HU177561B - Process for preparing biologically active protein linked to polyamide - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás biológiailag aktív proteinnek poliamidon vagy ismert szilárd hordozóra felvitt poliamidon történő rögzítésére; az eljárás azzal tűnik ki, hogy a hordozó semleges és töltés nélküli.

Az utóbbi években a biológiailag aktív proteinek, mint enzimek, hormonok rögzítése, ill. megkötése antigén-antitest reakciókra és haptén-antitest reakciókra alkalmas anyagokhoz, koaguláló szerekhez és hasonló anyagokhoz, különösen a preparatív és analitikai kémiában nagy jelentőségű lett. Eddig is számos rögzítési eljárást dolgoztak ki. Ennek ellenére egyre újabb rögzítési problémák merülnek fel, amelyek az eddig ismert eljárásokkal nem oldhatók meg. Erre vezethető vissza, hogy a biológiailag aktív proteinek hordozóanyagokon történő rögzítésének minden további nélkül belátható előnyei ellenére a megkötött (fixált) proteinek gyakorlati bevezetése késlekedik, és a várt, széles áttörés nem realizálódott e területen.

Immobilizált aktív proteinek hordozóanyagaiként érdekes fizikai és kémiai tulajdonságaik miatt a poliamidok különös jelentőségűek. A poliamidok szekunder aminocsoport-tartalmuk miatt a proteinszerkezettel bizonyos kémiai hasonlóságot mutatnak, különösen töltéseloszlásuk tekintetében, ily módon, ha egyéb — a proteinek aktivitását hátrányosan befolyásoló — csoportok nincsenek jelen bennük, akkor a poliamidok egyéb hordozóanyagokhoz képest a rajtuk immobilizált enzimek biológiai aktivitását csak kevéssé befolyásolják negatív értelemben.

Poliamidon mint hordozóanyagon kötött, biológiailag aktív proteinek már ismeretesek. Ezeknél a protein amidino-szerkezeten keresztül kötődik a poliamidra (lásd példá ul Kollowik Káplán: „Methods in Enzymology. 25. köt., 646—648. old.). Analóg módon poliamidokat már poliiminoészterré átalakított alakban is kapcsoltak biológiailag aktív proteinekkel.

Ezeknél a poliamidon immobilizált biológiailag aktív proteineknél azonban a poliamidok mint enzimhordozók alapvető előnyös tulajdonságai nem tudnak teljes mértékben érvényesülni, mert ezúton pozitív töltésű csoportok képződnek, amelyek az enzim-kötésre hátrányosan hátin nak. A találmány feladata ezért olyan, poliamidon kötött immobilizált enzimek létrehozása volt, amelyeknél a kötés (rögzítés) oly módon következik be. hogy a hordozóanyag semleges és töltés nélküli marad.

A feladatot a találmány szerint biológiailag aktív prote15 innék vagy protein-szubsztrátum poliamidon vagy ismert szilárd hordozóra felvitt poliamidon történő rögzítésére szolgáló olyan eljárással oldjuk meg, amelyet az jellemez, hogy a poliamidot. valamely poliamid-oldószer jelenlétében, ekvimoláris mennyiségű formaldehiddel és egy aro20 másaminnal. triazinnal. karbamiddal, fenollal, vagy zselatinnal 0 és 100 C közötti hőmérsékleten reagáltatunk olyan poliamid-származék képzése közben, amely a láncban CC) N

CH

R általános képletű lánctagokat tartalmaz, ahol R jelentése aromás aminból, triazinból, karbamidból, fenolból vagy zselatinból származó csoport, és ezt 30 a poliamid-származékot egy ismert bi- vagy poKfötíkCÍÓs

I77561 kapcsoló reagenssel vagy szervetlen nitrittel reagáltatjuk, majd önmagában ismert módon diazotáljuk és ezután vizes oldatban biológiailag aktív proteinnel vagy proteinszubsztrátumma! érintkeztetjük, utóbbi megkötődése mellett.

