JP5628476B2 - 抗体コンジュゲート - Google Patents
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Description
本出願は2005年4月28日に出願された特許文献1の利益を主張し、この出願は引用により本明細書に編入する。
1.分野
本発明は、生物学的サンプル中の目的分子を検出するための試薬および方法に関する。より詳細には、本発明は抗体コンジュゲートおよび組織切片のような生物学的サンプル中の目的分子を検出するためのそのようなコンジュゲートの使用法に関する。
2.背景
抗体およびシグナル発生部分の共有コンジュゲートは、生物学的サンプル中の特異的な標的分子を検出するためのイムノアッセイに使用することができる。そのようなコンジュゲートの抗体部分は、サンプル中の標的に特異的に結合し、そしてシグナル発生部分を利用して標的の存在/およびまたは場所を示す検出可能なシグナルを提供する。広く使用されるようになったコンジュゲートの1つの型、特に免疫組織化学的分析用のコンジュゲートは、抗体と酵素とのコンジュゲートである(抗体−酵素コンジュゲート)。検出可能なシグナルは、基質をサンプルに加え、そしてコンジュゲートの酵素部分が基質を、抗体部分がその標的に結合した部位で例えば着色、蛍光または発光生成物に転換することにより生成される。
シグナル発生部分を持つ抗体コンジュゲートが開示され、このコンジュゲートの作成および使用法も開示される。開示する抗体コンジュゲートは、生物学的サンプル中の目的分子の検出、特に組織切片および細胞学サンプル中のそのような分子の検出に優れた性能を現す。特に開示する抗体−酵素コンジュゲートは、高量の抗体特異性および酵素活性を保持し、そしてこれにより生物学的サンプル中の抗原の検出に現在使用されているコンジュゲートよりも強力な染色を低いバックグラウンドで提供する。
を有する。
を有する。場合によりPEGリンカーのヒドラジド基は抗体のグリコシル化部分に形成されたアルデヒド基の炭素に酸化により結合される。
本発明のさらなる観点は、以下の非限定的例により具体的に説明され、これは以下に定義する略号および用語について始める。
I.略号
2−ME 2−メルカプトエタノール
2−MEA 2−メルカプトエチルアミン
Ab 抗体
ALP アルカリホスファターゼ
BSA ウシ血清アルブミン
DTE ジチオエリスリトール(シス−2,3−ジヒドロキシ−1,4−ジチオ
ールブタン)
DTT ジチオスレイトール(トランス−2,3−ジヒドロキシ−1,4−ジチ
オールブタン)
EGFR 上皮増殖因子受容体
ER エストロゲン受容体
HRP 西洋ワサビペルオキシダーゼ
IHC 免疫組織化学
ISH in situハイブリダイゼーション
MAL マレイミド
NHS N−ヒドロキシ−スクシンイミド
PEG ポリエチレングリコール
PR プロゲステロン受容体
SAMSA S−アセチルメルカプトコハク酸
SATA N−スクシンイミジルS−アセチルチオアセテート
SATP スクシンイミジル アセチル−チオプロピオネート
SM シグナル発生部分
SMPT スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−(2−ピリジル
ジチオ)トルエン
SPDP N−スクシンイミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート
TCEP トリス(カルボキシエチル)ホスフィン
用語「a」、「an」および「the」は、内容が明確に他を示さない限り、単数および複数の両方の指示対称を含む。
III.概説
1つの観点では、以下に表す一般構造
を有するヘテロ二官能ポリアルキレングリコールリンカーを介してシグナル発生部分に共有結合された抗体を含む抗体/シグナル発生部分コンジュゲートが開示される。1または複数の水素原子は、ヒドロキシル基、アルコキシ基(メトキシおよびエトキシのような)、ハロゲン原子(F、Cl、Br、I)、スルファト基およびアミノ基(ジアルキルアミノ基のようなモノ−およびジ−置換アミノ基を含む)のようなさらなる官能基に置換され得る。
s)、インビトロジェン コーポレーション(Invitrogen Corporation)、ユージーン、オレゴン州に見いだすことができる)、検出可能な構築物(量子ドットのような蛍光構築物、これは例えばインビトロジェンコーポレーション、ユージーン、オレゴン州から得ることができる;例えば米国特許第6,815,064号、同第6,682,596号および同第6,649,138号明細書を参照にされたい。これら特許のそれぞれは、引用により本明細書に編入する)、金属キレート(Gd3+のような放射活性または常磁性金属イオンのDOTAおよびDPTAキレートのような)、およびリポソーム(蛍光分子を封鎖するリポソームのような)を含む。
