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐, 偶氮二氰基戊酸,偶氮二异丙基咪唑啉中的一种或多种的混合。
进一步的, S6中加热方式引发的加热温度为40-70℃,聚合时间2-24小时。
进一步的, S7将所制备的蛋白印迹亲和印迹水凝胶用100ml丙酮淋洗三次,每次淋洗后用100 ml蒸馏水冲洗;分别在50ml乙酸和50ml4%十二烷基磺酸钠水溶液中各浸泡2h后弃去溶液,并用蒸馏水反复冲洗至中性,滤干;进而在150 mL pH=7.5、含有0.05 mol/L的Tris-HCl和0.05mol/L咪唑的缓冲液中浸泡6h,期间定时更换缓冲液并测试其中蛋白质浓度以确定洗脱进程;待模板分子完全移除,得到基于丙烯酰胺族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物。
进一步的, S7中竞争络合剂是指可与丙烯酰胺族单体上的金属离子产生金属螯合相互作用的任何试剂,包括咪唑或乙二氨基四乙酸钠中的一种或多种的混合。
本发明具有以下特点:
1、本发明丙烯酰胺类单体带有金属螯合能力。
将甲基丙烯酸酯类、丙烯酸酯类或丙烯酰氯类通过化学方法偶联三配位的亚氨基二乙酸(IDA)或四配位的氮-三乙酸(NTA),螯合金属离子后,可以形成非常稳定的六面体或八面体结构,金属离子处于多面体的中心,从而有更多的位点与蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中与金属配位形成比较稳定的络合物,达到结合目的蛋白的亲和效果。相对于现有技术中金属离子仅以离子交换形式与单体结合,要稳定的多,螯合之后金属离子不易流失,大大提高了对蛋白质的吸附容量。
另一方面,本发明利用金属离子能特异性配位键合一些基团,利用蛋白质表面的氨基酸残基与金属离子的相互作用可实现对模板蛋白的特异性。螯合的二价金属离子(Fe2 +、Co2+、Cu2+、Ni2+、Zn2+)使整体材料具有较好的选择性和亲和性,可仅对特定区域结构的模板蛋白具有较好的选择性亲和。
2、本发明分子印迹水凝胶具有温度和pH双重敏感性
同时,由于采用甲基丙烯酸酯类、丙烯酸酯类、丙烯酰氯类中的一种与亚氨基二乙酸或氨基三乙酸在碱性条件下发生缩合反应,得到的单体存在亚酰胺结构,因此还具有温度敏感性和pH敏感性。结果显示,在34.8℃时甲基丙烯酸基氨基二乙酸钠与牛血清白蛋白以1∶2的配比强络合, 而在10.5℃时其以1∶1的比例弱络合。这表明温度的变化可以影响络合物的吸附及释放过程。本发明将分子印迹技术与温敏水凝胶技术相结合,制备具有温度敏感性的分子印迹水凝胶,可控制聚合物的网络形态,凝胶会发生相应的体积变化。除去模板分子后,该蛋白亲和印迹水凝胶聚合物在温度低临界温度时表现出溶胀特性,而在高临界温度时表现出收缩特性。pH敏感性使该分子印迹水凝胶对于生理条件也能实现对目标分子的自动识别或释放,此特性不仅能够提高聚合物对目标分子的专一识别能力,还可以通过调节外界环境的温度和离子强度,实现对目标分子的自动识别或释放。
3、本发明采用反相悬浮技术,
首先反相悬浮技术制成的包埋式分子印迹微球不需要进行传统的本体聚合材料后处理过程中的研磨,筛分过程,具有节约时间成本,制备效率高的优点。相对于表面聚合等方法,包埋式分子印迹微球制备过程简单,成本较低,获得的印迹微球结合容量更大,适于大规模蛋白的分离纯化生产需要。其次反相悬浮技术在水相介质中制备蛋白亲和印迹水凝胶聚合物,丙烯酰胺类单体在水相条件下进行蛋白质印迹,可形成交联度低的可溶胀凝胶聚合物,从而保证蛋白质大分子能够自由地进入聚合物内部空穴。同时,蛋白质是水溶性的生物大分子,对其识别主要是发生在水相体系中,因此在水相体系下进行分子印迹可使蛋白保持原有构型和构象。