Poliamidként a találmány szerinti eljárásnál alkalmasak mind az egységes poliamidok, vagyis az úgynevezett tisztavagy homopolikondenzátumok — mint az ω-aminokarbonsavak polikondenzátumai, lineáris alifás diaminok és dikarbonsavak polikondenzátumai, valamint aromás vagy egyéb komponensek polikondenzátumai — mind keverék poliamidok.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott poliamid az R—CO—NH—R általános képlettel jellemezhető, mely képletben

R és R jelentése (R'._CONH)— R' és (R',—CONH)_y—R'j általános képletnek felel meg, amelyekben

R'_ jelentése 1—12 szénatomos egyenes, elágazó láncú vagy/és ciklusos alkilcsoport, illetve alkiléncsoport, fehilcsoport, feniléncsoport, alkilfenilcsoport, alkilfenjléncsopórt, illetve alkilénfeniléncsoport, amei lyek észtercsoportot, aminocsoportot, karboxilcsoportot vagy N-helyettesített karbonamidcsoportot tartalmazhatnak, vagy jelentése valamely aminosav maradéka, x és y jelentése egész szám.

A bi- vagy polifunkciós kapcsolóreagensekre, illetve protein-kapcsolószerekre például a következők említhetők meg: a dialdehidek, mint a glutárdialdehid, dihidroxiszukcinimidészter, a diacetálok, a bisz-maleinimidek, a bifunkcionális iminoészterek, mint a dietilmalonimidát, a dimetiladipinímidát, a diepoxidok, a dikarbonsavkloridok, különösen az a—β telítetlen karbonsavdikloridok, a diizocianátok, a diizotiocianátok és hasonlók. Ezek előnyösen 2—12 szénatomszámúak, de hosszabb szénláncúak is lehetnek. Ilyen, hosszabb szénláncú vegyületek például az akrilamid-metakrilamid és akrilsavszukcinimidészter-metakrilsavszukcinimidészter kopoJimerek. A kiviteli példákban szereplő proteinreagensek minden esetben két funkcionális csoportot tartalmaznak, amelyek alkalmasak arra, hogy vizes oldatban a biológiailag aktív proteinhez legyenek kapcsolhatók anélkül, hogy azok biológiai aktivitását befolyásolnák. A proteinreagensből származó kapcsoló csoport azonban olyan vegyületből is származhat, amelynek csak egy protein megkötésére alkalmas, vagy kettőnél több ilyen funkcionális csoportja van. Ha csupán egy protein-megkötésre alkalmas csoportja van, akkor legalább még egy, olyan funkcionális csoportnak is jelen kell lennie, amely az R szubsztituenst szolgáltató, formaldehiddel kondenzálni képes vegyület további funkcionális csoportjával homopoláros kötés képződése közben reagálni képes. Alkalmas proteinreagensek továbbá például az 1915 970,2 237 083,2128 743,2 260185 és 2 603 319 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságrahozatali iratokban leírt reagensek. További olyan proteinmegkötőszerek, amelyekből a kapcsoló reagens levezethető, például a foszgén, tiofoszgén, ciánhalogén és nitrit.

Ha az R szubsztituens valamely aromás aminból származik, akkor a protein-megkötés nitrittel végzett reakcióval, vagyis az aromás aminocsoport diazotálása útján végezhető.

Biológiailag aktív proteinként a találmány szerinti eljárás során például enzimek, immunológia ilag aktív proteinek, mint antitestek, hormonok, valamint biológiailag aktív peptidek és hasonlók jönnek számításba. A biológiailag aktív proteinek helyett azok szubsztrátumai is megköthetők (fixálhatók)r

A találmány szerinti eljárás során oldószerként az ismert poliamid-oidószerek alkalmasak. Ilyenek a rövidszénláncú alifás karbonsavak, különösen a hangyasav és ecetsay. Koncentrációjuk legalább 10%, előnyösen legalább 50% kell legyen. További alkatfisas oldószerek a 100%-os kénsav, a foszforsav,.-a másodi^Sficsoportba tartozó fémek sóinak, mint CaCT-nek alkoholos oldata, a fenolok, a krezolok, a klorálhidrát és mások.

Az oldószer mennyiségé és koncentrációja egyrészt az alkalmazott poliamidtól, másrészt attól függ, högy csak felületi oldást kívánunk-e, vagyis a formaldehid jelenlétében végzett kondenzáció heterogén fázisban megy-e végbe, vagy pedig a poliamidot teljesen fel kívánjuk-e oldani. A keverék poliamidok esetében alkalmas oldószerek a vizes alkoholok oldódást elősegítő szerekkel, mint benzollal vagy klórozott szénhidrogénekkel képezett keverékei is.

