DE2708018C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein an synthetisches Polyamid als Träger fixiertes
immobilisiertes, biologisch aktives Protein, welches sich durch
einen neutralen ungeladenen Träger auszeichnet, sowie ein Verfahren
zu seiner Herstellung.
Die Fixierung bzw. Immobilisierung von biologisch aktiven Proteinen
wie Enzymen, Hormonen, zur Teilnahme an Antigen-Antikörperreaktionen
und Hapten-Antikörperreaktionen befähigten
Substanzen, Gerinnungsfaktoren und dergleichen, insbesondere
im Rahmen der präparativen und der analytischen Chemie, hat
in den vergangenen Jahren große Bedeutung erlangt. Es wurden
bereits zahlreiche Fixierungsverfahren entwickelt. Trotzdem
zeigt es sich, daß ständig neue Fixierungsprobleme auftauchen,
die mit den bisher bekannten Methoden nicht befriedigend gelöst
werden können. Hierauf ist es auch zurückzuführen, daß
bisher trotz der ohne weiteres einsehbaren Vorteile der Fixierung
von biologisch aktiven Proteinen an Trägermaterialien
auf vielen Gebieten die Einführung der fixierten Proteine in
die Praxis nur zögernd erfolgte und sich der erwartete breite
Durchbruch noch nicht realisierte.
Von besonderem Interesse als Trägermaterialien für immobilisierte
aktive Proteine sind Polyamide aufgrund ihrer interessanten
physikalischen und chemischen Eigenschaften. Polyamide weisen
aufgrund ihres Gehalts an sekundären Aminogruppen eine gewisse
chemische Ähnlichkeit mit der Proteinstruktur auf, insbesondere
hinsichtlich ihrer Ladungsverteilung, so daß hier negative
Auswirkungen auf die biologische Aktivität der daran
immobilisierten Enzyme im Vergleich zu anderen Trägermaterialien
gering sind, soweit keine sonstigen Gruppen vorliegen,
welche die Aktivität der Proteine nachteilig beeinflussen.
An Polyamid als Trägermaterial fixierte, biologisch aktive
Proteine sind bereits bekannt, bei denen das Protein mit dem
Polyamid über Amidinostrukturen gebunden ist (vgl. z. B.
Kollowik-Kaplan "Methods in Enzymology", Bd. 25, S. 646-648).
In analoger Weise hat man auch bereits Polyamide in die Polyiminoester
überführt und mit biologisch aktiven Proteinen gekuppelt.
In diesen, an Polyamid immobilisierten, biologisch aktiven Proteinen
kommen jedoch die grundsätzlichen günstigen Eigenschaften
der Polyamide als Träger für Enzyme nicht voll zur Geltung,
da hierbei positiv geladene Gruppen gebildet werden,
welche in vielen Fällen in bezug auf die Enzymbindung nachteilig
ist. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe
zugrunde, an synthetisches Polyamid gebundene immobilisierte
Enzyme zu schaffen, bei denen die Bindung an die
Amidgruppen der Polyamide derart erfolgt, daß der
Träger neutral und ungeladen bleibt.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein an
synthetisches Polyamid kovalent gebundenes, biologisch
aktives Protein oder Proteinsubstrat gemäß Patentanspruch
1.
Aus der US-PS 40 02 532 sind Enzymkonjugate mit Proteinmakromolekülen
bekannt, die durch Kupplung der beiden
Proteine mit einem polyfunktionalen Kupplungsmittel
hergestellt werden. Das Problem einer Bindung an synthetische
Polyamide wird hier nicht angesprochen.
Aus der US-PS 39 70 597 ist ein Verfahren zur Herstellung
substituierter Polyamide bekannt, bei dem Amidbindungen
geöffnet und die so gebildeten Aminogruppen mit
einem Aldehyd und einem Diisocyanoalkan in einer 4-Komponentenreaktion
umgesetzt werden. Eine Umsetzung mit
der Amidfunktion wird hier nicht vorgenommen, auch wird
als Aldehyd Formaldehyd nicht in Betracht gezogen. Wenn
daher derart substituierte Polyamide mit einem biologisch
aktiven Protein umgesetzt werden, kann hierbei kein
Protein gemäß der Erfindung gebildet werden.
