DE102007049335A1

DE102007049335A1 - Wasserlösliche Polymere mit Chelatoren

Info

Publication number: DE102007049335A1
Application number: DE102007049335A
Authority: DE
Inventors: Roland Dr. Fabis; Bernd Springer
Original assignee: Qiagen GmbH
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 2007-10-12
Filing date: 2007-10-12
Publication date: 2009-04-16
Also published as: US20100261289A1; WO2009050125A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein funktionalisiertes Polymer, welches eine hohe Löslichkeit in mindestens einem Lösemittel mit einem hohen ET(30)-Wert aufweist und mit mindestens einem N-haltigen Carboxylatchelator funktionalisiert ist.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der funktionalisierten Polymere, insbesondere solcher Polymere, welche in der Lage sind, Biomoleküle zu binden.
Technischer Hintergrund
Für viele Reinigungs- oder Assayanwendungen von Biomolekülen im Multiplexmaßstab ist der Einsatz von modifizierten Mikrotiterplatten zur zumindest zeitweisen Immobilisierung der Biomoleküle von Vorteil. Um Mikrotiterplatten für eine kovalente Immobilisierung von Biomolekülen chemisch zu modifizieren, benötigt man nach dem Stand der Technik entweder aufwendige chemische Modifikationsverfahren, wie Carboxymethylierung, oder aufwendige Geräte zur Bestrahlung der Platten.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die beschriebenen, sich aus dem Stand der Technik ergebenden Nachteile zu überwinden und insbesondere für eine weiten Spanne von Anwendungen ein funktionalisiertes wasserlösliches Polymer bzw. Copolymer zu schaffen, welches einfach bei Zugabe durch Pipettieren in wässriger oder organischer Lösung in der Lage ist, Kunststoff- und andere Oberflächen zu beschichten.
Die Aufgabe wird durch ein funktionalisiertes Polymer gemäß Anspruch 1 der vorliegenden Erfindung gelöst. Demgemäß wird ein funktionalisiertes Polymer bereitgestellt, welches eine Löslichkeit von ≥ 10 mg/ml in mindestens einem Lösemittel mit einem E_T(30)-Wert von ≥ 45 bis ≤ 65 aufweist und mit mindestens einem N-haltigen Carboxylatchelator funktionalisiert ist.
Unter „E_T(30)-Wert" innerhalb der vorliegenden Erfindung wird insbesondere die Polarität eines Lösemittels verstanden, wobei sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung auf die Werte bezogen wird, welche in Reichart; Dimroth Fortschr. Chem. Forsch. 1969, 11, 1–73, Reichart Angew. Chem. 1979, 91, 119–131 sowie zitiert in March, Advanced Organic Chemistry, 4. Auflage, J. Wiley & Sons, 2001, Tabelle 10.13, S. 453 veröffentlicht worden sind. Bevorzugte Lösemittel (gemäß einer dementsprechend bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung) sind Wasser (pH = 7) und Ethanol.
Unter einem „N-haltigen Carboxylatchelator" wird insbesondere eine Moleküleinheit verstanden, welche eine oder mehrere Carboxyl- und/oder Carbonsäureeinheiten sowie eine oder mehrere Amineinheiten aufweist.
Ein derartiges funktionalisiertes Polymer bietet für eine weite Spanne von Anwendungen innerhalb der vorliegenden Erfindungen mindestens einen der folgenden Vorteile:

– Dadurch, dass die Löslichkeit innerhalb der angegebenen Grenzen liegt, ist das Polymer oftmals einfach durch Pipettieren auf einer Glas- oder Kunststoffoberfläche (etwa einer Mikrotiterplatte) aufbringbar; jedoch kann innerhalb einer weiten Spanne von Anwendungen der vorliegenden Erfindung das Polymer auch sehr einfach wieder entfernt werden.
– Durch den mindestens einen Chelator ist das Polymer innerhalb einer weiten Spanne von Anwendungen der vorliegenden Erfindung in der Lage, Biomoleküle je nach den Anwendungsbedingungen reversibel und/oder irreversibel zu binden. Diese Methode gestattet eine freie Wahl des zur Bindung, Aufreinigung oder Nachweis verwendeten Kunststoffmaterials, da keine mit funktioneller Gruppe vorbehandelten Kunststoffoberflächen eingesetzt werden müssen.