4、本发明为水凝胶聚合物,
传统分子印迹聚合物需要依靠高交联度来保持其印迹结构的刚性,但交联度过高不仅使得分子印迹聚合物的外部形态松散易碎,还导致聚合物中模板分子的传质过程缓慢,吸附和脱附困难。而水凝胶聚合物,二级结构为低交联度的三维网络结构,这种结构具有比较致密的聚合物网络,能够减小聚合物空隙的尺寸增加交联的稳定性,而且能够创造更多的印记结合位点,以保证和模板分子更加稳定的相互作用以及更契合的结合部位。利用水凝胶聚合物特有的高度柔韧,克服了生物大分子受到印迹结构空隙大小和刚性的约束,为蛋白质大分子印迹提供了可行性,也为分子印迹水凝胶的温敏特性通过溶胀和收缩控制对目标分子的自动识别或释放提供了结构上的保证。
附图说明
图1丙烯酰胺族金属螯合单体制备的化学反应式。
图2 丙烯酰胺族IDA单体-Ni-His络合物结构示意图。
图3 的光学显微镜图。
图4 蛋白亲和印迹水凝胶的冷冻电子显微镜表征图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行进一步说明,实施例1、2为丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体的合成;实施例3、4、5为蛋白印迹亲和印迹水凝胶的制备。
实施例1
在配有搅拌桨,温度计,冷凝管和加料口的2L四口圆底烧瓶中,加入200ml三氯甲烷,加入50g甲基丙烯酸乙酯和0.5摩尔比亚氨基二乙酸并搅拌混合,加入1.8g 无水氢氧化钾进行反应,缓慢升高温度到80℃,该温度下反应3小时后,减压蒸馏除去未反应完全的甲基丙烯酸乙酯和反应产物乙醇,然后滴加1mol/l的NaOH调节pH至10,转移至500ml分液漏斗中。向分液漏斗中加入100ml的氯仿,摇晃后静置分层,去上层水溶液,旋转蒸发仪上减压干燥,得到85.3g白色产物,即丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体甲基丙烯酸基氨基二乙酸钠。
实施例2
在配有搅拌桨,温度计,冷凝管和加料口的2L四口圆底烧瓶中,加入200ml三氯甲烷,100 g甲基丙烯酰氯和0.5摩尔比氨基三乙酸并搅拌混合,加入5g 无水氢氧化钾进行反应,缓慢升高温度到60℃,该温度下反应6小时后,减压蒸馏除去未反应完全的甲基丙烯酰氯和反应产物乙醇,然后滴加1mol/l的NaOH调节pH至10,转移至500ml分液漏斗中。向分液漏斗中加入180ml的氯仿,摇晃后静置分层,去上层水溶液,旋转蒸发仪上减压干燥,得到152.6g白色产物,即丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体甲基丙烯酸基氨基三乙酸钠。
实施例3
(1)牛血清白蛋白印迹水凝胶聚合物 (MIP)的合成
A)在水相介质中,加入丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体甲基丙烯酸基氨基乙二酸钠60 mmoL,缓慢搅拌中加入10 mmoL硫酸镍,继续搅拌30 min,形成稳定络合物;
B)接着加入200mg的牛血清白蛋白BSA粉末,继续搅拌使其充分溶解;
C)然后加入30 mmol交联剂N,N′2亚甲基双丙烯酰胺,100mg引发剂过硫酸铵及20mg乳化剂吐温80。
D) 通过反相悬浮交联法进行分子印迹,将上述水相印迹体系制备成W/O油包水乳液液滴。具体方法如下:将上述水相溶液加入由三氯甲烷和正己烷和司盘80组成的反相悬浮介质,水相溶液、三氯甲烷、正己烷、司盘80的体积比为25:30:1:15,以500 rpm的速度进行机械搅拌60 min,待悬浮液滴粒径稳定后,通入氮气;