Als Polyamid kommen im Rahmen der Erfindung sowohl
einheitliche Polyamide, also die sogenannten Rein- oder
Homopolykondensate, zu denen die Polykondensate von
ω-Aminocarbonsäuren und die Polykondensate aus linearen
aliphatischen
Diaminen und Dicarbonsäuren sowie Polykondensate mit aromatischen
oder anderen Komponenten zählen, und die Mischpolyamide
in Betracht. Typische Beispiele sind Polycaprolactam,
Polykondensate aus Adipinsäure und Hexamethylendiamin
(6,6-Polyamid), 6,10-Polyamid, Polyaminoundecansäure
(11-Polyamid), Mischpolyamide aus Caprolactam und Dicarbonsäurediaminsalzen,
wie adipinsaurem 4,4′-Diaminodicyclohexylmethan,
12-Polyamid, Polycycloamide, wie Poly-(1,4-cyclohexylendimethylensuperamid)
und Polydodecanollactam.
Die Reste R und R₁ bestehen entsprechend der obigen Definition
aus den an die Amidogruppe gebundenen Resten des Polyamids. Diese
Reste können wiederum aliphatische, aromatische oder aliphatisch-
aromatische Reste enthalten, die weitere sekundäre oder tertiäre
Aminogruppen, Estergruppen, Amidgruppen, Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen
oder N-substituierte Carbonamidgruppen enthalten
können. Vorzugsweise enthalten R und R₁ dabei geradkettige, verzweigte
und/oder zyklische Alkylgruppen bzw. Alkylengruppen mit
1 bis 12 C-Atomen, Phenylgruppen bzw. Phenylengruppen oder Alkylphenylengruppen
bzw. Alkylenphenylengruppen, die wieder miteinander
durch eine oder mehrere der vorstehend erwähnten N-substituierten
Carbonamidgruppen, Amidgruppen, Estergruppen etc.
verbunden sind.
Der Rest R₂ leitet sich von einer Verbindung ab, die mit Formaldehyd
kondensierbar ist. Diese Eigenschaft ist erfüllt bei
den mit Formaldehyd Harz-bildenden Substanzen, beispielsweise
also negative Substituenten tragende aromatische Verbindungen
oder freie Aminogruppen oder Hydroxylgruppen enthaltende Verbindungen.
Außer der mit Formaldehyd kondensierbaren Struktur
bzw. Funktion muß noch eine weitere funktionelle Gruppe vorhanden
sein, die mit einem Proteinreagens zu reagieren vermag.
Typische Beispiele für im Rahmen der Erfindung geeignete, mit
Formaldehyd kondensierbare Verbindungen, von denen der Rest
R₂ sich herleitet, sind Phenol, Anilin, Harnstoff, Thioharnstoff,
Melamin, Diaminotriazin, Gelatine, Amine, insbesondere
aliphatische, aromatische oder araliphatische Diamine mit 2
bis 14 C-Atomen, und Alkohole, insbesondere Diole und Aminoalkohole.
R₃ stellt den Rest eines bi- oder polyfunktionellen Proteinreagens
bzw. Proteinkupplungsmittels dar. Beispiele für geeignete
Proteinreagentien sind Dialdehyde, wie Glutardialdehyd, Dihydroxysuccinimidester,
Diacetale, Bis-Maleinimide, bifunktionelle
Iminoester, wie Diäthylmalonimidat, Dimethyladipinimidat, Diepoxyde,
Dicarbonsäurechloride, insbesondere α-β-ungesättigte
Carbonsäuredichloride, Diisocyanate, Diisothiocyanate und dergleichen.
Sie enthalten zweckmäßig 2 bis 12 C-Atome, können jedoch
auch längerkettig sein. Beispiele für solche längerkettigen
Verbindungen sind Copolymere aus Acrylamid/Methacrylamid
und Acrylsäuresuccinimidester/Methacrylsäuresuccinimidester.
Die in den vorstehenden Beispielen aufgeführten Proteinreagentien
enthalten jeweils zwei funktionelle Gruppen, die zur
Kupplung mit biologisch aktiven Proteinen in wäßriger Lösung
ohne Beeinträchtigung der biologischen Aktivität derselben
geeignet sind. Im Rahmen der Erfindung kann sich R₃ jedoch
auch von solchen Proteinreagentien ableiten, die nur eine proteinbindende
Funktion oder mehr als zwei derartige Funktionen
enthalten. Falls nur eine proteinbindende Gruppe vorliegt, muß
wenigstens eine weitere funktionelle Gruppe vorliegen, die mit
der weiteren funktionellen Gruppe, welche die mit Formaldehyd
kondensierbare Verbindung, von der sich R₂ ableitet, enthält
unter Ausbildung einer homöopolaren Bindung zu reagieren vermag.
