JP2024507677A - １つ又は複数の検出可能部分で標識された１つ又は複数のバイオマーカーを含む染色された生物学的検体 - Google Patents

１つ又は複数の検出可能部分で標識された１つ又は複数のバイオマーカーを含む染色された生物学的検体 Download PDF

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Abstract

本開示は、生物学的検体（例えば、生物学的試料に由来する単一の連続組織切片）を、染色をストリッピングすることも、生物学的検体の染色された連続組織切片の異なる画像を評価することも必要とせずに、同じ生物学的検体を１つ又は複数の検出可能部分で同時に標識しながら、１つ又は複数の日常的及び／又は特殊スタチン（ｓｔａｔｉｎ）で染色する方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、１つ又は複数の従来の色素で染色された生物学的検体に関し、生物学的検体は、１つ又は複数の検出可能部分で標識された１つ又は複数のバイオマーカーをさらに含む。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１月２５日に出願された米国仮特許出願第６３／１４１，０９１号の出願日の利益を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
開示の分野
本出願は、生物学的検体を１つ又は複数の従来の色素で染色し、生物学的検体内の１つ又は複数のバイオマーカーを１つ又は複数の検出可能部分で標識する方法に関し、従来の色素による染色及び１つ又は複数の検出可能部分によるバイオマーカーの標識は、同じ生物学的検体上で行われる。
開示の背景
免疫組織化学（ＩＨＣ）は、特定の抗原に特異的な抗体を使用して、生物学的試料中のタンパク質等の抗原を検出、局在化、及び／又は定量化するプロセスを指す。ＩＨＣは、特定のタンパク質が生物学的試料内のどこにあるかを正確に特定するという実質的な利点を提供する。組織自体を調べるのにも効果的な方法である。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、核酸を検出、局在化、及び定量化するプロセスを指す。ＩＨＣとＩＳＨは両方とも、組織（例えば新鮮凍結、ホルマリン固定、パラフィン包埋）及び細胞学的試料等のさまざまな生物学的試料に対して実施することができる。標的の認識は、標的が核酸であるか抗原であるかに関わらず、様々な標識（例えば、発色性、蛍光性、発光性、放射性）を使用して検出することができる。臨床現場で標的を確実に検出し、場所を特定し、定量化するには、診断目的で存在量の少ない細胞マーカーを確実に検出する機能がますます重要になるため、認識イベントの増幅が望まれている。例えば、単一の抗原検出イベントに応答してマーカーの部位に数百又は数千の標識分子を堆積させると、増幅を通じて、その認識イベントを検出する能力が増強される。
有害事象は、増大したバックグラウンドシグナルとして明らかな非特異的シグナル等の増幅を伴うことが多い。増加したバックグラウンドシグナルは、低いが臨床的に重要な発現に関連し得るかすかなシグナルを不明瞭にすることによって臨床分析を妨げる。したがって、認識事象（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｅｖｅｎｔ）の増幅が望ましいが、バックグラウンドシグナルの増加を制限する増幅方法が非常に望ましい。そのような方法の１つはチラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）であり、これは触媒レポーター堆積（ＣＡＲＤ）とも呼ばれている。米国特許第５，５８３，００１号は、検出可能な標識シグナルを増幅するために触媒レポーター堆積に依存する分析物依存性酵素活性化システムを使用して分析物を検出及び／又は定量する方法を開示している。ＴＳＡを利用する方法は、有意なバックグラウンドシグナル増幅をもたらさずに、ＩＨＣアッセイ及びＩＳＨアッセイから得られるシグナルを効果的に増加させる（例えば、チラミド増幅試薬に関する開示についてその全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１２／０１７１６６８号を参照されたい）。これらの増幅アプローチのための試薬は、堅牢な診断能力を提供するために臨床的に重要な標的に適用されている。
ＴＳＡは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とチラミドとの間の反応を利用する。Ｈ２Ｏ２の存在下で、チラミドは、タンパク質上の電子に富むアミノ酸残基と優先的に反応する高度に反応性で短命のラジカル中間体に変換される。ラジカル中間体の寿命が短いと、生成部位に近接した組織上のタンパク質にチラミドが共有結合し、離散的かつ特異的なシグナルを与える。次いで、共有結合した検出可能な標識を、種々の発色可視化技術及び／又は蛍光顕微鏡法によって検出することができる。
２０１５年２月２０日の国際出願日を有する「Ｑｕｉｎｏｎｅ Ｍｅｔｈｉｄｅ Ａｎａｌｏｇ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」と題する同時係属出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３５５６は、ＴＳＡのように、バックグラウンドシグナルを増加させることなくシグナル増幅を増加させるために使用することができる代替技術（「ＱＭＳＡ」）を記載している。実際、ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３５５６は、新規なキノンメチド類縁体前駆体、及び生物学的試料中の１つ又は複数の標的を検出する際にキノンメチド類縁体前駆体を使用する方法を記載している。そこでは、検出方法は、試料を検出プローブと接触させるステップ、次いで試料を酵素を含む標識コンジュゲートと接触させる工程を含むものとして記載される。酵素は、検出可能な標識を含むキノンメチド類縁体前駆体と相互作用して反応性キノンメチド類縁体を形成し、これが標的の近位又は直接に生物学的試料に結合する。次いで、検出可能な標識が検出される。