– Durch den einfachen und nicht an bestimmte Formate gebundenen Beschichtungsprozess aus der Polymerlösung ist die hier beschriebene Erfindung innerhalb einer weiten Spanne von Anwendungen in besonderer Weise für Anwendungen im Bereich Microfluidics geeignet.
– Die Beschichtung durch einfaches Hineinpipettieren und Entfernen der Flüssigkeit kann ohne Hinzufügen teurer und komplexer Geräte durchgeführt werden. Es werden z. B. kein Plasmagenerator, Strahlenquelle oder aggressive Gase wie Ozon benötigt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist das funktionalisierte Polymer eine Löslichkeit von ≥ 25 mg/ml, bevorzugt ≥ 50 mg/ml, sowie am meisten bevorzugt ≥ 100 mg/ml in mindestens einem Lösemittel mit einem E_T(30)-Wert von ≥ 48 bis ≤ 65 sowie am meisten bevorzugt ≥ 50 bis ≤ 65 auf.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besitzt das Polymer eine Chelatorkonzentration von ≥ 2 Gew-% bis ≤ 75 Gew-%. Dabei wird unter dem „Chelator" ggf. allein die chelatisierende Gruppe (wie z. B. eine Iminoessigsäureeinheit; genaueres s. u.) verstanden.
Bevorzugt besitzt das Polymer eine Chelatorkonzentration von ≥ 5 Gew-% bis ≤ 70 Gew-%, noch bevorzugt ≥ 10 Gew-% bis ≤ 50 Gew-%.
Dies hat sich für viele Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung als vorteilhaft herausgestellt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Polymer ein linear und/oder quervernetztes Grundgerüst ausgewählt aus der Gruppe Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Poly(meth)acrylat, Poly(meth)acrylamid sowie Copolymere beliebiger Mischungen daraus.
Dies hat sich für eine breite Spanne von Anwendungen innerhalb der vorliegenden Erfindung als vorteilhaft herausgestellt, da so die gewünschte Löslichkeit sehr einfach erreicht werden kann.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das verwendete Polymer linear oder weist einen Quervernetzungsgrad von ≤ 20% auf.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der mindestens eine N-haltige Carboxylatchelator ausgewählt aus der Gruppe enthaltend
wobei R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe enthaltend Wasserstoff, Halogen, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Halogenalkyl, Aryl, Alkoxy, Pseudohalogen;
n1, n2 und n3 jeweils unabhängig voneinander 0 bis 5 betragen;
wobei R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ und R₆ jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe enthaltend Wasserstoff, Halogen, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Halogenalkyl, Aryl, Alkoxy, Pseudohalogen;
n1, n2 und n3 jeweils unabhängig voneinander 0 bis 5 betragen;
wobei R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe enthaltend Wasserstoff, Halogen, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Halogenalkyl, Aryl, Alkoxy, Pseudohalogen;
n1, n2 und n3 jeweils unabhängig voneinander 0 bis 5 betragen;
wobei R₁, R₂, R₃ und R₄ jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe enthaltend Wasserstoff, Halogen, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Halogenalkyl, Aryl, Alkoxy, Pseudohalogen;
n1, n2 und n3 jeweils unabhängig voneinander 0 bis 5 betragen;
wobei R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ und R₆ jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe enthaltend Wasserstoff, Halogen, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Halogenalkyl, Aryl, Alkoxy, Pseudohalogen;
n1, n2 und n3 jeweils unabhängig voneinander 0 bis 5 betragen und n4 von 1 bis 5 beträgt;
oder Mischungen daraus.
Es sei darauf hingewiesen, dass mit
die Stelle bzw. Bindung im Chelator bezeichnet wird, über die der Chelator – ggf. über weitere „Brücken" oder chemische Funktionalitäten mit dem Grundgerüst verbunden ist.