Beispiele für geeignete Proteinreagentien finden sich
weiter in den DE-OS 19 15 970; 22 37 083, 21 28 743, 22 60 185
und 26 03 319. Andere Proteinbindungsmittel, von denen sich R₃
ableiten kann, sind z. B. Phosgen, Thiophosgen, Halogencyan und
Nitrit.
Leitet sich R₂ von einem aromatischen Amin ab, so läßt sich die
Proteinbindung durch Umsetzung mit Nitrit, also Diazotierung
der aromatischen Aminogruppe, durchführen. In diesem Falle
erhält man eine Verbindung der allgemeinenFormel I mit n = 0.
Als biologisch aktive Proteine kommen im Rahmen der Erfindung
z. B. Enzyme, immunologisch aktive Proteine, wie Antikörper,
Hormone sowie biologisch aktive Peptide und dergleichen, in
Betracht. Anstelle der biologisch aktiven Proteine können auch
ihre Substrate fixiert sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur kovalenten Fixierung von
biologisch aktiven Proteinen oder von deren Substraten an
synthetischen Polyamiden ist dadurch gekennzeichnet, daß das
Polyamid in Anwesenheit eines Lösungsmittels für Polyamide
mit einander äquimolaren Mengen Formaldehyd und einer mit
Formaldehyd kondensierbaren Verbindung, welche wenigstens
eine weitere reaktionsfähige Gruppe enthält, umgesetzt wird
unter Bildung eines Polyamidderivates der allgemeinen Formel
worin R und R₁ unabhängig voneinander die an der Amidogruppe
gebundenen Reste des Polyamids und R₂′ den Rest der mit Formaldehyd
kondensierbaren Verbindung, welche noch wenigstens
eine weitere reaktionsfähige Gruppe enthält, darstellen, dieses
Polyamidderivat gegebenenfalls mit einem bi- oder polyfunktionellen
Proteinreagens umgesetzt und danach in wäßriger
Lösung mit einem biologisch aktiven Protein oder einem Substrat
davon unter Bindung desselben zusammengebracht wird.
Als Lösungsmittel kommen die bekannten Lösungsmittel für Polyamide
im Rahmen der Erfindung zur Anwendung. Hierzu gehören
die niederen aliphatischen Carbonsäuren, insbesondere Ameisensäure
und Essigsäure. Ihre Konzentration soll wenigstens 10%,
vorzugsweise wenigstens 50% betragen. Weitere geeignete Lösungsmittel
sind 100%ige Schwefelsäure, Phosphorsäure, Lösungen
von Metallsalzen der zweiten Hauptgruppe, wie CaCl₂ in
Alkoholen, Phenole, Kresole, Chloralhydrat und andere. Menge
und Konzentration des Lösungsmittels hängen einerseits vom
verwendeten Polyamid, andererseits davon ab, ob nur eine
oberflächliche Anlösung gewünscht wird, die Kondensation in
Gegenwart des Formaldehyds also in heterogener Phase verläuft,
oder eine vollständige Lösung des Polyamids gewünscht
wird. Für Mischpolyamide geeignete Lösungsmittel sind auch
Mischungen von wäßrigen Alkoholen mit Lösungsvermittlern, wie
Benzol oder chlorierten Kohlenwasserstoffen.
Wird nur eine oberflächliche Anlösung eines festen Polyamids
vorgenommen, so erfolgt lediglich eine oberflächliche Ankondensation,
ohne daß die Form des Polyamids verändert wird. Letzteres
kann daher beispielsweise als Schlauch, Granulat, Folie
oder dergleichen vorliegen, und erfindungsgemäß mit einem biologisch
aktiven Protein oberflächlich verbunden werden. Bei
Durchführung in Lösung werden am Polyamid die Carbonamidgruppen
durch Ankondensation substituiert und anschließend wird
mit einem geeigneten Fällungsmittel, wie Wasser oder Hydrogencarbonatlösung,
das gebildete substituierte Polyamid ausgefällt.