式中、AおよびBは前のような異なる反応性基を含み、xおよびyは前の通りであり、そしてXおよびYはスペーサー基、例えば1と6との間の炭素、または1と4との間の炭素のような1と10との間の炭素を有するスペーサー基であり、そして場合により1もしくは複数のアミド連結、エーテル連結、エステル連結等を含んでよい。スペーサーXおよびYは同じか、または異なることができ、そして直鎖、分岐または環式(例えば脂肪族もしくは芳香族環式構造)であることができ、そして非置換または置換されることができる。スペーサー上の置換基であることができる官能基には、カルボニル基、ヒドロキシル基、ハロゲン(F、Cl、BrおよびI)原子、アルコキシ基(メトキシおよびエトキシのような)、ニトロ基およびスルファト基がある。
を有するヘテロ二官能性ポリエチレングリコールリンカーである。さらに詳細な態様では、このリンカーのスクシンイミド基のカルボニルはシグナル発生部分のアミン基に共有結合され、そしてリンカーのマレイミド基は抗体のチオール基に共有結合されるか、あるいはその逆である。さらに他の特定の態様では、平均約1から約10の間のシグナル部分が抗体に共有結合している。
を有する。幾つかのさらに詳細な態様では、このリンカーのヒドラジド基は抗体のアルデヒド基に共有結合され、そしてリンカーのマレイミド基はシグナル発生部分のチオール基に共有結合されるか、あるいはその逆である。さらに一層詳細な態様では、抗体のアルデヒド基は、抗体のFc部分のグリコシル化領域の酸化により抗体のFc部分に形成されたアルデヒド基である。さらに別の詳細な態様では、平均約1から約10の間のシグナル発生部分が抗体に共有結合されており、そのようなシグナル発生部分は、酵素、量子ドットおよびリポソームを含む。
を有するコンジュゲートを含んでなる。
ートは、式:
を有するコンジュゲートを含んでなる。
を有するヘテロ二官能性リンカーが開示される。
を有するPEGマレイミド/活性エステルと反応させることを含む。シグナル発生部分は、例えば酵素(西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような)であることができる。
を有する。
以下の非限定的な実施例は、本発明の特定の観点をさらに具体的に説明するために提供される。
1つの態様では、開示するシグナル発生部分コンジュゲートは以下のスキーム1〜3に記載する方法に従い調製され、ここでヘテロ二官能性ポリアルキレングリコールリンカーは、アミン−反応性基(活性エステル)およびチオール−反応性基(マレイミド)を有するポリエチレングリコールリンカーである。スキーム1に示すように、1もしくは複数の利用可能なアミン基を有するシグナル発生部分(酵素または量子ドットのような)を、過剰なリンカーと反応させて活性化シグナル発生部分を形成する。
(具体的に説明するようにマレイミド基のような)を、シグナル発生部分のチオール基と反応させる。ここでも方法を逆転することができ、ここでリンカーは最初にシグナル発生部分上のアルデヒド基(例えば糖部分の酸化により形成された)と反応させて、活性化シグナル発生部分を形成し、次いで活性化シグナル発生部分を抗体上のチオール基と反応させることができる。さらにスキーム4および5は、単一抗体と単一のシグナル発生部分を連結する単一のリンカーのみを示しているが、複数のシグナル発生部分を単一の抗体に連結するか、または幾つかの抗体を単一のシグナル発生部分に連結することも可能であると考えられる。
HRPの活性化
HRPは、例えばマレイミド基および活性エステル基(例えばクウォンタ バイオデザイン(Quanta Biodesign)、ポーウェル、オハイオ州から入手可能なMAL−PEG4−NHS、MAL−PEG8−NHSまたはMAL−PEG12−NHSリンカー)を有する100倍モル過剰の二官能性PEGリンカーを用いて、周囲温度(23〜25℃)で60分間処理することにより結合のために活性化され得る。Superdex200 10/300GLカラムを通す精製の後、過剰なリンカーを含まないHRP(多くは5〜7個のマレイミドを有する)を100倍モル過剰で得る。MAL−PEG4−NHSリンカーを使用したHRP抗体コンジュゲートの生産のための例示の手順を以下に概略する。活性化HRP上のマレイミド基の数は、実施例Dに詳細に記載する方法により測定できる。
結合用の抗体、例えば抗−マウスIgGまたは抗−ウサギIgG抗体を活性化するために、抗体を25ミリモルのDTTと周囲温度(23〜25℃)で25分間インキュベーションした。PD−10SEカラムを通す精製後、DTTを含まない抗体、典型的には2〜6個の遊離チオールを持つ抗体を得る(スキーム2)。ヤギ抗−マウスIgGチオールを調製するために概略した例示の手順は、一般に他の抗体にも応用可能である。抗体あたりのチオール数は、実施例Dに記載するチオールアッセイにより測定することができる。
チオール化抗体(抗−マウスIgG−チオールまたは抗−ウサギIgG−チオールのように)に、3倍モル過剰のHRP−PEG4−マレイミドを加える。次いで反応物を周囲温度(23〜25℃)で16時間インキュベーションする。Superdex200 10/300GL SEカラムを通す精製後、典型的には抗体あたり平均2もしくは3個のHRPを持つ抗体が得られる。抗体あたりのHRPの数は、コンジュゲートの吸収を280/403nmの比率で測定し、そして実施例Dの章に概略する計算を行うことにより決定する。例示的手順を以下に概略する。