Ha a szilárd poliamodnak csak a felületét oldjuk, akkor csak felületi kondenzáció megy végbe anélkül, hogy a poliamid alakja változnék. így az utóbbi például cső, granulátum, fólia vagy hasonló alakban lehet jelen, és a találmány szerinti eljárással felületén biológiailag aktív protein köthető meg. Oldatban végzett kondenzációnál a poliamid karbonamid-csoportjai kondenzáció útján szubsztituálódnak, és ezt követően egy alkalmas kicsapószerrel, mint vízzel vagy hidrogénkarbonát oldattal a képződött, szubsztitűált poliamidot kicsapjuk. Eza munkamó<fear azt is lehetővé teszi, hogy tetszőleges felületeket, különösen olyan műanyag felületeket, amelyeket megfelelő oldószerrel felületileg ragadóssá tettünk (például polisztiroi csövecskéket benzollal) a szubsztituált poliamid oldatával vonunk be, majd a bevont felületeket bi-, illetve többfunkciós proteinreagenssel aktiváljuk, és a proteinre kötjük.

A találmány szerinti eljárás egy további foganatosítási módjánál a felületén oldott poliamidhoz tetszőleges szilárd hordozóanyagot használunk, amelynek felületét finom eloszlású poliamiddal, például poliamid-szövettel, szálakkal, pelyhekkei, rövid szálakkal vagy hasonlókkal vonjuk be. A poliamid részecskék a hordozóanyag felületére ragaszthatok, elektromos szórással vagy más módon vihetők fel. Ennél a módszernél nagy a fajlagos poliamidfelület, ami a találmány szerinti proteinfixálásnál a bevont hordozó nagy fajlagos aktivitását biztosítja. Ennek természetesen az a feltétele, hogy a poliamid-részecskék csak felületileg oldódjanak, és szerkezetüket megőrizzék.

A találmány szerinti eljárás egy különösen előnyös foganatosítási módjánál abban az esetben, amikor a formaldehiddel kondenzálható vegyület további funkciós csoportként aminocsoportot tartalmaz, a biológiailag aktív proteinhez vagy protein-szubsztrátumhoz a kötést ismét aminkapcsoló szerekkel, mint foszgénnel, tiofoszgénnel, halogénciánnal vagy nitrittel végezzük. Ilyen kapcsolószerek biológiailag aktív proteinek hidroxil- vagy aminocsoporttartalmú, oldhatatlan hordozóanyagra kötésénél ismertek. Nitrit használatánál például úgy járunk el, hogy az amiijocsoportot diazotáljuk, és a proteint azután a diazocsoporttal reagáltatjuk. Tiofoszgén használatánál első lépésben a megfelelő izotiocianátot képgzük, amit azután $ prqteín egy amino^oppt^n^ reagáltatunk, miáltal 4 protein

A töláíínány áaserind «Ijirásaál btológfetiíag aKtív $0$ nek helyett azok szubsztrátuma is rögzíthető. így például radioaktívan jelzett zselatin rögzíthető a poliamidon. Ilyen poliamidon rögzített zselatin hidrolitikus enzimek kimutatására alkalmas, érzékeny reagensként használható. így például egy műanyagból készült kémcső poliamidhoz kö- 5 tött jelzett zselatin-bevonattal látható el, és a kémcső hidroláz-oldattal történő megtöltése után az oldatba átment jelzett anyag meghatározható.

A találmány szerinti eljárás során a láncban —CO—N— általános képletű 10

CH

I

R lánctagokat tartalmazó poliamid-származékot a protein- 15 reagenssel, illetve kapcsolóreagenssel és a biológiailag aktív proteinnel vagy proteinszubsztrátummal egy vagy több lépésben reagáltathatjuk. Egy lépésben végrehajtott reakciónál vizes oldatban végezzük a reakciót a biológiailag aktív proteinnel vagy proteinszubsztrátummal és a kap- 20 csolószerrel. Ennek az eljárási változatnak előnye az egyszerűsége, de ily módon gyakran rosszabb kitermelés érhető el, mint a többlépéses eljárásnál, mert az említett poliamid-származék egy része saját magával kapcsolódhat, és nem kívánt mellékreakciók mehetnek végbe. A többlépé- 25 ses módszernél először a kapcsolószerrel reagáltatjuk a láncban —CO—N—

I

CH

I 30

R általános képletű lánctagokat tartalmazó poliamid-származékot, majd az így kapott terméket a proteinnel vagy protein-szubsztrátummal. Továbbá, a protein-kapcsolószerrel a protein térhálósítható, a térhálós protein a nem térhálósított proteintól elválasztható. 35 Ezután a térhálósított protein ugyanazzal, vagy egy másik protein-kapcsoló reagenssel reagáltatható az említett poliamid-származékkal. Az ilyen, térhálósított proteinszármazékok megkötése különösen nagy aktivitást biztosít.