Diese Arbeitsweise bietet auch die Möglichkeit,
beliebige Oberflächen, insbesondere Kunststoffoberflächen,
die mit einem entsprechenden Lösungsmittel an der Oberfläche
klebrig gemacht werden (z. B. bei Verwendung von Polystyrolröhrchen
mit Benzol) mit einer Lösung des substituierten
Polyamids zu beschichten und anschließend die beschichteten
Oberflächen durch die Umsetzung mit dem bi- bzw. multifunktionellen
Proteinreagens zu aktivieren und zur Proteinbindung
einzusetzen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird bei
nur oberflächlicher Anlösung des Polyamids ein fester Träger
aus beliebigem Material verwendet, dessen Oberfläche mit
feinteiligem Polyamid, beispielsweise in Form von Geweben,
Fäden, Flocken, Lints oder dergleichen beschichtet ist. Die
Polyamidteilchen können auf der Trägeroberfläche aufgeklebt,
durch elektrische Beflockung aufgebracht oder auf andere Weise
gebunden sein. Bei dieser Ausführungsform liegen große
spezifische Polyamidoberflächen vor, die bei der Proteinfixierung
gemäß Erfindung eine hohe spezifische Aktivität
des beschichteten Trägers ergibt. Voraussetzung ist dabei
natürlich, daß nur eine oberflächliche Anlösung der feinen
Polyamidteilchen erfolgt, die ihre Struktur erhält.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens der
Erfindung wird in den Fällen, in denen die mit Formaldehyd
kondensierbare Verbindung als weitere Funktion eine Aminogruppe
enthält, die Kupplung mit dem biologisch aktiven Protein
oder dem Proteinsubstrat mit Hilfe von bekannten Aminkupplungsmitteln,
wie Phosgen, Thiophosgen, Halogencyan oder Nitrit
durchgeführt. Derartige Kupplungsmittel sind für die Fixierung
von biologisch aktiven Proteinen an unlöslichen Trägermaterialien,
welche Hydroxyl oder Aminogruppen enthalten,
bekannt. Beispielsweise wird bei Verwendung von Nitrit die
Aminogruppe diazotiert und das Protein dann mit der Diazogruppe
umgesetzt. Bei Verwendung von Thiophosgen wird in erster
Stufe das entsprechende Isothiocyanat gebildet, welches dann
mit einer Aminogruppe des Proteins unter Immobilisierung desselben
reagieren kann.
Das Verfahren der Erfindung läßt sich auch dazu verwenden,
anstelle der biologisch aktiven Proteine deren Substrate
zu fixieren. Beispielsweise kann radioaktiv markierte Gelatine
an dem Polyamid immobilisiert werden. Eine derart an
Polyamid immobilisierte Gelatine läßt sich als empfindliches
Nachweisreagens für hydrolytische Enzyme verwenden. So kann
beispielsweise ein Kunststoffreagensgläschen mit der an
Polyamid gebundenen markierten Gelatine beschichtet, mit
einer Hydrolaselösung gefüllt und danach die in die Lösung
übergegangene Markierung z. B. die Radioaktivität bestimmt
werden.
Die Umsetzung der erfindungsgemäß erhaltenen Verbindung der
allgemeinen Formel II mit dem Proteinreagens bzw. Kupplungsreagens
und dem biologisch aktiven Protein oder Proteinsubstrat
kann in einer oder in mehreren Stufen erfolgen. Bei einstufiger
Umsetzung wird in wäßriger Lösung die Verbindung der
allgemeinen Formel II mit dem biologisch aktiven Protein oder
Proteinsubstrat und der Kupplungsverbindung zusammengebracht
und reagieren gelassen. Diese Verfahrensweise hat den Vorteil
der Einfachheit, es werden jedoch häufig schlechtere Ausbeuten
erzielt als bei mehrstufiger Arbeitsweise, da hierbei ein Teil
der Verbindung II miteinander gekuppelt werden kann, also unerwünschte
Nebenreaktionen eingeht. Bei mehrstufiger Arbeitsweise
wird das Kupplungsmittel zuerst mit der Verbindung II
umgesetzt und das Produkt dann mit dem Protein oder dem Proteinsubstrat
umgesetzt. Weiter kann mit dem Proteinkupplungsmittel
das Protein vernetzt werden und von nichtvernetzem Protein
abgetrennt werden. Dann wird das vernetzte Protein mit
dem gleichen oder einem anderen Proteinkupplungsreagens mit
der Verbindung II umgesetzt. Die Bindung derartiger vernetzter
Proteinderivate ergibt besonders hohe Aktivitäten.
Die erste Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens, also die Umsetzung
in Gegenwart der mit Formaldehyd kondensierbaren Verbindung
und mit Formaldehyd, kann bei Temperaturen zwischen etwa 0
und 100°C durchgeführt werden. Arbeitet man in ameisensaurer
Lösung und in Gegenwart von Aminen, so kann als Konkurrenzreaktion
die Leuckart-Wallach-Reaktion ablaufen. Unter diesen Bedingungen
wird daher vorzugsweise bei niedrigeren Temperaturen
im Rahmen des obigen Bereiches gearbeitet.
