JP7073487B2 - 操作された抗体化合物およびこれらの抱合体 - Google Patents

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Description

本発明は、新規抗体化合物およびその使用方法に関する。
抗体、およびその切断型フラグメントは、インビボおよびインビトロでの適用のために、治療用、細胞毒性、および診断用ペプチドまたは他の小分子を含む種々のペイロードと抱合され得る。抗体抱合体は、免疫グロブリン重鎖または軽鎖残基の表面に生成した遊離システインスルフヒドリル基を反応性求核試薬として使用して合成し、種々のリンカーを介してペイロードと安定した化学結合を形成することができる。しかしながら、鎖間ジスルフィド結合の還元後の従来のチオール結合は、反応条件に応じて不均一な抗体－薬物抱合体混合物をもたらす。注意深く制御された反応でさえ、結果的に抱合体対抗体比（ＣＲ）の分布を生じることとなる。高いＣＲの抱合体混合物は、低いＣＲの抱合体混合物と比較して、異なる化学的および生物物理学的特徴を示す。抗体へのペイロードの付加は、標的結合およびＦｃ受容体の相互作用に潜在的に影響を与えることを含む、抗体の薬理学的特性も変化させることができる。それゆえ、抱合体対抗体比のより均一で標的とされる分布を有する抱合体を得ることが望ましい。
ペイロード抱合抗体のより均質で標的とする分布を可能にするために、システイン残基を親ｍＡｂに組み込んで、チオール結合を介した薬物ペイロードの部位特異的結合を促進してきた（例えば、米国特許第７，５２１，５４１号）。しかしながら、親の表面アミノ酸残基のシステインへの突然変異は、ｍＡｂの生物物理学的特性および発現に影響することがある。例えば、操作されたシステイン残基は、適切なタンパク質の折り畳みに重要である天然のジスルフィドを破壊する可能性があった。さらに、結果として生じる不対システインは、分子間ジスルフィドを形成し、結果的に高次の凝集体を生じる可能性もあった。したがって、代替の操作されたシステイン残基を含むさらなるＩｇＧ ｍＡｂについての必要性が残っている。免疫系の細胞に関与する化合物におけるこのような抗体についての必要性も残っている。
癌免疫療法は、身体の免疫系を利用して癌細胞を攻撃するものであって、腫瘍学の創薬および開発におけるダイナミックな分野である。殺腫瘍薬の使用に基づく療法とは対照的に、治療アプローチは、腫瘍細胞を認識して破壊するために、宿主の免疫系に関与するパラダイムシフトを表す。２つの成功した癌免疫療法戦略は、免疫系の抑制を抑制して適応免疫系および／または自然免疫系、特に腫瘍特異的細胞毒性Ｔ細胞の活性化を可能にすること（すなわち、免疫チェックポイント遮断）と抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）に関与するようおよび／またはＡＤＣＣを増強するよう設計された抗体改変である。
成功した臨床結果は、近年、Ｔ細胞の活性化を結果的に生じ、Ｔ細胞仲介性腫瘍細胞破壊を結果的に生じる様式で、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４などのＴ細胞表面受容体と同族リガンドとの相互作用を改変するように設計された免疫チェックポイント調節因子を用いて達成された。ＰＤ－１（例えば、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））およびペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）））およびＣＴＬＡ－４（例えば、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））を標的とする癌免疫療法は、扁平非小細胞肺癌および転移性黒色腫などの癌の治療のためにＦＤＡによって承認されてきた。
ＡＤＣＣは、抗体Ｆｃドメインと免疫系細胞（例えば、ナチュラルキラーまたは「ＮＫ」細胞）の表面上にある受容体（例えば、Ｆｃガンマ受容体ＩＩＩａ）との相互作用を包含し、結果的に免疫細胞からの細胞溶解タンパク質の放出とともに標的とされた腫瘍細胞のその後の破壊をもたらす。ＡＤＣＣを提示する承認済みの抗体療法には、リツキシン（登録商標）（リツキシマブ）、アルゼラ（登録商標）（オファツムマブ）、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）、およびカンパス（登録商標）（アレムツズマブ）が含まれる。強化されたＦｃ受容体結合を介してＡＤＣＣ活性を改良させた抗体を操作する取り組みは、同様の標的特異性を持ち、ＡＤＣＣ活性化が低い抗体では、疾患において有効ではないか、またはもはや十分に有効ではない患者において有効であった（例えば、Ｇａｚｙｖａ（登録商標）（オビヌツズマブ））。
現行の癌免疫療法の進歩にもかかわらず、癌を治療する上で免疫系を関与させる代替アプローチの必要性が残っている。例えば、Ｔ細胞特異的免疫療法に応答する患者の割合は様々であり、どの患者が応答することになるかを特定する信頼性の高い予後アッセイが不足している。さらに、療法誘発性自己免疫疾患は、免疫チェックポイント阻害剤療法と関連する深刻な副作用である。免疫チェックポイント阻害剤による自己免疫疾患の出現は、腫瘍特異的Ｔ細胞が出現、増殖、および活性化することができるようにＴ細胞レパートリーの抑制を除去するように設計されているので、免疫チェックポイント阻害剤の作用機序におそらく関連している。したがって、免疫チェックポイント阻害剤は比較的非特異的であり、この特異性の欠如の結果の１つは、自己反応性Ｔ細胞が寛容を破り、療法の中止で必ずしも可逆的ではない自己免疫疾患を誘発することである。増強されたＡＤＣＣアプローチは、腫瘍細胞の殺滅のためにＮＫ細胞を関与させるように設計されている。しかしながら、ＮＫ細胞は、血中の総白血球数の約５％しか構成していない。
自然免疫系の多形核細胞（ＰＭＮ）を標的にして腫瘍細胞の殺滅に関与させることは、癌免疫療法への代替アプローチを代表する。ＰＭＮは白血球総数の５０％超を含んでおり、片利共生細菌および外来細菌を含む病原体に対する主要な防御ラインである。自然免疫応答中に、病原体によって提示される病原体と関連する分子パターン（ＰＡＭＰ）は、好中球などの免疫細胞の表面上にあるパターン認識受容体（ＰＲＲ）によって認識される。このようなＰＲＲの１つは、好中球細胞表面上に発現する膜結合型Ｇタンパク質共役受容体であるホルミルペプチド受容体１（ＦＰＲ１）である。ＦＰＲ１は、感染後に細菌によって産生および放出されるものを含む、Ｎ－ホルミル－メチオニンを含有するタンパク質およびペプチドを検出する。好中球の表面上のＦＰＲ１とＮ－ホルミル－メチオニン含有ペプチド、特にＮ－ホルミル－メチオニン－ロイシン－フェニルアラニン（本明細書では「ｆＭＬＦ」）残基を提示するペプチドとの結合は、感染部位への好中球の運動性／走化性を誘起する。ホルミルペプチドによるＦＰＲ１の活性化はまた、病原体を破壊するために、細胞毒性分子を放出するための脱顆粒、活性酸素種の産生、および食作用などの病原体殺滅機序を誘発する。本発明に関連する文献には、天然および非天然のＦＰＲ－１アゴニストの広範な説明がある（Ｈｅ ＨＱ ａｎｄ Ｙｅ ＲＤ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１７ Ｍａｒ １３；２２（３）．ｐｉｉ：Ｅ４５５．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２２０３０４５５、Ｈｗａｎｇ ＴＬ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ ＢｉｏｍｏｌＣｈｅｍ．２０１３ Ｊｕｎ １４；１１（２２）：３７４２－５５．ｄｏｉ：１０．１０３９／ｃ３ｏｂ４０２１５ｋ、Ｃａｖｉｃｃｈｉｏｎｉ Ｇ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏｏｒｇＣｈｅｍ．２００６ Ｏｃｔ；３４（５）：２９８－３１８、Ｈｉｇｇｉｎｓ ＪＤ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ＭｅｄＣｈｅｍ．１９９６ Ｍａｒ １；３９（５）：１０１３－５、Ｖｅｒｇｅｌｌｉ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ｒｅｓ．２０１７ Ｆｅｂ；７８（１）：４９－６２．ｄｏｉ：１０．１００２／ｄｄｒ．２１３７０、Ｋｉｒｐｏｔｉｎａ ＬＮ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１０ Ｆｅｂ；７７（２）：１５９－７０．ｄｏｉ：１０．１１２４／ｍｏｌ．１０９．０６０６７３、Ｃｉｌｉｂｒｉｚｚｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ＭｅｄＣｈｅｍ．２００９ Ａｕｇ ２７；５２（１６）：５０４４－５７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊｍ９００５９２ｈ．）
腫瘍細胞を殺滅するためにｆＭＬＦ生体抱合体（ペプチドに抱合された抗体）を利用してマクロファージを誘引する以前の取り組みには、いくつかの制限があった。ＯｂｒｉｓｔおよびＳａｎｄｂｅｒｇは、カルボジイミドの化学的性質を使用してペプチドを遊離リジンに連結させて、ｆＭＬＦをポリクローナルウサギ抗腫瘍抗体に結合させた。このポリクローナル抗体へのｆＭＬＦの非特異的結合は、親和性の有意な低減、マクロファージの走化性を促進するｆＭＬＦの効力の１００倍の低減、および補体源として正常ウサギ血清を使用した事前標識済み肝細胞癌細胞からの補体依存的５１Ｃｒ放出を抗体が誘導する能力の有意な低下をもたらした（Ｏｂｒｉｓｔ ａｎｄ Ｓａｎｄｂｅｒｇ，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２５；９１－１０２（１９８２））。これらのデータは、リジンの化学的性質を介したｆＭＬＦの抗体への非特異的付加が、抗原結合親和性、ＦＰＲ－１受容体の関与、およびＦｃ受容体の関与を低減させる可能性と一致している。
Ｏｂｒｉｓｔらは、カルボジイミドの化学的性質を用いたｆＭＬＦとマウスモノクローナル抗体とのカップリングにより、ヒト卵巣癌細胞に対する親和性を保持できることを示したが、この結合は、ヒト末梢血単核細胞に対する走化性応答を低減させた。補体固定に及ぼす結合の影響は報告されていなかった。（Ｏｂｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃ．，５（４）；３０７－３１４（１９８３））。類似の知見（結合の保存および走化性の低下）は、ｆＭＬＦを黒色腫ｍＡｂ ９．２．２７へカルボジイミドの化学的性質を介して直接結合したときにも報告された（Ｏｂｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３２；４０６－０８（１９９１））。本発明の抗体結合化合物は、単核細胞およびマクロファージに加えてヒト好中球を誘引および活性化することができるが、以前の文献での所見は、ほぼ専ら単核細胞およびマクロファージに向けられていた。このことは、好中球がヒトの循環中の総白血球集団のより大きな割合を表し、他の全ての白血球集団よりも高い率で産成され、組織内へと容易に移行することができ、活性化されるとき、標的細菌を排除するのに非常に有効であるので、重要な治療関連性を有している可能性がある。
抗体と薬物の結合の最も一般的な方法は、還元された鎖間ジスルフィドのアルキル化、リジン残基のアシル化、および遺伝子操作されたシステイン残基のアルキル化である。本発明は、抗体抱合体を生成するための全ての一般的な方法が、好中球および自然免疫系細胞上にあるＦＰＲ－１を作動させることができる抗体抱合体を生成するのに有効であろうことを企図する。
自然免疫系のＰＭＮ好中球細胞を関与させて腫瘍細胞破壊に関与させることができる腫瘍標的治療用抗体はまた、現行の癌免疫療法を上回る利点を提供する可能性がある。例えば、このような治療用抗体は、腫瘍に対するＴ細胞応答を増強する可能性があり、腫瘍細胞の殺滅を駆動するために腫瘍特異的Ｔ細胞の存在を必要としない場合がある。ＰＭＮ好中球による抗腫瘍活性の関与は、全ての患者が好中球において本来発現するであろうＦＰＲ（例えば、ＦＰＲ１）の存在に依存するであろう。さらに、腫瘍細胞殺滅においてＰＭＮ好中球を関与させることができる薬剤は、１日あたり１×１０１１個の好中球が産生されると概算されてきたので、腫瘍殺滅細胞の強力で持続的な供給から利益を得るであろう。腫瘍細胞殺滅において好中球を関与させることができる腫瘍標的化抗体は、免疫チェックポイント調節因子よりも安全性の利点を有している可能性がある。チェックポイント調節因子とは異なり、好中球を標的とする療法は、循環中の好中球が短命であるので、免疫細胞の増殖を誘導したり必要としたりしないであろう。さらに、好中球が、付着した抗体を用いて標的腫瘍細胞を殺滅するとき、腫瘍標的抗体は排除され、治療用抗体が標的エフェクター細胞によって消費されるにつれて免疫刺激を低下させる負のフィードバックループを提供する。
腫瘍細胞内でＦＰＲ－１陽性の自然免疫細胞を関与させることができる腫瘍標的治療用抗体が有用であると立証することができる別の方法は、低い突然変異量を有しそれゆえ免疫系によって容易に認識されない不活発な腫瘍の治療のためにある。好中球仲介性腫瘍細胞殺滅を誘引し活性化すると、結果的に、サイトカインが豊富な環境において新抗原が局所的に産生され、それにより適応免疫系の細胞が腫瘍を認識して腫瘍細胞を排除のために標的とする能力を獲得する。
腫瘍細胞殺滅において好中球を関与させることができる腫瘍標的抗体は、腫瘍細胞内への内在化後に毒性ペイロードを放出するように典型的に設計された毒性剤ベースの抗体薬物抱合体（ＡＤＣ）を上回る利点も有している可能性がある。ＡＤＣと同様に、腫瘍細胞殺滅において好中球を関与させることができる腫瘍標的抗体は、腫瘍細胞で高い発現をし、正常組織では低い発現をする抗原を認識すべきであるが、ＡＤＣとは異なり、腫瘍細胞殺滅において好中球に関与させることができる腫瘍標的抗体は、自然免疫系の表面上にある受容体へのアゴニストの曝露を必要とし、したがって、内在化の可能性が比較的低い標的抗原を用いてより良好に機能することが予想される。
抱合された抗体は、鎖間ジスルフィドを還元して反応性チオールを生成するか、結合に表面リジンを利用することによって生成することができるが、このような従来の結合方法は、結果として抗体の不安定性または結合親和性の喪失をもたらすことがある。それゆえ、本発明は、操作されたシステイン残基にＮ－ホルミル－メチオニンペプチド体の部位特異的付加（複数可）を抗体ペプチド抱合体に提供し、この部位特異的付加は次の利点のうちの１つ以上を提供する（ｉ）部位特異的付加により、Ｎ－ホルミル－メチオニンペプチド生体抱合体の効力および最大有効性を必要とする均質な結合特性が可能になり、（ｉｉ）スペーサーを使用して、抗体へ結合するときにヒト好中球の遊走および活性化のためにＮ－ホルミル－メチオニンペプチド生体抱合体の効力を保持することができ、（ｉｉｉ）部位特異的付加が腫瘍細胞殺滅に寄与することができるＩｇＧ１構築物におけるＦｃ受容体相互作用を保持し、（ｉｖ）部位特異的付加により、抗体は抗原結合親和性を保持することができ、これは、全てではないが、いくつかの先行文献の例ですでに達成されており、ならびに（ｖ）部位特異的結合が薬剤物質の製造および薬剤製品の安定性において有意な利点となり得る抗体の安定性を維持する。
本発明はまた、抗体抱合化合物（生体抱合体とも称する）の生成における使用のための操作されたシステイン残基を含む、ＩｇＧ抗体も提供する。より詳細には、本発明は、自然免疫系の細胞上のＦＰＲ－１を活性化することができるペプチドまたはペプチド模倣体に抱合された、操作されたシステイン残基からなる腫瘍標的抗体を含む治療用化合物を提供する。実施形態において、抗体は、ＦＰＲ－１を作動させることができるペプチドまたはペプチド模倣体に結合する。いくつかの特定の実施形態において、ペプチドまたはペプチド模倣体は、次式のうちの１つの化合物である：
式Ｉ．Ｒ－Ｐ１―Ｐ２－Ｐ３－ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２－Ｙ
（式中、
Ｒは、ＨＣ（＝Ｏ）－またはＲ１ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－であり、
Ｒ１は、置換または非置換であってもよいＣ５～Ｃ１０アリールであり、
Ｐ１は、ＭｅｔまたはＮｌｅであり、
Ｐ２は、ペプチドまたはペプチド模倣体であり、
Ｐ３は、イプシロンアミノアシル化されたリジンであり、
ｎは、６～２４の整数であり、
Ｙは、マレイミド、マレイミド－ジアミノプロピオン酸、ヨードアセトアミドまたはビニルスルホンである）、
またはその塩。
式ＩＩ．Ｒ－Ｐ１－Ｐ２－ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２－Ｐ３－Ｙ
（式中、
Ｒは、ＨＣ（＝Ｏ）－またはＲ１ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－であり、
Ｒ１は、置換または非置換であってもよいＣ５～Ｃ１０アリールであり、
Ｐ１は、ＭｅｔまたはＮｌｅであり、
Ｐ２は、ペプチドまたはペプチド模倣体であり、
Ｐ３は、イプシロンアミノアシル化されたリジンであり、
ｎは、６～２４の整数であり、
Ｙは、マレイミド、マレイミド－ジアミノプロピオン酸、ヨードアセトアミドまたはビニルスルホンである）、
またはその塩。
式ＩＩＩ．Ｒ－Ｍｅｔ－Ｘ１―Ｘ２―Ｘ３―Ｘ４－ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２－－Ｘ５－Ｙ
（式中、
Ｒは、ＨＣ（＝Ｏ）－またはＲ１ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－であり、
Ｒ１は、フェニル、４－クロロフェニル、４－メトキシフェニル、ｐ－トリル、ｍ－トリル、アリール、置換アリール、または２－アリルであり、
Ｘ１は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、ジエチルグリシン、またはジプロピルグリシンであり、
Ｘ２は、Ｐｈｅ、α－Ｍｅ－Ｐｈｅ、ＤＰｈｅ、４－Ｆ－Ｐｈｅ、２－Ｎａｌ、または１－Ｎａｌであり、
Ｘ３は、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、α－Ｍｅ－Ｌｅｕ、ＤＬｅｕ、または非存在であり、
Ｘ４は、Ｇｌｕ、ＤＧｌｕ、γＧｌｕ、Ｇｌａ、または非存在であり、
Ｘ５は、Ｃ２～Ｃ１０ジアミノアルキルであり、かつ
Ｙは、マレイミド、マレイミド－ジアミノプロピオン酸、ヨードアセトアミドまたはビニルスルホンである）、
またはその塩。
いくつかの他の詳細な実施形態では、ペプチドは次式のうちの１つの化合物である：
式ＩＶ．［Ｒ－Ｐ１－Ｐ２－ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２－］２－Ｑ－Ｘ－Ｙ
（式中、
Ｒは、ＨＣ（＝Ｏ）－またはＲ１ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－であり、
Ｒ１は、置換または非置換であってもよいＣ５～Ｃ１０アリールであり、
Ｐ１は、ＭｅｔまたはＮｌｅであり、
Ｐ２は、ペプチドまたはペプチド模倣体であり、
ｎは、６～２４の整数であり、
Ｑは、アルファアミノ基および側鎖アミノ基においてアシル化されることができるアミノ二官能性残基であり、
Ｘは、Ｃ２～Ｃ１０ジアミノアルキルであり、かつ
Ｙは、マレイミド、マレイミド－ジアミノプロピオン酸、ヨードアセトアミドまたはビニルスルホンである）、
またはその塩。
式Ｖ．［［Ｒ－Ｐ１－Ｐ２－ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２－］４－ （Ｑ）２－Ｑ－Ｘ－Ｙ
（式中、
Ｒは、ＨＣ（＝Ｏ）－またはＲ１ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－であり、
Ｒ１は、置換または非置換であってもよいＣ５～Ｃ１０アリールであり、
Ｐ１は、ＭｅｔまたはＮｌｅであり、
Ｐ２は、ペプチドまたはペプチド模倣体であり、
ｎは、６～２４の整数であり、
Ｑは、アルファアミノ基および側鎖アミノ基においてアシル化することができるアミノ二官能性残基であり、
Ｘは、Ｃ２～Ｃ１０ジアミノアルキルであり、かつ
Ｙは、マレイミド、マレイミド－ジアミノプロピオン酸、ヨードアセトアミドまたはビニルスルホンである）、
またはその塩。
式ＶＩ．［［［Ｒ－Ｐ１－Ｐ２－ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２－］８－（Ｑ）４－（Ｑ）２－Ｑ－Ｘ－Ｙ
（式中、
Ｒは、ＨＣ（＝Ｏ）－またはＲ１ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－であり、
Ｒ１は、置換または非置換であってもよいＣ５～Ｃ１０アリールであり、
Ｐ１は、ＭｅｔまたはＮｌｅであり、
Ｐ２は、ペプチドまたはペプチド模倣体であり、