Diese Anbindung kann z. B. über sämtliche dem Fachmann bekannte chemische Funktionalitäten oder „Brücken" erfolgen; in der Praxis haben sich bei vielen Anwendungen insbesondere bewährt:

– Ester/Amidknüpfungen
– Anbindungen via Öffnung von Epoxiden oder Thiiranen
– Anbindungen über Olefinmethathesereaktionen, insbesondere unter Zuhilfenahme von „Grubbs-Katalysatoren"
– Anbindungen über Thioether oder Sulfonsäuregruppen
– Iminbildungen via „Schiff-Base"-Reaktionen und/oder reduktive Aminierung, entweder über Reaktion mit komplexen Hydriden wie Natriumcyanoborhydrid et al. oder über „Staudinger-Chemie"
– Anbindung an Arylgruppen über Suzuki/Sonogashira oder Heck-Kupplungen
– Diels-Alder Reaktionen oder [3 + 2] dipolare Cycloadditionen.

allgemeine Gruppendefinition:
Innerhalb der Beschreibung und den Ansprüchen werden allgemeine Gruppen, wie z. B: Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkoxy, Aryl etc. beansprucht und beschrieben. Wenn nicht anders beschrieben, werden bevorzugt die folgenden Gruppen innerhalb der allgemein beschriebenen Gruppen im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet:
Alkyl: lineare und verzweigte C1-C8-Alkyle,
Alkenyl: C2-C8-alkenyl,
Alkinyl: C2-C8-alkinyl,
Cycloalkyl: C3-C8-cycloalkyl,
Alkoxy: C1-C6-alkoxy,
Aryl: ausgewählt aus Aromaten mit einem Molekulargewicht unter 300Da.
Halogen: ausgewählt aus der Gruppe enthaltend: F; Cl; Br und I,
Halogenalkyl: ausgewählt aus der Gruppe enthaltend mono, di, tri-, poly und perhalogenierte lineare und verzweigte C1-C8-Alkyle
Pseudohalogen: ausgewählt aus der Gruppe enthaltend -CN, -SCN, -OCN, N3, -CNO, -SeCN
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist zumindest ein Teil der Chelatoren des Polymers mit einem Metall komplexiert bzw. komplexierbar, welches bevorzugt aus der Gruppe enthaltend Co, Ni, Fe, Zn, Cu, Mn oder Mischungen daraus ausgewählt ist.
Dies hat sich insbesondere bei der reversiblen Bindung von sog. „His-getaggten" Biomolekülen bei vielen Anwendungen der vorliegenden Erfindung als hilfreich herausgestellt. Dabei sind „His-getaggte" Proteine im Sinne der vorliegenden Er findung insbesondere solche Proteine, die eine Folge von mehreren, bevorzugt 6–10 Histidineinheiten, die von weiteren Aminosäuren unterbrochen sein können, aufweisen.
Es sei darauf hingewiesen, dass die oben angegebenen Löslichkeitswerte und Chelatorkonzentrationen jeweils auf unkomplexierte Polymere beziehen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf eine Mikrotiterplatte, umfassend mindestens einen mit einem erfindungsgemäßen Polymer versehenen Oberflächenbereich.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt das Polymer als Monolayer vor.
Bevorzugt wird die Mikrotiterplatte dadurch hergestellt, dass der mit dem Polymer zu versehene Oberflächenbereich mit einer Lösung, enthaltend ≥ 5 mg/ml Polymer versetzt wird, man diese für eine ausreichende Zeitspanne einwirken lässt und dann die Lösung abpipettiert.