Unter Formaldehyd werden im Rahmen der Erfindung die üblichen
Formen des Formaldehyds verstanden, also wäßrige Formaldehydlösungen,
Paraformaldehyd, Trioxan und andere Formaldehydpolymere,
die sich unter den Reaktionsbedingungen wie freier Formaldehyd
verhalten. Besonders bevorzugt wird Trioxan, da es als
feste und chemisch eindeutig definierte Substanz am einfachsten
quantitativ zu handhaben ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Immobilisierung
bzw. Fixierung biologisch aktiver Proteine oder ihrer Substrate
an Trägermaterialien auf Basis von synthetischen Polyamiden in besonders schonender
Weise und unter Erhalt der vorteilhaften Eigenschaften.
Erfindungsgemäß kann das Protein direkt an die als Zwischenprodukte
gebildete Verbindung der Formel II gekuppelt werden, als
auch über Zwischenverbindungen beliebig zu wählender Größe gebunden
werden. Letzteres erlaubt es, auch den Abstand des Proteins
zum eigentlichen Trägermolekül nach Belieben auszuwählen.
Ein größerer Abstand, also die Verwendung eines längeren Spacers,
ist beispielsweise dann von Interesse, wenn bereits vorvernetzte
Proteine fixiert werden sollen, also Aggregate, die aus mehreren
Molekülen der biologisch aktiven Proteine bestehen. Aus räumlichen
Gründen ist dann häufig ein möglichst langer Spacer erforderlich.
Die erfindungsgemäßen immobilisierten biologisch aktiven Proteine
bzw. Proteinsubstrate können in wäßrigen Lösungen löslich
oder unlöslich sein. Durch Kupplung mit wasserlöslichen Polyamiden
kann beispielsweise das Ausbluten des Proteins durch
semipermeable Membranen verringert oder beseitigt werden, die
Stabilität erhöht werden oder ihre Einsatzfähigkeit als Arzneimittel
ermöglicht werden. Bei der Kupplung an unlösliche Trägermaterialien
steht die einfache Wiedergewinnbarkeit des biologisch
aktiven Proteins im Vordergrund der Anwendungszwecke.
Sie können aber auch zur Gewinnung von Antigenen und Antikörpern
als spezifische Adsorptionsmittel und im Rahmen der enzymatischen
Analyse verwendet werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
0,3 M Phenylendiamin und 0,1 M Trioxan werden in 50proz. Ameisensäure
zusammengegeben und 3 Stunden durch einen 3 m langen
Schlauch aus Polyamid-6 hindurchgepumpt. Der Schlauch wird anschließend
mit Wasser gespült, mit einer 10proz. Lösung von
Glutardialdehyd in 0,2 M Borat-Puffer, pH = 8,5, gefüllt, 15
Minuten stehengelassen, wieder gewaschen und dann mit einer
Lösung von 2 mg Glucose-oxidase pro ml 0,1 M Phosphat-Puffer,
pH = 7,8, gefüllt und über Nacht bei 4° stehengelassen. Nach
Waschen mit 0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 7,0, der 1 M an Kochsalz
ist, wird eine enzymatische Aktivität von 1,8 U/m Schlauch
gemessen.
20 g Polyamidflocken von 1 mm Länge werden in 50proz. Ameisensäure
suspendiert und mit 0,3 M Phenylendiamin und 0,1 M Trioxan
3 Stunden bei 50° umgesetzt. Nach dem Abfiltrieren wird gewaschen
und die modifizierten Polyamidflocken werden in 1 : 10 verdünnter
Salzsäure suspendiert, auf 0° gekühlt und unter Rühren
bei 0° mit 2,5 M Natriumnitrit-Lösung versetzt. Nach 60 Minuten
wird mit eisgekühltem Wasser gewaschen und ein Teil des
Derivates sofort mit einer Lösung von Glucoseoxidase mit
10 mg/ml in Phosphat-Puffer, pH = 7,0, versetzt. Die anschließend
nach der Fixierung über Nacht bei 4° mit 1 M Kochsalzlösung
gewaschenen Polyamidflocken weisen eine Aktivität von 17 U/g
auf.
Es wird wie in Beispiel 2 verfahren, nur wird anstelle von Phenylendiamin
Anilin bzw. Dianisidin bzw. Diamino-diphenylmethan eingesetzt.
0,03 M Phenylendiamin und 0,01 M Trioxan werden in 50proz. Essigsäure
gelöst, auf 60° erwärmt und 3 Stunden durch einen 2 m langen
Polyamidschlauch gepumpt. Anschließend wird der Schlauch mit
Wasser gewaschen und eine 5proz. Lösung eines Copolymeren aus
Methacrylamid und Methacrylsäure-hydroxysuccinimidester in den
Schlauch eingefüllt und nach 4 Stunden wieder entleert und mit
Wasser gewaschen. Dann wird eine Lösung von 2 mg Glucoseoxidase
pro ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 7,8, eingefüllt und nach
Stehen über Nacht bei 4° entleert und gewaschen. Der fertige
Enzymschlauch weist eine Aktivität von 1,5 U/m auf.