ｎは、６～２４の整数であり、
Ｑは、アルファアミノ基および側鎖アミノ基においてアシル化することができるアミノ二官能性残基であり、
Ｘは、Ｃ２～Ｃ１０ジアミノアルキルであり、かつ
Ｙは、マレイミド、マレイミド－ジアミノプロピオン酸、ヨードアセトアミドまたはビニルスルホンである）、
またはその塩。
式ＩＶ～式ＶＩの化合物は、アミノ二官能性残基（「Ｑ」で表される）を介して一緒に連結された２つ以上の化学誘引物質を含む。いくつかの実施形態において、Ｑは、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｐ、またはＤａｂである。好ましい実施形態において、二官能性残基は、リジン残基またはオルニチン残基である。二官能性残基は、各アミノ基を介して２つの追加のアミノ二官能性残基に結合し、それにより、化学誘引物質の数を４つの化学誘引物質に増加させることができる。追加の二官能性残基により、追加の数の化学誘引物質が可能になる。好ましい実施形態において、化学誘引物質の数は８以下である。例えば、Ｑ２がリジン分枝残基の繰り返しである場合、構造は次のとおりである。
Figure 0007073487000001
本発明は、式Ｉ～式ＶＩのいずれか１つの化合物を提供し、式中、Ｐ２はＸ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４によって与えられ、かつ
Ｘ１は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、ジエチルグリシン、またはジプロピルグリシンであり、
Ｘ２は、Ｐｈｅ、α－Ｍｅ－Ｐｈｅ、ＤＰｈｅ、４―Ｆ－Ｐｈｅ、２－Ｎａｌ、または１－Ｎａｌであり、
Ｘ３は、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、α－Ｍｅ－Ｌｅｕ、ＤＬｅｕ、または非存在であり、かつ
Ｘ４は、Ｇｌｕ、ＤＧｌｕ、γＧｌｕ、Ｇｌａ、または非存在である。
いくつかの実施形態において、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖまたは式ＶＩのいずれか１つの化合物は、ホルミルペプチド受容体１を作動させ、タンパク質と共有結合を形成することができる。いくつかの実施形態において、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ、または式ＶＩのいずれか１つの化合物は、リンカーを介して抗体に抱合されている。いくつかの詳細な実施形態において、化合物は、本明細書に説明するマレイミド－ＰＥＧリンカーを介して結合している。いくつかの詳細な実施形態において、ＰＥＧリンカーは、Ｘのジアミノアルキルに結合している。いくつかの詳細な実施形態において、ＰＥＧリンカーは非存在であり、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ、または式ＶＩのいずれか１つの化合物がＸのジアミノアルキルへ直接結合している。いくつかのこのような実施形態において、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ、または式ＶＩのいずれか１つに由来する化合物は、好中球などの自然免疫細胞の表面上のホルミルペプチド受容体を活性化することができる。
本発明の実施形態は、癌療法を超えた有用性を有する関心対象の標的細胞の特異的排除において自然免疫細胞を関与させるために非腫瘍の脈絡においても有用である。例えば、肥大組織、接近が制限された組織、またはウイルス感染細胞において正常細胞の排除が望ましい状況では、提供される標的とされる細胞の殺滅に対して自然免疫系の細胞を活性化することもできる関心対象の細胞を特異的に標的とする抗体は、該標的組織または感染細胞を排除するのに有用であろう。
本発明は、操作されたシステイン残基にＦＰＲ－１アゴニストを付着させるための一連のリンカーを企図する（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１６ Ｆｅｂ ２；１７（２）．ｐｉｉ：Ｅ１９４．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ１７０２０１９４）。提供される例には、システインへのチオエーテル結合を形成するためのマレイミド系リンカーが含まれる。ハロアセチルリンカーなどの別のリンカーの使用も、抗体を結合するために使用されることができる。
したがって、本発明は、ＩｇＧ重鎖および軽鎖定常領域を含む抗体を提供し、該定常領域は少なくとも１つのシステインを含む。実施形態において、定常領域は、表面上に不対遊離システインを含む。別の実施形態において、定常領域は操作されたシステインを含む。いくつかの詳細な実施形態において、定常領域は、次の残基、すなわち、ＣＨ１ドメインにおける残基１２４、ＣＨ１ドメインにおける残基１５７、ＣＨ１ドメインにおける残基１６２、ＣＨ２ドメインにおける残基２６２、ＣＨ３ドメインにおける残基３７５、ＣＨ３ドメインにおける残基３７３、ＣＨ３ドメインにおける残基３９７、ＣＨ３ドメインにおける残基４１５、Ｃカッパドメインにおける残基１５６、Ｃカッパドメインにおける残基１７１、Ｃカッパドメインにおける残基１９１、Ｃカッパドメインにおける残基１９３、Ｃカッパドメインにおける残基２０２、またはＣカッパドメインにおける残基２０８のうちの１つに少なくとも１つの操作されたシステインを含む。
本発明は、ＩｇＧ重鎖定常領域を含む抗体も提供し、該定常領域は、ＣＨ１ドメインにおける残基１２４にあるシステインと、ＣＨ１ドメインにおける残基１５７および１６２ならびにＣＨ３ドメインにおける残基３７５および残基３７８のうちの１つではあるが全てではない残基のシステインとを含む。詳細な実施形態として、ＩｇＧ重鎖定常領域は、ヒト、マウス、ラットまたはウサギＩｇＧ定常領域である。さらにより詳細には、ＩｇＧ重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４アイソタイプであり、さらにより詳細には、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４である。さらにより詳細な実施形態として、ＩｇＧ重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプであり、配列番号１７、１８、１９または５２のアミノ酸配列、およびさらにより詳細には配列番号２０、２１または５３のアミノ酸配列によって付与される。ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む上述の抗体に対するさらに詳細な実施形態として、該定常領域は、残基２４７で置換されたイソロイシンと、残基３３９で置換されたグルタミンとをさらに含む。別の実施形態において、定常領域は、残基２４７で置換されたイソロイシンと、残基３３９で置換されたグルタミンと、残基３３２で置換されたグルタミン酸とを含む。代替的な詳細な実施形態として、ＩｇＧ重鎖定常領域はヒトＩｇＧ４アイソタイプであり、配列番号１２、１３、１４、５４または５５のアミノ酸配列、さらにより詳細には配列番号１５、１６、５６または５７のアミノ酸配列によって付与される。ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域を含む上述の抗体に対するさらに詳細な実施形態として、該定常領域は、残基２２８で置換されたプロリンと、残基２３４で置換されたアラニンと、残基２３５で置換されたアラニンとをさらに含む。
本発明はさらに、各ＩｇＧ定常領域が少なくとも１つのシステインを含む、２つの重鎖ＩｇＧ定常領域を含む抗体を提供する。実施形態において、各ＩｇＧ定常領域は、次の残基、すなわちＣＨ１ドメインにおける残基１２４、ＣＨ１ドメインにおける残基１５７、ＣＨ１ドメインにおける残基１６２、ＣＨ３ドメインにおける残基３７５、およびＣＨ３ドメインにおける残基３７８のうちの１つのシステインを含む。本発明は、各ＩｇＧ定常領域がＣＨ１ドメインにおける残基１２４のシステインと、ＣＨ１ドメインにおける残基１５７および残基１６２ならびにＣＨ３ドメインにおける残基３７５および残基３７８のうちの１つではあるが全てではない残基のシステインとを含む２つの重鎖ＩｇＧ定常領域を含む上述の抗体のいずれかも提供する。より詳細には、各ＩｇＧ定常領域は、ヒト、マウス、ラットまたはウサギＩｇＧ、さらにより詳細にはヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４アイソタイプ、さらにより詳細にはヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４である。さらに詳細な実施形態として、各ＩｇＧ重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプであり、配列番号１７、１８、１９または５２のアミノ酸配列、さらにより詳細には配列番号２０、２１または５３のアミノ酸配列によって与えられる。２つのヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む上述の抗体のさらに詳細な実施形態として、該定常領域は、残基２４７で置換されたイソロイシンと残基３３９で置換されたグルタミンとをさらに含む。別の実施形態において、定常領域は、残基２４７で置換されたイソロイシンと、残基３３９で置換されたグルタミンと、残基３３２で置換されたグルタミン酸とを含む。代替的な詳細な実施形態として、各ＩｇＧ重鎖定常領域はヒトＩｇＧ４アイソタイプであり、配列番号１２、１３、１４、５４または５５のアミノ酸配列、さらにより詳細には配列番号１５、１６、５６または５７のアミノ酸配列によって与えられる。２つのヒトＩｇＧ４重鎖定常領域を含む上述の抗体に対するさらに詳細な実施形態として、該定常領域は、残基２２８で置換されたプロリンと、残基２３４で置換されたアラニンと、残基２３５で置換されたアラニンとをさらに含む。
本発明は、ＣＨ１ドメインにおける残基１２４、ＣＨ１ドメインにおける残基１５７、ＣＨ１ドメインにおける残基１６２、ＣＨ２ドメインにおける残基２６２、ＣＨ３ドメインにおける残基３７５、ＣＨ３ドメインにおける残基３７３、ＣＨ３ドメインにおける残基３９７、ＣＨ３ドメインにおける残基４１５、Ｃカッパドメインにおける残基１５６、Ｃカッパドメインにおける残基１７１、Ｃカッパドメインにおける残基１９１、Ｃカッパドメインにおける残基１９３、Ｃカッパドメインにおける残基２０２、または、Ｃカッパドメインにおける残基２０８の各システインが化学誘引物質に結合させた上述の抗体のうちのいずれかをさらに提供する。実施形態において、化学誘引物質は、ｆ－Ｍｅｔペプチド、小分子ＦＰＲ－１アゴニスト、ＰＲＲアゴニスト、ペプチド模倣体、Ｎ－ウレイド－ペプチド、または細菌糖である。詳細な実施形態において、化学誘引物質は、Ｎ－ホルミル－メチオニンペプチドである。いくつかの実施形態において、化学誘引物質は、マレイミドリンカーを介して抗体システインに抱合されており、ここで、該リンカーは、マレイミド官能基とシステイン（ＣＨ１ドメインにおける残基１２４、ＣＨ１ドメインにおける残基１５７、ＣＨ１ドメインにおける残基１６２、ＣＨ２ドメインにおける残基２６２、ＣＨ３ドメインにおける残基３７５、ＣＨ３ドメインにおける残基３７３、ＣＨ３ドメインにおける残基３９７、ＣＨ３ドメインにおける残基４１５、Ｃカッパドメインにおける残基１５６、Ｃカッパドメインにおける残基１７１、Ｃカッパドメインにおける残基１９１、Ｃカッパドメインにおける残基１９３、Ｃカッパドメインにおける残基２０２、またはＣカッパドメインにおける残基２０８にある。）との間のチオエーテル結合を通じて該ＩｇＧ重鎖および軽鎖定常領域、への共有結合を形成し、該Ｎ－ホルミル－メチオニンペプチドのＣ末端リジンのイプシロンアミノ側鎖へのアミド結合を介して該Ｎ－ホルミル－メチオニンペプチドへの共有結合も形成する。実施形態において、本発明は、本明細書で言及される各システインがマレイミドリンカーを介してＮ－ホルミル－メチオニンペプチドに抱合されている上述の抗体のうちのいずれかを提供し、該リンカーはマレイミド官能基とシステインとの間のチオエーテル結合を介して該ＩｇＧ重鎖定常領域への共有結合を形成し、該Ｎ－ホルミル－メチオニンペプチドのＣ末端リジンのイプシロンアミノ側鎖へのアミド結合を介した該Ｎ－ホルミル－メチオニンペプチドへの共有結合も形成する。詳細な実施形態として、本発明は、各ＩｇＧ定常領域が、ＣＨ１ドメインにおける残基１２４のシステインと、ＣＨ１ドメインにおける残基１５７および１６２ならびにＣＨ３ドメインにおける残基３７５および３７８のうちの１つではあるが全てではない残基のシステインとを含む、２つの重鎖ＩｇＧ定常領域を含む抗体化合物をさらに提供し、ここで各ＣＨ１ドメインの残基１２４の各システイン、ならびにＣＨ１ドメインにおける残基１５７または１６２、各ＣＨ３ドメインの３７５または３７８における各システインは、マレイミドリンカーを介してＮ－ホルミル－メチオニンペプチドに抱合され、該リンカーは、マレイミド官能基と各ＩｇＧ定常領域の残基１２４、１５７または１６２および３７５または３７８のシステインとの間のチオエーテル結合を介して該抗体に、かつ該Ｎ－ホルミル－メチオニンペプチドのＣ末端リジンのイプシロンアミノ側鎖へのアミド結合を介して該Ｎ－ホルミル－メチオニンペプチドに共有結合している。上述の抱合抗体に対してさらに詳細には、マレイミドリンカーは式
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 を有し、式中、ｎ＝１～２４、より詳細にはｎ＝６～２４、さらにより詳細にはｎ＝１２である。さらにより詳細には、Ｎ－ホルミル－メチオニンペプチドは、Ｎ－ホルミル－メチオニン－ロイシン－フェニルアラニン－Ｘ（配列番号２２）であり、式中、Ｘは、マレイミドリンカーへのアミド結合形成によって修飾されたリジンである。さらにより詳細には、上述の抱合抗体化合物の各ＩｇＧ定常領域はヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４アイソタイプであり、さらにより詳細には、各ＩｇＧ重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１アイソタイプであり、残基２４７で置換されたイソロイシンと、残基３３９で置換されたグルタミンとをさらに含み、または各ＩｇＧ重鎖定常領域はヒトＩｇＧ４アイソタイプであり、残基２２８で置換されたプロリンと、残基２３４で置換されたアラニンと、残基２３５で置換されたアラニンとをさらに含む。
本発明の操作されたシステイン残基は、既存の癌治療用抗体のＩｇＧ定常領域へと組み込まれて、代替のＮ－ホルミル－メチオニンペプチド結合免疫治療薬の生成を促進することができる。あるいは、既存の癌治療用抗体の重鎖ＣＤＲまたは可変ドメインを、本発明の操作されたシステイン残基を含有するＩｇＧ定常領域と組み合わせて、結合免疫治療薬を生成することができる。これらの応用のための例示的な癌治療薬には、ＨＥＲ－２を発現する腫瘍を含む固形腫瘍を標的とするＩｇＧ１治療用抗体（すなわち、トラスツズマブおよびペルツズマブなどのＩｇＧ１抗体）、ＣＤ２０を発現する液性腫瘍を含む液性腫瘍を標的とするＩｇＧ１治療用抗体（すなわち、リツキシマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ、およびＡＭＥ１３３ｖなどのＩｇＧ１およびＩｇＧ１増強ＡＤＣＣ抗体）、およびｃ－Ｍｅｔ発現腫瘍を標的とする抗体（すなわち、エミベツズマブ）が含まれる。
本明細書に開示されるＮ－ホルミルメチオニンペプチド抱合抗体は、細胞毒性剤にさらに抱合してより高い有効性を達成するためのプラットフォームとして、または癌細胞内で過剰発現する抗原を標的とする抗体薬物抱合体における薬物抱合体の代替物としても役立つことができる。例示的な抗体薬物抱合体を含有する標的抗原には、ＧＰＮＭＢ（グレムバツムマブベドチン）、ＣＤ５６（ロルボツズマブメルタンシン（ＩＭＧＮ－９０１））、ＴＡＣＳＴＤ２（ＴＲＯＰ２、サシツズマブゴビテカン、（ＩＭＭＵ－１３２））、ＣＥＡＣＡＭ５（ラベツズマブＳＮ－３８）、葉酸受容体－α（ミルベツキシマブソラブタンシン（ＩＭＧＮ－８５３）、ビンタフォリド）、ムチン１（シアログリコトープＣＡ６、ＳＡＲ－５６６６５８）ＳＴＥＡＰ１（バンドルツズマブベドチン（ＲＧ－７４５０））、メソテリン（ＤＭＯＴ４０３９Ａ、アネツマブラブテンシン（ＢＡＹ－９４－９３４３）、ＢＭＳ－９８６１４８）、ネクチン４（エンフォルツマブベドチン（ＡＳＧ－２２Ｍ６Ｅ）、ＡＳＣ－２２ＣＥ）、ＥＮＰＰ３（ＡＧＳ－１６Ｍ８Ｆ）、グアニリルシクラーゼＣ（インダツマブベドチン（ＭＬＮ－０２６４））、ＳＬＣ４４Ａ４（ＡＳＧ－５ＭＥ）、ＮａＰｉ２ｂ、（リファスツズマブベドチン）、ＣＤ７０（ＴＮＦＳＦ７、ＤＮＩＢ０６００Ａ、ＡＭＧ－１７２、ＭＤＸ－１２４３、ボルセツズマブマフォドチン（ＳＧＮ－７５））ＣＡ９炭酸脱水酵素（ＢＡＹ７９－４６２０）、５Ｔ４（ＴＰＢＧ、ＰＦ０６２６３５０７）ＳＬＴＲＫ６（ＡＳＧ－１５ＭＥ）、ＳＣ－１６（抗Ｆｙｎ３、ＳＣ１６ＬＤ６．５）、組織因子（ＨｕＭａｘ－ＴＦ－ＡＤＣ（ＴＦ－０１１－ＭＭＡＥ））、ＬＩＶ－１（ＺＩＰ６、ＳＧＮ－ＬＩＶ１Ａ）、Ｐ－カドヘリン（ＰＣＡ０６２）ＰＳＭＡ（ＭＬＮ２７０４、ＰＳＭＡ－ＡＤＣ）、フィブロネクチンエクストラドメインＢ（ヒトｍＡｂ Ｌ１９およびＦ８）、エンドセリン受容体ＥＴＢ（ＲＧ－７６３６）、ＶＥＧＦＲ２（ＣＤ３０９、抗ＶＥＧＦＲ－２ＳｃＦｖ－Ａｓ２Ｏ３－ステルスナノ粒子）、テネイシンｃ（抗ＴｎＣ－Ａ１抗体ＳＩＰ（Ｆ１６））、ペリオスチン（抗ペリオスチン抗体）、ＤＬＬ３（ロバルピツズマブソラブタンシン）、ＨＥＲ２（Ｔ－ＤＭ１、ＡＲＸ７８８、ＳＹＤ９８５）、ＥＧＦＲ（ＡＢＴ－４１４、ＩＭＧＮ２８９ ＡＭＧ－５９５）、ＣＤ３０（ブレンツキシマブベドチン、イラツムマブＭＤＸ－０６０）、ＣＤ２２（イノツズマブオゾガミシン（ＣＭＣ－５４４）、ピナツズマブベドチン、エプラツズマブＳＮ３８）、ＣＤ７９ｂ（ポラツズマブベドチン）、ＣＤ１９ （コルツキシマブラブタンシン、ＳＡＲ－３４１９、ＳＧＮ－ＣＤ１９Ａ）、ＣＤ１３８（インダツキシマブラブタンシン）、ＣＤ７４（ミラツズマブドキソルビシン）、ＣＤ３７（ＩＭＧＮ－５２９）、ＣＤ３３（ゲムツズマブオゾガマイシン、ＩＭＧＮ７７９、ＳＧＮ ＣＤ３３ Ａ、）およびＣＤ９８（ＩＧＮ５２３）が含まれるが、これらに限定されない。（例えば、Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ，Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１６ Ｊｕｎ；１７（６）ｅ２５４－６２およびＤｉａｍａｎｔｉｓ ａｎｄ Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｂｒｉｔ．Ｊｏｕｒｎ．Ｃａｎｃｅｒ，２０１６；１１４，３６２－３６７を参照されたい）。
したがって、本発明は、上述の癌治療用抗体のうちのいずれかの重鎖ＣＤＲと軽鎖ＣＤＲとを含むＩｇＧ抗体をさらに提供し、各ＩｇＧ定常領域は、ＣＨ１ドメインにおける残基１２４のシステインと、ＣＨ１ドメインにおける残基残基１５７および１６２ならびにＣＨ３ドメインにおける残基３７５および３７８のうちの１つではあるが全てではない残基のシステインとを含む。さらに、本発明は、各ＩｇＧ定常領域の残基１２４の各システイン、および各ＩｇＧ定常領域の残基１５７、１６２、３７５または３７８の各システインが、本明細書に全て説明されているように、マレイミド－ＰＥＧリンカーを介してＮ－ホルミル－メチオニンペプチドに抱合されている、上述のシステインが操作された抗体のうちのいずれかを提供する。
本発明は、免疫系の１つ以上の細胞を誘引および／または活性化することができる、化学誘引物質に、場合によりリンカーを介して結合した少なくとも１つのシステインを含有する抗体である化合物を提供し、該薬剤は、抗体内の１つ以上のシステイン残基で抗体へ結合している。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ重鎖定常領域を含み、該定常領域は、次の残基、すなわちＣＨ１ドメインにおける残基１２４、ＣＨ１ドメインにおける残基１５７、ＣＨ１ドメインにおける残基１６２、ＣＨ２ドメインにおける残基２６２、ＣＨ３ドメインにおける残基３７５、ＣＨ３ドメインにおける残基３７３、ＣＨ３ドメインにおける残基３９７、ＣＨ３ドメインにおける残基４１５、Ｃカッパドメインにおける残基１５６、Ｃカッパドメインにおける残基１７１、Ｃカッパドメインにおける残基１９１、Ｃカッパドメインにおける残基１９３、Ｃカッパドメインにおける残基２０２、またはＣカッパドメインにおける残基２０８のうちの少なくとも１つにシステインを含む。いくつかの実施形態において、システインは操作されたシステインである。さらなる実施形態において、各重鎖および／または軽鎖の上にある操作されたシステインの数は、１～３である。他の実施形態において、抗体は、リンカーを介して化学誘引物質に抱合されている。いくつかの実施形態において、リンカーは、マレイミド－ＰＥＧリンカーまたはＭａｌ－Ｄａｐリンカーである。他の実施形態において、化学誘引物質は、ｆ－Ｍｅｔペプチド、小分子ＦＰＲ－１アゴニスト、ＰＲＲアゴニスト、ペプチド模倣体、Ｎ－ウレイド－ペプチド、または細菌糖である。