Bevorzugt wird die Mikrotiterplatte dadurch hergestellt, dass der mit dem Polymer zu versehene Oberflächenbereich mit einer Lösung, enthaltend das Polymer versetzt wird und das Lösemittel durch Abdampfen entfernt wird. Diese Herstellungsweise hat sich insbesondere dann bewährt, wenn als Lösemittel leicht flüchtige Verbindungen wie z. B. Ethanol gewählt werden. In diesem Fall kann das Lösemittel oftmals einfach durch Stehenlassen entfernt werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zur zumindest reversiblen Bindung eines Biomoleküls, vorzugsweise eines His-enthaltenden Moleküls, umfassend

(a) Bereitstellen einer mit einem erfindungsgemäßen Polymer versehenen Oberfläche, bevorzugt einer Mikrotiterplatte
(b) Versetzen der Oberfläche mit einer Lösung, welche mindestens ein His-enthaltendes Molekül enthält

Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zur Identifikation eines Biomoleküls, vorzugsweise eines His-enthaltenden Moleküls in einer vorzugsweise wässrigen Lösung, umfassend

(a) Bereitstellen einer mit einem erfindungsgemäßen Polymer versehenen Oberfläche, bevorzugt einer Mikrotiterplatte
(b) Versetzen der Oberfläche mit der Lösung
(c) Nachweis des Moleküls

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt Schritt (c) mittels optischer und/oder spektroskopischer Methoden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren zusätzlich den Schritt (z) des Lösens des Moleküls von dem Polymer.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt der Schritt (z) durch Versetzen mit Histidin und/oder Imidazol.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polymers und/oder einer erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte zur Identifikation von Biomolekülen, vorzugsweise von His-getaggten Molekülen in einer vorzugsweise wässrigen Lösung.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polymers und/oder einer erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte zur zumindest teilweisen Abtrennung von Biomolekülen, vorzugsweise von His-getaggten Molekülen in einer vorzugsweise wässrigen Lösung.
Die vorgenannten sowie die beanspruchten und in den Ausführungsbeispielen beschriebenen erfindungsgemäß zu verwendenden Komponenten unterliegen in ihrer Größe, Formgestaltung, Materialauswahl und technischen Konzeption keinen besonderen Ausnahmebedingungen, so dass die in dem Anwendungsgebiet bekannten Auswahlkriterien uneingeschränkt Anwendung finden können.
Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile des Gegenstandes der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen sowie aus der nachfolgenden Beschreibung, der zugehörigen Beispiele, in denen – exemplarisch – mehrere Ausführungsbeispiele sowie Einsatzmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung dargestellt sind.
Es versteht sich, dass die nachfolgenden Beispiele rein illustrativ zu betrachten sind und keine Einschränkung der vorliegenden Erfindung darstellen sollen, welche ausschließlich durch die Ansprüche festgelegt wird.
A) Ni-NTA funktionalisiertes Methacrylsäuremethylester-co-Methacrylsäure Polymer
5 g Poly(methyl methacrylate-co-methacrylic acid), Mw 34.000, 1/0,16 (Aldrich, Kat. # 376914) werden in einem 250 ml Rundkolben mit 100 ml Millipore Wasser versetzt und der pH-Wert der Suspension auf 6,0 eingestellt. Man versetzt mit 1 g N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimid (EDC) und lässt am Rotati onsverdampfer bei RT und 100 rpm 30 Minuten reagieren. Dann filtriert man durch eine Glasfilternutsche, Por. 4 (Standartangabe zur Porosität resp. Porengröße), ab und nimmt den Rückstand sofort in einer Lösung von 10 g 6-Aminocapronsäure in Millipore Wasser, pH 7,5 auf. Man lässt zwei Stunden bi RT und 100 rpm am Rotationsverdampferreagieren, kühlt dann auf 0°C herab und filtriert dann erneut durch eine Glasfilternutsche, Por. 4, ab. Anschließend wäscht man mit 25 ml gekühltem Millipore Wasser und saugt gründlich trocken. Man suspendiert den Rückstand dann erneut in 100 ml Millipore Wasser und setzt 1 g EDC zu. Dann lässt man 30 Minuten am Rotationsverdampferbei 100 rpm und RT reagieren und saugt dann erneut durch die Glasfilternutsche ab. Der Rückstand wird dann sofort mit 25 ml NTA Lösung und 75 ml Millipore Wasser versetzt und am Rotationsverdampfer zwei Stunden lang bei RT und 100 rpm reagieren gelassen. Anschließen lässt man über Nacht abkühlen und filtriert durch eine Glasfilternutsche, Por. 4, ab. Man wäscht mit 25 ml eisgekühltem VE Wasser nach, saugt gründlich trocken und nimmt den Rückstand in 100 ml einer 1%igen Nickelsulfatlösung auf. Man lässt zwei Stunden bei RT und 100 rpm am Rotationsverdampferreagieren, saugt dann erneut ab, wascht zweimal mit je 25 ml eiskaltem Millipore Wasser, saugt gründlich trocken und trocknet dann das entstandene Produkt bei RT im Vakuumtrockenschrank.