E)缓慢加热到70℃引发聚合反应,继续聚合6小时,制得分子印迹微球。
F)模板分子牛血清白蛋白的洗脱,将所制备的牛血清白蛋白印迹亲和印迹水凝胶每次用100 ml丙酮淋洗三次,然后每次用100 ml蒸馏水冲洗。然后用各50 ml乙酸和4%十二烷基磺酸钠水溶液浸泡2h后弃去溶液,并用蒸馏水反复冲洗至中性,滤干。进而在150 mLpH=7.5、含有0.05 mol/L的Tris-HCl和0.05mol/L咪唑的缓冲液中浸泡约6h,期间定时更换缓冲液并测试其中蛋白质浓度以确定洗脱进程。待模板分子完全移除,即可得到牛血清白蛋白BSA印迹微球。
(2)作为对比,非印迹聚合物球(NIP)的合成
A)在水相介质中,加入丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体甲基丙烯酸基氨基乙二酸钠60 mmoL,缓慢搅拌中加入10 mmol硫酸镍,继续搅拌30 min,形成稳定络合物;
B)然后加入30 mmol交联剂N,N′2亚甲基双丙烯酰胺,100 mg引发剂过硫酸铵及20mg乳化剂吐温80。
C)通过反相悬浮交联法进行分子印迹,将上述水相印迹体系制备成W/O油包水乳液液滴。具体方法如下:将上述水相溶液加入由三氯甲烷和正己烷和司盘80组成的反相悬浮介质,水相溶液、三氯甲烷、正己烷、司盘80的体积比为25:30:1:15,以500 rpm的速度进行机械搅拌约60min,待悬浮液滴粒径稳定后,通入氮气;
D)缓慢加热到70℃引发聚合反应,继续聚合6小时,制得分子印迹微球。
E)将所制备的非印迹亲和印迹水凝胶每次用100ml丙酮淋洗三次,然后每次用100ml蒸馏水冲洗。然后用各50ml乙酸和4%十二烷基磺酸钠水溶液浸泡2h后弃去溶液,并用蒸馏水反复冲洗至中性,滤干。
实施例4
(2) 血红蛋白印迹水凝胶聚合物 (MIP)的合成
A)在水相介质中,加入丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体甲基丙烯酸基氨基三乙酸钠315mmol,缓慢搅拌中加入35mmol氯化钴,继续搅拌90min,形成稳定络合物;
B)接着加入700mg的HGB粉末,继续搅拌使其充分溶解;
C)然后加入105mmol交联剂二丙烯酰胺基苯甲酸,350mg引发剂过硫酸铵及70 mg乳化剂吐温80。
D)通过反相悬浮交联法进行分子印迹,将上述水相印迹体系制备成W/O油包水乳液液滴。具体方法如下:将上述水相溶液加入由三氯甲烷和正己烷和司盘80组成的反相悬浮介质,水相溶液、三氯甲烷、正己烷、司盘80的体积比为35:25:5:20,以100rpm的速度进行机械搅拌约30min,待悬浮液滴粒径稳定后,通入氮气;
E)缓慢加热到40℃引发聚合反应,继续聚合6小时,制得分子印迹微球。
F)模板分子血红蛋白的洗脱:将所制备的血红蛋白印迹亲和印迹水凝胶每次用100ml丙酮淋洗三次,然后每次用100ml蒸馏水冲洗。然后用各50ml质量分数4%乙酸和4%十二烷基磺酸钠水溶液浸泡2h后弃去溶液,并用蒸馏水反复冲洗至中性,滤干。在150mL pH7.5、含有0.05 mol/L的Tris-HCl和0.05mol/L咪唑的缓冲液中浸泡约6h,期间定时更换缓冲液并测试其中蛋白质浓度以确定洗脱进程。待模板分子完全移除,即可得到血红蛋白HGB印迹微球。
(2)作为对比,非印迹聚合物球(NIP)的合成
A)在水相介质中,加入丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体甲基丙烯酸基氨基三乙酸钠315 mmol,缓慢搅拌中加入35mmol氯化钴,继续搅拌90min,形成稳定络合物;