本発明は、免疫系の１つ以上の細胞を誘引および／または活性化することができる、化学誘引物質に場合によりリンカーを介して結合した少なくとも１つのシステインを含有する抗体である化合物を提供し、該薬剤は、抗体内の１つ以上のシステイン残基にある抗体へ結合しており、かつ化学誘引物質は、本明細書に説明するような、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ、または式ＶＩのうちのいずれか１つの化合物である。いくつかの実施形態において、化合物は、免疫系の１つ以上の細胞を誘引および活性化することができる。いくつかの詳細な実施形態において、化合物は、自然免疫系の１つ以上の細胞を誘引および活性化することができる。好ましい実施形態において、リンカーが存在する。
さらに、本発明は、抗体、そのＩｇＧ重鎖定常領域、およびＮ－ホルミルメチオニンペプチド抱合体のいずれかも提供し、それぞれ本明細書に具体的に例示されるとおりである。さらなる実施形態として、本発明は、「単離された」形態の、抗体、そのＩｇＧ重鎖定常領域、抱合抗体、またはこれらのうちの１つをコードする核酸ののうちのいずれかを提供する。本明細書で使用する場合、「単離された」という用語は、細胞環境内で認められる他の高分子種を含まないか、または実質的に含まない、タンパク質、ポリペプチド、または核酸を称する。
本発明は、本明細書に説明するＮ－ホルミルメチオニンペプチド抱合抗体のうちのいずれかと、医薬上許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物をさらに提供する。さらに、本発明は、乳癌、肺癌、前立腺癌、皮膚癌、大腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、筋肉癌、骨中胚葉癌、血管癌および線維癌ならびに関連する転移を含む固形癌と、白血病およびリンパ腫を含む液性腫瘍とを治療する方法であって、このような治療を必要とする患者に、それぞれ本明細書に説明されるように、有効量のＮ－ホルミル－メチオニンペプチド抱合抗体、またはその医薬組成物を投与することを含む、方法をさらに提供する。さらに、本発明は、療法における使用のための、本明細書に説明するＮ－ホルミル－メチオニンペプチド抱合抗体、およびその医薬組成物のいずれかをさらに提供する。特に、本発明は、乳癌、肺癌、前立腺癌、皮膚癌、大腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、筋肉癌、骨中胚葉癌、血管癌および線維癌、白血病ならびにリンパ腫の治療における使用のための、本明細書に説明するＮ－ホルミル－メチオニンペプチド抱合抗体のうちのいずれかと、その医薬組成物とを提供する。本明細書の方法、使用および組成物の詳細な実施形態として、Ｎ－ホルミル化メチオニンペプチドは、Ｎ－ホルミル－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＯＨである。
定義
「ＩｇＧ抗体」の一般的な構造は非常によく知られている。ＩｇＧタイプの野生型（ＷＴ）抗体は、鎖内および鎖間ジスルフィド結合を介して架橋された４つのポリペプチド鎖（２つの同一の「重」鎖および２つの同一の「軽」鎖）からなるヘテロ四量体である。各重鎖（ＨＣ）は、Ｎ末端重鎖可変領域（「ＶＨ」）および重鎖定常領域から構成されている。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）と、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間のヒンジ領域（「ヒンジ」）とで構成されている。各軽鎖（ＬＣ）は、Ｎ末端軽鎖可変領域（「ＶＬ」）および軽鎖定常領域（「ＣＬ」）から構成されている。ＶＬおよびＣＬ領域は、カッパ（「κ」）またはラムダ（「λ」）アイソタイプ（それぞれ「Ｃκ」または「Ｃλ」）のものであってもよい。各重鎖は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの間の界面（ＶＨ／ＶＬ界面）、ならびに重鎖定常ＣＨ１および軽鎖定常ドメイン（ＣＨ１／ＣＬ界面）を介して１つの軽鎖と結合する）。ＶＨ－ＣＨ１およびＶＬ－ＣＬセグメントの各々の間の結合は、同じ抗原標的またはエピトープへの抗体結合を指示する２つの同一の抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）を形成する。各重鎖は、各重鎖のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３セグメント間の界面を介して他の重鎖と結合し、２つのＣＨ２－ＣＨ３セグメント間の結合は抗体のＦｃ領域を形成する。まとまって、各ＦａｂおよびＦｃは、ＩｇＧ抗体の特徴的な「Ｙ字型」アーキテクチャを形成し、各Ｆａｂは「Ｙ」の「アーム」を表す。ＩｇＧ抗体は、サブタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４へと分けることができ、該サブタイプは、ヒンジ領域の長さ、鎖間および鎖内ジスルフィド結合の数および位置、ならびにそれぞれのＨＣ定常領域のアミノ酸配列によって異なる。
各重鎖－軽鎖対の可変領域は、結合して結合部位を形成する。重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）は、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と称される、より保存された領域で挟まれた、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と称される超変異性の領域へとさらに分けることができる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成されており、次の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖のＣＤＲは、「ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３」と呼ばれることがあり、軽鎖の３つのＣＤＲは「ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３」と呼ばれることがある。重鎖のＦＲは、ＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３、およびＨＦＲ４と称されることがあるのに対し、軽鎖のＦＲは、ＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３、およびＬＦＲ４と呼ばれることがある。ＣＤＲは、抗原との特異的相互作用を形成する残基の大部分を含有する。
本発明の化合物および方法は、重鎖ポリペプチドの定常領域内の特定の残基に、設計されたアミノ酸修飾を含む。当業者が理解することになるように、ＩｇＧ定常領域配列および可変領域配列内の特定のアミノ酸残基を指定するために、様々な番号付け規則を採用することができる。一般的に使用される番号付け規則には、「Ｋａｂａｔ番号付け」および「ＥＵインデックス番号付け」システムが含まれる。「Ｋａｂａｔ番号付け」または「Ｋａｂａｔ番号付けシステム」とは、本明細書で使用する場合、抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインおよび定常ドメインの両方においてアミノ酸残基を指定するために、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）における著者らによって考案されおよび明らかにされた番号付けシステムを称する。「ＥＵインデックス番号付け」または「ＥＵインデックス番号付けシステム」は、本明細書で使用する場合、抗体重鎖定常ドメインにおけるアミノ酸残基を指定するための番号付け規則を称し、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ（１９９１）にも明らかにされている。可変ドメインのための修正または代替番号付けシステムを含む他の規則には、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ，Ｌｅｓｋ ＡＭ（１９８７），Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－９１７、Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３）、ＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７）、およびＡＨｏ（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ Ａ，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ（２００１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０９：６５７－６７０）が含まれる。本明細書で特に明記しない限り、明細書、実施例および特許請求の範囲において表される免疫グロブリン重鎖定常領域ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３アミノ酸残基に対する参照（すなわち、番号）は全て、ＥＵインデックス番号付けに基づく。ＥＵインデックス番号付けによる残基番号の知識があれば、当業者は、何らかの一般的に使用される番号付け規則に従って、本発明内のアミノ酸配列修飾を特定するために当業者の教示を応用することができる。本発明の明細書、実施例および特許請求の範囲は、特定のアミノ酸残基を特定するためにＥＵインデックス番号付けを採用しているが、本出願に添付の実施例および配列表において表される配列番号が、Ｐａｔｅｎｔ Ｉｎ Ｖｅｒｓｉｏｎ第３．５版によって生じるように、所与のポリペプチド内のアミノ酸の連続番号付けを提供し、したがって、ＥＵインデックス番号付けによって提供されるような対応するアミノ酸残基番号に一致していないことは理解される。
本明細書に説明するポリペプチド鎖は、左から右に読むと、Ｎ末端からＣ末端までのアミノ酸配列によって表され、各アミノ酸は１文字または３文字のいずれかのアミノ酸略語で表される。本明細書で特に明記しない限り、本発明のポリペプチドの調製に使用されるアミノ酸は全て、Ｌ－アミノ酸である。アミノ酸またはポリペプチド鎖の「Ｎ末端」（またはアミノ末端）は、アミノ酸上の遊離アミン基、またはポリペプチド鎖の最初のアミノ酸残基上の遊離アミン基を指す。さらに、「Ｎ末端アミノ酸」という用語は、ポリペプチド鎖における最初のアミノ酸を指す。同様に、アミノ酸またはポリペプチド鎖の「Ｃ末端」（またはカルボキシ末端）は、アミノ酸上の遊離カルボキシ基、またはポリペプチド鎖の最終アミノ酸残基上の遊離カルボキシ基を指す。さらに、「Ｃ末端アミノ酸」という用語は、ポリペプチド鎖における最後のアミノ酸を指す。
本明細書で使用する場合、「・・・残基・・・で置換された［アミノ酸名］」という句は、重鎖または軽鎖ポリペプチドに関して、示されたアミノ酸での親アミノ酸の置換を指す。例として、「残基２３５で置換されたアラニン」を含む重鎖は、親アミノ酸配列が、親アミノ酸の代わりに残基番号２３５のアラニンを含有するよう突然変異した重鎖を指す。このような突然変異は、特定のアミノ酸残基番号を示すことによっても表され、親アミノ酸が先行し、その後に置き換えアミノ酸が続くことがある。例えば、「Ｆ２３５Ａ」は、残基２３５のフェニルアラニンのアラニンとの置き換えを指す。同様に、「２３５Ａ」は、親アミノ酸のアラニンとの置き換えを指す。「操作された」システインは、親アミノ酸のシステインへの置換を指す。
本明細書で使用する場合、「Ｎ－ホルミル－メチオニンペプチド」とは、長さ４～１０個のアミノ酸のペプチドを指し、Ｎ末端アミノ酸はホルミル化メチオニンであり、Ｃ末端アミノ酸はリジンである。特定のＮ－ホルミル－メチオニンペプチドは、ペプチドＮ－ホルミル－メチオニン－ロイシン－フェニルアラニン－リジン－ＯＨ（「ｆＭＬＦＫ」、配列番号２３）である。
本明細書で使用する場合、「リンカー」とは、２つ以上の追加の構造を接続する構造を指す。リンカーの例としては、ペプチドリンカー、タンパク質リンカー、およびＰＥＧリンカーが挙げられる。「マレイミド－ＰＥＧリンカー」は、本明細書で使用する場合、「ｎ」が６～２４である式「－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－」のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーと誘導体化マレイミド官能基とを含む化学部分を指し、ここで、該リンカーは、マレイミド官能基と重鎖定常領域におけるシステイン残基との間のチオエーテル結合を介してＩｇＧ抗体重鎖への共有結合を形成し、該Ｎ－ホルミル－メチオニンペプチドのＣ末端リジンのイプシロンアミノ側鎖へのアミド結合を介して、Ｎ－ホルミル－メチオニンペプチドへの共有結合も形成する。詳細な実施形態として、本発明の化合物のマレイミド－ＰＥＧリンカーは、次の構造を有し、破線はＩｇＧ抗体重鎖およびＮ－ホルミル－メチオニンペプチドへの共有結合の位置を表す：
Figure 0007073487000003
 式中、「ｎ」＝６～２４であり、より詳細には、「ｎ」＝１２である。
この場合、以下の実施例において採用される試験化合物の調製に使用される試薬（Ｍａｌ－ｄＰＥＧ１２－ＯＨ（ＱｕａｎｔａＢｉｏｄｅｓｉｇｎカタログ番号１０２８５、ロットＩＨ１－Ａ１２４０－８０））は単分散試薬であり、エチル－オキシモノマー（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）単位の離散した数を含有することを意味する。同様に、この試薬を使用すると、ｎ＝１２の（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）単位を有するマレイミド－ＰＥＧｎリンカーを含有する抱合抗体化合物が生成されることになる。
しかしながら、当業者が理解することになるように、ペグ化試薬はしばしば、試薬中のＰＥＧ含有化合物のＰＥＧポリマー部分の（ダルトンまたはキロダルトンにおける）分子量に対する参照によって説明される。さらに、多くの市販のＰＥＧ含有試薬は、概して、ある程度の多分散性を有しており、試薬内に含有されるエチレングリコールモノマー単位を繰り返す数（「ｎ」）がある範囲にわたって、典型的には狭い範囲にわたって変化することを意味する。したがって、多分散試薬におけるＰＥＧポリマー分子量への参照は、典型的には、試薬内に含有されるＰＥＧポリマーの平均分子量への参照である。本発明の抱合抗体化合物を調製するために使用される試薬のエチルオキシモノマー（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）は、約４４ｇ／モルまたは４４ダルトンの分子量を有する。したがって、当業者は、その平均分子量によって示される多分散ペグ化試薬を使用する場合の「ｎ」の値、および同様に、結果的に生じる抱合抗体化合物における「ｎ」の値を容易に決定することができる。
「Ｒ１は、置換または非置換であってもよいＣ５～Ｃ１０アリールである」という句において使用される場合の「置換」という用語は、例えば、本明細書では、１つ以上の置換基が存在することができることを意味し、該置換基は原子および基から選択され、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖまたは式ＶＩの化合物中に存在する場合、化合物が化学誘引物質として機能するのを妨げない。置換Ｃ５～Ｃ１０アリール基中に存在することができる置換基の例としては、アリール構造へ共有結合しているヒドロキシル、ハロゲン化物（Ｉ、Ｃｌ、Ｆ、ＢＲ）、アルコキシ基（ＭｅＯ－、ＥｔＯ－、ＰｒｏまたはＣ１～Ｃ４）、またはアルキル基（Ｍｅ－、Ｅｔ－、ＰｒまたはＣ１～Ｃ４）が挙げられる。
ジアミノアルキルという用語は、構造－ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ－によって与えられ、式中、ｎ＝２～１０である。
ホルミル基は、水素に結合したカルボニルからなり、次の構造、すなわちＣＨ（＝Ｏ）、または次式によって与えられる。
Figure 0007073487000004
 マレイミド－ジアミノプロピオン酸は、遊離アミンへのアミド結合を介してＹにカップリングし、次の構造を指す。
Figure 0007073487000005
 マレイミドは、遊離アミンへのアミド結合を介してＹにカップリングし、次の構造によって与えられる３－マレイミドプロピオン酸を指す。
Figure 0007073487000006
本明細書で使用する場合、「それを必要とする患者」という用語は、本発明の化合物による治療または投与が示される容態または障害に罹患していると診断されたヒトまたは非ヒト哺乳類動物、より好ましくはヒトを指す。
本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、患者への単回または複数回投与の際に、患者における所望の薬理学的効果を提供する、本発明の抱合抗体化合物の量または用量を指す。有効量は、哺乳類動物の種、該哺乳類動物の大きさ、齢、および全身レベルの健康、関連する具体的な疾患または外科的手順、疾患または病気の程度または重症度、個々の患者の応答、投与される詳細な化合物または組成物、投与様式、投与された調製物の生物学的利用能特徴、選択された投与治療計画、何らかの併用薬の使用などの多くの要因を考慮することにより、担当の診断医が、当業者として容易に決定することができる。
本発明における使用のためのシステインを操作されたＩｇＧ抗体は、哺乳類動物細胞または酵母細胞内での組換え発現など、当技術分野で周知の技術を使用して産生することができる。特に、本明細書の実施例の方法および手順は容易に採用することができる。さらに、本発明のＩｇＧ抗体は、完全にヒトのフレームワークに由来するフレームワーク領域を含むようにさらに操作されてもよい。本発明の実施形態を実施する上で、種々の異なるヒトフレームワーク配列を使用することができる。詳細な実施形態として、本発明のＩｇＧ抗体で採用されるフレームワーク領域は、ヒト起源のものであるか、または実質的にヒト（ヒト起源の少なくとも９５％、９７％または９９％）である。ヒト起源のフレームワーク領域の配列は、当技術分野で既知であり、Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ，ｂｙ Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｇｅｒａｒｄ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ２００１，ＩＳＢＮ ０１２４４１３５１から取得することができる。
操作可能に連結されている遺伝子の発現を導くことができる発現ベクターは、当技術分野において周知である。発現ベクターは、プロモーター配列および複製開始部位などの適切な制御配列を含有している。発現ベクターはまた、適切な選択マーカーならびに宿主細胞からの所望のポリペプチド産物（複数可）の分泌を促進するシグナルペプチドをコードしてもよい。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種性シグナルペプチドであってもよい。所望のポリペプチドをコードする核酸、例えば、本発明の結合ＩｇＧ抗体のＨＣおよびＬＣ成分は、単一ベクターにおいて操作可能に連結された異なるプロモーターを使用して独立して発現することができるか、またはそれに代わるものとして、所望の産物をコードする核酸は、別個のベクターにおいて操作可能に連結された異なるプロモーターを使用して独立して発現することができる。本発明のシステインを操作されたＩｇＧ抗体のＨＣおよびＬＣ成分の両方をコードする単一の発現ベクターは、標準的な方法を使用して調製することができる。
本明細書で使用する場合、「宿主細胞」とは、１つのまたは複数の所望のポリペプチド産物をコードするヌクレオチド配列を安定的または一過性にトランスフェクトし、形質転換し、形質導入し、または感染させた細胞を指す。本発明における使用のためのＩｇＧ抗体を産生する宿主細胞株の創出および単離は、当技術分野で既知の標準的な技術を使用して達成することができる。哺乳類動物細胞は、本発明によるシステインを操作されたＩｇＧ抗体の発現に好ましい宿主細胞である。詳細な哺乳類動物細胞には、ＨＥＫ２９３、ＮＳ０、ＤＧ－４４、およびＣＨＯ細胞が含まれる。好ましくは、組み立てられたタンパク質は、宿主細胞が培養されている培地中へと分泌され、そこからタンパク質を回収および単離することができる。タンパク質が分泌されてきた培地は、従来の技術によって精製することができる。例えば、培地は、従来の方法を使用して、プロテインＡまたはプロテインＧカラムに適用され、そこから溶離することができる。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、ヒドロキシアパタイト、または混合様式のクロマトグラフィーを含む、一般的な技術によって有効に除去することができる。回収された産物は、例えば、－７０℃で即時凍結させてもよく、または凍結乾燥させてもよい。当業者が理解することになるように、ある特定の生物系、例えば哺乳類動物細胞株において発現させるとき、グリコシル化を低減させるためにＦｃ領域において突然変異が導入されない限り、抗体はＦｃにおいてグリコシル化される。さらに、抗体は、他の位置において同様にグリコシル化されていてもよい。