A találmány szerinti eljárás első lépése, vagyis a formai- 40 dehiddel és a formaldehiddel kondenzálható vegyülettel végzett reakció 0 C^e és 100 C° közötti hőmérsékleten hajtható végre. Ha hangyasavas oldatban vagy aminek jelenlétében dolgozunk, akkor konkurrens reakcióként a Leuckart—Wallach-féle reakció mehet végbe. Ezért ebben az 45 esetben előnyösen a fentiekben jelzett alacsony hőmérséklet-tartományban dolgozunk.

Formaldehid alatt a formaldehid szokásos formáit, vagyis vizes formaldehid oldatot, paraformaldehidet, trioxánt és egyéb formaldehidpolimereket értünk, amelyek a 50 jelzett reakciókörülmények között szabad formaldehidként viselkednek. Különösen előnyös a trioxán használata, mert ez szilárd és kémiailag jól definiált anyag lévén a legkönnyebben kezelhető kvantitatív módon.

A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi biológiailag 55 aktív proteinek vagy szubsztrátumaik poliamid-alapú hordozókon különösen kíméletes módon történő megkötését, illetve fixálását. A protein ezzel az eljárással a közbenső termékként képezett, említett poliamid-származékhoz; közvetlenül vagy tetszőleges nagyságú közbenső vegyületeken keresztül közvetve is köthető. Nagyobb távolság tartása, vagyis hosszabb „spacer” használata például akkor érdekes, ha már előre térhálósított proteineket akarunk itíegkötni, vagyis Olyan agregátumokat, amelyek a biológiailag aktív proteinek több molekulájából állanak. Térbeli 65 okokból ilyenkor gyakran van szükség aránylag hosszú „spacer”-ekre.

A találmány szerinti eljárással rögzített biológiailag aktív proteinek, illetve protein-szubsztrátumok lehetnek vízben oldhatók és vízben oldhatatlanok. Vízoldható poliamidokkal végzett kapcsolás útján például a proteinek féligáteresztő hártyákon történő kivérzése csökkenthető vagy megszüntethető, stabilitásuk növelhető és gyógyszerként való alkalmazásuk tehető lehetővé. Oldhatatlan hordozóanyagokra történő kötésnél a biológiailag aktív protein visszanyerhetősége jelent alkalmazási szempontból előnyt. Használhatók azonban antigének és antitestek specifikus abszorbeálószerek céljára és az enzimatikus analízisben is.

Az alábbi kiviteli példák a találmány szerinti eljárás további szemléltetését célozzák.

1. példa

0,3 mól feniléndiamint és 0,1 mól trioxánt 50%-os hangyasavba töltünk, és a reakcióelegyet 3 órán át egy 3 m hosszú nylon—6 csőben áramoltatjuk szivattyúval. A csövet ezután vízzel kimossuk, beletöltjük glutáraldehid 0,2 mólos, 8,5 pH-jú borát pufferral készült 10%-os oldatát, 15 percig állni hagyjuk, ismét kimossuk, majd megtöltjük 2 mg glukóz-oxidáz/ml koncentrációjú 0,1 mólos,

7.8 pH-jú foszfát pufferral készült oldatával, és éjszakán át 4C°-on állni hagyjuk. 0,1 mólos, 7,0 pH-jú, 1 mól konyhasót tartalmazó foszfátpufferral végzett mosás után

1.8 U/m cső enzimatikus aktivitást mérünk.

2. példa g 1 mm hosszúságú nylon-pelyhet 50%-os hangyasavban szuszpendálunk, és 0,3 mól feniléndiaminnal és 0,3 mól trioxánnal 3 órán át 50 C°-on reagáltatunk. Leszűrés után a módosított nylonpelyheket mossuk, és 1:1 arányú hígított sósavban szuszpendá^uk, 0 C°-ra hütjük, és keverés közben 0 C' -on 2,5 mólos nátriumnitrit-oldatot adunk hozzá. 60 perc eltelte után jéggel hütött vízzel mossuk, és a származék egy részéhez azonnal 10 mg/ml koncentrációjú, 7,0 pH-jú foszfát pufferral készült gulkózoxidáz oldatot adunk hozzá. A fixálást követően éjszakán át 1 mólos nátriumkloridoldattal 4 C°-on mosott nylon-pelyhek 17 U/g aktivitást mutatnak.