開示したコンジュゲートの優れた単分散性を具体的に説明するために、開示したコンジュゲートの全12例のMWプロファイル(具体的には、8種のHRP−抗−マウスIgGコンジュゲートおよび4種のHRP−抗−ウサギIgGコンジュゲート)を、サイズ排除クロマトグラフィーにより、Superdex200 10/300GLカラム(アマシャム、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)に充填したAkta purifierで、0.1Mリン酸ナトリウムバッファーpH7.5で0.5〜1.0mL/分で溶出することにより決定した。分子量のキャリブレーション標準には:アルドラーゼ(158kDa)、カタラーゼ(232kDa)、フェリチン(440kDa)、チログロビン(669kDa)、リボヌクレアーゼA(13.7kDa)、キモトリプシノーゲン(25kDa)、卵白アルブミン(43kDa)およびアルブミン(67kDa)を含んだ。調査したコンジュゲートは、約230から約330kDaの間の平均MWを有し、与えられたコンジュゲートのMWの全体的範囲は約190〜550kDaであった。精製したコンジュゲートの再注入では、コンジュゲートが非結合化HRPおよび抗体を含まないことが示された。
以下の代表的方法は、マレイミドおよびチオール含量ならびにコンジュゲートあたりのHRP分子の数を測定するために使用することができる。
全タンパク質マイクロプレート法(ピアス)
BSA ピアス(ロックフォード、イリノイ州)
Coomasie Plus(商標)試薬 ピアス(ロックフォード、イリノイ州)
マイクロタイタープレート BIO−TEK Synergy HT
プレートリーダー
1.プレートリーダーをつけ、そして少なくとも30分間、595nmでウォームアップする。
2.脱イオン水中に1組のBSA標準(1.0、0.5、0.25および0.125mg/mL)を調製する。
3.3連で、15mLのブランク、および各標準または未知を適切なマイクロプレートウェルにピペットで入れる。
4.300mlのCoomasie Plus(商標)試薬を各ウェルに加え、そしてプレートシェーカーで30秒間、混合する。
5.シェーカーからプレートを取り出す。最高に合致した結果のために、プレートを10分間、室温でインキュベーションする。
6.プレートリーダーで595nmの吸収を測定する。
7.ブランクレプリカに関する595nmの平均測定値を、すべての他の個別標準および未知サンプルレプリカの595nmの測定から差し引く(プレートリーダーにより自動的に行われた)。
8.各BSA標準に関してブランク−補正した595nmの測定の平均を、そのμg/mLの濃度に対してプロットすることにより標準曲線を準備する。各未知サンプルのタンパク質濃度を決定するために標準曲線を使用する(プレートリーダーにより行なわれる)。
装置および材料:
メルカプトエタノール J.T.Baker,フィリップスバーグ、
ニュージャージー州
エルマン試薬 ピアス、ロックフォード、イリノイ州
リン酸ナトリウム
EDTA
・反応バッファー:0.1Mリン酸ナトリウム;1mM EDTA、pH8.0。
・メルカプトエタノール(BME):M.W.=78.3、d=1.114g/ml。
1.プレートリーダーをつけ、そして少なくとも30分間、412nmでウォームアップする。
2.作業ストックを調製する:7μlのBMEを5mlの反応バッファーに
3.3連で、以下のような1組のBME標準を調製する。
5.100μlの各標準または未知をマイクロタイタープレートの適切なウェルに加える(鋳型を取り付ける)。
6.エルマン試薬溶液を調製する。
7.20μlのエルマン試薬を、標準または未知を含む各ウェルに加える。
8.混合し、そして室温で15分間インキュベーションする。
9.プレートリーダーを使用して412nmで吸収を測定する。
10.生データのみを使用する場合、標準について得た値をプロットして標準曲線を作成する。
実験の濃度(mMチオール)は、標準曲線から決定し、ここで標準曲線は式:Y=mX+b、式中、Y=OD412nm、X=mMチオール、m=傾斜(標準曲線の式から得た
)、およびb=x軸切片(標準曲線の式から得た)を与える。
係数
・HRP分子量=40,000Da
・抗体分子量=150,000Da
・1パーセント溶液(1mg/mL)のHRPの280nm吸光係数=6.52
・1パーセント溶液(1mg/mL)の抗体の280nm吸光係数=14
・403nmでのHRP吸収/280での吸収=2.90(この値はHRPの各異なるロットについて測定する)
1)HRPによるコンジュゲートに起因する280nmでの吸収を、403nmでのコンジュゲートの吸収を測定し、そして式:403nmでのHRP吸収/2.90=280nmでのHRP吸収
に適用することにより決定する。
2)1で得た値から、HRPの量を式:280nmでのHRP吸収/6.52=mg/mlでの[HRP]に適用することにより決定する。
3)mMHRPの数は、mg/mlでのタンパク質濃度(2から得た)をFW(40,000)で割り、そして1000を掛けることにより決定する。