B)然后加入105mmol交联剂二丙烯酰胺基苯甲酸,350mg引发剂过硫酸铵及70 mg乳化剂吐温80。
C)通过反相悬浮交联法进行分子印迹,将上述水相印迹体系制备成W/O油包水乳液液滴。具体方法如下:将上述水相溶液加入由三氯甲烷和正己烷和司盘80组成的反相悬浮介质,水相溶液、三氯甲烷、正己烷、司盘80的体积比为35:25:5:20,以100rpm的速度进行机械搅拌约30min,待悬浮液滴粒径稳定后,通入氮气;
D)缓慢加热到40℃引发聚合反应,继续聚合6小时,制得分子印迹微球。
E)将所制备的非印迹亲和印迹水凝胶每次用100ml丙酮淋洗三次,然后每次用100ml蒸馏水冲洗。然后用各50ml乙酸和4%十二烷基磺酸钠水溶液浸泡2h后弃去溶液,并用蒸馏水反复冲洗至中性,滤干。
实施例5
(1)溶菌酶印迹水凝胶聚合物 (MIP)的合成
A)在水相介质中,加入丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体甲基丙烯酸基氨基三乙酸钠450 mmol,缓慢搅拌中加入50mmol硫酸铜,继续搅拌120min,形成稳定络合物;
B)接着加入1000mg的溶菌酶粉末,继续搅拌使其充分溶解;
C)然后加入150mmol交联剂N,N′-亚苯基双丙烯酰胺,500mg引发剂过硫酸铵及100mg乳化剂吐温80。
D)通过反相悬浮交联法进行分子印迹,将上述水相印迹体系制备成W/O油包水乳液液滴。具体方法如下:将上述水相溶液加入由三氯甲烷和正己烷和司盘80组成的反相悬浮介质,水相溶液、三氯甲烷、正己烷、司盘80的体积比为40: 40:4:25以15000rpm的速度进行机械搅拌约180min,待悬浮液滴粒径稳定后,通入氮气;
E)缓慢加热到60℃引发聚合反应,继续聚合6小时,制得分子印迹微球。
F)模板分子血红蛋白的洗脱:将所制备的血红蛋白印迹亲和印迹水凝胶每次用100ml丙酮淋洗三次,然后每次用100ml蒸馏水冲洗。然后用各50ml质量分数4%乙酸和4%十二烷基磺酸钠水溶液浸泡2h后弃去溶液,并用蒸馏水反复冲洗至中性,滤干。在150mL pH7.5、含有0.05 mol/L的Tris-HCl和0.05mol/L咪唑的缓冲液中浸泡约6h,期间定时更换缓冲液并测试其中蛋白质浓度以确定洗脱进程。待模板分子完全移除,即可得到溶菌酶印迹微球。
(2)作为对比,非印迹聚合物球(NIP)的合成
A) 在水相介质中,加入丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体甲基丙烯酸基氨基三乙酸钠450mmol,缓慢搅拌中加入50mmol硫酸铜,继续搅拌120min,形成稳定络合物;
B)然后加入150mmol交联剂N,N′-亚苯基双丙烯酰胺,500mg引发剂过硫酸铵及100mg乳化剂吐温80。
C)通过反相悬浮交联法进行分子印迹,将上述水相印迹体系制备成W/O油包水乳液液滴。具体方法如下:将上述水相溶液加入由三氯甲烷和正己烷和司盘80组成的反相悬浮介质,水相溶液、三氯甲烷、正己烷、司盘80的体积比为40: 40:4:20,以15000rpm的速度进行机械搅拌约180min,待悬浮液滴粒径稳定后,通入氮气;
D)缓慢加热到60℃引发聚合反应,继续聚合6小时,制得分子印迹微球。
E)将所制备的非印迹亲和印迹水凝胶每次用100ml丙酮淋洗三次,然后每次用100ml蒸馏水冲洗。然后用各50ml乙酸和4%十二烷基磺酸钠水溶液浸泡2h后弃去溶液,并用蒸馏水反复冲洗至中性,滤干。
实施例6
(1)血红蛋白印迹水凝胶聚合物 (MIP)的合成