A frissen diazotált származék egy további részletéhez 0,1% tenzid tartalmú, 8 pH-jú nátriumkarbonát pufferral készült α-foetoprotein-antitest oldatot adunk, majd éjszakán át állni hagyjuk. Az antitest fajlagos megkötését a mellékelt rajz szerinti diagram ábrázolja.

3—5. példák

A 2. kiviteli példában leírt módon járunk el, de feniléndiamin helyett anilínt, illetve dianizidint, illetve diaminodifenilmetánt használunk. Az antitestek fajlagos megkötését ugyancsak a mellékelt rajz ábrázolja.

6. példa

0,03 mól feniléndiamint és 0,01 mól trioxánt 50%-os ecetsavban oldunk, 60 C^c-ra melegítünk, majd az oldatot szivattyúval 3 órán át egy 2 m hosszú nyloncsövön keresz- tül áramoltatjuk. Ezután a csövet vízzel mossuk, metakrilamid-metakrilsav-hidroxiszukcinimidészter kopolimer oldatát töltjük a csőbe, 4 óra múlva a csövet kiürítjük, és vízzel mossuk. Ezt követően 2 mg/ml koncentrációjú glukózoxidáz 0,1 mólos, 7,8 pH-jú foszfátpuffert töltünk belé, éjszakán át 4 C^c-on hagyjuk állni, kiürítjük, és mossuk. A kész enzimcső 1,5 U/m aktivitást mutat.

7. példa

20—20 g nylon-6 részecskét 0,3 mól feniléndiaminnal és 0,1 mól trioxánnal 60%-os ecetsavoldatban 50 C°-on, illetve 0,3 mól diaminodifenilmetánnal és 0,1 mól trioxánnal 60%-os ecetsavoldattal 50 C -on 2 órán át reagáltatunk. Vizes mosás után a feniléndiamin-termék és a diaminodifenilmetán-termék felét 1:10 arányban hígított híg sósavban szuszpendáljuk, 0 C°-ra hűtjük, és keverés közben 0 C -on 2,5 mólos nátriumnitrit-oldattal diazotáljuk. 60 perc múlva jéggel hütött vízzel mossuk. 1—1 g diazotált feníldiamín-származékhoz 10 mg/ml koncentrációjú, 0,1 mólos, 7,0 pH-jú foszfátpufferral készült glukózoxidáz-oldatot adunk, és 4 C^G-on éjszakán át állni hagyjuk. 0,1 mólos, 7,0 pH-jú, 1 mólos konyhasó tartalmú foszfátpufferral végzett mosás után a feniléndiamin-származék esetében 17 U/g, a diaminodifenilmetán-származék esetében 71 U/g aktivitást mérünk. A frissen diazotált feniléndiamin-származék és diaminodifenilmetán-származék 1—1 g-jához 5 mg/ml koncentrációjú, 6,0 pH-jú 0,1 mólos foszfátpufferral készült koleszterin-oxidáz oldatot adunk, 4 C^ü-on éjszakán át állni hagyjuk, majd konyhasóra 1 mólos, 6,0 pH-jú 0,1 mólos foszfátpufferral mossuk. A diazotált feniléndiamin-származék esetében az aktivitás 155 U/g, a diazotált diaminodifenilmetán-származék esetében pedig 160 U/g. Ezután mindkét terméket még egyszer mossuk konyhasóra 1 mólos és Thesit-re (hidroxipolietoxidodekán) 0,5%-os, 6,0 pH-jú 0,1 mólos foszfátpufferral. Ezután a mosási művelet után a feniléndiamin-származék aktivitása 10 U/g-ra, a diaminodifenilmetán-származék aktivitása pedig 15 U/g-ra csökken.