Je 20 g Polyamid-6-Partikel werden mit 0,3 M Phenylendiamin und 0,1 M
Trioxan in 60proz. Essigsäurelösung bei 50° bzw. mit 0,3 M
Diaminodiphenylmethan und 0,1 M Trioxan in 60proz. Essigsäurelösung
bei 50°C 2 Stunden lang umgesetzt. Nach Waschen mit Wasser
wird jeweils die Hälfte des Phenylendiamin-Produktes und des
Diaminodiphenylmethan-Produktes in 1 : 10 verdünnter Salzsäure
suspendiert, auf 0° gekühlt und unter Rühren bei 0°C mit 2,5 M
Natriumnitrit-Lösung diazotiert. Nach 60 Minuten wird mit eisgekühltem
Wasser gewaschen. Je 1 g diazotiertes Phenyldiamin-
Derivat werden mit einer Lösung von 10 mg Glucoseoxidase pro
ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 7,0, versetzt und bei 4° über
Nacht belassen. Nach dem Waschen mit 0,1 M Phosphat-Puffer, pH =
7,0, der 1 M an Kochsalz ist, ergibt sich eine Aktivität im Fall
des Phenylendiamin-Derivates von 17 U/g, im Fall des Diaminodiphenylmethan-
Derivates von 71 U/g. Je 1 g des frisch diazotierten
Phenylendiamin-Derivates und des Diaminodiphenylmethan-Derivates
werden mit einer Lösung von 5 mg Cholesterinoxidase pro
ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 6,0, versetzt, über Nacht bei
4° belassen und anschließend mit 0,1 M Phosphat-Puffer, pH =
6,0, der 1 M an Kochsalz ist, gewaschen. Es ergibt sich eine
Aktivität von 155 U/g bei dem diazotierten Phenylendiamin-Derivat
bzw. 160 U/g bei dem diazotierten Diaminodiphenylmethan-
Derivat. Anschließend werden die beiden Produkte nochmals mit
0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 6,0, der 1 M an Kochsalz und 0,5proz.
an Thesit ist (Hydroxypolyäthoxyidodecan), gewaschen. Durch
diesen Waschvorgang nimmt die Aktivität des Phenylendiamin-Derivates
auf 10 U/g und die des Diaminodiphenylmethan-Derivates
auf 15 U/g ab.
Jeweils 5 g Polyamidpartikel werden mit jeweils 0,3 M Diaminodiphenylmethan
und 0,1 M Trioxan bzw. 0,3 M Harnstoff und 0,1 M
Trioxan bzw. 0,3 M Anilin und 0,1 M Trioxan bzw. 0,3 M Triaminotriazin
und 0,1 M Trioxan in 50proz. Ameisensäure-Lösung
3 Stunden bei 20° umgesetzt. Nach dem Waschen werden die verschiedenen
Derivate mit 10proz. Glutardialdehyd-Lösung in 0,2 M
Borat-Puffer, pH = 8,5, für 15 Minuten umgesetzt und abermals
gewaschen. Je 1 g der verschiedenen Derivate wird danach mit
3 ml einer Nierenacylase-Lösung von 480 mg in 40,5 ml 0,1 M
Triäthanolamin-Puffer, pH = 8,3, für 1 Stunden versetzt, danach
abfiltriert und gewaschen. Die gemessene Aktivität beträgt im
Fall des Phenylendiamin-Derivates 7,5 U/g, bei Diaminodiphenylmethan
6,7 U/g, bei Harnstoff 6,8 U/g, bei Triaminotriazin 8,9 U/g.
10 g Polyamid-6-Partikel werden mit einer Lösung von 2 g Gelatine
und 0,1 M Trioxan in 50proz. Ameisensäure-Lösung 3 Stunden bei
50° umgesetzt. Anschließend wird gewaschen und das Polyamid-Derivat
mit einer 10proz. Lösung von Glutardialdehyd in 0,2 M Borat-
Puffer, pH = 8,5, versetzt. Nach 15 Minuten wird abfiltriert
und erneut gewaschen und das Derivat mit einer Lösung von 5 mg
Glucoseoxidase pro ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 7,8, versetzt.
Nach Stehen über Nacht bei 4° wird abfiltriert und gewaschen.