開示の簡単な概要
単一の生物学的試料に由来する異なる連続組織切片は、生物学的検体を１つ又は複数の従来の色素（例えば、ヘマトキシリン及びエオシン）で染色するとき、及び１つ又は複数のバイオマーカーの存在のために伝統的に使用される。例えば、第１の連続組織切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色して、生物学的検体の形態学的特徴を同定することができ；一方で、第２の連続組織切片中の１つ又は複数のバイオマーカーは、ＩＨＣアッセイ又はＩＳＨアッセイにおいて１つ又は複数の色素原又は蛍光団で標識され得る。異なる連続組織切片の使用の結果として、異なる染色された連続組織切片間には、正確な細胞間相関及び特徴間相関はない。
異なる連続組織切片の使用を避けるために、本明細書にそれぞれ記載される日常的染色及び／又は特殊染色を生物学的検体に適用し、撮像し、次いで生物学的検体からストリッピングすることができる。続いて、日常的染色又は特殊染色をストリッピングした同じ生物学的検体を、１つ又は複数のバイオマーカーの存在について染色し、次いで再撮像することができる。これは実現可能であるが、そのようなプロセスは、生成された任意の２つの画像内で評価のために同じ領域を再位置合わせする必要性を含む、かなりの時間及び労力を追加する。
本出願人は、染色剤をストリッピングすることも、生物学的検体の染色された連続組織切片の異なる画像を評価することも必要とせずに、同じ生物学的検体を１つ又は複数の検出可能部分で同時に標識しながら、生物学的検体（例えば、生物学的試料に由来する単一の連続組織切片）を１つ又は複数の日常的及び／又は特殊染色（ｓｔａｔｉｎ）で染色する方法を開発した。本出願人は、別個の連続組織切片が同じ細胞、細胞の一部又は組織形態を含まないので、本明細書に記載の方法が、別個の連続組織切片を有する別個のスライドの使用よりも正確な染色された生物学的検体の評価を提供することを提出する。
上記を考慮して、いくつかの実施形態では、本開示は、１つ又は複数の従来の色素で染色された生物学的検体（例えば、基材上に配置された単一の生物学的検体）に関し、生物学的検体は、１つ又は複数の検出可能部分で標識された１つ又は複数のバイオマーカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、本明細書に記載されるように、可視スペクトル外のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、クマリンコア、ヘプタメチンシアニンコア及びクロコネートコアからなる群より選択されるコアを含む。適切な検出可能部分の非限定的な例は、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、紫外スペクトル又は赤外スペクトルのいずれかの範囲内にピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の従来の色素は、可視色素であり、すなわち、可視スペクトル内に１つ又は複数のピーク吸光度波長を有し、例えば、約４００ｎｍ～約７００ｎｍの範囲の１つ又は複数のピーク吸光度波長、例えば、ヒトの眼の明所反応の外側の１つ又は複数のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、従来の色素は、ヘマトキシリン及び／又はエオシンである。他の実施形態では、従来の色素は、特殊染色と共に利用される色素を含む。
いくつかの実施形態では、本開示はまた、可視スペクトル内で検出可能な１つ又は複数の「日常的染色」（例えば、ヘマトキシリン及び／又はエオシン）で基材上に配置された生物学的検体を染色し、可視スペクトル外のピーク吸光度波長をそれぞれ有する１つ又は複数の検出可能部分で生物学的検体内の１つ又は複数のバイオマーカーをさらに標識する方法に関する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、クマリンコア、ヘプタメチンシアニンコア及びクロコネートコアからなる群より選択されるコアを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、紫外スペクトル（近紫外スペクトルを含む）又は赤外スペクトル（近赤外スペクトルを含む）のいずれかの範囲内にピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分はそれぞれ、約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超のピーク吸光度波長を有する。
いくつかの実施形態では、本開示はまた、光学顕微鏡法のための可視スペクトル内で一般に検出可能である１つ又は複数の「特殊染色」（例えば、鉄、ムチン、グリコーゲン、アミロイド、核酸などのための染色）で、基材上に配置された生物学的検体を染色し、生物学的検体内の１つ又は複数のバイオマーカーを、それぞれが特殊染色のスペクトルの一部（複数可）の外側にあるピーク吸光度波長を有する１つ又は複数の検出可能部分でさらに標識する方法にも関する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、クマリンコア、ヘプタメチンシアニンコア及びクロコネートコアからなる群より選択されるコアを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、紫外スペクトル（近紫外スペクトルを含む）又は赤外スペクトル（近赤外スペクトルを含む）のいずれかの範囲内にピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分はそれぞれ、約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超のピーク吸光度波長を有する。