Das so entstandene Polymer weist eine Löslichkeit von 10 mg/ml in Wasser sowie eine Chelatorkonzentration von 15% auf
B) Ni-NTA funktionalisiertes Polyvinylphenol
5 g Polyvinylphenol (Polysciences, Kat. # 06527) werden in einem 250 ml Rundkolben in 100 ml 1,4-Dioxan gelöst und mit 2 g Natriumhydroxid-Perlen und 4,9 ml Epichlorhydrin versetzt. Das Reaktionsgemisch wird an einen Rotationsver dampfer gehängt und vier Stunden lang bei 100 rpm und 50°C umgesetzt. Anschließend destilliert man die leichflüchtigen Bestandteile zuerst am Rotationsverdampfer (100 mbar, 60°C) und anschließend an der Hochvakuumanlage (auf 50°C erhitzen) ab, bis sämtliches Epichlorhydrin entwichen ist. Der trockene Rückstand wird, damit keine Anhaftungen zurückbleiben, aus dem Kolben gekratzt und mit einem Gemisch aus 25 ml NTA-Lösung und 75 ml Millipore Wasser versetzt. Man lässt das Gemisch am Rotationsverdampfer über Nacht (16 h) bei 75°C reagieren. Am nächsten Morgen stellt man das Produktgemisch bei –20°C für einen Tag in den Gefrierschrank und saugt dann, wenn ein Niederschlag vorhanden ist, über eine Glasfilternutsche, Por. 4, ab. Man wäscht mit 25 ml eisgekühltem VE Wasser nach, saugt gründlich trocken.
Das so entstandene Polymer weist eine Löslichkeit von 20 mg/ml in Wasser sowie eine Chelatorkonzentration von 50% auf.
Anschließend wird das Polymer in 100 ml einer 1%igen Nickelsulfatlösung aufgenommen. Man lässt zwei Stunden bei RT und 100 rpm am Rotationsverdampfer reagieren, saugt dann erneut ab, wäscht zweimal mit je 25 ml eiskaltem Millipore Wasser, saugt gründlich trocken und trocknet dann das entstandene Produkt bei RT im Vakuumtrockenschrank.
C) Ni-IDA Modifikation von Polystyrol-co-Allylalkohol
5 g Polystyrol-co-Allylalkohol (Aldrich, Kat. # 19,110-8) werden in einem 250 ml Rundkolben in 100 ml 1,4-Dioxan gelöst und mit 2 g Natriumhydroxid-Perlen und 4,9 ml Epichlorhydrin versetzt. Das Reaktionsgemisch wird an einen Rotationsverdampfer gehängt und vier Stunden lang bei 100 rpm und 50°C umgesetzt. An schließend destilliert man die leichflüchtigen Bestandteile zuerst am Rotationsverdampfer (100 mbar, 60°C) und anschließend an einer Hochvakuumanlage (auf 50°C erhitzen) ab, bis sämtliches Epichlorhydrin entwichen ist. Der trockene Rückstand wird, damit keine Anhaftungen zurückbleiben, aus dem Kolben gekratzt und mit einer Lösung aus 5 g Iminodiessigsäure in 95 ml 500 mM Natronlauge versetzt. Man lässt das Gemisch am Rotationsverdampfer über Nacht (16 h) bei 75°C reagieren. Am nächsten Morgen stellt man das Produktgemisch bei –20°C für einen Tag in den Gefrierschrank und saugt dann, wenn ein Niederschlag vorhanden ist, über eine Glasfilternutsche, Por. 4, ab. Man wäscht mit 25 ml eisgekühltem VE Wasser nach, saugt gründlich trocken.
Das so entstandene Polymer weist eine Löslichkeit von 25 mg/ml in Wasser sowie eine Chelatorkonzentration von 40% auf.
Anschließend wird das Polymer in 100 ml einer 100 mM Nickelchloridlösung aufgenommen. Man lässt zwei Stunden bei RT und 100 rpm am Rotationsverdampfer reagieren, saugt dann erneut ab, wascht zweimal mit je 25 ml eiskaltem 50 mM Tris-Puffer, pH 7,0, dann 2 × mit je 25 ml eiskaltem Millipore Wasser, saugt gründlich trocken und trocknet dann das entstandene Produkt bei RT im Vakuumtrockenschrank.