本明細書で使用する場合、「細菌糖」とは、細菌の外面にある多糖を指す。細菌糖の例はカラギーナンである。
本明細書で使用する場合、「模倣体」とは、天然に存在する分子と同様に機能する分子を指す。例えば、ペプチド模倣体は、ペプチド、修飾されたペプチド、またはホルモン、サイトカイン、酵素基質、ウイルスもしくは他の天然に存在する分子の活性リガンドを生物学的に模倣する何らかの他の分子などの分子であることができる。
本明細書で使用する場合、「化学誘引物質」とは、免疫系の細胞を誘引および／または活性化することができるペプチドなどの構造を指す。好ましい実施形態において、化学誘引物質とは、免疫系の細胞を誘引および活性化することができる構造である。化学誘引物質の例としては、ｆ－Ｍｅｔペプチド、小分子ＦＰＲ－１アゴニスト、ＰＲＲアゴニスト、ペプチド模倣体、Ｎ－ウレイド－ペプチド、および細菌糖が挙げられる。より具体的な例としては、式Ｉ～ＩＶのいずれか１つの化合物、および配列番号２２、３６～３９のいずれか１つのペプチドが挙げられる。
次の実施例は、本発明をさらに説明し、本発明の種々の詳細な実施形態を実施するための典型的な方法および手順を提供する。しかしながら、実施例は例証として明らかにされていること、および種々の変更が当業者によってなされてもよいことは理解される。
実施例１：操作されたシステイン残基を含有するＩｇＧ重鎖定常領域の設計
ＩｇＧ重鎖定常領域残基は、多様な変数または抗原結合ドメインを有する親ｍＡｂを用いて操作されたシステイン設計の使用を突然変異が可能にするように選択される。簡単にいうと、抗体の二次構造および三次構造にとって重要ではない定常ドメイン内のバリン、アラニン、およびセリン残基が、インシリコでの初期突然変異のために選択される。ＣＨ１－ＣカッパＦａｂ（ｐｄｂ：４ＤＴＧ）およびＩｇＧ４ Ｆｃ（ｐｄｂ：４Ｃ５５）の公表されている結晶構造を使用して、複数の異なる抗体単一システイン操作コンストラクトを設計する。各突然変異体設計物をコードする遺伝子を、ヒトＩｇＧ４重鎖およびカッパ軽鎖プラスミドにおいて構築し、細胞内で発現させ、結合していない操作されたシステインを含有するｍＡｂは発現レベルおよび分析特性によって特徴づける。結合前の最小の高分子量凝集体で（＜１０％）で、親の野生型ｍＡｂと本質的に同じ標的結合親和性および発現レベル（ＥＬＩＳＡで決定）を保持する構築物を規模拡大産生し、さらに特徴づける。
次に、各ＨＣおよびＬＣ定常ドメインへと操作された単一のシステイン突然変異を有する２０超のｍＡｂ構築物をＨＥＫ２９３細胞内で発現させ、精製し、リンカーを介してモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびクリプトフィシンなどの細胞毒性ペイロードに結合させる。結合効率を、ＥＳＩ－ＴＯＦ質量分析または疎水性指数クロマトグラフィー（ＨＩＣ）などの標準的な手順によって監視し、凝集傾向を分析用サイズ排除クロマトグラフィーで測定する。両方のペイロードへの結合後の結合効率が約６０％を超え、かつ高分子凝集体が約１０％未満である構築物を、エクスビボでの血漿およびインビボでの安定性試験についてさらに検討する。
簡単にいえば、抱合体を血漿とともに数日間インキュベートし、質量分析によって分析して、ペイロードがまだ抗体に抱合されていることを確認する。各ＨＣにおけるＳ１２４Ｃ、Ｓ１５７Ｃ、Ａ１６２Ｃ、Ｓ３７５Ｃ、またはＡ３７８Ｃに残基突然変異を含有する結合構築物には、適切な安定性があることが認められる。ＨＣ １２４Ｃ突然変異を１５７Ｃ、１６２Ｃ、３７５Ｃまたは３７８Ｃのいずれかと組み合わせて、より高い抗体薬物比を得ることができる。さらに、ＣＨ１ドメインにおける重鎖残基１２４、１５７、および１６２、ＣＨ２ドメインにおける残基２６２、ＣＨ３ドメインにおける残基３７５、３７８、および３９７、ならびにＣカッパドメインにおける軽鎖残基１５６、１７１、１９１、１９３、２０２、および２０８を、種々のホルミルペプチドとの結合のために生成した。
化学誘引物質を結合した操作されたシステインを含む一価ＩｇＧ抗体に加えて、二価抗体構築物も、本明細書に開示される化学誘引物質を結合した操作されたシステインを用いて開発することもできる。操作されたシステインを有する二価抗体構築物には、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ形式（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５８７１９において報告されている）および二価ＩｇＧ形式（ＵＳ２０１８／０００９９０８において開示されている）が含まれるが、これらに限定されない。このような二価抗体構築物によると、部位特異的な操作されたシステインには、化学誘引物質の二重特異性抗体への結合のための表面露出型システインが含まれる。具体的な実施形態（配列番号３４、３５の２つのＨＣおよび配列番号５８、５９の２つのＬＣを備えた二価ＩｇＧ形式を有する二重特異性抗体）によると、重鎖残基１２４および３７８のシステインは、化学誘引物質の結合のために操作されている。このような例示された構成の発現および組立ては変わらなかったが、検査ペプチドとの結合は単一特異性抗体に匹敵するＣＲをもたらした。
実施例２：ペグ化ｆＭＬＦＫペプチドの合成
実施例２（Ａ）：ホルミル－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｍａｌ－ＰＥＧ１２）－ＯＨ（「ペプチド－‘１８３」）（配列番号２２）の合成。
Figure 0007073487000007
 非結合ペプチドとして使用される加水分解されたマレイミド基を持つペプチド－‘１８３。
Figure 0007073487000008
走化性ペプチドホルミル－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＯＨ（配列番号２３）を合成し、ＨＣｌ塩として精製する。この材料をリジンのε－アミノ基でのさらなる誘導体化のための基質として使用する。
ペプチドを、Ａｃｅ Ｇｌａｓｓｗａｒｅ Ｉｎｃ．製の１００ｍＬフリットガラス手動反応容器中で０．３ｍｍｏｌ尺度の標準的なＦｍｏｃ／ｔＢｕ化学的性質を使用した手動固相ペプチド合成を介して生成する。合成に使用する固体支持体はＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－Ｗａｎｇ樹脂（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号８．５６０１３、ロットＳ６６９６７１３－５２９）、１００～２００メッシュ、０．５７ｍｅｑ／ｇの置換とした。使用した標準アミノ酸は、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号０４－１２－１０３０、ロットＡ２１６５３）、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号０４－１２－１０２５、ロットＡ２５９１７）、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ（ＭｉｄＷｅｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ カタログ番号１２４００、ロットＯＰ１２２４０）であった。ＤＭＦ中の２０％ピペリジンの処理（２×１０分）による各カップリング工程に先立ってＦｍｏｃ基を除去する。全てのカップリングは、等比のＦｍｏｃアミノ酸、ジイソプロピルカルボジイミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＤＩ２５４０７、ロット８０８９６ＡＰＶ）およびＨＯＡｔ（ＡＫ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｄ０４６、ロット１１８８Ｇ５０Ｉ）を、ＤＭＦ中の約０．２Ｍの終濃度の理論的ペプチド樹脂置換を上回る３倍モル濃度過剰量で用いて６時間実施する。最後のアミノ酸をカップリングし、Ｎ末端のＦｍｏｃ基の除去後、２００μＬのジイソプロピルエチルアミン含有ＤＭＦ中に溶解した６倍過剰量のギ酸２，４，６－トリクロロフェニル（ＴＣＩ、カタログ番号Ｔ３１２１、ロットＰ８ＡＦＡ－ＰＥ）による処理によってホルミル化し、室温で３時間反応させた。次に、樹脂をＤＣＭおよびジエチルエーテルで洗浄し、真空吸引を反応容器に５分間適用することによって完全に乾燥させる。乾燥樹脂を２５ｍＬの切断カクテル（ＴＦＡ：アニソール：水：トリイソプロピルシラン＝８８：５：５：１（ｖ／ｖ））で室温で２時間処理する。樹脂を濾別し、５ｍＬの無水ＴＦＡで２回洗浄し、合わせた濾液を５０ｍＬの冷ジエチルエーテルで処理して、粗ペプチドを沈殿させる。次いで、ペプチド／エーテル懸濁液を４０００ｒｐｍで４分間遠心分離して固体ペレットを形成し、エーテルをデカントし、固体ペレットをエーテルでさらに２回粉砕し、真空で３０分間乾燥させる。粗ペプチドを２０％アセトニトリル／水中で可溶化し、０．１％ＨＣｌ含有水中のアセトニトリルの線形勾配によるＣ１８分取カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｌｕｎａ Ｐｈｅｎｙｌ－Ｈｅｘｙｌ、２１×２５０ｍｍ）の逆相ＨＰＬＣによって精製して、凍結乾燥したペプチドをＨＣｌ塩（１２５ｍｇ、出発樹脂置換に基づく７３％の収率）として得る。純度は、分析用逆相ＨＰＬＣを使用して評価し、９９％超であることがわかった。分子量は、分析用エレクトロスプレーＭＳによって決定した。計算値：５６５．７Ｄａ、実測値：５６５．３Ｄａ（平均分子量）。次のイオンを観察した：５６６．３（Ｍ＋１Ｈ）。
リジンのε－アミノ基は次のようにアシル化する：凍結乾燥したペプチド約５０ｍｇ（約０．０８８ｍｍｏｌ）を超音波処理器を用いて５ｍＬの無水ＤＭＦに溶解する。別個のシンチレーションバイアル中で、７４ｍｇ（１．１当量）のＭａｌ－ｄＰＥＧ１２－ＯＨ（ＱｕａｎｔａＢｉｏｄｅｓｉｇｎ カタログ番号１０２８５、ロットＩＨ１－Ａ１２４０－８０）を２９ｍｇ（１．１当量）のＴＳＴＵ（ＯａｋＷｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号０２４８９１、ロット０２４８９１）および１ｍＬの無水ＤＭＦ中の６１μＬ（４当量）のＤＩＰＥＡで室温で２５分間で活性化する。活性化したＭａｌ－ＰＥＧ１２－ＯＨをＤＭＦ（１ｍＬ）中に可溶化したペプチドへ滴下して添加し、６２μＬ（５当量）のトリエチルアミンを添加し、反応物を室温で混合した。１時間後、冷ジエチルエーテルの添加により反応を停止させる。次に、溶液を分けて２本の５０ｍＬコニカルチューブへと移し、より多量の冷エーテルを添加してペプチドをさらに沈殿させる。次に、ペプチド／エーテル懸濁液を４０００ｒｐｍで４分間遠心分離して固体ペレットを形成し、エーテルをデカントし、固体ペレットをエーテルでさらに２回粉砕し、真空で３０分間乾燥させる。合わせた粗ペプチドペレットを２０％アセトニトリル／水中に可溶化し、０．１％ＴＦＡ含有水中のアセトニトリルの線形勾配を用いたＣ１８分取カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｌｕｎａ Ｐｈｅｎｙｌ Ｈｅｘｙｌ ２１×２５０ｍｍ）で逆相ＨＰＬＣにより精製して、凍結乾燥したペプチドをＴＦＡ塩（４４．４ｍｇ、出発物質に基づく３８％の収率）として得る。純度は、分析用逆相ＨＰＬＣを使用して評価し、９６％超であることがわかった。分子量は、分析用エレクトロスプレーＭＳによって決定した。計算値：１３１６．６Ｄａ、実測値：１３１６．２Ｄａ（平均分子量）。次のイオンを観察した：６５９．０（Ｍ＋２Ｈ）、および１３１７．２（Ｍ＋１Ｈ）。次に、このペプチド（ホルミル－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｍａｌ－ＰＥＧ１２）－ＯＨ）を、以下の実施例３に説明するように抗体に結合させることができる。
以下の実施例において使用する非結合ペプチドについて、工程１の２０ｍｇの生成物を２ｍＬの４０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中で室温で一晩インキュベートすることによって、マレイミド基をさらに加水分解する。１８時間後、溶液を１０ｍＬの２０％アセトニトリル／水で希釈し、０．１％のＴＦＡ含有水中のアセトニトリルの線形勾配を用いるＣ１８分取カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｌｕｎａ Ｐｈｅｎｙｌ Ｈｅｘｙｌ ２１×２５０ｍｍ）の逆相ＨＰＬＣによって、精製して、凍結乾燥したペプチドをＴＦＡ塩（６．４ｍｇ、出発物質に基づく３２％収率）として得た。純度は、分析用逆相ＨＰＬＣを使用して評価し、９４％超であることがわかる。分子量は、分析用エレクトロスプレーＭＳによって決定する：計算値：１３３４．６Ｄａ、実測値：１３３４．４Ｄａ（平均分子量）。次のイオンを観察する：６６８．０（Ｍ＋２Ｈ）、および１３３５．８（Ｍ＋１Ｈ）。
実施例２（Ｂ）：Ｈ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｍａｌ－ＰＥＧ１２－ＯＨ（「ペプチド－‘８４４」）（配列番号２４）の合成。
Figure 0007073487000009
 非結合ペプチドとして使用される加水分解したマレイミド基を有するペプチド－‘８４４。
Figure 0007073487000010
ホルミル化のない陰性対照ペプチド（（Ｈ－Ｍｅｔ－ＬｅｕＰｈｅ－Ｌｙｓ－ＯＨ）（配列番号２５）を、０．３ｍｍｏｌ尺度の標準的なフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）／第三級ブチル基（ｔＢｕ）の化学的性質を用いる手動固相ペプチド合成によって生成する。ペプチドの組立ては、Ａｃｅ Ｇｌａｓｓｗａｒｅ Ｉｎｃ．製の１００ｍＬフリットガラス手動反応容器中で行う。合成に使用する固体支持体は、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－Ｗａｎｇ樹脂（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号８．５６０２１、ロットＳ６６９２６２１ ５０３）、１００～２００メッシュ、０．５７ｍｅｑ／ｇの置換でとする。使用する標準アミノ酸は、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号０４－１２－１０３０、ロットＡ２１６５３）、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号０４－１２－１０２５、ロットＡ２５９１７）、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ（ＭｉｄＷｅｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ カタログ番号１２４００、ロットＯＰ１２２４０）とする。
Ｆｍｏｃ基を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンの処理（２×１０分）による各カップリング工程に先立って除去する。全てのカップリングは、等比のＦｍｏｃアミノ酸、ジイソプロピルカルボジイミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＤＩ２５４０７、ロット８０８９６ＡＰＶ）およびＨＯＡｔ（ＡＫ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｄ０４６、ロット１１８８Ｇ５０Ｉ）を、理論的ペプチド樹脂置換を超える３倍モル濃度過剰量で、かつＤＭＦ中の約０．２Ｍの終濃度で６時間実施する。
最後のアミノ酸をカップリングし、Ｎ末端のＦｍｏｃ基の除去後、ペプチジル樹脂を、２００μＬのジイソプロリルエチルアミン含有ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解した６倍過剰量のＢｏｃ２Ｏ（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号０１－６３－０００７、ロットＡ２５６７５）を用いた処理によって、Ｂｏｃ（ブチルオキシカルボニル）基で保護し、室温で３時間反応させる。次に、樹脂をジクロロメタン（ＤＣＭ）で８回洗浄しており、Ｌｙｓ残基上のＭｔｔ（４－メチルトリチル）保護基を、ＤＣＭ（２×１０分および１×４５分）中の２０％ヘキサフルオロイソプロパノール（Ｏａｋｗｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，カタログ番号００３４０９）の３回の連続した処理で選択的に除去して、さらなる反応のためにＬｙｓの遊離イプシロンアミンを曝露した。Ｆｍｏｃ ＰＥＧ１２－ＯＨ（ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ、カタログ番号ＢＰ－２２２４１）と３－マレイミドプロピオン酸（Ｂａｃｈｅｍ、カタログ番号Ｑ－２６２０）とのその後のカップリングを、標準アミノ酸残基と同じ様式で行う。
合成が完了した後、ペプチジル樹脂をＤＣＭ、ジエチルエーテルで洗浄し、反応容器を５分間真空吸引することにより完全に乾燥させる。乾燥樹脂を２５ｍＬの切断カクテル（トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：アニソール：水：トリイソプロピルシラン＝８８：５：５：１（ｖ／ｖ））で室温で２時間処理する。樹脂を濾別し、５ｍＬの無水ＴＦＡで２回洗浄し、合わせた濾液を５０ｍＬの冷ジエチルエーテルで処理して、粗ペプチドを沈殿させる。次に、ペプチド／エーテル懸濁液を４０００ｒｐｍで４分間遠心分離して固体ペレットを形成し、エーテルをデカントし、固体ペレットをエーテルでさらに２回粉砕し、真空で３０分間乾燥させる。
粗ペプチドを２０％アセトニトリル／水中に可溶化し、０．１％ＴＦＡ含有水中のアセトニトリルの線形勾配を用いてＣ１８分取カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｌｕｎａ Ｐｈｅｎｙｌ－Ｈｅｘｙｌ、２１×２５０ｍｍ）でＲＰ－ＨＰＬＣにより精製して、凍結乾燥したペプチドをＴＦＡ塩（３８．８ｍｇ、出発樹脂置換に基づく１０％収率）として得る。純度は、分析用逆相ＨＰＬＣを使用して評価し、９６％超であることがわかった。分子量は、分析用エレクトロスプレーＭＳによって決定する。計算値：１２８８．５Ｄａ、実測値：１２８８．４Ｄａ（平均分子量）。次のイオンを観察する：６４５．０（Ｍ＋２Ｈ）、および１２８９．７（Ｍ＋１Ｈ）。次に、このペプチド（Ｈ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｍａｌ－ＰＥＧ１２－ＯＨ）を、以下の実施例３に説明するように抗体に結合させることができる。
以下の実施例で使用される非結合ペプチドの場合、工程１の生成物２０ｍｇを２ｍＬの４０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中で室温で一晩インキュベートすることにより、マレイミド基をさらに加水分解する。１８時間後、溶液を１０ｍＬの２０％アセトニトリル／水で希釈し、０．１％ＴＦＡ含有水中のアセトニトリルの線形勾配を用いたＣ１８分取カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｌｕｎａ Ｐｈｅｎｙｌ Ｈｅｘｙｌ ２１×２５０ｍｍ）の逆相ＨＰＬＣによって精製して、凍結乾燥したペプチドをＴＦＡ塩（５．２ｍｇ、出発物質に基づく収率２６％）として得た。純度は、分析用逆相ＨＰＬＣを使用して評価し、９６％超であることがわかった。分子量は、分析用エレクトロスプレーＭＳによって決定した。計算値：１３０６．６Ｄａ、実測値：１３０６．４Ｄａ（平均分子量）。次のイオンを観察した：６５４．０（Ｍ＋２Ｈ）、および１３０７．７（Ｍ＋１Ｈ）。
実施例２（ｃ）：ホルミル－Ｎｌｅ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－ＰＥＧ１２－Ｌｙｓ（マレイミド－プロピオニル）－ＯＨ（「ｆＮｌｅ」、配列番号４２）の合成
Figure 0007073487000011
走化性ペプチドであるホルミル－Ｎｌｅ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－ＰＥＧ１２－Ｌｙｓ－ＯＨを、ＨＣｌ塩（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）として合成し、さらに修飾することなく誘導体化の基質として使用する。