本開示の第１の態様は、基材上に配置された生物学的検体内の１つ又は複数の標的を可視化する方法であって、第１のバイオマーカーを、約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超のいずれかの吸光度最大値（λｍａｘ）を有する第１の検出可能部分で標識すること；及び約４００ｎｍ～約７００ｎｍの１つ又は複数のピーク吸光度波長を有する少なくとも１つの従来の色素で基材上に配置された生物学的検体を染色することを含み、第１の検出可能部分のピーク吸光度波長と、１つ又は複数の従来の色素の１つ又は複数のピーク吸光度波長とが、少なくとも２０ｎｍ離れている。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、クマリンコア、ヘプタメチンシアニンコア及びクロコネートコアからなる群より選択されるコアを含む。
いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約１９０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約１８０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約１７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約１６０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約１４０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約１３０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約１２０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約１１０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約９０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約８０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約６０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約４０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のＦＷＨＭは、約６０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のＦＷＨＭは、約５０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のＦＷＨＭは、約４０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のピーク吸光度波長と、１つ又は複数の従来の色素の１つ又は複数のピーク吸光度波長とは、少なくとも１０ｎｍ離れている。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のピーク吸光度波長と、１つ又は複数の従来の色素の１つ又は複数のピーク吸光度波長とは、少なくとも１５ｎｍ離れている。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のピーク吸光度波長と、１つ又は複数の従来の色素の１つ又は複数のピーク吸光度波長とは、少なくとも２０ｎｍ離れている。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のピーク吸光度波長と、１つ又は複数の従来の色素の１つ又は複数のピーク吸光度波長とは、少なくとも２５ｎｍ離れている。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のピーク吸光度波長と、１つ又は複数の従来の色素の１つ又は複数のピーク吸光度波長とは、少なくとも３０ｎｍ離れている。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のピーク吸光度波長と、１つ又は複数の従来の色素の１つ又は複数のピーク吸光度波長とは、少なくとも３５ｎｍ離れている。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のピーク吸光度波長と、１つ又は複数の従来の色素の１つ又は複数のピーク吸光度波長とは、少なくとも４０ｎｍ離れている。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のピーク吸光度波長と、１つ又は複数の従来の色素の１つ又は複数のピーク吸光度波長とは、少なくとも４５ｎｍ離れている。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のピーク吸光度波長と、１つ又は複数の従来の色素の１つ又は複数のピーク吸光度波長とは、少なくとも５０ｎｍ離れている。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のピーク吸光度波長と、１つ又は複数の従来の色素の１つ又は複数のピーク吸光度波長とは、少なくとも５５ｎｍ離れている。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のピーク吸光度波長と、１つ又は複数の従来の色素の１つ又は複数のピーク吸光度波長とは、少なくとも６０ｎｍ離れている。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のピーク吸光度波長と、１つ又は複数の従来の色素の１つ又は複数のピーク吸光度波長とは、少なくとも７０ｎｍ離れている。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のピーク吸光度波長と、１つ又は複数の従来の色素の１つ又は複数のピーク吸光度波長とは、少なくとも８０ｎｍ離れている。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、クマリンコア、ヘプタメチンシアニンコア及びクロコネートコアからなる群より選択されるコアを含む。