A)在水相介质中,加入丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体丙烯酸基氨基二乙酸钠100 mmol,缓慢搅拌中加入25mmol硫酸镍,继续搅拌90min,形成稳定络合物;
B)接着加入300mg的血红蛋白粉末,继续搅拌使其充分溶解;
C) 然后加入400 mmol交联剂二丙烯酰胺基苯甲酸,850 mg水溶性光引发剂二苯基碘鎓盐六氟磷酸盐和120 mg乳化剂吐温80。
D) 通过反相悬浮交联法进行分子印迹,将上述水相印迹体系制备成W/O油包水乳液液滴。具体方法如下:将上述水相溶液加入由三氯甲烷和正己烷和司盘80组成的反相悬浮介质,水相溶液、三氯甲烷、正己烷、司盘80的体积比为35:25:5:20,以300rpm的速度进行机械搅拌约30min,待悬浮液滴粒径稳定后,通入氮气;
E) 以功率为375瓦的直管高压汞紫外光源,辐照波长为320nm的紫外光引发聚合反应,继续聚合6小时,制得分子印迹微球。
F) 模板分子血红蛋白的洗脱:将所制备的血红蛋白印迹亲和印迹水凝胶每次用100ml丙酮淋洗三次,然后每次用100ml蒸馏水冲洗。然后用各50ml质量分数4%乙酸和4%十二烷基磺酸钠水溶液浸泡2h后弃去溶液,并用蒸馏水反复冲洗至中性,滤干。在150mL pH7.5、含有0.05 mol/L的Tris-HCl和0.05mol/L咪唑的缓冲液中浸泡约6h,期间定时更换缓冲液并测试其中蛋白质浓度以确定洗脱进程。待模板分子完全移除,即可得到血红蛋白HGB印迹微球。
(2)作为对比,非印迹聚合物球(NIP)的合成
A) 在水相介质中,加入丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体丙烯酸基氨基二乙酸钠100 mmol,缓慢搅拌中加入25mmol硫酸镍,继续搅拌90min,形成稳定络合物;
B) 然后加入400 mmol交联剂二丙烯酰胺基苯甲酸,850 mg水溶性光引发剂二苯基碘鎓盐六氟磷酸盐和120 mg乳化剂吐温80。
C)通过反相悬浮交联法进行分子印迹,将上述水相印迹体系制备成W/O油包水乳液液滴。具体方法如下:将上述水相溶液加入由三氯甲烷和正己烷和司盘80组成的反相悬浮介质,水相溶液、三氯甲烷、正己烷、司盘80的体积比为35:25:5:20,以300 rpm的速度进行机械搅拌约30min,待悬浮液滴粒径稳定后,通入氮气;
D) 以功率为375瓦的直管高压汞紫外光源,辐照波长为320nm的紫外光引发聚合反应,继续聚合6小时,制得分子印迹微球。
E) 将所制备的非印迹亲和印迹水凝胶每次用100ml丙酮淋洗三次,然后每次用100ml蒸馏水冲洗。然后用各50ml乙酸和4%十二烷基磺酸钠水溶液浸泡2h后弃去溶液,并用蒸馏水反复冲洗至中性,滤干。
实施例3所制备的牛血清白蛋白印迹亲和印迹水凝胶,粒径约为60-120μm,平均粒径90μm,交联度为25%,孔径达到500 nm,分别以溶菌酶和血红蛋白为对比分子,对牛血清白蛋白的分离因子达到4.52。而相对于非模板印迹微球,所制备的牛血清白蛋白印迹亲和印迹水凝胶的选择因子αMIPNIP为8.3,证明所制备的牛血清白蛋白印迹亲和印迹水凝胶具有高选择性。
实施例4所制备的血红蛋白印迹亲和印迹水凝胶,粒径约为700-1300μm,平均粒径1000μm,交联度为40%,孔径达到10nm,分别以溶菌酶和牛血清白蛋白为对比分子,对牛血红蛋白的分离因子达到3.2。而相对于非模板印迹微球,所制备的血红蛋白印迹亲和印迹水凝胶的选择因子αMIP/αNIP为12.0,证明所制备的血红蛋白印迹亲和印迹水凝胶具有高选择性。