リジンのε－アミノ基のアシル化は、次のように実施する。超音波処理器を使用して、凍結乾燥ペプチド約５０ｍｇ（約０．０４４ｍｍｏｌ）を５ｍＬの無水ＤＭＦ中に溶解する。別個のシンチレーションバイアルにおいて、８．１ｍｇ（１．１当量）のマレイミド－プロピオン酸（Ｂａｃｈｅｍ、カタログ番号Ｑ－２６２０、ロット０５６４２３０）を、１ｍＬの無水ＤＭＦ中の１４．５ｍｇ（１．１当量）のＴＳＴＵ（ＯａｋＷｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号０２４８９１、ロット０２４８９１）および３３．４μＬ（４当量）のＤＩＰＥＡを用いて室温で２５分間活性化する。活性化したマレイミド－プロピオン酸を、ＤＭＦ（１ｍＬ）中の可溶化ペプチドに滴下して添加し、次に、３０μＬ（５当量）のトリエチルアミンを添加し、反応物を室温で混合する。１時間後、冷ジエチルエーテルの添加により反応を停止させる。次に、溶液を分けて２本の５０ｍＬコニカルチューブへと移し、より多量の冷エーテルを添加してペプチドをさらに沈殿させる。次いで、ペプチド／エーテル懸濁液を４０００ｒｐｍで４分間遠心分離して固体ペレットを形成し、エーテルをデカントし、固体ペレットをエーテルでさらに２回粉砕し、真空で３０分間乾燥させる。合わせた粗ペプチドペレットを２０％アセトニトリル／水中で可溶化し、０．１％ＴＦＡ含有水中のアセトニトリルの線形勾配でＣ１８分取カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｌｕｎａ Ｐｈｅｎｙｌ Ｈｅｘｙｌ ２１×２５０ｍｍ）で逆相ＨＰＬＣにより精製して、凍結乾燥ペプチドをＴＦＡ塩（８．６ｍｇ、出発物質に基づく１５．１％の収率）として得る。純度は、分析用逆相ＨＰＬＣを使用して評価し、９７％超であることがわかった。分子量は、分析用エレクトロスプレーＭＳによって決定した。計算値：１２９８．５Ｄａ、実測値：１２９８．８Ｄａ（平均分子量）。次のイオンを観察した：６５０．０（Ｍ＋２Ｈ）、および１２９９．８（Ｍ＋１Ｈ）。次に、このペプチドを、以下の実施例３に説明するように抗体に結合させることができる。
実施例３：ペプチドに対するＩｇＧ抗体の結合
抗体－ペプチド生体結合は、次のように調製することができる。操作されたシステイン残基を含有する親抗体を、Ｚｅｂａ（商標）スピン脱塩カラム（４０Ｋ ＭＷＣＯ）を使用して、５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス－ＨＣｌ）、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．５中へと緩衝液交換し、５ｍｇ／ｍｌの終濃度にする。ＭｉｌｌｉＱ水中に可溶化した、新たに調製した１００ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を４０倍モル濃度過剰量で抗体に添加する。反応混合物を室温で１６時間インキュベートする。インキュベーション時間の後、Ｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用して、反応混合物を５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス－ＨＣｌ）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、ｐＨ７．５中へと緩衝液交換して、過剰量の未反応ＤＴＴを除去する。
新たに調製したジメチルアセトアミド中の１００ｍＭデヒドロアスコルビン酸（ｄＨＡＡ）を３０倍モル濃度過剰量で抗体に添加し、室温で３時間インキュベートする。インキュベーション後、４、８、または１２倍モル濃度過剰量のホルミル－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｍａｌ－ＰＥＧ１２）－ＯＨ（配列番号２２）、Ｈ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｍａｌ－ＰＥＧ１２）－ＯＨ（配列番号２４）またはホルミル－Ｎｌｅ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－ＰＥＧ１２－Ｌｙｓ（マレイミド－プロピオニル）－ＯＨ（それぞれ実施例２（Ａ）、２（Ｂ）および２（Ｃ）において説明したとおり合成）を、１、２、または３個の操作されたシステイン残基をそれぞれ有する抗体に（分子等級の水中に溶解して）添加して、２、４、または６の比率の生体抱合体を結果的に得る。この反応混合物を室温で１時間インキュベートする。インキュベーション後、試料を所望の緩衝液中へと緩衝液交換し、脱塩カラム、分取サイズ排除クロマトグラフィー（ｐＳＥＣ）、または透析を使用して、過剰量の非結合ペプチドを除去する。
表１は、本質的に本明細書および先に説明したとおり調製し、結合に使用される抗体ＨＣおよびＬＣ配列とペグ化ペプチドとを含む、次のアッセイで試験される結合型および非結合型ＩｇＧ抗体構築物を提供する。本明細書で使用する場合、「エミベツズマブ」、「ＴＭａｂ」（トラスツズマブ）、および「ＡＭＥ１３３」は、示された抗体の可変領域を含有する抗体構築物を指す。
Figure 0007073487000012
Figure 0007073487000013
実施例４：結合比の決定
ＴＭａｂ（「トラスツズマブ」）、ＡＭＥ１３３、およびエミベツズマブ構築物のシステイン操作重鎖上のペプチド－１８３の結合比を、抱合体付加の加重平均を用いて、未処置の質量分析によって決定する。未処置の質量測定結果を、Ａｇｉｌｅｎｔ ６２３０ ＥＳＩ－ＴＯＦ質量分析計と組み合わせたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ＨＰＬＣを使用して収集する。試料（２ｕｇ）を、ＰＬＲＰ－Ｓ逆相カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）で、移動相Ａとして水／０．２％ギ酸、移動相Ｂとしてアセトニトリル／０．２％ギ酸を使用し、０．３ｍｌ／分の流量で、４分間で２０～７０％Ｂの勾配溶離を用いて分析する。Ａｇｉｌｅｎｔ ６２３０ ＴＯＦを、４０００Ｖの陽イオンモード、６５Ｖのスキマー、３００Ｖのフラグメンター、３５０℃のガス温度、１２ｐｓｉの乾燥ガス、および４０ｐｓｉの噴霧器ガスで稼働させる。ＭＳ走査は、１走査／秒で、６００ｍ／ｚから５０００ｍ／ｚまでとする。データは、２分から１５分まで収集し、タンパク質の分子量は、ＴＩＣピークスペクトルを合計した後、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍａｓｓ ＨｕｎｔｅｒおよびＢｉｏｃｏｎｆｉｒｍ第７．０版を用いたデコンボリューションを合計することによって決定する。非還元試料のデコンボリューションは５００００～１９００００Ｄａ．であり、ピーク幅は１．０Ｄａ．であり、２０回の反復および１Ｄａ．のステップとする。
Figure 0007073487000014
５０μｌの１ｍｇ／ｍｌ抗体抱合体をマウス血清に添加し、３００ＲＰＭで振盪しながら３７℃で０．５～４８時間インキュベートすることによって、血清安定性についての試料を調製する。全てのインビボでの試料または血清安定性試料は、結合比の決定に先立って、生体マトリックスからの抽出を必要とする。生体液は、１３，０００ＲＰＭで１０分間遠心分離した後、階段勾配を使用したヒトＦｃ選択アフィニティカラムへの適用を受ける。結合した抗体を、移動相Ａ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中に捕捉し、０．２％（Ｖ／Ｖ）ギ酸で溶離する。試料画分を手動で収集し、低熱での真空遠心分離を使用して５０～１００μｌに乾燥させる。オフターゲット率は、意図したシステイン以外の部位への生体抱合体の付加を示す。先に説明した手順に従って、次のデータを取得した。
Figure 0007073487000015
Figure 0007073487000016
これらのデータは、操作されたシステイン部位１２４、１５７、３７５および／または３７８でのモノクローナル抗体とホルミル化ペプチド構築物との、マレイミド化学的性質を介した結合が結果的に、オフターゲット率によって実証されるように、抗体へ付加されたシステインの数によって予測されるペプチド：抗体結合比を生じることを実証している。
実施例５：ヒトＨＥＲ２を結合するＴＭａｂ生体抱合体
ＴＭａｂのヒトＨＥＲ２への結合を、ヒトＨＥＲ２でコーティングされた９６ウェル細胞培養プレートを使用したＥＬＩＳＡによって決定する。プレートを抱合抗体に８０分間曝露し、洗浄して非抱合抗体を除去し、二次抗体と５０分間インキュベートする。プレートを洗浄した後、３７℃で２５分間発色させる。光学密度５６０で９６ウェルプレートリーダーを用いて結合を測定する。本質的に先に説明した手順に従って、次のデータを取得した。
Figure 0007073487000017
 抗体構築物は、本明細書の実施例１の表１において説明したのと同じ規則に従って命名されている。
これらのデータは、ＴＭａｂのヒトＨｅｒ２への結合が、部位１２４および３７８にシステインを導入するために重鎖を修飾することによっても影響されず、部位１２４および３７８でのシステイン残基へのペプチド－‘１８３の結合によっても影響されないことを実証している。
実施例６：ＰＭＮ走化性
改変されたＢｏｙｄｅｎチャンバーアッセイにおいてトランスウェル膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３４１５番）を経た抗体抱合体への一次ヒト多形核好中球（ＰＭＮ）の移動を観察することによって、走化性を測定する。好中球濃縮製剤からのおよそ２～４×１０５個の細胞を、３．０ｕｍの細孔を有する膜上の上部トランスウェルチャンバーに播種する。下部のトランスウェルチャンバーには、緩衝液とｆＭＬＦ（陽性対照としてのＮ－ホルミル－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅペプチド）と実験用抗体生体抱合体とからなる溶液を含有している。一部の実験には、ｆＭＬＦＫ（Ｍａｌ［ＯＨ］－ＰＥＧ１２）－ＯＨ（加水分解ペプチド－‘１８３）およびＨ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｍａｌ［ＯＨ］－ＰＥＧ１２－ＯＨ（加水分解ペプチド－‘８４４）も陽性対照として含んでいた。トランスウェル中に播種した後、細胞を加湿インキュベーター内で３７℃に置く。１時間後、上部チャンバー内のいかなる細胞も取り出し、製造元が指定したプロトコルに従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ７５７１番）を使用して、下部チャンバーにうまく移動した細胞の割合を定量化する。移動の割合は、（下部チャンバーに移動する細胞の数／最初に播種した細胞の数）として定義する。標準曲線を使用して細胞数を決定する。全てのデータは、各個々の実験についての最大ｆＭＬＦ応答に対する割合に変換する。
Ｎ－ホルミル修飾は、ＰＭＮ走化性を刺激するために必要とされる
ＰＭＮ移動を誘導するＮ－ホルミル修飾ペプチドの能力を決定するために、Ｎ－ホルミル修飾の有無の下でペプチドに初代ヒトＰＭＮを曝露し、ＰＭＮ移動応答を測定する。本質的に先に説明した手順に従って、ＰＭＮは、それぞれ１０ｎＭ、１ｎＭ、および１μＭの濃度でｆＭＬＦ、ペプチド－‘１８３、およびペプチド－‘８４４に最大限に応答した（表４）。ペプチド－‘８４４は、Ｎ－ホルミル基を欠いていることを除き、ペプチド－’１８３と類似しており、ペプチド－‘１８３とペプチド－’８４４との用量応答の違いによって示されるように、ＰＭＮ移動を誘導する点で１０００倍効力が低い。値は、１０ｎＭのｆＭＬＦに対するＰＭＮの移動率として与えられる。
Figure 0007073487000018
これらのデータは、ペプチドのＮ－ホルミル修飾がＰＭＮ走化性を誘導するために重要であることを実証している。
ホルミルペプチド変異体は好中球走化性を誘導する
初代ヒト好中球をホルミルペプチドに曝露し、ＰＭＮ移動応答を、細胞計数へと変換する代わりに生の移動値が保持されることを除いて、本質的に上述のとおり測定する。本質的に先に説明したとおりの手順に従って、次のデータを１００ｎＭのｆＭＬＦに対する割合として提供する。
Figure 0007073487000019
これらのデータは、ホルミルペプチドのアミノ酸配列とリンカーとへの修飾がＦＰＲ１によって仲介される好中球の移動を誘導することができることを実証している。ＰＥＧ結合ペプチド［ペプチド－‘１８３、ＦＲＭ－０２１、ＦＲＭ－０２９、ＦＲＭ－０３０、およびＦＲＭ－０３１］は、１～３ｎＭの曝露濃度で好中球移動を最大限に誘導した。
ＰＭＮ走化性を駆動する上でのＮ－ホルミルペプチドアミノ酸配列および結合部位の役割
ヒト抗ＭＥＴ ＩｇＧ４抗体（エミベツズマブ）を修飾して、各ＨＣのＣＨ１－Ｓ１２４またはＣＨ３－Ａ３７８のいずれかにシステイン残基を含む。修飾した抗体は、ペプチドと抗体の比が約２：１で、ペプチド－‘１８３またはｆ－Ｎｌｅ（ホルミル－Ｎｌｅ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－ＰＥＧ１２－Ｌｙｓ（マレイミド－プロピオニル）－ＯＨ）のいずれかに結合する。一次ヒトＰＭＮをこれらの異なる抗体抱合体に曝露し、ＰＭＮ移動応答を測定する。
抗体－ペプチド生体抱合体は次のとおりである：エミベツズマブ－Ｇ４－ｆＭＬＦＫ－ＨＣ－３７８Ｃ、エミベツズマブ－Ｇ４－ｆＮｌｅ－ＨＣ－３７８Ｃ、エミベツズマブ－Ｇ４－ｆＭＬＦＫ－ＨＣ－１２４Ｃ、およびエミベツズマブ－Ｇ４－ｆＮｌｅ－ＨＣ－１２４Ｃ。
本質的に先に説明したとおりの手順に従って、ｆＮｌｅ抱合抗体は、ペプチド－‘１８３抱合抗体よりもＰＭＮ移動を刺激する効力が低かった。部位Ａ３７８およびＳ１２４でペプチド－‘１８３に抱合された抗体は、３０ｎＭでＰＭＮ移動を最大限に誘導し、それぞれｆＭＬＦ、対照の９９．１および１１７．８パーセントに等しい移動応答を誘導した。対照的に、ｆＮｌｅ抗体抱合体は１００ｎＭでＰＭＮ移動を最大限に誘導し、それぞれｆＭＬＦ対照の７１．７および７６．５パーセントに等しい移動応答を結果的に生じた。以下の表５の値を、１００ｎＭ ｆＭＬＦに対するＰＭＮ移動率として与える。
Figure 0007073487000020
これらのデータは、ＰＭＮ移動を誘導する際に、ペプチド－‘１８３に抱合された抗体がｆＮｌｅ抗体抱合体よりも有意に強力であることを実証している。Ａ３７８およびＳ１２４部位はいずれも、Ｎ－ホルミルペプチド抱合に適している。
ペプチドと抗体との抱合比が高いとＰＭＮ移動応答が上昇する
ＣＨ１－１２４Ｃおよび３７８Ｃまたは３７８Ｃのみでアミノ酸修飾されたヒト抗ＭＥＴ ＩｇＧ４抗体（エミベツズマブ）を、ペプチド－‘１８３に抱合体させる。一次ヒトＰＭＮをこれらの抗体抱合体に曝露し、ＰＭＮ応答を測定する。
先に説明したとおり不可欠な手順に従って、エミベツズマブ－Ｇ４－ｆＭＬＦＫ－ＨＣ－１２４Ｃ－３７８Ｃは１２．５ｎＭで移動を最大限に誘導し、エミベツズマブ－Ｇ４－ｆＭＬＦＫ－ＨＣ－３７８Ｃは２５ｎＭでの移動を最大限に誘導し、それぞれｆＭＬＦ対照の１１９．３および１２４．３パーセントに等しい移動応答を誘導した（表６）。非抱合抗体は、抱合抗体と比較してＰＭＮの移動を誘導しなかった。値を、３．１２ｎＭ ｆＭＬＦに対するＰＭＮ移動率として与える。
Figure 0007073487000021
これらのデータは、ペプチドと抗体との比率を上昇させると、ＰＭＮ移動濃度応答の関係性に比例的に影響することを実証している。
ＴＭａｂ（トラスツズマブ）およびＡＭＥ１３３抗体抱合体
ＴＭａｂ－Ｇ１－ｆＭＬＦＫ－ＨＣ－１２４Ｃ－３７８Ｃ、ＡＭＥ１３３－Ｇ１（ＩＱ）－ｆＭＬＦＫ－ＨＣ－１２４Ｃ－３７８Ｃ、およびエミベツズマブ－Ｇ４－ＵＣ－１２４Ｃ－３７８Ｃを、本質的に先に説明したとおりのＰＭＮ走化性アッセイにおいて研究する。ＴＭａｂ－Ｇ１－ｆＭＬＦＫ－ＨＣ－１２４Ｃ－３７８ＣおよびＡＭＥ１３３－Ｇ１（ＩＱ）－ｆＭＬＦＫ－ＨＣ－１２４Ｃ－３７８Ｃは、それぞれ１０ｎＭおよび３ｎＭでＰＭＮ移動を最大限に誘導した。エミベツズマブ－Ｇ４－ＵＣ－１２４Ｃ－３７８Ｃは、抱合抗体と比較してＰＭＮ移動を誘発しなかった。値を以下の表７に与えており、３０ｎＭ ｆＭＬＦに対するＰＭＮの移動率とする。
Figure 0007073487000022
これらのデータは、Ｎ－ホルミルペプチドに抱合されたＴＭａｂおよびＡＭＥ１３３抗体がＰＭＮ移動を有効に誘導することを実証している。それゆえ、本発明の抱合抗体は、身体の免疫系を利用して癌細胞を攻撃するのに有用であると考えられている。
実施例７：ＰＭＮの活性酸素種（ＲＯＳ）の産生
多形核好中球（ＰＭＮ）は、刺激の際にＲＯＳを産生することができ、ミエロペルオキシダーゼのようなＲＯＳ生成酵素を案有している。ＰＭＮの刺激は、脱顆粒を誘導し、病原体に応答するための主要な機序として、事前に形成されたＲＯＳおよびＲＯＳ生成酵素を細胞外環境へと放出する。ＰＭＮによるＲＯＳ産生の刺激は、細菌から真核細胞まで、広範囲の標的を損傷および殺滅するのに十分である。ＰＭＮを刺激してＲＯＳを産生する最も有効な経路の１つは、Ｎ－ホルミルペプチドによるＰＭＮ上のホルミルペプチド受容体１（ＦＰＲ１）の関与を包含する。ＰＭＮ上の抗体によるＦｃ受容体の関与も、ＲＯＳ産生を誘導する有効な機序である。
ヒト一次ＰＭＮによるＲＯＳの産生は、ルミノール増幅化学発光を使用して測定される。単離後、０．２５％ヒト血清アルブミン（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ ｐｒｏｄｕｃｓｔ ＃８００－１２４）および５０ｕＭルミノール（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ ＃１２３０７２－２．５Ｇ）を補充したカルシウムおよびマグネシウム（Ｇｉｂｃｏ ＃１４０２５－０９２）を含有するＨＢＳＳ中に、ＰＭＮを１×１０６個／ｍｌで懸濁する。次に、１００μｌの細胞懸濁液（総細胞数１×１０５個）を、蛍光測定に適した９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃６５５０９８）の各ウェルへと分注し、温度を３７℃まで５分間平衡化する。平衡化後、抗体抱合体の１０×溶液をウェルに適用し、１×終濃度を達成する。
抗体抱合体の添加直後、化学発光シグナルを、ウェルあたり０．０１秒の滞留時間、連続プレート読み取り間の時間合計２０秒、総試行時間４５分で、３７℃に維持されたルミノメーターにおいて記録する（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）。曲線下面積（ＡＵＣ）スコアを、各曝露条件についての初回ＲＯＳバーストの相対的な振幅を示す、各試行の最初の５分間の発光シグナルを使用して計算する。ホルミル－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ（ｆＭＬＦ）ペプチドを陽性対照として使用し、シクロスポリンＨをＦＰＲ１阻害剤として使用する。値は、最大曝露濃度でのｆＭＬＦ対照の割合として表示する（（ＡＵＣ曝露条件／ＡＵＣ ｆＭＬＦ）×１００）。
一次ヒトＰＭＮをペプチドまたは生体抱合体に曝露し、本質的に先に説明したとおりルミノール増幅化学発光を使用してＲＯＳ産生を測定した。本質的に先に説明した手順に従って、示された操作されたシステイン（複数可）でモノクローナル抗体に抱合されたＮ－ホルミルペプチドは、一次ヒト多形核好中球によって発現するホルミルペプチド受容体と有効に結合し、細胞毒性活性酸素種の産生を刺激する。抱合されたＮ－ホルミルペプチドによるＲＯＳ産生の刺激は、ＦＲＰ１アンタゴニストであるシクロスポリンＨによるＦＰＲ１シグナル伝達の阻害が、Ｎ－ホルミルペプチド抱合抗体に応じてＰＭＮ ＲＯＳ産生を有意に低減させたので、主としてＦＰＲ１依存的であった。具体的な抗体抱合体を使用する例を以下に示す。
ペプチドのＮ－ホルミル修飾
一次ヒトＰＭＮをペプチドに曝露し、本質的に先に説明するとおり、ルミノール増幅化学発光を使用してＲＯＳ産生を測定した。データを以下の表８に示し、抗体抱合体への曝露後５分間に記録した発光についての曲線下面積計算を使用して、１０ｕＭ ｆＭＬＦに対する割合として、データを報告する。
Figure 0007073487000023
これらのデータは、ペプチド－‘１８３へ曝露したＰＭＮが１０ｎＭ～１０ｕＭの濃度のｆＭＬＦについて観察されたよりも多くのＲＯＳを産生したことを実証している。ペプチド－‘８４４刺激ＲＯＳ産生は、ｆＭＬＦについて観察されたＲＯＳ産生よりも実質的に少なく、ＰＭＮによるＲＯＳ産生の有効な刺激にはペプチドＮ－ホルミル修飾が必要であることを示している。
ホルミルペプチド変異体は好中球のＲＯＳ産生を誘導する
初代ヒト好中球を、合成アミノ酸を含むアミノ酸置換を有するホルミルペプチド変異体へ曝露し、本質的に先に説明したとおり、ルミノール増幅化学発光を使用してＲＯＳ産生を測定した。データを以下の表８ｂに示しており、試薬への曝露後５分間に記録された発光についての曲線下面積計算を使用して、３０００ｎＭ ｆＭＬＦに対する割合としてデータを報告する。ＥＣ５０値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ ＰＲＩＳＭのＢｅｓｔ－Ｆｉｔ値を使用して計算した。