D) Poly(4-vinylphenol), modifiziert mit Carboxymethylaspartat
5 g Poylvinylphenol (Polysciences, Kat. # 06527) werden in 50 ml einer 1 mol/L Natronlauge suspendiert. Nach einer halben Stunde Einwirkzeit, werden 4,9 ml (63 mmol) Epichlorhydrin zugesetzt und das Reaktionsgemisch 4 h bei 60°C am Rotationsverdampfer gerührt. Anschließend nutscht man über eine Glasfritte, Por. 3, ab und wascht fünfmal mit 50 mL VE-Wasser. Dann nimmt man den Rückstand mit 50 ml 1 mol/l Natronlauge aufnehmen und versetzt mit 8,4 g (63 mmol) L-Asparaginsäure. Man lässt am Rotationsverdampfer für 4 h bei 80°C reagieren und anschließend abkühlen. Am nächsten Morgen wird die Suspension abgenutscht und fünfmal mit 50 mL VE-Wasser gewaschen.
Der Rückstand wird in 50 mL einer 1,5 mol/l NaOH aufgenommen und mit 8,8 g (63 mmol) Bromessigsäure versetzt. Das Reaktionsprodukt wird 16 Stunden lang am Rotationsverdampfer auf 60°C erhitzt, nach Abkühlen abgenutscht und fünfmal mit 50 mL VE-Wasser gewaschen.
Anschließend wird der Rückstand mit 75 mL einer mol/l CoSO₄-Lösung versetzt und 4 h bei RT am Rotationsverdampfer inkubiert. Danach saugt man ab und wäscht fünfmal mit je 50 ml VE-Wasser. Nach gründlichem Trockensaugen wird das Polymer im Vakuumtrockenschrank bei 40°C getrocknet.
Das so entstandene Polymer weist eine Löslichkeit von 20 mg/ml in Wasser sowie eine Chelatorkonzentration von 50% auf
Anwendungen:
E) Direkter Proteinnachweis über die Anbindung an verschiedene Ni-NTA- bzw. IDA- und Carboxymethylaspartat-modifizierte Polymere mittels Pre-coating
In die Wells einer Mikrotiterplatte wird eine wässrigen Lösung des Polymers mit einer Konzentration von 1,5 mg/mL aus Herstellvorschrift A) bis D) gegeben. Man lässt 30 Minuten einwirken, entfernt die Polymerlösung durch Pipettieren, wäscht zweimal mit Millipore-Wasser und trocknet dann die beschichtete Platte.
Man setzt 200 μl einer Proteinkonzentrationsreihe von 6 × His getaggtem GFP Protein in PBS/BSA-Puffer (eingestellt auf pH 7,2–7,5) mit 0, 2, 5, 10, 20, 50, 100 und 200 ng Protein zu. Dann lässt man eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Die Lösung wird durch Pipettieren aus der Mikrotiterplatte entfernt und die Wells durch viermaliges Waschen mit PBS/Tween-Puffer gereinigt. Dann setzt man 200 μl PBS Puffer zu und vermisst die Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 511 nm.
F) Proteinnachweis über die Anbindung an verschiedene Ni-NTA- bzw. IDA- und Carboxymethylaspartat-modifizierte Polymere (Immunoassay) mittels Precoating
In die Wells einer Mikrotiterplatte wird eine wässrigen Lösung des Polymers mit einer Konzentration von 1,5 mg/ml aus Herstellvorschrift A) bis D) gegeben. Man lässt 30 Minuten einwirken, entfernt die Polymerlösung durch Pipettieren, wäscht zweimal mit Millipore-Wasser und trocknet dann die beschichtete Platte.