8. példa

5—5 g nylon részecskét az egyik esetében 0,3 mól diaminodifenilmetánnal és 0,1 mól trioxánnal, a másik esetben 0,3 mól karbamiddal és 0,1 mól trioxánnal, a harmadik esetben 0,3 mól anilinnal és 0,1 mól trioxánnal, a negyedik esetben 0.3 mól triaminotriazinnal és 0,1 mól trioxánnal 50%-os hangyasavoldatban 3 órán át 20 C°-on reagáltatunk. A mosás után a különböző származékokat 0,2 mólos, 8,5 pH-jú borátpufferral készült 10%-os glutáraldehidoldattal 15 percig reagáltatjuk, majd még egyszer mossuk. A különböző származékok 1—1 g-jához ezután 40,5 ml 0,1 mólos, 8,3 pH-jú trietanolamin pufferral 480 mg veseacilázból készített oldat 3 ml-ét adjuk. 1 órán át reagáltatjuk, majd leszűrjük, és mossuk. A mért aktivitás a feniléndiamin-származék esetében 7,5 U/g, a diaminodifenilmetán-származék esetében 6,7 U/g, a karbamid-származék esetében 6,8 U/g, és a triaminotriazin esetében 8,9 U/g.

9. példa g nylon-6 részecskéket 2 g zselatin és 0,1 mól trioxán 50%-os hangyasawal készült oldatával 3 órán át 50 C°-on reagáltatunk. Ezután mossuk, és a nylon-származékhoz 0,2 mólos, 8,5 pH-jú borátpufferral készült 10%-os glutár dialdehid oldatot adunk. 15 perc múlva leszűrjük, újra mossuk, és a származékhoz 5 mg/ml koncentrációjú, 0,1 mólos, 7,8 pH-jú foszfátpufferral készült glukózoxidáz oldatot adunk. Éjszakán át 4 C^ü-on történt állás után leszűrjük és mossuk. A nylonzselatin-származékhoz kötött glukózoxidáz aktivitása 81 U/g.

10. példa

0,1 mól poliamid-6-ot 100 %-os hangyasavban oldunk, és 0,1 mól feniléndiamint és 0,033 mól trioxánt adunk hozzá. 3 órás, 50 C°-on végzett reakció után az oldatot vízzel kicsapjuk, majd a kicsapott nylon-származékhoz alkoholos és vizes mosás után 0,2 mólos, 8,5 pH-jú borátpufferral készült 10%-os glutáraldehid oldatot adunk, majd 15 perc múlva újra mossuk. Ezután a nylon-származékhoz 2 mg/ml koncentrációjú, 0,1 mólos, 7,8 pH-jú foszfátpufferral készült glukózoxidáz oldatot adunk, éjszakán át 4 C'-on áííni hagyjuk, majd ezután mossuk. A mosott nylon-származék 16 U/g aktivitást mutat.

11. példa

A 10. kiviteli példában leírt módon nylon-származékot állítunk elő, de nem vízzel csapjuk ki azt, hanem 0,315—0,400 mm átmérőjű agyagrészecskéket adunk hozzá úgy, hogy még diszkrét részecskék vannak jelen, majd az anyagot vákuum alá helyezzük. Vizes mosás után 0,2 mólos, 8,5 pH-jú borátpufferral készült 10%-os glutáraldehid-oldatot adunk hozzá, 15 perc múlva szűrjük, mossuk, és a bevonattal ellátott agyaghoz 0,1 mólos, 7,8 pH-jú foszfátpufferral készült 2 mg/ml koncentrációjú glukózoxidáz oldatot adunk hozzá. Éjszakán át 4 C°-on állni hagyjuk, leszűrjük és mossuk. A nylon-agyag származék glukózoxidáz-aktivitása 8 U/g.

12. példa

Nylon-származékot állítunk elő a 10. kiviteli példában leírt módon, és azt előzőleg benzollal ragacsossá tett, 3 cm magas és 1 cm átmérőjű polisztirol üvegecskékbe töltjük. Egy órás állási idő után a nylon-származékot kiöntjük, az üvegecskéket átöblítjük, majd 0,2 mólos, 8,5 pH-jú pufferral készült glutárdialdehid oldattal töltjük meg azokat. Éjszakán át 4 C^c-on történt állás után az üvegecskék mosás után 0,5 U/üveg aktivitást mutatnak.