4)2次抗体によるコンジュゲートに起因する280nmの吸収は、280nmでのコンジュゲートの吸収を測定し、そして1で決定したHRPによる吸収(contribution)を差し引くことにより決定する。
5)4で得た値から、mg/mlでのHRPの量を、式:280nmでの抗体の吸収/14=mg/mlでの[抗体]に適用することにより決定する。
6)mM抗体の数は、mg/mlでの抗体濃度をFW(150,000)で割り、そして1000を掛けることにより決定する。
7)2次抗体あたりのHRPの数は、mMoleのHRP(3で決定した)を2次抗体のmMole数(6で決定した)により割ることにより算出する。
1パーセント溶液(1mg/mL)のHRP−抗体コンジュゲートの280nmでの吸光係数の決定は、コンジュゲートのタンパク質濃度を確認し、次いで280nmでの吸収を測定することにより決定される。タンパク質濃度は、上記のピアスのクーマシーアッセイに従い測定することができる。
ヤギ抗−マウスおよびヤギ抗−ウサギHRPコンジュゲートのIHC中のカクテルの45℃での安定性を、B5ブロッカー(ベンタナ メディカル システム(Ventana Medical Systems)社、タゥーソン、アリゾナ州)で希釈したアビジン中で測定し、そして結果を図1A〜Dに示す。固定したパラフィン包埋ヒト扁桃組織切片を、CD20/L26(マウス)1次抗体を使用してプローブで釣り、続いてBenchMark(商標)XT自動染色機(ベンタナ メディカル システム社、タゥーソン、アリゾナ州)の標準自動化プロトコールに従いHRPコンジュゲートのカクテルを用いてDAB検出を行った。すべてのスライドは3連で行った。図1Aは試験0日目の典型的な結果を示す;図1Bは試験1日目の典型的な結果を示す;図1Cは試験3日目の典型的な結果を示す;そして図1Dは試験7日目の典型的な結果を示す。たとえ45℃の高温でも、開示したコンジュゲートは7日までに完全に分解せず(染色強度の30〜40%の損失)、開示したコンジュゲートが高度に安定であることを示す。
MAL−PEG4−NHSリンカーで作成されたヤギ抗−マウスIgGコンジュゲート、同じリンカーで作成されたヤギ抗−ウサギIgGコンジュゲート、またはウサギ抗−マウスIgGおよび2つのコンジュゲートの混合物(「増幅」)を、以下に掲げる1次抗体(ベンタナ メディカル システム社、タゥーソン、アリゾナ州から入手可能)の組織抗原への結合を検出する2次抗体試薬として使用した。適切な保管組織切片をこれらのコンジュゲートで処理し、そして自動化染色機(BenchMark(商標)XT、ベンタナ メディカル システム社、タゥーソン、アリゾナ州)でHRPシグナル発生(DABの添加による)に関する標準プロトコールを使用して発色した。典型的な自動化プロトコールには、脱パラフィン化、数回のすすぎ工程、反応バッファーの添加、1次抗体の添加、2次抗体の添加、DABおよび過酸化水素の添加、そしてカウンター染色の添加を含む。
抗−bcl−2(クローン100/D5) 抗−CD57(クローンNK−1)
抗−CD15(クローンMMA) 抗−CD23(クローン1B12)
抗−CD20(クローンL26) 抗−ER(クローン6F11)
抗−PR(クローン16) 抗−p53(クローンD07)
抗−EGFR(クローン31G7) 抗−サイクリン−d1(クローンP2D
11F11)
抗−c−erbB−2(クローンCB11) 抗−PSA
*注記:ウサギ抗体であるPSAを除き、すべてはマウス抗体であった。
実験は45℃および37℃でヤギ抗−ウザキIgG抗体−HRP(PEG4)コンジュゲートの経時的安定性を評価するために行った。この場合、コンジュゲートの安定性は核酸配列の酵素金属組織学的検出(EnzMet、ナノプローブ(Nanoprobe)社、ヤップハンク、ニューヨーク州)が関与するアッセイで評価した。図14に具体的に説明するように、ビオチン−標識プローブDNAを抗−ビオチンウサギコンジュゲートおよび抗−ウサギIgGコンジュゲートの組み合わせを用いて検出した。コンジュゲートの混合物は希釈剤としてStabilzyme Select(スーモディックス(Surmodics)、エデン プレーリー、ミネソタ州)で保存した。上記実施例Dで検討した第2世代のスカフォールドコンジュゲートの安定性も、同じ期間にわたり調査した。
十分に定められた抗体−HRPコンジュゲートが作成できる再現性は、抗体のDTT還元時間の効果、リンカーの長さならびに種類、加えたリンカーの立体化学、カップリング反応中のHRP濃度、および抗体に対するHRPのモル比を見ることにより調査した。Superdex 10/300 200GLカラムに充填したAKTA Purifie
r LC(アマシャム、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)でのサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、最初の比較を行った。使用した移動相は、リン酸緩衝化生理食塩水、pH=7.5で1ml/分の流速であった。