Man setzt 200 μl einer Proteinkonzentrationsreihe von 6 × His- und Tag 100 markiertem Thioredoxin in PBS/BSA-Puffer (eingestellt auf pH 7,2–7,5) mit 0, 2, 5, 10, 20, 50, 100 und 200 ng Protein zu. Dann lässt man eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Die Lösung wird durch Pipettieren aus der Mikrotiterplatte entfernt und die Wells durch viermaliges Waschen mit PBS/Tween-Puffer gereinigt. Dann setzt man 200 μl einer 1/1000 Verdünnung des Erst-Antikörpers zu und lässt 60 Minuten bei RT auf einem Schüttler inkubieren. Anschließend wascht man viermal mit PBS/Tween-Puffer. Nach Zugabe von 200 μl einer 1/2000 Verdünnung in PBS/BSA-Puffer des Zweit-Antikörpers wird die Mikrotiterplatte 60 Minuten bei RT auf einem Schüttler inkubieren gelassen. Anschließend wascht man viermal mit PBS/Tween-Puffer. Dann setzt man 200 μl der Substratlösung zu und stoppt die Reaktion nach 20 Minuten mit 50 μl 3 mol/l HCl ab. Anschließend vermisst man die Absorption bei 492 nm.
G) Proteinnachweis über die Anbindung an verschiedene Ni-NTA- bzw. IDA- und Carboxymethylaspartat-modifizierte Polymere ohne Pre-Coating
Man setzt 200 μl einer Protein-Polymerkonzentrationsreihe in PBS/BSA-Puffer (eingestellt auf pH 7,2–7,5) von GFP Protein mit 0, 2, 5, 10, 20, 50, 100 und 200 ng Protein mit 300 ng gelöstem Polymer [hergestellt nach Beispiel A) bis D)] in der Polymerlösung zu. Dann lässt man eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Die Lösung wird durch Pipettieren aus der Mikrotiterplatte entfernt und die Wells durch viermaliges Waschen mit PBS/Tween-Puffer gereinigt. Dann setzt man 200 μl einer 1/2000 Verdünnung in PBS/BSA-Puffer des Erst-Antikörpers zu und lässt 60 Minuten bei RT auf einem Schüttler inkubieren. Anschließend wäscht man viermal mit PBS/Tween-Puffer. Nach Zugabe von 200 μl einer 1/10000 Verdünnung in PBS/BSA-Puffer des Zweit-Antikörpers wird die Mikrotiterplatte 60 min bei RT auf einem Schüttler inkubieren gelassen. Anschließend wascht man viermal mit PBS/BSA-Puffer. Dann setzt man 200 μl der Substratlösung zu und stoppt die Reaktion nach 20 Minuten mit 50 μl 3 mol/L HCl ab. Anschließend vermisst man die Absorption bei 492 nm.
H) Proteinnachweis über die Anbindung an verschiedene Ni-NTA- bzw. IDA- und Carboxymethylaspartat-modifizierte Polymere ohne Pre-Coating
Man setzt 200 μl einer Protein-Polymerkonzentrationsreihe in PBS/BSA-Puffer (eingestellt auf pH 7,2–7,5) von Thioredoxin mit 0, 2, 5, 10, 20, 50, 100 und 200 ng Protein mit 300 ng gelöstem Polymer [hergestellt nach Beispiel A) bis D)] in der Polymerlösung zu. Dann lässt man eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Die Lösung wird durch Pipettieren aus der Mikrotiterplatte entfernt und die Wells durch viermaliges Waschen mit PBS/Tween-Puffer gereinigt. Dann setzt man 200 μl einer 1/1000 Verdünnung in PBS/BSA-Puffer des Erst-Antikörpers zu und lässt 60 Minuten bei RT auf einem Schüttler inkubieren. Anschließend wascht man viermal mit PBS/Tween-Puffer. Nach Zugabe von 200 μl einer 1/2000 Verdünnung in PBS/BSA-Puffer des Zweit-Antikörpers wird die Mikrotiterplatte 60 Minuten bei RT auf einem Schüttler inkubieren gelassen. Anschließend wascht man viermal mit PBS/Tween-Puffer. Dann setzt man 200 μl der Substratlösung zu und stoppt die Reaktion nach 20 Minuten mit 50 μl 3 mol/L HCl ab. Anschließend vermisst man die Absorption bei 492 nm.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Reichart; Dimroth Fortschr. Chem. Forsch. 1969, 11, 1–73 [0005]
- Reichart Angew. Chem. 1979, 91, 119–131 [0005]
- March, Advanced Organic Chemistry, 4. Auflage, J. Wiley & Sons, 2001, Tabelle 10.13, S. 453 [0005]

Claims

Funktionalisiertes Polymer, welches eine Löslichkeit von ≥ 10 mg/ml in mindestens einem Lösemittel mit einem E_T(30)-Wert von ≥ 45 bis ≤ 65 aufweist und mit mindestens einem N-haltigen Carboxylatchelator funktionalisiert ist.