Figure 0007073487000024
これらのデータは、ＲＯＳ産生を誘導するための例示されたホルミルペプチド変異体の効力を実証している。非コード化アミノ酸の組込みは、ペプチドの安定性を改善することができ、非コード化アミノ酸変異体を組み込んでホルミルペプチドとＦＰＲ１との間の結合を強化し、結果的に効力を上昇させることが期待される。
マウス好中球ＦＰＲ－１は、ｆＭＬＦ誘導体よりもｆＭＩＦＬペプチドおよび抗体抱合体に対してより敏感である。
骨髄から精製したマウス好中球をホルミルペプチドまたは抗体抱合体へ曝露し、本質的に先に説明したとおりルミノール増幅化学発光を使用してＲＯＳ産生を測定した。データを以下の表８ｃに示し、試薬への曝露後５分間に記録した発光についての曲線下面積計算を使用して、１００００ｎＭ ｆＭＬＦに対する割合としてデータを報告する。
Figure 0007073487000025
これらのデータは、マウス好中球がｆＭＬＦペプチドおよび抗体抱合体に対してｆＭＬＦ変異体よりも感受性が有意に高いことを実証している。ヒトにおいて、ｆＭＬＦは、最も強力なＦＰＲ１アゴニストのうちの１つであるが、マウス実験では効力が有意に低い。マウスおよびヒトの好中球のＦＰＲ１間のこの関係は、ＦＰＲ１アゴニストが可溶性ペプチドであるかどうか、または抗体に抱合されているかどうかに関係なく成り立つ。
ＴＭａｂ生体抱合体
一次ヒトＰＭＮをＴＭａｂ生体抱合体に曝露し、本質的に先に説明したとおりルミノール増幅化学発光を使用してＲＯＳ産生を測定した。データを以下の表９に示しており、試薬への曝露後５分間に記録した発光についての曲線下面積計算を使用して、１０００ｎＭ ｆＭＬＦに対する割合としてデータを報告する。
Figure 0007073487000026
これらのデータは、１０００ｎＭ ＴＭａｂ－Ｇ１－ｆＭＬＦＫ－ＨＣ－１２４Ｃ－３７８Ｃに曝露したＰＭＮが、ｆＭＬＦ対照の７０．１％に等しいレベルで、ＴＭａｂ－Ｇ１－ＵＣ－ＨＣ－１２４Ｃ－３７８Ｃよりも非常に高いレベルでＲＯＳを産生したことを実証している。
エミベツズマブ抱合体
一次ヒトＰＭＮをエミベツズマブ抱合体に曝露し、本質的に先に説明したとおり、ルミノール増幅化学発光を使用してＲＯＳ産生を測定した。データを以下の表１０に示しており、抗体抱合体への曝露後５分間に記録した発光についての曲線下面積計算を使用して、１０００ｎＭ ｆＭＬＦに対する割合としてデータを報告する。
Figure 0007073487000027
これらのデータは、１０００ｎＭのエミベツズマブ－Ｇ４－ｆＭＬＦＫ－ＨＣ－１２４Ｃ－３７８Ｃおよびエミベツズマブ－Ｇ４－ｆＭＬＦＫ－ＨＣ－３７８Ｃに曝露したＰＭＮが、それぞれ１０００ｎＭ ｆＭＬＦ対照の６２．２％および４８．９％に等しいレベルでＲＯＳを産生したことを実証している。１０００ｎＭのエミベツズマブ－Ｇ４－ＵＣ－ＨＣ－１２４Ｃ－３７８Ｃへの曝露は、対照のわずか３２．２％に等しい低いＲＯＳ産生を生じた。
ＡＭＥ１３３（抗ＣＤ２０）抱合体
一次ヒトＰＭＮをＡＭＥ１３３抗体抱合体に曝露し、本質的に先に説明したとおりルミノール増幅化学発光を使用してＲＯＳ産生を測定した。データを以下の表１１に示しており、抗体抱合体への曝露後５分間に記録した発光についての曲線下面積計算を使用して、１０００ｎＭ ｆＭＬＦに対する割合としてデータを報告する。
Figure 0007073487000028
これらのデータは、１０００ｎＭ ＡＭＥ１３３－Ｇ１（ＩＱ）－ｆＭＬＦＫ－ＨＣ－１２４Ｃ－３７８ＣおよびＡＭＥ１３３－ＵＣに曝露したＰＭＮが、それぞれ対照の７７．９％および１３．９％に等しいレベルのＲＯＳを産生したことを実証している。
抗体抱合体およびＦＰＲ１シグナル伝達の阻害
抱合抗体が非抱合抗体よりも多くのＲＯＳ産生を誘起するかどうかを決定するために、ＲＯＳ産生を本質的に先に説明したとおり測定する。全てのペプチドを、終濃度３００ｎＭで試験する。ＰＭＮを１ｕＭのシクロスポリンＨとともに３０分間プレインキュベートした後、ペプチドを添加する。
緩衝液は、０．２５％のヒト血清アルブミン（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ ｐｒｏｄｕｃｓｔ＃８００－１２４）および５０ｕＭ ルミノール（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃ＃１２３０７２－２．５Ｇ）を補充した、カルシウムおよびマグネシウムを含有するＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ＃１４０２５－０９２）とする。値を以下の表１２ａに報告しており、抗体抱合体への曝露後５分間に記録した発光についての曲線下ｆＭＬＦ面積に対する割合として表す。
Figure 0007073487000029
これらのデータは、ｆＭＬＦＫに抱合された抗体が、非抱合抗体と比較して、ヒトＰＭＮから実質的に多量のＲＯＳ産生を誘起することを実証している。データは、ＰＭＮをＦＰＲ１アンタゴニストであるシクロスポリンＨで前処理すると、抗体生体抱合体におけるＲＯＳレベルの実質的な低減をもたらすが、非抱合体対照においてはそうではないことも実証している。
ＦｃγＲ３結合を増強する抗体突然変異は、Ｎ－ホルミルペプチド生体抱合体に応じてＦＰＲ１仲介性ＲＯＳ産生を上昇させる
初代ヒト好中球を、ＦｃγＲ３に対する親和性を上昇させるＦｃ領域の突然変異（２４７Ｉ、３３９Ｑ、±３３２Ｅ突然変異）の有無の下で、Ｔｍａｂ Ｎ－ホルミルペプチド抱合体に曝露する。ＲＯＳ産生を、本質的に先に説明したとおりルミノール増幅化学発光を使用して測定する。データを以下の表１２ｂに示しており、試薬への曝露後５分間に記録した発光の曲線下面積計算を使用して、１０００ｎＭ ｆＭＬＦに対する割合としてデータを報告する。ＦＰＲ１仲介性ＲＯＳ産生についてのＥＣ５０値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ ＰＲＩＳＭにおけるＢｅｓｔ－Ｆｉｔ値を使用して計算する。
Figure 0007073487000030
これらのデータは、好中球によるＦｃＲの関与を最適化することによって、ＲＯＳ産生をさらに増強するために、Ｎ－ホルミル－Ｍｅｔ生体抱合体を操作することができることを実証している。ＩＱおよびＩＱＥアミノ酸置換を有するＦｃ最適化Ｔｍａｂ生体抱合体は、野生型Ｔｍａｂ ＩｇＧ１抱合体と比較して好中球による刺激されたＲＯＳ産生を増強し、Ｔｍａｂ－Ｇ１－ｆＭＬＦＫ－ＨＣ－１２４Ｃ－３７８Ｃ－ＩＱおよびＴｍａｂ－Ｇ１－ｆＭＬＦＫ－ＨＣ－１２４Ｃ－３７８Ｃ－ＩＱＥ変異体はそれぞれ、Ｔｍａｂ－Ｇ１－ｆＭＬＦＫ－ＨＣ－１２４Ｃ－３７８Ｃと比較したときにＥＣ５０が２．９８倍および１４．９倍改善することを示した。ＰＭＮ細胞殺滅機序の活性化におけるＦｃ操作の改善は、好中球による抱合抗体仲介性細胞殺滅に実質的な利益をもたらすであろうと予想される。
化合物リンカーの長さ
一次ヒト好中球を、種々の長さのＰＥＧリンカーを有するＮ－ホルミルペプチドＴｍａｂ抱合体へ曝露し、本質的に先に説明したとおりルミノール増幅化学発光を使用してＲＯＳ産生を測定した。データを以下の表１２ｃに示しており、試薬への曝露後５分間に記録した発光の曲線下面積計算を使用して、３０００ｎＭ ＦＲＭ－０２３（配列番号４０）に対する割合としてデータを報告する。ＦＰＲ１を介したＲＯＳ産生についてのＥＣ５０値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ ＰＲＩＳＭにおけるＢｅｓｔ－Ｆｉｔ値を使用して計算した。
Figure 0007073487000031
これらのデータは、Ｎ－ホルミルペプチド抱合体が、種々の大きさのＰＥＧを有するＦＰＲ１アゴニストとして機能性を維持していることを実証している。
実施例８：抗体抱合体は、好中球媒介腫瘍細胞殺滅を可能にする
腫瘍に対するＰＭＮを標的とし、腫瘍細胞殺滅に関与する抗体化合物の能力を決定する。ＴＭａｂ、エミベツズマブ、およびＡＭＥ１３３抗体抱合体を腫瘍細胞殺滅においてＰＭＮを関与させる能力について、固形腫瘍および液性腫瘍で評価する。
ＰＭＮによる腫瘍細胞の抗体標的殺滅は、ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅリアルタイム細胞分析システム（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定する。このシステムは、培養プレートの成長表面上のセンサー間の電気インピーダンスを記録することによって、細胞の生存率をリアルタイムで監視する。並列ウェルの細胞を制御するために正規化された正規化細胞指数（ＮＣＩ）を報告し、相対的な培養生存率について制御することができるようにする。ＮＣＩを、腫瘍培養物を標的抗体とともにインキュベートした後、１５分間隔で２４時間連続的に測定し、１０：１のＰＭＮと腫瘍細胞との比でヒト初代ＰＭＮを添加します。腫瘍細胞を播種するのに先立って、ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ ９６ウェルＥ－Ｐｌａｔｅを背景シグナルについて較正する。各ウェルに５０μｌの培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋抗生物質）を入れ、ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅプレートリーダーを備えた加湿インキュベーター内でＥプレートを３７℃に平衡化する。
平衡化後、Ｅ－Ｐｌａｔｅウェルの背景の変動を測定する。培養腫瘍細胞株を分離し、計数し、培養培地中で１×１０５個／ｍｌの最終密度に希釈し、１００μｌの希釈腫瘍細胞をＥ－Ｐｌａｔｅウェルに播種した。Ｅ－ＰｌａｔｅをｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅリーダーに戻し、ベースラインを確立するために１５分の間隔で細胞指数を一晩測定する。
翌日、ＰＭＮを新鮮なヒト血液試料から単離し、培養培地中の最終密度を２×１０６個／ｍｌにする。一晩記録した後、Ｅ－ＰｌａｔｅをｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅリーダーから取り出し、２２μｌの１０×抗体溶液または緩衝液を指定のウェルに添加する。１５分後、５０μｌの希釈ＰＭＮ（総細胞数１×１０５個）または緩衝液を指定のウェルに添加した。ＰＭＮを添加した直後に、Ｅ－ＰｌａｔｅをｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅリーダーに戻し、細胞指数を最長７２時間測定した。本実験の完了後、細胞指数を抗体の添加直前の時点に正規化する（ＮＣＩ）。
ＮＣＩの割合は、（（試料のＮＣＩ）／（腫瘍細胞単独のＮＣＩ）×１００）として定義する。非接着性腫瘍細胞（Ｄａｕｄｉ細胞）については、ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ免疫療法キット－Ｂ細胞殺滅アッセイ（ＡＣＥＡ＃８１００００４）を使用して、製造元のプロトコルに従って腫瘍細胞をＥ－Ｐｌａｔｅウェルに固定する。固定および背景の獲得の後、プロトコルを先に示したとおり実施する。
以下に示すデータは、Ｎ－ホルミルペプチドに抱合された抗体が腫瘍細胞のＰＭＮ仲介性殺滅につながることを実証している。
Ｎ－ホルミル－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅペプチド
２つのＮ－ホルミル化ペプチドであるｆ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－ＰｈｅおよびＰｅｐｔｉｄｅ－‘１８３をＳＫＯＶ３腫瘍細胞殺滅アッセイにおいて査定して、モノクローナル抗体による腫瘍標的化の非存在下でのＰＭＮ仲介性腫瘍細胞殺滅に及ぼすＮ－ホルミルメチオニンペプチドの影響を決定する。
ＮＣＩの割合の値は、指定された条件に２時間曝露した後のＳＫＯＶ３細胞の相対的な生存率を表す。値を、ＳＫＯＶ３対照±標準偏差に正規化された平均の割合として与え、全ての条件についてｎ＝４とする。統計的有意性を、一元配置分散分析に続いて、ポストホックダネットの多重比較検定と「＋ＰＭＮ」によって決定する。
Figure 0007073487000032
これらのデータは、ＰＭＮの非存在下では、ペプチドが腫瘍細胞の生存率に及ぼす統計的な影響がなかったことを実証している。ＰＭＮの存在下では、これらのペプチドは最高濃度のペプチドでのみＮＣＩの低減を引き起こした。
ＴＭａｂ
付着性ＨＥＲ２（＋）ＳＫＯＶ３ヒト腺癌腫瘍細胞をおよそ２４時間播種し、次にＴＭａｂ－Ｇ１－ｆＭＬＦＫ－ＨＣ－１２４Ｃ－３７８ＣまたはＴＭａｂ－Ｇ１－ＵＣ－ＨＣ－１２４Ｃ－３７８Ｃとともにインキュベートし、１０：１のエフェクター標的対細胞比で初代ヒトＰＭＮに曝露した。
ＮＣＩの割合の値は、指定された条件への２時間曝露後のＳＫＯＶ３細胞の相対的な生存率を表す。値を以下の表１４に与えており、ＳＫＯＶ３対照に対して正規化された平均の割合±標準偏差として表す。全ての条件についてＮ＝４とする。
Figure 0007073487000033
これらのデータは、２時間後、１０ｎＭのＴＭａｂ－Ｇ１－ｆＭＬＦＫ－ＨＣ－１２４Ｃ－３７８Ｃとともにインキュベートし、ＰＭＮに曝露した細胞が、対照細胞の６３．５±９．９％パーセント（ｐ値＜０．０００１）に等しい正規化した細胞指数（ＮＣＩ）の減少を示したのに対し、１０ｎＭのＴＭａｂ－Ｇ１－ＵＣ－ＨＣ－１２４Ｃ－３７８Ｃに曝露した細胞は、対照細胞の１０３±１．２％のＮＣＩを維持した（統計的に有意ではない）ことを実証している。ＴＭａｂ－Ｇ１－ｆＭＬＦＫ－ＨＣ－１２４Ｃ－３７８Ｃは、ＰＭＮの非存在下で２時間後に腫瘍細胞の生存率を低減させず、抗体なしのＰＭＮの添加はＳＫＯＶ３腫瘍細胞の生存率に影響しなかった。
エミベツズマブ
付着したＭＥＴ（＋）Ａ５４９ヒト肺癌細胞をおよそ２４時間播種し、次に、エミベツズマブ－Ｇ４－ｆＭＬＦＫ－ＨＣ－１２４Ｃ－３７５Ｃまたはエミベツズマブ－Ｇ４－ＵＣ－ＨＣ－１２４Ｃ－３７５Ｃとともにインキュベートし、一次ヒトＰＭＮに１０：１のエフェクター対標的細胞比で曝露する。
本質的に先に説明したとおりの手順に従って、次のデータを取得したので、表１５に示す。
Figure 0007073487000034
ＮＣＩ値の割合の値は、指定した条件に２時間曝露した後のＡ５４９細胞の相対的な生存率を表す。値は、「＋ＰＭＮ」対照±標準偏差に正規化された平均の割合として与え、全ての条件についてｎ＝４とする。統計的有意性は、一元配置分散分析とそれに続くポストホックダネットの多重比較検定および「＋ＰＭＮ」によって決定した。ＮＣＩ：正規化された細胞指数、ＰＭＮ：一次ヒト多形核好中球、ｎｓ：有意ではない。
これらのデータは、ＰＭＮの存在下で１０ｎＭエミベツズマブ－Ｇ４－ｆＭＬＦＫ－ＨＣ－１２４Ｃ－３７５Ｃに曝露した培養物が、２時間のインキュベーション後に対照細胞の８７．７±０．９％に等しいＮＣＩの低減を示したのに対し、エミベツズマブ－Ｇ４－ＵＣ－ＨＣ－１２４Ｃ－３７５Ｃ処理細胞が、対照細胞のＮＣＩ１０２．５±１．９％を維持したことを実証している。
ＡＭＥ１３３の例
非接着性のＣＤ２０＋Ｄａｕｄｉ Ｂリンパ芽球細胞をｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ免疫療法キット（ＡＣＥＡ＃８１００００４）で固定し、製造元のプロトコルに従って腫瘍細胞をＥ－Ｐｌａｔｅウェルに固定し、以下の表１６に示す条件に曝露する。ＮＣＩの割合の値は、指定した条件に６時間曝露した後のＤＡＵＤＩ細胞の相対的な生存率を表す。値を、「緩衝液対照」に正規化された平均の割合±標準偏差として与え、全ての条件についてｎ＝４とする。統計的有意性を、一元配置分散分析およびそれに続くポストホックダネットの多重比較検定対「＋ＰＭＮ」によって決定した。
Figure 0007073487000035
これらのデータは、３０ｎＭ ＡＭＥ１３３－Ｇ１（ＩＱ）－ｆＭＬＦＫ－１２４Ｃ－３７８Ｃに曝露した培養物では、６時間のインキュベーション後、対照細胞の２０±２．１％（ｐ値＜０．０００１）に等しくＮＣｌを低減させたのに対し、３０ｎＭ ＡＭＥ１３３－Ｇ１（ＩＱ）－ＵＣ－１２４Ｃ－３７８Ｃは、対照細胞の９７．３±１．２％のＮＣＩを維持した。ＡＭＥ１３３－Ｇ１（ＩＱ）－ｆＭＬＦＫ－１２４Ｃ－３７８ＣおよびＡＭＥ１３３－Ｇ１（ＩＱ）－ＵＣ－１２４Ｃ－３７８Ｃは、ＰＭＮの非存在下で腫瘍細胞の生存率を低減させなかった。しかしながら、抗体の非存在下でＤａｕｄｉ細胞をＰＭＮに曝露すると、腫瘍培養ＮＣＩが対照細胞の６６．９±５．２％に低減した（ｐ値＜０．０００１）。
単一抗体抱合体の複数のシステインへのホルミルペプチドの抱合は効力を上昇させる
一次ヒト好中球を、異なる数の操作されたシステイン結合部位を有するＩｇＧ４抗体抱合体に曝露し、本質的に先に説明したとおりルミノール増幅化学発光を使用してＲＯＳ産生を測定する。本質的に先に説明したとおりの手順に従って、次のデータを取得した。
Figure 0007073487000036
表１７のデータを、試薬への曝露後５分間に記録した発光についての曲線下面積計算を使用して、１０００ｎＭ ｆＭＬＦに対する割合として報告する。
これらのデータは、ｆＭＬＦＫに抱合された抗体が、追加の抱合部位でより強力になれることを実証している。
実例となる実施形態
次のものは、本開示の種々の実施形態を表す本開示による実例となる実施形態のリストを含む。
これらの実例となる実施形態は、網羅的であること、または本開示を、開示された正確な形態に限定することを意図するものではなく、むしろ、これらの実例となる実施形態は、当業者がこれらの教示を利用することができるように、本開示をさらに説明するのを助けるために提供される。
１．ＩｇＧ重鎖定常領域と軽鎖定常領域とを含む抗体であって、該抗体が、次の残基、すなわちＣＨ１ドメインにおける残基１２４、ＣＨ１ドメインにおける残基１５７、ＣＨ１ドメインにおける残基１６２、ＣＨ２ドメインにおける残基２６２、ＣＨ３ドメインにおける残基３７５、ＣＨ３ドメインにおける残基３７３、ＣＨ３ドメインにおける残基３９７、ＣＨ３ドメインにおける残基４１５、Ｃカッパドメインにおける残基１５６、Ｃカッパドメインにおける残基１７１、Ｃカッパドメインにおける残基１９１、Ｃカッパドメインにおける残基１９３、Ｃカッパドメインにおける残基２０２、またはＣカッパドメインにおける残基２０８のうちの少なくとも１つにシステインを含む、抗体。
２．該抗体が該ＣＨ１ドメインにおける残基１２４にシステインを含み、該ＣＨ１ドメインにおける残基１５７および残基１６２ならびに該ＣＨ３ドメインにおける残基３７５および残基３７８のうちの１つではあるが全てではない残基にシステインをさらに含む、実施形態１に記載の抗体。
３．該抗体が、該ＣＨ１ドメインにおける残基１５７にシステインを含む、実施形態１または２に記載の抗体。
４．該抗体が、該ＣＨ３ドメインの残基３７５にシステインを含む、実施形態２に記載の抗体。
５．該抗体が該ＣＨ３ドメインにおける残基３７８にシステインを含む、実施形態２に記載の抗体。
６．該ＩｇＧ重鎖定常領域が、ヒト、マウス、ラット、またはウサギＩｇＧ定常領域である、実施形態１～４のいずれか１つに記載の抗体。
７．該ＩｇＧ重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４アイソタイプである、実施形態５に記載の抗体。
８．該ＩｇＧ重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１である、実施形態６に記載の抗体。
９．該重鎖定常領域が、配列番号１７、１８、１９、または５２のアミノ酸配列によって与えられるヒトＩｇＧ１である、実施形態１に記載の抗体。
１０．該重鎖定常領域が、配列番号２０、２１、または５３のアミノ酸配列によって与えられるヒトＩｇＧ１である、実施形態２に記載の抗体。
１１．該ＩｇＧ１重鎖定常領域が、残基２４７で置換されたイソロイシンと、残基３３９で置換されたグルタミンと、場合により残基３３２で置換されたグルタミン酸とをさらに含む、実施形態７～９のいずれか１つに記載の抗体。
１２．該ＩｇＧ重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４である、実施形態６に記載の抗体。
１３．該重鎖定常領域が、配列番号１２、１３、１４、５４、または５５のアミノ酸配列によって与えられるヒトＩｇＧ４である、実施形態１に記載の抗体。
１４．該重鎖定常領域が、配列番号１５、１６、５６、または５７のアミノ酸配列によって与えられるヒトＩｇＧ４である、実施形態２に記載の抗体。
１５．該ＩｇＧ４重鎖定常領域が、残基２２８で置換されたプロリンと、残基２３４で置換されたアラニンと、残基２３５で置換されたアラニンと、残基３３９で置換されたグルタミンとをさらに含む、実施形態１１～１３のいずれか１つに記載の抗体。
１６．２つの重鎖と２つの軽鎖とを含み、各重鎖が、次の残基、すなわちＣＨ１ドメインにおける残基１２４、ＣＨ３ドメインにおける残基３７５、およびＣＨ３ドメインにおける残基３７３のうちの１つにシステインを含むＩｇＧ重鎖定常領域を含む、実施形態１に記載の抗体。