実施例Bですでに概略したコンジュゲートに関する合成プロトコールに続いて、DTT(25mM)でのインキュベーション時間を変える一連の反応を設定した。以下の時点を試験した:15分、25分、35分および60分。抗体とマレイミド誘導化HRPとの間のカップリング反応を行った後、図17で具体的に説明するサイズ排除クロマトグラフィーを行った。DTT処理の時間を変えることにより、コンジュゲートの組成が有意に改変しないことが明らかとなった。これらのコンジュゲートを用いて組織に関して得た染色(扁桃、Ki−67)は、染色特異性または強度に有意な変化を示さなかったが、15分のDTT処理は残りの処理よりもわずかに良かった。しかし他の3つの時点では組織に関して同一の染色が得られ、この実験が開示した方法による再現性のある活性コンジュゲートの生産に、DTT還元の時間感受性がそれほど重要ではないことを示す。
実施例Bの手順に続き、リンカーの種類およびサイズを変えて一連の反応を設定した。以下のリンカーを使用した:LC−SMCC(16原子の疎水性リンカー、ピアス、ロックフォード、イリノイ州)、MAL−dPEG8−NHSエステル(34原子の親水性リンカー、クウォンタ バイオデザイン社、ポーウェル、オハイオ州)、MAL−dPEG12−NHSエステル(46原子の親水性リンカー、クウォンタ バイオデザイン社、ポーウェル、オハイオ州)、ならびに推薦されるMAL−dPEG4−NHSエステル(22原子の親水性リンカー、クウォンタ バイオデザイン社、ポーウェル、オハイオ州)。これら各リンカーは、バッファー中(0.1Mリン酸ナトリウム、pH=7.5)にて100倍過剰で1時間使用した。LC−SMCCはジメチルホルムアミド(DMF)に溶解し、そしてHRPに加えたが、バッファー中で全DMF容量の10%を越えなかった。DTT処理抗体にカップリングした後、サイズ排除クロマトグム(図18)を精製で得た。3つの各PEGリンカーは、保持容量に基づき、比較的良い性能であったが、LC−SMCCリンカーは、HRPへの少ない結合を示し(〜16分で大きなピーク)、そして全体的に小さいコンジュゲートを示した。
HRP−IgGコンジュゲートの合成は、実施例Bの結合手順に従い行ったが、HRP量よりもモル過剰のMAL−PEG4−NHSエステルリンカーは、5倍過剰から500倍過剰まで変動させた。コンジュゲートの分析(500x、250x、100x、50x、25x、10xおよび5x)は、DTTで還元したAbとの反応後、この実施例の直前に記載したようなサイズ排除クロマトグラフィーを介して行い、より過剰なリンカーを使用して合成したコンジュゲートが小さく、狭いサイズ排除範囲を有することが示された(図20)。しかし5x〜100xの範囲のコンジュゲートに関して、全体的なサイズ分布に大きな差異は無いようだった。これら各コンジュゲートに関する組織染色(扁桃、Ki−67、示さず)は大体等価であり、5xが他の量よりもわずかに暗いだけであった。
実施例Bですでに概略した合成法に従い、初期の誘導化工程中のHRP濃度の効果を調査した。以下の濃度でHRPのストック溶液:元のプロトコール(25mg/ml)濃度と一緒に5mg/ml、15mg/ml、20mg/mlおよび50mg/mlを反応に使用した。DTTで還元した抗体を用いたカップリング工程の後、合成したコンジュゲートに関する全体的なサイズ排除クロマトグラムに差異は無かった(図21)。組織に関して合成したコンジュゲートの活性をアッセイすると(扁桃、Ki−67)、染色特異性および強度は5、10、15、20および25mg/mlのHRP濃度を使用して合成したコンジュゲートについて同一であったことに注目した。しかし染色強度は、開始HRP濃度を50mg/mlに上げた時、低下した。開始HRP濃度は、生産レベルのスケールアップについては10〜25mg/mlの間に留めるべきである。
HRP/IgGコンジュゲートは実施例Bに概略したプロトコールを使用して合成したが、マレイミド誘導化HRPに対してDTTで還元した抗体の比を変動させた。以下の比(抗体/HRP)を試験した:3:1、1:3、1:2、1:4、1:5、1:10,1:20ならびに推薦される1:3。サイズ排除クロマトグラムのプロファイルは(図22)、HRPの相対的量が減少すると、コンジュゲートの全体的サイズが減少し、1:20(Ab:HRP)が最大のコンジュゲートを、そして3:1(Ab/HRP)が最小のコンジュゲートを生じたことを示す。これらコンジュゲートの各々が組織(扁桃、Ki−67)で十分機能し、3:1(Ab:HRP)が最も明るい量の染色を生じた。1:3(Ab:HRP)は良好な染色の中間点であり、そしてHRPに関して比較的高い収量を生産する。