实施例5所制备的溶菌酶印迹亲和印迹水凝胶,粒径约为0.07-0.13μm,平均粒径0.1μm,交联度为10%,孔径达到800nm,分别以血红蛋白和牛血清白蛋白为对比分子,对溶菌酶的分离因子达到6.5。而相对于非模板印迹微球,所制备的溶菌酶印迹亲和印迹水凝胶的选择因子αMIP/αNIP为5.6,证明所制备的溶菌酶印迹亲和印迹水凝胶具有高选择性。
实施例6所制备的血红蛋白印迹亲和印迹水凝胶,粒径约为240-4000μm,平均粒径300μm,交联度为25%,孔径达到15nm,分别以溶菌酶和牛血清白蛋白为对比分子,对血红蛋白的分离因子达到3.8。而相对于非模板印迹微球,所制备的血红蛋白印迹亲和印迹水凝胶的选择因子αMIP/αNIP为10.0,证明所制备的血红蛋白印迹亲和印迹水凝胶具有高选择性。
由于采用甲基丙烯酸酯类、丙烯酸酯类、丙烯酰氯类中的一种与亚氨基二乙酸或氨基三乙酸在碱性条件下缩合反应,得到的单体存在亚酰胺结构,因此还具有温度敏感性和pH敏感性,可通过温度控制聚合物的网络形态,实验表明,在34.8℃时甲基丙烯酸基氨基二乙酸钠与牛血清白蛋白以1∶2的配比强络合, 10.5℃时其以1∶1的比例弱络合。而在适宜pH范围内,凝胶结构发生变化,有利于蛋白的释放和识别。

Claims (11)

1.一种基于丙烯酰胺族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物的制备方法,其特征在于,将丙烯酰胺族单体与二价金属离子螯合后,对目标蛋白进行特异性吸附结合、移除后得到聚合物,包括以下步骤:
S1取甲基丙烯酸酯类、丙烯酸酯类、丙烯酰氯类中的一种与0.5摩尔比亚氨基二乙酸或氨基三乙酸并搅拌混合,加入无水氢氧化钾进行反应,所述无水氢氧化钾与以上混合物摩尔比为(0.04-0.06):1,缓慢升高温度到60-80℃,反应3-6小时,减压蒸馏除去未反应完全的试剂,调节pH至碱性,加入氯仿,摇晃后静置分层,去上层水溶液,减压干燥,得到丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体;
S2在水相介质中,加入上述步骤制备丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体,并引入0.1-0.3摩尔比的一种或多种二价金属离子,搅拌 30-120min进行螯合反应,所述的单体和二价金属离子形成稳定的八面体络合结构;
S3引入占单体5-25%质量比的蛋白模板分子,使金属螯合单体与蛋白模板分子形成稳定复合物;
S4加入一种或多种可与丙烯酰胺族单体共聚形成凝胶态聚合物的交联剂及引发剂和乳化剂吐温80,所述交联剂用量为单体物质的量的30-50%,所述引发剂用量为单体重量的1.3~12%,所述乳化剂用量为单体重量的0.2~2.5%;
S5将上述水相溶液加入由三氯甲烷、正己烷、司盘80组成的反相悬浮介质,所述水相溶液、三氯甲烷、正己烷、司盘80的体积比为(25~40):(20~40):(1~5):(15~25),通过100-15000转/分钟的搅拌速度搅拌使体系内形成粒径0.1-1000微米的油包水性乳液液滴,待悬浮液滴粒径稳定后,通入氮气;
S6通过加热方式引发或者紫外辐照方式引发使单体与交联剂共聚形成具有亲和印迹水凝胶聚合物;
S7使用乙腈、N,N'-二甲基甲酰胺、竞争络合剂中的一种,使蛋白模板分子从亲和印迹水凝胶聚合物上移除,即可得到基于丙烯酰胺族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述S1中所述甲基丙烯酸酯类为甲基丙烯酸甲酯,甲基丙烯酸乙酯,甲基丙烯酸丁酯中的一种;所述丙烯酸酯类为丙烯酸甲酯,丙烯酸乙酯,丙烯酸丙酯中的一种。