Die Aktivität der an das Polyamidgelatine-Derivat gebundenen Glucoseoxidase
beträgt 81 U/g.
0,1 M Polyamid-6 wird in 100proz. Ameisensäure gelöst und mit
0,1 M Phenylendiamin und 0,033 M Trioxan versetzt. Nach 3 Stunden
bei 50° wird die Lösung in Wasser ausgefällt und das ausgefällte
Polyamid-Derivat nach Waschen mit Alkohol und Wasser mit 10proz.
Glutardialdehyd-Lösung in 0,2 M Borat-Puffer, pH = 8,5, für 15
Minuten versetzt und erneut gewaschen. Danach wird das Polyamid-
Derivat zu einer Lösung von 2 mg Glucoseoxidase pro ml 0,1 M
Phosphat-Puffer, pH = 7,8, gegeben, über Nacht bei 4° stehengelassen
und anschließend gewaschen. Das gewaschene Polyamid-Derivat
weist anschließend eine Aktivität von 16 U/g auf.
Polyamid-Derivat wie in Beispiel 10 wird hergestellt, jedoch nicht
in Wasser ausgefällt, sondern mit Tonpartikeln mit einem Durchmesser
von 0,315 bis 0,400 mm versetzt, so daß noch diskrete
Partikel vorliegen, und anschließend evakuiert. Nach dem Waschen
mit Wasser wird mit 10proz. Glutardialdehyd-Lösung in
0,2 M Borat-Puffer, pH = 8,5, versetzt, nach 15 Minuten abfiltriert
und gewaschen und der gecoatete Ton mit einer Lösung
von 2 mg Glucoseoxidase pro ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH =
7,8, versetzt. Nach Stehen über Nacht bei 4°, Abfiltrieren und
Waschen, weist das Polyamid-Ton-Derivat eine Glucoseoxidase-Aktivität
von 8 U/g auf.
Polyamid-Derivat wie in Beispiel 10 wird hergestellt und in vorher
mit Benzol klebrig gemachte Polystyrolgläschen von 3 cm Höhe und
1 cm Durchmesser eingefüllt. Nach einstündigem Stehenlassen wird
ausgegossen und gespült, dann mit einer 10proz. Lösung von Glutardialdehyd
in 0,2 M Borat-Puffer, pH = 8,5, gefüllt, nach 15
Minuten ausgeleert und gespült und mit einer Lösung von 2 mg
Glucoseoxidase pro ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 7,8, gefüllt.
Nach Stehen über Nacht bei 4° werden die Gläschen gewaschen
und weisen anschließend eine Aktivität von 0,5 U/Gläschen auf.
In einem Gemisch aus 18,6 g CaCl₂ und 18,6 g H₂O plus 63 g
Methanol und 1 bis 1000 Teilen Ameisensäure wird Polyamid-6
bei erhöhter Temperatur von 30 bis 80°C gelöst und heiß in 2 m
lange Polyamid-6-Schläuche eingefüllt und danach sofort mit kaltem
Wasser gespült. An der inneren Oberfläche des Schlauches bleibt
eine Schicht amorphes, reaktionsfähiges Polyamid zurück. Dann wird
eine Lösung von 0,03 M Phenylendiamin und 0,01 M Trioxan in 60proz.
Essigsäure bei 60° durch die Polyamidschläuche gepumpt. Anschließend
wird mit Wasser gewaschen und dann eine Lösung von
50 mg Korksäuredihydroxysuccinimidester in 1 ml Dioxan in den
Schlauch eingefüllt. Nach 15 Stunden wird der Schlauch geleert
und
- a) eine Lösung von 5 mg Glucoseoxidase pro ml 0,1 M Phosphat- Puffer, pH = 7,8, eingefüllt,
- b) eine Lösung von 372 mg Glucoseoxidase in 4,5 ml 0,1 M Phosphat- Puffer, pH = 7,8, wird mit 6,4 mg Äthylenglycolbispropionsäure- bishydroxysuccinimidester in 0,5 ml Dioxan versetzt und über Nacht bei 4° stehengelassen. Danach wird die vernetzte Glucoseoxidase über eine Sephadex-G200® (vernetztes Dextran)-Säule chromatographiert und die vernetzten Anteile (ca. 90% im Ausschlußvolumen) werden in 0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 7,8, in den oben propagierten Schlauch gefüllt.
Im Fall a) ergibt sich eine Aktivität von 4 U/m, im Fall b) eine
Aktivität von 9 U/m.