HRP−PEG 12 −マレイミド(4):4mLの琥珀色のバイアルに、18.4mg(100当量)のMAL−dPEG12(商標)NHSエステル(クウォンタ バイオデザイン、ポーウェル、オハイオ州、F.W.=865.92)を加え、続いて341μL(8.52mg、0.213μM)のHRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ、ピアス、ロックフォード、イリノイ州)を0.1Mのリン酸ナトリウム、pH7.5中の25mg/mL溶液として加えた。次いでバイアルを暗中、周囲温度(23〜25℃)で自動回転機に置き、そして1時間アミド結合形成反応を進めた。次いで340μlのアリコートを精製のために取り出した。(使用したAkta Purifier注入ループの容量は500μlであった)。次いで純粋なHRP−PEG12−マレイミドは、Superdex 10/300カラムに充填したAkta Purifierでサンプルを分画し、0.1Mリン酸ナトリウム、p7.5で1.0mL/分で溶出することにより得た。HRPを含有する画分(F15〜17)をプールして、1%溶液(pH7.5)で6.52の280nmでの吸光係数を使用してUV/VIS分光光度計により測定した時、HRP−PEG12−マレイミドの1.5mlの4.75mg/mL溶液を得た(83.6%収率)。
フィド還元を25分間進めた。反応溶液を2つの等しい容量に分け(脱塩カラムの能力の限界により)、そして過剰なDTTは画分をPD−10脱塩カラムに通し、0.1Mリン酸ナトリウム、1.0mM EDAT、pH6.5で溶出すことにより除去した。抗体を含有する画分(F4〜5)を合わせて、pH6.5の1%溶液で14の280nmの吸光係数を使用してAgilent8453UV/分光計により測定した時、DTTを含まないウサギ−抗−ビオチン−SHの4.0mLの0.436mg/mL溶液(87.5%収率)を得た。
スキーム6はマレイミド/ヒドラジドヘテロ二官能性PEGリンカーの一般的調製法を示す。簡単に説明すると、マレイミド/活性エステルPEGリンカー(クウォンタ バイオデザインから得られるような)を保護されたヒドラジド誘導体と反応させ、次いで酸と反応させてマレイミド/ヒドラジドPEGリンカーを得た。
1.ヘテロ二官能性PEGリンカーを介してシグナル発生部分と共有結合された抗体を含んでなる抗体−シグナル発生部分コンジュゲート。
2.リンカーのチオール−反応性基が抗体に共有結合され、そしてヘテロ二官能性リンカーのアミン反応性基がシグナル発生部分と共有結合されている、態様1に記載のコンジュゲート。
3.リンカーのチオール−反応性基が抗体のシステイン残基に共有結合されている、態様2に記載のコンジュゲート。
4.リンカーのチオール−反応性基が、抗体に導入されたチオール基に共有結合されている、態様2に記載のコンジュゲート。
5.リンカーのアルデヒド−反応性基が抗体に共有結合され、そしてリンカーのチオール反応性基がシグナル発生部分に共有結合されている、態様1に記載のコンジュゲート。
6.リンカーのアルデヒド−反応性基が、抗体のグリコシル化部分上に形成されたアルデヒドに共有結合されている、態様5に記載のコンジュゲート。
7.リンカーが式:
を有する態様1に記載のコンジュゲート。
8.コンジュゲートが式:
を有する態様7に記載のコンジュゲート。
9.シグナル発生部分が酵素を含んでなる態様8に記載のコンジュゲート。
10.酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼを含んでなる態様9に記載のコンジュゲート。
11.s=2〜6の態様8に記載のコンジュゲート。
12.n=4〜12の態様8に記載のコンジュゲート。
13.コンジュゲートが式:
を有する態様7に記載のコンジュゲート。
14.シグナル発生部分が酵素を含んでなる態様13に記載のコンジュゲート。
15.酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼを含んでなる態様14に記載のコンジュゲート。
16.t=2〜6の態様13に記載のコンジュゲート。
17.m=4〜12の態様13に記載のコンジュゲート。
18.式:
を有するヘテロ二官能性リンカー。
19.m=2〜30の態様18に記載のリンカー。
20.m=3〜20の態様18に記載のリンカー。
21.m=4〜12の態様18に記載のリンカー。
22.抗体−シグナル発生部分コンジュゲートを調製する方法であって:
抗体からチオール化抗体を形成し;
アミン基を有するシグナル発生部分をPEGマレイミド/活性エステル二官能性リンカーと反応させて、活性化シグナル発生部分を形成し;そして
チオール抗体を活性化シグナル発生部分と反応させて、抗体−シグナル発生部分コンジュゲートを形成する、
ことを含んでなる上記方法。
23.チオール化抗体を形成することが、抗体と還元剤を反応させてチオール化抗体を形成することを含んでなる、態様22に記載の方法。
24.抗体と還元剤を反応させてチオール化抗体を形成することが、抗体あたり約1から約10の間の平均チオール数をもつ抗体を形成することを含んでなる、態様23に記載の方法。
25.抗体を還元剤と反応させることが、抗体を2−メルカプトエタノール、2−メルカプトエチルアミン、DTT、DTEおよびTCEPおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される還元剤と反応させることを含んでなる、態様23に記載の方法。