１７．該抗体が、各重鎖のＣＨ１ドメインにおける残基１２４にシステインを含み、ＣＨ３ドメインにおける残基３７５および残基３７８、ならびにＣＨ１ドメインにおける残基１５７のうちの１つではあるが全てではない残基にシステインを含む、実施形態１５に記載の抗体。
１８．該抗体が、各重鎖のＣＨ３ドメインにおける残基３７５にシステインを含む、実施形態１６に記載の抗体。
１９．該抗体が、各重鎖のＣＨ３ドメインの残基３７８にシステインを含む、実施形態１６に記載の抗体。
２０．該ＩｇＧ重鎖定常領域のそれぞれが、ヒト、マウス、ラットまたはウサギＩｇＧ定常領域である、実施形態１５～１８のいずれか１つに記載の抗体。
２１．該ＩｇＧ重鎖定常領域のそれぞれがヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４アイソタイプである、実施形態１９に記載の抗体。
２２．該ＩｇＧ重鎖定常領域のそれぞれがヒトＩｇＧ１である、実施形態２０に記載の抗体。
２３．該重鎖定常領域のそれぞれが、配列番号１７、１８、１９、または５２のアミノ酸配列によって与えられるヒトＩｇＧ１である、実施形態１５に記載の抗体。
２４．該重鎖定常領域のそれぞれが、配列番号２０、２１、または５３のアミノ酸配列によって与えられるヒトＩｇＧ１である、実施形態１６に記載の抗体。
２５．該ＩｇＧ１重鎖定常領域のそれぞれが、残基２４７で置換されたイソロイシンと、残基３３９で置換されたグルタミンと、場合により残基３３２で置換されたグルタミン酸とをさらに含む、実施形態２１～２３のいずれか１つに記載の抗体。
２６．該ＩｇＧ重鎖定常領域のそれぞれがヒトＩｇＧ４である、実施形態２０に記載の抗体。
２７．該重鎖定常領域のそれぞれが、配列番号１２、１３、１４、５４、または５５のアミノ酸配列によって与えられるヒトＩｇＧ４である、実施形態１５に記載の抗体。
２８．該重鎖定常領域のそれぞれが、配列番号１５、１６、５６、または５７のアミノ酸配列によって与えられるヒトＩｇＧ４である、実施形態１６に記載の抗体。
２９．該ＩｇＧ４重鎖定常領域のそれぞれが、残基２２８で置換されたプロリンと、残基２３４で置換されたアラニンと、残基２３５で置換されたアラニンと、残基３３９で置換されたグルタミンとをさらに含む、実施形態２５～２７のいずれか１つに記載の抗体。
３０．各ＩｇＧ定常領域の残基１２４、１５７、１６２、３７５または３７８の各システインが、マレイミド－ＰＥＧリンカーを介してＮ－ホルミル－メチオニンペプチドに抱合されている、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の抗体。
３１．各ＩｇＧ定常領域の残基１２４のシステインと、各ＩｇＧ定常領域の残基１５７、１６２、３７５、および３７８のうちの１つではあるが全てではない残基のシステインとを含み、各ＩｇＧ定常領域の残基１２４および１５７、１６２、３７５、または３７８の各システインが、次の式のマレイミド－ＰＥＧリンカーを介してＮ－ホルミル－メチオニンペプチドに抱合され、
Figure 0007073487000037
 該リンカーが、該ＩｇＧ定常領域の残基１２４および１５７、１６２、３７５、または３７８のシステインへのチオエーテル結合を介して該抗体に、かつペプチドのＣ末端リジンのイプシロンアミノ基におけるアミド結合を介して該Ｎ－ホルミル－メチオニンペプチドに共有結合しており、式中、ｎ＝６～２４である、実施形態２９に記載の抱合抗体。
３２．各ＩｇＧ定常領域の残基１２４のシステインおよび残基３７５のシステインが、該マレイミド－ＰＥＧリンカーを介して該Ｎ－ホルミルメチオニンペプチドに抱合されている、実施形態３０に記載の抱合抗体。
３３．各ＩｇＧ定常領域の残基１２４のシステインおよび残基３７８のシステインが、該マレイミド－ＰＥＧリンカーを介して該Ｎ－ホルミルメチオニンペプチドに抱合されている、実施形態３０に記載の抱合抗体。
３４．ｎ＝１２である、実施形態３０～３２のいずれか１つに記載の抱合抗体。
３５．該Ｎ－ホルミルメチオニンペプチドが、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、または配列番号４１によって与えられる、実施形態２９～３３のいずれか１つに記載の抱合抗体。
３６．実施形態２９～３４のいずれか１つに記載の抱合抗体と、１つ以上の医薬上許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
３７．固形癌または液性腫瘍を治療する方法であって、それを必要とする患者に、実施形態２９～３５のいずれか１つに記載の有効量の抱合抗体またはその医薬組成物を投与することを含む、方法。
３８．乳癌、肺癌、前立腺癌、皮膚癌、大腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、筋肉癌、骨癌、中皮腫、血管癌、線維癌、白血病またはリンパ腫を治療するための、実施形態３６に記載の方法。
３９．療法における使用のための、実施形態２９～３５のいずれか１つに記載の抱合抗体。
４０．固形癌または液性腫瘍の治療における使用のための、実施形態２９～３５のいずれか１つに記載の抱合抗体。
４１．乳癌、肺癌、前立腺癌、皮膚癌、大腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、筋肉癌、骨癌、中皮腫、血管癌、線維癌、白血病またはリンパ腫の治療における使用のための、実施形態３９に記載の抱合抗体。
４２．少なくとも１つの操作されたシステインを含む抗体である化合物であって、該抗体が該免疫系の１つ以上の細胞を誘引および／または活性化することができる化学誘引物質にリンカーによって抱合されており、該化学誘引物質が該抗体内の１つ以上のシステイン残基で該抗体に抱合されている、化合物。
４３．該抗体が、モノクローナル抗体または二重特異性抗体である、実施形態４２に記載の化合物。
４４．該抗体が、モノクローナル抗体である、実施形態４２に記載の化合物。
４５．該抗体が、二重特異性抗体である、実施形態４２記載の化合物。
４６．該システインが、抗体可変領域内にある操作されたシステインである、実施形態４２～４５のいずれか１つに記載の化合物。
４７．該システインが、抗体定常領域内にある操作されたシステインである、実施形態４２～４５のいずれか１つに記載の化合物。
４８．該システインが、該ＣＨ１またはＣＨ３ドメイン内にある操作されたシステインである、実施形態４２～４５のいずれか１つに記載の化合物。
４９．該システインが、天然のセリン、バリン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、トレオニン、またはグリシンを置き換える位置で操作される、実施形態４２～４８のいずれか１つに記載の化合物。
５０．該システインが、天然のセリン、バリン、またはアラニンを置き換える位置で操作される、実施形態４９に記載の化合物。
５１．操作されたシステインの総数が２～６である、実施形態４２～５０のいずれか１つに記載の化合物。
５２．該化合物が、該免疫系の１つ以上の細胞を誘引および活性化することができる、実施形態４２～５１のいずれか１つに記載の化合物。
５３．該免疫系が適応免疫系である、実施形態４２～５２のいずれか１つに記載の化合物。
５４．該免疫系が自然免疫系である、実施形態４２～５２のいずれか１つに記載の化合物。
５５．該免疫系の該１つ以上の細胞が、好中球である、実施形態４２～５２のいずれか１つに記載の化合物。
５６．該免疫系のより多数の細胞のうちの１つが、マクロファージである、実施形態４２～５２のいずれか１つに記載の化合物。
５７．該リンカーがＰＥＧリンカーまたはＭａｌ－Ｄａｐリンカーである、実施形態４２～５６のいずれか１つに記載の化合物。
５８．該リンカーがＰＥＧリンカーである、実施形態５７に記載の化合物。
５９．該リンカーがＭａｌ－Ｄａｐリンカーである、実施形態５７に記載の化合物。
６０．該抗体がＩｇＧ重鎖定常領域と軽鎖定常領域とを含み、該定常領域が次の残基、すなわちＣＨ１ドメインにおける残基１２４、ＣＨ１ドメインにおける残基１５７、ＣＨ１ドメインにおける残基１６２、ＣＨ２ドメインにおける残基２６２、ＣＨ３ドメインにおける残基３７５、ＣＨ３ドメインにおける残基３７３、ＣＨ３ドメインにおける残基３９７、ＣＨ３ドメインにおける残基４１５、Ｃカッパドメインにおける残基１５６、Ｃカッパドメインにおける残基１７１、Ｃカッパドメインにおける残基１９１、Ｃカッパドメインにおける残基１９３、Ｃカッパドメインにおける残基２０２、またはＣカッパドメインにおける残基２０８のうちの少なくとも１つにある操作されたシステインを含む、実施形態４２～５８のいずれか１つに記載の化合物。
６１．該抗体が、ＣＨ１ドメインにおける残基１２４にシステインを含み、ＣＨ１ドメインにおける残基１５７および１６２ならびにＣＨ３ドメインにおける残基３７５および３７８のうちの１つではあるが全てではない残基にシステインをさらに含む、実施形態６０に記載の化合物。
６２．該抗体がＣＨ１ドメインにおける残基１５７にシステインを含む、実施形態６１に記載の化合物。
６３．該抗体がＣＨ３ドメインにおける残基３７５にシステインを含む、実施形態６１に記載の化合物。
６４．該抗体がＣＨ３ドメインにおける残基３７８にシステインを含む、実施形態６１に記載の化合物。
６５．該ＩｇＧ重鎖定常領域が、ヒト、マウス、ラット、またはウサギＩｇＧ定常領域である、実施形態４２～６４のいずれか１つに記載の化合物。
６６．該ＩｇＧ重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４アイソタイプである、実施形態６５に記載の化合物。
６７．該ＩｇＧ重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１である、実施形態６６に記載の化合物。
６８．重鎖定常領域が、配列番号１７、１８、１９、または５２のアミノ酸配列によって与えられるヒトＩｇＧ１である、実施形態６７に記載の化合物。
６９．該重鎖定常領域が、配列番号２０、２１、または５３のアミノ酸配列によって与えられるヒトＩｇＧ１である、実施形態６７に記載の化合物。
７０．該ＩｇＧ１重鎖定常領域が、残基２４７で置換されたイソロイシンと、残基３３９で置換されたグルタミンと、場合により残基３３２で置換されたグルタミン酸とをさらに含む、実施形態６６～６９のいずれか１つに記載の化合物。
７１．該ＩｇＧ重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４である、実施形態６６に記載の化合物。
７２．該重鎖定常領域が、配列番号１２、１３、１４、５４、または５５のアミノ酸配列によって与えられるヒトＩｇＧ４である、実施形態７１に記載の化合物。
７３．該重鎖定常領域が、配列番号１５、１６、５６、または５７のアミノ酸配列によって与えられるヒトＩｇＧ４である、実施形態７１に記載の化合物。
７４．該ＩｇＧ４重鎖定常領域が、残基２２８で置換されたプロリンと、残基２３４で置換されたアラニンと、残基２３５で置換されたアラニンと、残基３３９で置換されたグルタミンとをさらに含む、実施形態７１～７３のいずれか１つに記載の抗体。
７５．該化学誘引物質が、ｆ－Ｍｅｔペプチド、小分子ＦＰＲ－１アゴニスト、ＰＲＲアゴニスト、ペプチド模倣体、Ｎ－ウレイド－ペプチド、または細菌糖である、実施形態４２～７４のいずれか１つに記載の化合物。
７６．該化学誘引物質が、Ｎ－ホルミルメチオニンペプチドである、実施形態７５に記載の化合物。
７７．該Ｎ－ホルミルペプチドが、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、または配列番号４１によって与えられる、実施形態７６に記載の化合物。
７８．該システインが、マレイミド－ＰＥＧリンカーを介して化学誘引物質に抱合されている、実施形態４２～７８のいずれか１つに記載の化合物。
７９．該システインが、次の式のマレイミド－ＰＥＧリンカーを介して化学誘引物質に抱合されており、
Figure 0007073487000038
 該リンカーが、該システインへのチオエーテル結合を介して該抗体に、かつペプチドのＣ末端リジンのイプシロンアミノ基のアミド結合を介して該化学誘引物質に共有結合しており、式中、ｎ＝２～２４である、実施形態７８に記載の化合物。
８０．ｎ＝１２である、実施形態７９に記載の化合物。
８１．実施形態４２～８０のいずれか１つに記載の抗体と、１つ以上の医薬上許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む、医薬組成物。
８２．固形癌または液性腫瘍を治療する方法であって、それを必要とする患者に、実施形態４２～８１のいずれか１つに記載の有効量の化合物またはその医薬組成物を投与することを含む、方法。
８３．乳癌、肺癌、前立腺癌、皮膚癌、大腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、筋肉癌、骨癌、中皮腫、血管癌、線維癌、白血病またはリンパ腫を治療するための、実施形態８２に記載の方法。
８４．療法における使用のための、実施形態４２～８０のいずれか１つに記載の化合物または塩。
８５．固形癌または液性腫瘍の治療における使用のための、実施形態４２～８０のいずれか１つに記載の化合物。
８６．乳癌、肺癌、前立腺癌、皮膚癌、大腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、筋肉癌、骨癌、中皮腫、血管癌、線維癌、白血病またはリンパ腫の治療における使用のための、実施形態４２～８０のいずれか１つに記載の化合物。
８７．化合物Ｒ－Ｐ１－Ｐ２－Ｐ３－ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２－Ｙであって、式中、
（ｉ）Ｒが、ＨＣ（＝Ｏ）－もしくはＲ１ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－であり、
（ｉｉ）Ｒ１が、置換もしくは非置換であってもよいＣ５～Ｃ１０アリールであり、
（ｉｉｉ）Ｐ１が、ＭｅｔもしくはＮｌｅであり、
（ｉｖ）Ｐ２が、ペプチドもしくはペプチド模倣体であり、
（ｖ）Ｐ３が、イプシロンアミノアシル化したリジンであり、
（ｖｉ）ｎが、６～２４の整数であり、
（ｖｉｉ）Ｙが、マレイミド、マレイミド－ジアミノプロピオン酸、ヨードアセトアミド、もしくはビニルスルホンである、化合物Ｒ－Ｐ１－Ｐ２－Ｐ３－ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２－Ｙ、
（ｖｉｉｉ）またはその塩。
８８．化合物Ｒ－Ｐ１－Ｐ２－ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２－Ｐ３―Ｙであって、式中、
（ｉ）Ｒが、ＨＣ（＝Ｏ）－もしくはＲ１ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－であり、
（ｉｉ）Ｒ１が、置換もしくは非置換であってもよいＣ５～Ｃ１０アリールであり、
（ｉｉｉ）Ｐ１が、ＭｅｔもしくはＮｌｅであり、
（ｉｖ）Ｐ２が、ペプチドもしくはペプチド模倣体であり、
（ｖ）Ｐ３が、イプシロンアミノアシル化したリジンであり、
（ｖｉ）ｎが、６～２４の整数であり、
（ｖｉｉ）Ｙが、マレイミド、マレイミド－ジアミノプロピオン酸、ヨードアセトアミドもしくはビニルスルホンである、化合物Ｒ－Ｐ１－Ｐ２－ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２－Ｐ３―Ｙ、
（ｖｉｉｉ）またはその塩。
８９．化合物Ｒ－Ｍｅｔ－Ｐ２－ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２－Ｘ５－Ｙであって、式中
（ｉ）Ｒが、ＨＣ（＝Ｏ）－もしくはＲ１ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－であり、
（ｉｉ）Ｒ１が、フェニル、４－クロロフェニル、４－メトキシフェニル、ｐ－トリル、ｍ－トリル、アリール、置換アリール、もしくは２－アリルであり、
（ｉｉｉ）Ｐ２が、ペプチドもしくはペプチド模倣体であり、
（ｉｖ）Ｘ５が、Ｃ２～Ｃ１０ジアミノアルキルであり、かつ
（ｖ）Ｙが、マレイミド、マレイミド－ジアミノプロピオン酸、ヨードアセトアミドもしくはビニルスルホンである、化合物Ｒ－Ｍｅｔ－Ｐ２－ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２－Ｘ５－Ｙ、
（ｘｉ）またはその塩。
９０．化合物［Ｒ－Ｐ１－Ｐ２－ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２－］２－Ｑ－Ｘ－Ｙであって、式中、
（ｉ）Ｒが、ＨＣ（＝Ｏ）－もしくはＲ１ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－であり、
（ｉｉ）Ｒ１が、置換もしくは非置換であってもよいＣ５～Ｃ１０アリールであり、
（ｉｉｉ）Ｐ１が、ＭｅｔもしくはＮｌｅであり、
（ｉｖ）Ｐ２が、ペプチドもしくはペプチド模倣体であり、
（ｖ）ｎが、６～２４の整数であり、
（ｖｉ）Ｑが、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、もしくはアルファアミノ基および側鎖アミノ基においてアシル化されることができる他のアミノ二官能性残基であり、
（ｖｉｉ）Ｘが、Ｃ２～Ｃ１０ジアミノアルキルであり、かつ
（ｖｉｉｉ）Ｙが、マレイミド、マレイミド－ジアミノプロピオン酸、ヨードアセトアミドもしくはビニルスルホンである、化合物［Ｒ－Ｐ１－Ｐ２－ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２－］２－Ｑ－Ｘ－Ｙ、
（ｉｘ）またはその塩。
９１．化合物［［Ｒ－Ｐ１－Ｐ２－ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２－］４－（Ｑ）２―Ｑ－Ｘ－Ｙであって、式中、
（ｉ）Ｒが、ＨＣ（＝Ｏ）－もしくはＲ１ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－であり、
（ｉｉ）Ｒ１が、置換もしくは非置換であってもよいＣ５～Ｃ１０アリールであり、
（ｉｉｉ）Ｐ１が、ＭｅｔもしくはＮｌｅであり、
（ｉｖ）Ｐ２が、ペプチドもしくはペプチド模倣体であり、
（ｖ）ｎが、６～２４の整数であり、
（ｖｉ）Ｑが、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、もしくはアルファアミノ基および側鎖アミノ基においてアシル化されることができる他のアミノ二官能性残基あり
（ｖｉｉ）Ｘが、Ｃ２～Ｃ１０ジアミノアルキルであり、かつ
（ｖｉｉｉ）Ｙが、マレイミド、マレイミド－ジアミノプロピオン酸、ヨードアセトアミドもしくはビニルスルホンである、化合物［［Ｒ－Ｐ１－Ｐ２－ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２－］４－（Ｑ）２―Ｑ－Ｘ－Ｙ、
（ｉｘ）またはその塩。
９２．化合物［［［Ｒ－Ｐ１－Ｐ２－ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２－］８－（Ｑ）４－（Ｑ）２－Ｑ－Ｘ－Ｙであって、式中、
（ｉ）Ｒが、ＨＣ（＝Ｏ）－もしくはＲ１ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－であり、
（ｉｉ）Ｒ１が、置換もしくは非置換であってもよいＣ５～Ｃ１０アリールであり、
（ｉｉｉ）Ｐ１が、ＭｅｔもしくはＮｌｅであり、
（ｉｖ）Ｐ２が、ペプチドもしくはペプチド模倣体であり、
（ｖ）ｎが、６～２４の整数であり、
（ｖｉ）Ｑが、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、もしくはアルファアミノ基および側鎖アミノ基でアシル化されることができる他のアミノ二官能性残基であり
（ｖｉｉ）Ｘが、Ｃ２～Ｃ１０ジアミノアルキルであり、かつ
（ｖｉｉｉ）Ｙが、マレイミド、マレイミド－ジアミノプロピオン酸、ヨードアセトアミドもしくはビニルスルホンである、化合物［［［Ｒ－Ｐ１－Ｐ２－ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２－］８－（Ｑ）４－（Ｑ）２－Ｑ－Ｘ－Ｙ、
（ｉｘ）またはその塩。
９３．Ｐ２が、Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４によって与えられ、かつ
（ｉ）Ｘ１が、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、ジエチルグリシン、またはジプロピルグリシンであり、
（ｉｉ）Ｘ２が、Ｐｈｅ、α－Ｍｅ－Ｐｈｅ、ＤＰｈｅ、４－Ｆ－Ｐｈｅ、２－Ｎａｌ、または１－Ｎａｌであり、
（ｉｉｉ）Ｘ３が、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、α－Ｍｅ－Ｌｅｕ、ＤＬｅｕ、または非存在であり、かつ
（ｉｖ）Ｘ４が、Ｇｌｕ、ＤＧｌｕ、γＧｌｕ、Ｇｌａ、または非存在である、実施形態８７～９２のいずれか１つに記載の化合物。