10 g Polyamid-6-Partikel mit 0,100 bis 0,125 mm Durchmesser werden
in 100 ml 40proz. Ameisensäure suspendiert und 2,25 g Trioxan
(0,075 Mol Formaldehydeinheiten) und 9,4 g Phenol (0,1 Mol) werden
zugegeben. Nach 3 Stunden bei 50° wird abgesaugt, mit Methanol
nachgewaschen und danach mit trockenem Äther nachgewaschen.
Die Partikel werden in 250 ml Toluol suspendiert, in dem
10 ml Hexamethylendiisocyanat gelöst sind. Nach 2 Stunden wird
abgesaugt, mit getrocknetem Äther nachgespült und sofort eine
Lösung von 5 mg Glucoseoxidase pro ml 0,1 M Phosphat-Puffer,
pH = 7,0, zu den Partikeln zugegeben. Nach Stehen über Nacht
wird gewaschen und die anschließend gemessene Aktivität beträgt
11,2 U/g.
Claims (13)
1. An synthetisches Polyamid kovalent gebundenes,
biologisch aktives Protein oder Proteinsubstrat,
dadurch gekennzeichnet,
daß es der allgemeinen Formel
entspricht, worin R und R₁ die an der Amidogruppe
gebundenen Reste des Polyamids darstellen, R₂ den
Rest einer mit Formaldehyd kondensierbaren Verbindung
darstellt, welche wenigstens eine weitere reaktionsfähige
Gruppe enthält, R₃ den Rest eines
bi- oder polyfunktionellen Proteinreagenz darstellt,
n die Zahl 0 oder 1 und P ein biologisch aktives
Protein bedeutet.
2. Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
R und R₁ Reste von Polycaprolactam, 6,6-Polyamid, 6,10-Polyamid,
11-Polyamid oder 12-Polyamid sind.
3. Protein nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß R₂ sich von Phenol, Anilin, Harnstoff, Thioharnstoff, Melamin,
Diaminotriacin, aliphatischen, aromatischen oder araliphatischen
Diaminen mit 2 bis 14 C-Atomen ableitet.
4. Protein nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
daß sich R₃ von Glutardialdehyd, Dihydroxysuccinimidester, Diacetal,
Bismaleinimid, bifunktionellem Iminoester, Diepoxyd,
Dicarbonsäurechlorid, Diisocyanat oder Diisothiocyanat mit 2
bis 12 C-Atomen ableitet.
5. Protein nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
daß sich R₃ von einem Copolymeren aus Acrylamid/Methacrylamid
und Acrylsäuresuccinimidester/Methacrylsäuresuccinimidester
ableitet.
6. Verfahren zur Fixierung von biologisch aktivem
Protein oder Proteinsubstrat an Polyamide,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Polyamid in Anwesenheit eines
Lösungsmittels für Polyamide mit einander
äquimolaren Mengen Formaldehyd und einer mit
Formaldehyd kondensierbaren Verbindung, welche
wenigstens eine weitere reaktionsfähige Gruppe
enthält, umgesetzt wird unter Bildung eines
Polyamidderivates der allgemeinen Formel
worin R und R₁ unabhängig voneinander die an der
Amidogruppe gebundenen Reste des Polyamids und R₂′
den Rest der mit Formaldehyd kondensierbaren
Verbindung mit wenigstens einer weiteren
reaktionsfähigen Gruppe darstellt, gegebenenfalls
dieses Polyamidderivat mit einem bi- oder
polyfunktionellen Proteinreagenz umgesetzt und
danach in wäßriger Lösung mit einem biologisch
aktiven Protein oder Proteinsubstrat unter Bindung
desselben zusammengebracht wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß
die Umsetzung mit dem Formaldehyd in wenigstens 50%iger Ameisensäure
oder Essigsäure durchgeführt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet,
daß das Polyamid als Formkörper eingesetzt wird
und nur eine oberflächliche Anlösung vorgenommen wird.
9. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet,
daß die Umsetzung mit gelöstem Polyamid durchgeführt
wird und die Verbindung der Formel II dann auf eine
feste Trägeroberfläche abgeschieden wird.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
daß der Formkörper aus einem festen Trägermaterial besteht,
dessen Oberfläche mit feinteiligem Polyamid beschichtet ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch
gekennzeichnet, daß die Kupplung mit dem Protein durch Umsetzung
mit Nitrit und Diazotierung erfolgt.
12. Verfahren nach Anspruch 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet,
daß die Kupplung mittels Phosgen, Thiophosgen oder Halogencyan
erfolgt.
13. Verfahren nach Anspruch 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet,
daß ein vernetztes Protein gekuppelt wird.
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