26.抗体を還元剤と反応させることが、抗体をDTTおよびDTEおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される還元剤と反応させることを含んでなる、態様25に記載の方法。
27.抗体を還元剤と反応させることが、抗体を約1mMから約40mMの間の濃度の還元剤と反応させることを含んでなる、態様26に記載の方法。
28.チオール化抗体を形成することが、チオール基を抗体に導入することを含んでなる、態様22に記載の方法。
29.チオール基を抗体に導入することが、抗体を2−イミノチオラン、SATA、SATP、SPDP、N−アセチルホモシステインチオラクトン、SAMSAおよびシスタミンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される試薬と反応させることを含んでなる、態様28に記載の方法。
30.チオール基を抗体に導入することが、抗体をオキシダントと反応させて抗体の糖部分をアルデヒド基に変換し、そしてアルデヒド基をシスタミンと反応させることを含んでなる、態様28に記載の方法。
31.オキシダントが過ヨウ素酸塩イオン、I 2 、Br 2 またはそれらの組み合わせを含んでなる、態様30に記載の方法。
32.シグナル発生部分をPEGマレイミド/活性エステル二官能性リンカーと反応させて活性化シグナル発生部分を形成することが、シグナル発生部分と式:
を有するPEGマレイミド/活性エステルと反応させることを含んでなる、態様22に記載の方法。
33.シグナル発生部分が酵素を含んでなる態様22に記載の方法。
34.酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼを含んでなる態様33に記載の方法。
35.抗体−シグナル発生部分コンジュゲートを調製する方法であって:
抗体をオキシダントと反応させてアルデヒドを持つ抗体を形成し;
アルデヒドを持つ抗体をPEGマレイミド/ヒドラジド二官能性リンカーと反応させて、チオール−反応性抗体を形成し;そして
チオール−反応性抗体を、チオール化シグナル発生部分を反応させて、抗体−シグナル発生部分コンジュゲートを形成する、
ことを含んでなる、上記方法。
36.抗体をオキシダントと反応させてアルデヒドを持つ抗体を形成することが、抗体のグリコシル化領域を酸化してアルデヒドを持つ抗体を形成することを含んでなる、態様35に記載の方法。
37.抗体のグリコシル化領域を酸化することが、抗体を過ヨウ素酸塩、I 2 、Br 2 またはそれらの組み合わせで処理することを含んでなる態様35に記載の方法。
38.さらにチオール化シグナル発生部分をシグナル発生部分から形成することを含んでなる、態様35に記載の方法。
39.チオール化シグナル発生部分を形成することが、シグナル発生部分を還元剤と反応させてチオール化シグナル発生部分を形成することを含んでなる、態様38に記載の方法。
40.還元剤が2−メルカプトエタノール、2−メルカプトエチルアミン、DTT、DTEおよびTCEPおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、態様39に記載の方法。
41.チオール化シグナル発生部分を形成することが、チオール基をシグナル発生部分に導入することを含んでなる、態様38に記載の方法。
42.チオール基をシグナル発生部分に導入することが、シグナル発生部分を2−イミノチオラン、SATA、SATP、SPDP、N−アセチルホモシステインチオラクトン、SAMSAおよびシスタミンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される試薬と反応させることを含んでなる、態様38に記載の方法。
43.アルデヒドを持つ抗体をPEGマレイミド/ヒドラジド二官能性リンカーと反応させて、チオール−反応性抗体を形成することが、アルデヒドを持つ抗体を式:
を有するリンカーを持つアルデヒドを持つ抗体と反応させることを含んでなる、態様37に記載の方法。
44.チオール化シグナル発生部分が酵素を含んでなる態様35に記載の方法。
45.酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼを含んでなる態様44に記載の方法。
46.生物学的サンプル中の目的分子の検出方法であって:
生物学的サンプルを、ヘテロ二官能性PEGリンカーを介してシグナル発生部分に共有結合された抗体を含んでなる抗体−シグナル発生部分コンジュゲートと接触させ;そして
サンプル中の目的分子の存在を示す抗体−シグナル発生部分コンジュゲートにより生成されるシグナルを検出する、
ことを含んでなる、上記検出方法。
47.生物学的サンプルが組織切片または細胞学サンプルを含んでなる、態様46に記載の方法。
48.コンジュゲートが酵素に共有結合した抗体を含んでなる態様46に記載の方法。
49.酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼを含んでなる態様48に記載の方法。
50.コンジュゲートが式:
を有する態様46に記載の方法。