９４．該化合物が、チオエーテル結合を介して抗体または抗体フラグメントに共有結合することができる、実施形態８７～９３のいずれか１つに記載の化合物。
９５．該化合物が、ＣＨ１ドメインにおけるシステイン残基１２４、ＣＨ１ドメインにおける残基１５７、ＣＨ１ドメインにおける残基１６２、ＣＨ２ドメインにおける残基２６２、ＣＨ３ドメインにおける残基３７５、ＣＨ３ドメインにおける残基３７３、ＣＨ３ドメインにおける残基３９７、ＣＨ３ドメインにおける残基４１５、Ｃカッパドメインにおける残基１５６、Ｃカッパドメインにおける残基１７１、Ｃカッパドメインにおける残基１９１、Ｃカッパドメインにおける残基１９３、Ｃカッパドメインにおける残基２０２、またはＣカッパドメインにおける残基２０８のシステインでチオエーテル結合を介して抗体または抗体フラグメントに共有結合することができる、実施形態８７～９４のいずれか１つに記載の化合物。
９６．免疫系の１つ以上の細胞を誘引および／または活性化することができる、実施形態８７～９５のいずれか１つに記載の化合物にリンカーによって抱合された少なくとも１つのシステインを含有する抗体である化合物であって、該薬剤が、該抗体内の１つ以上のシステイン残基で該抗体に抱合されている、化合物。
配列
エミベツズマブ３７８Ｃ抱合体の抗体重鎖（配列番号１）
Figure 0007073487000039
 （位置３７３のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
エミベツズマブ１２４Ｃ抱合体の抗体重鎖（配列番号２）
Figure 0007073487000040
 （位置１２２のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
エミベツズマブ１２４Ｃ～３７８Ｃ抱合体の抗体重鎖（配列番号３）
Figure 0007073487000041
 （位置１２２のＸおよび位置３７３のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
エミベツズマブ１２４Ｃ～３７５Ｃ抱合体の抗体重鎖（配列番号４）
Figure 0007073487000042
 （位置１２２のＸおよび位置３７０のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
エミベツズマブ抱合体の抗体軽鎖（配列番号５）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＶＳＳＳＶＳＳＩＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＶＹＳＧＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＴＭａｂ１２４Ｃ～３７８Ｃ抱合体の抗体重鎖（配列番号６）
Figure 0007073487000043
 （位置１２７のＸと位置３８１のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
ＴＭａｂ抱合体の抗体軽鎖（配列番号７）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＡＭＥ１３３ １２４Ｃ～３７８Ｃ抱合体の抗体重鎖（配列番号８）
Figure 0007073487000044
 （位置１２８のＸおよび位置３８２のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
ＡＭＥ１３３抱合体の抗体軽鎖（配列番号９）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＳＳＶＰＹＩＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＡＴＳＡＬＡＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＷＬＳＮＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ヒトＩｇＧ１定常領域（配列番号１０）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ヒトＩｇＧ４定常領域（配列番号１１）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
ＩｇＧ４ １２４Ｃ抱合体の抗体重鎖定常領域（配列番号１２）
Figure 0007073487000045
 （位置７のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
ＩｇＧ４ ３７８Ｃ抱合体の抗体重鎖定常領域（配列番号１３）
Figure 0007073487000046
 （位置２５８のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオイミド結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
ＩｇＧ４ ３７５Ｃ抱合体の抗体重鎖定常領域（配列番号１４）
Figure 0007073487000047
 （位置２５５のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成により修飾されたシステイン残基である）
ＩｇＧ４ １２４Ｃ－３７８Ｃ抱合体の抗体重鎖定常領域（配列番号１５）
Figure 0007073487000048
 （位置７のＸおよび位置２５８のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
ＩｇＧ４ １２４Ｃ－３７５Ｃ抱合体の抗体重鎖定常領域（配列番号１６）
Figure 0007073487000049
 （位置７のＸおよび位置２５５のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
ＩｇＧ１ １２４Ｃ抱合体の抗体重鎖定常領域（配列番号１７）
Figure 0007073487000050
 （位置７のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
ＩｇＧ１ ３７８Ｃ抱合体の抗体重鎖定常領域（配列番号１８）
Figure 0007073487000051
 （位置２６１のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成により修飾されたシステイン残基である）
ＩｇＧ１ ３７５Ｃ抱合体の抗体重鎖定常領域（配列番号１９）
Figure 0007073487000052
 （位置２５８のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
ＩｇＧ１ １２４Ｃ－３７８Ｃ抱合体の抗体重鎖定常領域（配列番号２０）
Figure 0007073487000053
 （位置７のＸおよび位置２６１のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
ＩｇＧ１ １２４Ｃ～３７５Ｃ抱合体の抗体重鎖定常領域（配列番号２１）
Figure 0007073487000054
 （位置７のＸおよび位置２５８のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
ｆＭＬＦＸ（ペプチド－‘１８３）（配列番号２２）
（位置１のＭｅｔはホルミル化されている）
（位置４のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのアミド結合形成により修飾されたリジン残基である）
ｆＭＬＦＫ（配列番号２３）
（位置１のＭｅｔはホルミル化されている）
ＭＬＦＸ（ペプチド－‘８４４）（配列番号２４）
（位置４のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのアミド結合形成により修飾されたリジン残基である）
ＭＬＦＫ（配列番号２５）
ＭＥＴ４１５Ｃ抗体抱合体の抗体重鎖（配列番号２６）
Figure 0007073487000055
 （位置４１０のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成により修飾されたシステイン残基である）
ＭＥＴ１５６Ｃ抗体抱合体の抗体軽鎖（配列番号２７）
Figure 0007073487000056
 （位置１５７のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
ＭＥＴ１７１Ｃ抗体抱合体の抗体軽鎖（配列番号２８）
Figure 0007073487000057
 （位置１７２のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成により修飾されたシステイン残基である）
ＭＥＴ１９１Ｃ抗体抱合体の抗体軽鎖（配列番号２９）
Figure 0007073487000058
 （位置１９２のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
ＭＥＴ１９３Ｃ抗体抱合体の抗体軽鎖（配列番号３０）
Figure 0007073487000059
 （位置１９４のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
ＭＥＴ ２０２Ｃ抗体抱合体の抗体軽鎖（配列番号３１）
Figure 0007073487000060
 （位置２０３のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
ＭＥＴ２０８Ｃ抗体抱合体の抗体軽鎖（配列番号３２）
Figure 0007073487000061
 （位置２０９のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成により修飾されたシステイン残基である）
トラスツズマブ１２４Ｃ～１５７Ｃ抗体抱合体の抗体重鎖（配列番号３３）
Figure 0007073487000062
 （位置１２７のＸおよび位置１６０のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
１２４Ｃ～３７８Ｃ二重特異性抗体Ｉ抱合体の抗体重鎖Ａ（配列番号３４）
Figure 0007073487000063
 （位置１２６のＸおよび位置３８０のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
１２４Ｃ～３７８Ｃ二重特異性抗体Ｉ抱合体の抗体重鎖Ｂ（配列番号３５）
Figure 0007073487000064
 （位置１２８のＸおよび位置３８２のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
ｆＭＩＦＬＸ（ＦＲＭ－０２１）（配列番号３６）
（位置１のＭｅｔはホルミル化されている）
（位置５のＸは、加水分解されたマレイミド－ＰＥＧリンカーへのイプシロンアミド結合形成を介して修飾されたリジン残基側鎖である）
ｆＭＸＦＸ（ＦＲＭ－０２９）（配列番号３７）
（位置１のＭｅｔはホルミル化されている）
（位置２のＸはジエチルグリシンである）
（位置４のＸは、式（ＰＥＧ６）２－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ２のＰＥＧリンカーへのアミド結合形成によってＣ末端で結合したロイシン残基である）
ｆＭＸＦＸ（ＦＲＭ－０３０）（配列番号３８）
（位置１のＭｅｔはホルミル化されている）
（位置２のＸはジプロピルグリシンである）
（位置４のＸは、式（ＰＥＧ６）２－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ２のＰＥＧリンカーへのアミド結合形成によってＣ末端で結合したロイシン残基である）
ｆＭＩＸ（ＦＲＭ－０３１）（配列番号３９）
（位置１のＭｅｔはホルミル化されている）
（位置３のＸは、式ＰＥＧ１２－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ２のＰＥＧリンカーへのアミド結合形成によってＣ末端で結合したフェニルアラニン残基である）
ｆＭＩＦＸ（ＦＲＭ－０２３）（配列番号４０）
（位置１のＭｅｔはホルミル化されている）
（位置４のＸは、式ＰＥＧ１２－ＮＨ－（ＣＨ２）－ＮＨ２のＰＥＧリンカーへのアミド結合形成によってＣ末端で結合したロイシン残基である）
ｆＭＩＦＸ（ＦＲＭ－０３２）（配列番号４１）
（位置１のＭｅｔはホルミル化されている）
（位置４のＸは、式ＮＨ－（ＣＨ２）－ＮＨ－［（Ｍａｌ－Ｄａｐ（ＮＨ２）］のリンカーへのアミド結合形成よって修飾されたロイシン残基である）
ｆＮｌｅＬＸ（ＦＲＭ－００９）（配列番号４２）
（位置１のＮｌｅはホルミル化されている）
（位置３のＸは、式ＰＥＧ１２－Ｌｙｓ（マレイミド－プロピオニル）－ＯＨのリンカーへのアミド結合形成によってＣ末端で結合したフェニルアラニンである）
エミベツズマブ抱合体の抗体重鎖（配列番号４３）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＶＮＰＮＲＲＧＴＴＹＮＱＫＦＥＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＮＷＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
エミベツズマブ１５７Ｃ抗体抱合体の抗体重鎖（配列番号４４）
Figure 0007073487000065
 （位置１５５のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
エミベツズマブ１６２Ｃ抗体抱合体の抗体重鎖（配列番号４５）
Figure 0007073487000066
 （位置１６０のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
エミベツズマブ２６２Ｃ抗体抱合体の抗体重鎖（配列番号４６）
Figure 0007073487000067
 （位置２５７のＸは、マレイミドＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
エミベツズマブ３７５Ｃ抗体抱合体の抗体重鎖（配列番号４７）
Figure 0007073487000068
 （位置３７０のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
エミベツズマブ３９７Ｃ抗体抱合体の抗体重鎖（配列番号４８）
Figure 0007073487000069
 （位置３９２のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
エミベツズマブ１２４Ｃ－１５７Ｃ－３７８Ｃ抗体抱合体の抗体重鎖（配列番号４９）
Figure 0007073487000070
 （位置１２２のＸおよび位置１５５のＸおよび位置３７３のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
エミベツズマブ１２４Ｃ－１６２Ｃ－３７８Ｃ抗体抱合体の抗体重鎖（配列番号５０）
Figure 0007073487000071
 （位置１２２のＸおよび位置１６０のＸおよび位置３７３のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
Ｔｍａｂ（ＩＱＥ）１２４Ｃ－３７８Ｃ抗体抱合体の抗体重鎖（配列番号５１）
Figure 0007073487000072
 （位置１２７のＸと位置３８１のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
ＩｇＧ１ １５７Ｃ抱合体の抗体重鎖定常領域（配列番号５２）
Figure 0007073487000073
 （位置４０のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
ＩｇＧ１ １２４Ｃ－１５７Ｃ抱合体の抗体重鎖定常領域（配列番号５３）
Figure 0007073487000074
 （位置７のＸおよび位置４０のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
ＩｇＧ４ １５７Ｃ抱合体の抗体重鎖定常領域（配列番号５４）
Figure 0007073487000075
 （位置４０のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
ＩｇＧ４ １６２Ｃ抱合体の抗体重鎖定常領域（配列番号５５）
Figure 0007073487000076
 （位置４５のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
ＩｇＧ４ １２４Ｃ－１５７Ｃ－３７３Ｃ抱合体の抗体重鎖定常領域（配列番号５６）
Figure 0007073487000077
 （位置７のＸおよび位置４０のＸおよび位置２５８のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
ＩｇＧ４ １２４Ｃ－１６２Ｃ－３７３Ｃ抱合体の抗体重鎖定常領域（配列番号５７）
Figure 0007073487000078
 （位置７のＸおよび位置４５のＸおよび位置２５８のＸは、マレイミド－ＰＥＧリンカーへのチオエーテル結合形成によって修飾されたシステイン残基である）
二重特異性抗体Ｉ抱合体の抗体軽鎖Ａ（配列番号５８）
ＲＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡＷＹＱＤＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＩＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＹＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＷＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣ
二重特異性抗体Ｉ抱合体の抗体軽鎖Ｂ（配列番号５９）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＴＹＭＹＷＹＱＲＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＨＩＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

Claims (13)

  1. ＩｇＧ重鎖定常領域と軽鎖定常領域とを含む抗体であって、ＣＨ１ドメインにおける残基１２４にシステインならびにＣＨ３ドメインにおける残基３７８にシステインを含み、
    前記ＣＨ１ドメインにおける残基１５７、前記ＣＨ１ドメインにおける残基１６２、および前記ＣＨ３ドメインにおける残基３７５のうちの２個またはそれ以下にシステインをさらに含むか、または前記ＣＨ１ドメインにおける残基１５７および１６２ならびに前記ＣＨ３ドメインにおける残基３７５のいずれにもシステインを含まない、抗体。
  2. 前記ＣＨ１ドメインにおける残基１５７にシステインを含む、請求項１に記載の抗体。
  3. 前記ＣＨ３ドメインにおける残基３７５にシステインを含む、請求項１に記載の抗体。
  4. 前記ＩｇＧ重鎖定常領域が、ヒト、マウス、ラット、またはウサギＩｇＧ定常領域である、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
  5. 前記ＩｇＧ重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４アイソタイプである、請求項４に記載の抗体。
  6. 前記ＩｇＧ重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１である、請求項５に記載の抗体。
  7. 前記重鎖定常領域が、配列番号２０のアミノ酸配列によって与えられるヒトＩｇＧ１である、請求項１に記載の抗体。
  8. 前記ＩｇＧ１重鎖定常領域が、残基２４７で置換されたイソロイシンと、残基３３９で置換されたグルタミンとを含む、請求項６または７に記載の抗体。
  9. 前記ＩｇＧ１重鎖定常領域が、残基３３２で置換されたグルタミン酸をさらに含む、請求項８に記載の抗体。
  10. 前記ＩｇＧ重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４である、請求項５に記載の抗体。
  11. 前記重鎖定常領域が、配列番号１５のアミノ酸配列によって与えられるヒトＩｇＧ４である、請求項１に記載の抗体。
  12. 前記ＩｇＧ４重鎖定常領域が、残基２２８で置換されたプロリンと、残基２３４で置換されたアラニンと、残基２３５で置換されたアラニンとを含み、さらに残基３３９で置換されたグルタミンを含む、請求項１０または１１に記載の抗体。
  13. ２つの重鎖と２つの軽鎖を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体。
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