Polymer gemäß Anspruch 1, wobei das Polymer eine Chelatorkonzentration von ≥ 2 Gew-% bis ≤ 75 Gew-% aufweist.
Polymer gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Polymer linear ist oder einen Quervernetzungsgrad von ≤ 20% aufweist.
Polymer gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Polymer ein linear und/oder quervernetztes Grundgerüst ausgewählt aus der Gruppe Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Poly(meth)acrylat, Poly(meth)acrylamid sowie Copolymere beliebiger Mischungen daraus, umfasst.
Polymer gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der mindestens eine N-haltigen Carboxylatchelator ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend
wobei R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe enthaltend Wasserstoff, Halogen, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Halogenalkyl, Aryl, Alkoxy, Pseudohalogen; n1, n2 und n3 jeweils unabhängig voneinander 0 bis 5 betragen;
wobei R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ und R₆ jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe enthaltend Wasserstoff, Halogen, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Halogenalkyl, Aryl, Alkoxy, Pseudohalogen; n1, n2 und n3 jeweils unabhängig voneinander 0 bis 5 betragen;
wobei R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆ und R₇ jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe enthaltend Wasserstoff, Halogen, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Halogenalkyl, Aryl, Alkoxy, Pseudohalogen; n1, n2 und n3 jeweils unabhängig voneinander 0 bis 5 betragen;
wobei R₁, R₂, R₃ und R₄ jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe enthaltend Wasserstoff, Halogen, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Halogenalkyl, Aryl, Alkoxy, Pseudohalogen; n1, n2 und n3 jeweils unabhängig voneinander 0 bis 5 betragen;
wobei R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ und R₆ jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe enthaltend Wasserstoff, Halogen, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Halogenalkyl, Aryl, Alkoxy, Pseudohalogen; n1, n2 und n3 jeweils unabhängig voneinander 0 bis 5 betragen und n4 von 1 bis 5 beträgt; oder Mischungen daraus.
Mikrotiterplatte, umfassend mindestens einen mit einem Polymer gemäß einem oder mehreren Ansprüchen 1 bis 5 versehenen Oberflächenbereich.
Mikrotiterplatte nach Anspruch 6, wobei das Polymer als Monolayer vorliegt.
Verfahren zur zumindest reversiblen Bindung eines Biomoleküls, vorzugsweise eines His-enthaltenden Moleküls, umfassend (a) Bereitstellen einer mit einem Polymer gemäß einem oder mehreren Ansprüchen 1 bis 5 versehenen Oberfläche, bevorzugt einer Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 6 oder 7 (b) Versetzen der Oberfläche mit einer Lösung, welche mindestens ein His-enthaltendes Molekül enthält
Verfahren zur Identifikation eines Biomoleküls, vorzugsweise eines His-enthaltenden Moleküls in einer, vorzugsweise wässrigen Lösung, umfassend (a) Bereitstellen einer mit einem Polymer gemäß einem oder mehreren Ansprüchen 1 bis 5 versehenen Oberfläche, bevorzugt einer Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 6 oder 7 (b) Versetzen der Oberfläche mit der Lösung (c) Nachweis des Moleküls
Verfahren nach Anspruch 9, wobei Schritt (c) mittels optischer und/oder spektroskopischer Methoden erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, zusätzlich umfassend den Schritt (z) des Lösens des Moleküls von dem Polymer
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Schritt (z) durch Versetzen mit Histidin und/oder Imidazol erfolgt.
Verwendung eines Polymers nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und/oder einer Mikrotiterplatte gemäß einem der Ansprüche 6 oder 7 zur Identifikation von Biomolekülen, vorzugsweise von His-getaggerten Molekülen in einer vorzugsweise wässrigen Lösung.
Verwendung eines Polymers nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und/oder einer Mikrotiterplatte gemäß einem der Ansprüche 6 oder 7 zur zumindest teilweisen Abtrennung von Biomolekülen, vorzugsweise von His-getaggten Molekülen aus/in einer vorzugsweise wässrigen Lösung.