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述S1为在配有搅拌桨,温度计,冷凝管和加料口的四口圆底烧瓶中,加入200ml三氯甲烷,50g甲基丙烯酸乙酯和0.5摩尔比亚氨基二乙酸并搅拌混合,加入1.8g 无水氢氧化钾进行反应,缓慢升高温度到80℃,该温度下反应3小时后,减压蒸馏除去未反应完全的甲基丙烯酸乙酯和反应产物乙醇,然后滴加1mol/l的NaOH调节pH至10,加入100ml的氯仿,摇晃后静置分层,去上层水溶液,旋转蒸发仪上减压干燥,得到丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体甲基丙烯酸基氨基二乙酸钠。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述S1为在配有搅拌桨,温度计,冷凝管和加料口的四口圆底烧瓶中,加入200ml三氯甲烷,100 g甲基丙烯酰氯和0.5摩尔比氨基三乙酸并搅拌混合,加入5g 无水氢氧化钾进行反应,缓慢升高温度到60℃,该温度下反应6小时后,减压蒸馏除去未反应完全的甲基丙烯酰氯和反应产物乙醇,然后滴加1mol/l的NaOH调节pH至10,加入180ml的氯仿,摇晃后静置分层,去上层水溶液,旋转蒸发仪上减压干燥,得到丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体甲基丙烯酸基氨基三乙酸钠。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述S2中二价金属离子为Fe2+、Co2+、Cu2+、Ni2+、Zn2+中的一种或多种。
6.根据权利要求1或5所述的制备方法,其特征在于,所述S2中二价金属离子用量为10-50mmol。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述S3中蛋白模板分子为牛血清白蛋白,溶菌酶,核糖核酸酶,血红蛋白中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述S4中所述的交联剂为N,N′-亚甲基双丙烯酰胺,N,N′-亚苯基双丙烯酰胺,二丙烯酰胺基苯甲酸中的一种或多种的混合;所述引发剂为过硫酸铵、过硫酸钾、偶氮二异丁基脒盐酸盐、偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐、 偶氮二氰基戊酸、偶氮二异丙基咪唑啉中的一种或多种的混合。
9.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述S6中加热方式引发的加热温度为40-70℃,聚合时间2-24小时。
10.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述S7将所制备的蛋白印迹亲和印迹水凝胶用100ml丙酮淋洗三次,每次淋洗后用100 ml蒸馏水冲洗;分别在50ml乙酸和50ml4%十二烷基磺酸钠水溶液中各浸泡2h后弃去溶液,并用蒸馏水反复冲洗至中性,滤干;进而在150 mL pH=7.5、含有0.05 mol/L的Tris-HCl和0.05mol/L咪唑的缓冲液中浸泡6h,期间定时更换缓冲液并测试其中蛋白质浓度以确定洗脱进程;待模板分子完全移除,得到基于丙烯酰胺族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物。
11.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述S7中竞争络合剂包括咪唑或乙二氨基四乙酸钠中的一种或多种的混合。
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