13. példa

18,6 g CaCl₂, 18,6 g víz, 63 g metanol és 1—1000 rész hangyasav elegyében 30—80 C° közötti hőmérsékleten poliamid-6-ot oldunk, az oldatot forrón 2 m hosszú csövekbe töltjük, majd ezután azokat azonnal kiöblítjük hideg vízzel. A csövek belső felületén amorf, reakcióképes nylonréteg marad vissza. Ezután 0,03 mól feniléndiamin és 0,01 mól trioxán 60%-os ecetsawal készült oldatát szivattyúzzuk át 60 C^c-on a nyloncsöveken. Ezután vízzel mossuk, majd 50 mg/ml koncentrációjú dioxános parafasav-dihidroxiszukciniinidészter oldatot töltünk a csőbe. 15 óra múlva a csövet kiürítjük, és .

a) 5 mg/ml koncentrációjú, 0,1 mólos, 7,8 pH-jú főszfátpufferral készült glukózoxidáz-oldatot töltünk belé,

b) 372 mg glukózoxidáz4,5 ml 0,1 mólos, 7,8 pH-jú oldatához 6,5 mg, 0,5 ml dioxánban oldott etilénglikol-bisz-propionsav-bisz-hidroxíszukcinimidésztert adunk hozzá, majd éjszakán át 4 C^c-on állni hagyjuk. Ezután a térhálósított glukózoxidázt Sephadex G 200^R (térhálósított dextrán) kolonnán kromatografáljuk, és a térhálós részt (kizárási térfogat kb. 90%) 0,1 mólos, 7,8 pH-jú foszfátpufferbán a fenti csőben töltünk.

Az a) esetben az aktivitás 4 U/m, a b) esetben 9 U/m.

14. példa g 0,100—0,125 mm átmérőjű nylon-6 szemcsét 100 ml 40%-os hangyasavban szuszpendálunk, és 2,25 g trioxánt (0,075 mól formaldehid-egységet) és 9,4 g (0,1 mól) fenolt adunk hozzá. 3 órán át 50 C°-on tartjuk, majd leszűrjük, metanollal, ezt követően pedig vízmentes éterrel lemossuk. A szemcséket 250 ml olyan toluolban szuszpendáljuk, amelyben előzőleg 10 ml hexametiléndiizocianátot oldottunk, 2 óra múlva leszívatjuk, vízmentes éterrel mossuk, és azonnal 15 mg/ml koncentrációjú, 0,1 mólos, 7,0 pH-jú foszfátpufferral készült glukózoxidázt adunk hozzá. Éjszakán át állni hagyjuk, majd mossuk. Az ezután mért aktivitás 11,2 U/g.

Claims (6)

1. Eljárás proteinnek poliamidon vagy ismert szilárd hordozóra felvitt poliamidon történő rögzítésére, azzal jellemezve, hogy a poliamidot, valamely poliamid-oldószer jelenlétében, ekvimoláris mennyiségű formaldehiddel és egy aromás aminnal, triazinnal, karbamiddal, fenollal vagy zselatinnal 0 és 100 C^c közötti hőmérsékleten reagáltatunk olyan poliamid-származék képzése közben, amely a láncban —CO—N—

5 CH₂

I

R₂ általános képletű lánctagokat tartalmaz, amelyben R₂ jelentése aromás aminból, triazinból, karbamidból, fenolból vagy zselatinból származó csoport, 10 ezt a poliamid-származékot egy ismert bi- vagy polifunkciós kapcsoló reagenssel vagy szervetlen nitrittel reagáltatjuk, majd önmagában ismert módon diazotáljuk és ezután vizes oldatban biológiailag aktív proteinnel vagy protein-szubsztrátummal érintkeztetjük, utóbbi megkötődése 15 mellett.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a formaldehiddel történő reakciót legalább 50%-os hangyasavban vagy ecetsavban mint poliamid oldószerben hajtjuk végre.

20

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a poliamidot formatest alakjában alkalmazzuk és csak felületét kezeljük oldószerrel.

4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a poliamidot oldata alakjá-

25 bán reagáltatjuk, és a poliamid-származékot azután szilárd hordozóanyag felületére csapjuk le.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy kapcsoló reagensként glutárdialdehidet, dihidroxiszukcinimidésztert, diacetált, bisz-maleini-

30 midet, bifunkcionális iminoésztert, diepoxidot, dikarbonsavkloridot, diizocianátot vagy diizotiocianátot — mely vegyületek 2—12 szénatomosak — alkalmazunk.

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy kapcsolóreagensként akrilamid/me-

35 takrilamid-ból és akrilsavszukcinimidészter/metakrilsavszukcinimidészter-ből álló kopolimert alkalmazunk.