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の従来の色素は、ヘマトキシリンを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の従来の色素はエオシンを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の従来の色素は、ヘマトキシリン及びエオシンを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、クマリンコア、ヘプタメチンシアニンコア及びクロコネートコアからなる群より選択されるコアを含む。
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の従来の色素は、酸性フクシン、アルシアンブルー８ＧＸ、アリザリンレッドＳ、オーラミンＯ、アゾカルミンＢ、アゾカルミンＧ、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、塩基性フクシン、ビスマルックブラウンＹ、ブリリアントクレシルブルー、ブリリアントグリーン、カルミン、クロラゾールブラックＥ、コンゴーレッド、クレシルバイオレット、クリスタルバイオレット、ダローレッド、エチルグリーン、ファストグリーンＦＣＦ、フルオレセインイソチオシアネート、ギムザ染色、インジゴカルミン、ヤヌスグリーンＢ、ジェンナー染色１８９９、ライトグリーンＳＦ、マラカイトグリーン、マーチウスイエロー、メチルオレンジ、メチルバイオレット２Ｂ、メチレンブルー、メチレンブルー、メチレンバイオレット（ベルンツェン）、ニュートラルレッド、ニグロシン、ナイルブルーＡ、ヌクレアファストレッド、オイルレッドＯ、オレンジＧ、オレンジＩＩ、オルセイン、パラロサニリン、フロキシンＢ、プロタルゴールＳ、ピロニンＢ、ピロニンＹ、レザズリン、ローズベンガル、サフラニンＯ、ズダンブラックＢ、ズダンＩＩＩ、ズダンＩＶ、テトラクロム染色（ＭａｃＮｅａｌ）、チオニン、トルイジンブルー、ワイゲルト１８７８、ライト染色及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーを第１の検出可能部分で標識することは、（ａ）生物学的検体を抗バイオマーカー一次抗体と接触させること；（ｂ）生物学的検体を、抗バイオマーカー一次抗体に特異的な抗特異的（ａｎｔｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｅｓ）二次抗体と接触させることであって、抗種（ａｎｔｉ－ｓｐｅｃｉｅｓ）抗体が、少なくとも１つの酵素に直接的又は間接的にコンジュゲートされている、抗特異的二次抗体と接触させること；並びに、（ｃ）生物学的検体を、（ｉ）第１の検出可能部分、及び（ｉｉ）チラミド部分、キノンメチド部分、又はチラミド部分若しくはキノンメチド部分の誘導体若しくは類似体を含む検出可能なコンジュゲートと接触させること、を含む。
いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーを第１の検出可能部分で標識することは、（ａ）生物学的検体を抗バイオマーカー一次抗体と接触させること；（ｂ）生物学的検体を、抗バイオマーカー抗体に特異的な抗特異的（ａｎｔｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｅｓ）二次抗体と接触させることであって、抗種（ａｎｔｉ－ｓｐｅｃｉｅｓ）抗体が、少なくとも１つの酵素に直接的又は間接的にコンジュゲートされている、抗特異的二次抗体と接触させること；（ｃ）生物学的検体を、（ｉ）クリックケミストリー反応に関与することができる一対の反応性官能基の第１のメンバー、及び（ｉｉ）チラミド部分、キノンメチド部分、又はチラミド部分若しくはキノンメチド部分の誘導体若しくは類似体を含む第１の組織反応性コンジュゲートと接触させること；並びに、（ｄ）生物学的検体を、（ｉ）第１の検出可能部分、及び（ｉｉ）一対の反応性官能基の第２のメンバーを含む検出可能なコンジュゲートと接触させること、を含む。
いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーはタンパク質バイオマーカーである。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーは、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、Ｋｉ－６７、ＣＤ３、ＣＤ８、Ｋｉ６７、ＣＤ５、ＣＤ２０、パンサイトケラチン、ＨＥＲ２、ＥＲ、ＰＲ、ｐ１６、ｐ６３、ｐ４０、ＴＴＦ－１、ナプシンＡ、シナプトフィシン、及びＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡから選択される。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーは核酸バイオマーカーである。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、クマリンコア、ヘプタメチンシアニンコア及びクロコネートコアからなる群より選択されるコアを含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、第２のバイオマーカーを第２の検出可能部分で標識することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の検出可能部分は、約２００ｎｍ未満（例えば、約１５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満など）のＦＷＨＭ及び約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超のいずれかの最大吸光度（λｍａｘ）を有し、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは異なる。いくつかの実施形態では、第２の検出可能部分は、紫外スペクトル内又は赤外スペクトル内にある。いくつかの実施形態では、第２の検出可能部分は、紫外スペクトル内にある。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、クマリンコア、ヘプタメチンシアニンコア及びクロコネートコアからなる群より選択されるコアを含む。
いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは、少なくとも１０ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは、少なくとも１５ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは、少なくとも２０ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは、少なくとも３０ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは、少なくとも３５ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは、少なくとも４０ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは、少なくとも４５ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは、少なくとも５０ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは、クマリンコア、ヘプタメチンシアニンコア及びクロコネートコアからなる群より選択されるコアを含む。
本開示の第２の態様は、基材上に配置された生物学的検体内の１つ又は複数の標的を可視化する方法であって、第１のバイオマーカーのマーカーを、クマリンコア、ヘプタメチンシアニンコア、及びクロコネートコアからなる群から選択されるコアを含む第１の検出可能部分で標識すること；及び約４００ｎｍ～約７００ｎｍの１つ又は複数のピーク吸光度波長を有する少なくとも１つの従来の色素で基材上に配置された生物学的検体を染色することを含み、第１の検出可能部分のピーク吸光度波長と、１つ又は複数の従来の色素の１つ又は複数のピーク吸光度波長とが、少なくとも２０ｎｍ離れている。
いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、紫外スペクトル内にある。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、赤外スペクトル内にある。
いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約４３０ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約４００ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約６７０ｎｍ超のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約７００ｎｍ超のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約４３０ｎｍ未満であるが約４００ｎｍ超のピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の従来の色素の１つ又は複数のピーク吸光度波長は、約４３０ｎｍ超である。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約６７０ｎｍ超であるが約７００ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の従来の色素の１つ又は複数のピーク吸光度波長は、約６７０ｎｍ未満である。
いくつかの実施形態では、本方法は、第２のバイオマーカーを第２の検出可能部分で標識することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の検出可能部分は、約２００ｎｍ未満（例えば、約１５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満など）のＦＷＨＭ及び約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超のいずれかの最大吸光度（λｍａｘ）を有し、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは異なる。いくつかの実施形態では、第２の検出可能部分は、紫外スペクトル内又は赤外スペクトル内にある。いくつかの実施形態では、第２の検出可能部分は、紫外スペクトル内にある。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは、少なくとも２０ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは、少なくとも３０ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する。
いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、
Figure 2024507677000002
Figure 2024507677000003
Figure 2024507677000004