51.コンジュゲートが式:
を有する態様46に記載の方法。
52.方法がさらに、生物学的サンプルを水溶性金属イオン、および酵素によりレドックス−活性剤に転換される酵素のレドックス−不活性基質と接触させることを含んでなり、このレドックス−活性剤は金属イオンを還元してその沈殿を生じる、態様48に記載の方法。
53.酵素がアルカリホスファターゼを含んでなる態様52に記載の方法。
54.シグナル発生部分がオキシド−レダクターゼ酵素を含んでなり、そして方法がさらに生物学的サンプルを水溶性金属イオン、酸化剤および還元剤と接触させることを含んでなる、態様48に記載の方法。
55.オキシド−レダクターゼ酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼを含んでなる、態様54に記載の方法。
56.抗体が抗−抗体抗体を含んでなる、態様46に記載の方法。
57.抗体が抗−ハプテン抗体を含んでなり、そして方法がさらにサンプルをハプテン−標識化抗体またはハプテン−標識化核酸配列と接触させることを含んでなる態様46に記載の方法。
58.シグナル発生部分が酵素を含んでなり、そして方法がさらに生物学的サンプルを発色性、蛍光性および/または発光性化合物と接触させることを含んでなる、態様46に記載の方法。
Claims (34)
- 生物学的サンプルが組織切片または細胞学サンプルを含む、請求項1に記載の方法。
- コンジュゲートが酵素に共有結合した抗体を含む、請求項1に記載の方法。
- 酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼを含む、請求項3に記載の方法。
- さらに、生物学的サンプルを水溶性金属イオン、および酵素によりレドックス−活性剤に転換される酵素のレドックス−不活性基質と接触させる工程を含み、このレドックス−活性剤は金属イオンを還元してその沈殿を起こさせる、請求項3に記載の方法。
- 酵素がアルカリホスファターゼを含む、請求項5に記載の方法。
- シグナル発生部分がオキシド−レダクターゼ酵素を含み、そしてさらに生物学的サンプルを水溶性金属イオン、酸化剤および還元剤と接触させる工程を含む、請求項3に記載の方法。
- オキシド−レダクターゼ酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼを含む、請求項7に記載の方法。
- 抗体が抗−抗体抗体を含む、請求項1に記載の方法。
- 抗体が抗ハプテン抗体を含み、そしてさらにサンプルをハプテン−標識化抗体またはハプテン−標識化核酸配列と接触させる工程を含む請求項1に記載の方法。
- シグナル発生部分が酵素を含み、そしてさらに生物学的サンプルを発色性、蛍光性および/または発光性化合物と接触させる工程を含む、請求項1に記載の方法。
- nが4〜12の整数であり、そしてsが2〜6の整数である、請求項1に記載の方法。
- sが3〜4の整数である、請求項12に記載の方法。
- SMが西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼである、請求項13に記載の方法。
- シグナル発生部分が量子ドットである、請求項1または15に記載の方法。
- 抗体を還元剤と反応させてチオール化抗体を形成する工程であって、抗体当り1から10の間の平均チオール数をもつ抗体を形成する工程を含む、請求項18に記載の方法。
- 抗体を還元剤と反応させる工程が、抗体を2−メルカプトエタノール、2−メルカプトエチルアミン、DTT、DTEおよびTCEPおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される還元剤と反応させる工程を含む、請求項19に記載の方法。
- 抗体を還元剤と反応させる工程が、抗体を1mMから40mMの間の濃度の還元剤と反応させる工程を含む、請求項20に記載の方法。
- シグナル発生部分が酵素を含む請求項18に記載の方法。
- 酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼを含む請求項22に記載の方法。
- コンジュゲートが酵素に共有結合した抗体を含む請求項18に記載の方法。
- 酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼを含む請求項24に記載の方法。
- 抗体が抗−抗体抗体を含む請求項24に記載の方法。
- 抗体が抗−ハプテン抗体を含む請求項24に記載の方法。
- シグナル発生部分が酵素を含んでなる請求項28に記載のコンジュゲート。
- 酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼである請求項30に記載のコンジュゲート。
- sが2〜6の整数である請求項28に記載のコンジュゲート。
- nが4〜12の整数である請求項28に記載のコンジュゲート。
- シグナル発生部分が量子ドットを含む請求項28に記載のコンジュゲート。
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