Figure 2024507677000005
Figure 2024507677000006
Figure 2024507677000007
Figure 2024507677000008
Figure 2024507677000009
Figure 2024507677000010
Figure 2024507677000011
Figure 2024507677000012
からなる群から選択される。
式中、記号
Figure 2024507677000013
は、検出可能部分が、検出可能なコンジュゲートの別の部分にコンジュゲートされている部位を指す。
本開示の第３の態様は、第１の検出可能部分で標識された第１のバイオマーカーを含む基材上に配置された染色された生物学的検体（例えば、単一の染色された連続組織切片）であり；第１の検出可能部分は、約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超の最大吸光度（λｍａｘ）を有し；染色された生物学的検体は、少なくとも１つの従来の色素で染色されており、少なくとも１つの従来の色素は、可視スペクトル内に１つ又は複数のピーク吸光度波長を有する。
いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のＦＷＨＭは、約６０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のＦＷＨＭは、約５０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のＦＷＨＭは、約４０ｎｍ未満である。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの従来の色素は、ヘマトキシリンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの従来の色素は、エオシンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの従来の色素は、ヘマトキシリン及びエオシンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの従来の色素は、酸性フクシン、アルシアンブルー８ＧＸ、アリザリンレッドＳ、オーラミンＯ、アゾカルミンＢ、アゾカルミンＧ、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、塩基性フクシン、ビスマルックブラウンＹ、ブリリアントクレシルブルー、ブリリアントグリーン、カルミン、クロラゾールブラックＥ、コンゴーレッド、クレシルバイオレット、クリスタルバイオレット、ダローレッド、エチルグリーン、ファストグリーンＦＣＦ、フルオレセインイソチオシアネート、ギムザ染色、インジゴカルミン、ヤヌスグリーンＢ、ジェンナー染色１８９９、ライトグリーンＳＦ、マラカイトグリーン、マーチウスイエロー、メチルオレンジ、メチルバイオレット２Ｂ、メチレンブルー、メチレンブルー、メチレンバイオレット（ベルンツェン）、ニュートラルレッド、ニグロシン、ナイルブルーＡ、ヌクレアファストレッド、オイルレッドＯ、オレンジＧ、オレンジＩＩ、オルセイン、パラロサニリン、フロキシンＢ、プロタルゴールＳ、ピロニンＢ、ピロニンＹ、レザズリン、ローズベンガル、サフラニンＯ、ズダンブラックＢ、ズダンＩＩＩ、ズダンＩＶ、テトラクロム染色（ＭａｃＮｅａｌ）、チオニン、トルイジンブルー、ワイゲルト１８７８、ライト染色及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、染色された生物学的検体は、第２の検出可能部分で標識された第２のバイオマーカーをさらに含み、第２の検出可能部分は、約２００ｎｍ未満（例えば、約１５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満など）のＦＷＨＭ及び約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超のいずれかの最大吸光度（λｍａｘ）を有し、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは異なる。いくつかの実施形態では、第２の検出可能部分は、紫外スペクトル内又は赤外スペクトル内にある。いくつかの実施形態では、第２の検出可能部分は、紫外スペクトル内にある。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは、少なくとも２０ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは、少なくとも３０ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する。
いくつかの実施形態では、染色された生物学的検体は、第３の検出可能部分で標識された第３のバイオマーカーをさらに含み、第３の検出可能部分は、約２００ｎｍ未満（例えば、約１５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満など）のＦＷＨＭ及び約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超のいずれかの最大吸光度（λｍａｘ）を有し、第１の検出可能部分と、第２の検出可能部分と、第３の検出可能部分とは異なる。いくつかの実施形態では、第３の検出可能部分は、紫外スペクトル内又は赤外スペクトル内にある。いくつかの実施形態では、第３の検出可能部分は、紫外スペクトル内にある。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分と、第２の検出可能部分と、第３の検出可能部分とは、少なくとも２０ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分と、第２の検出可能部分と、第３の検出可能部分とは、少なくとも３０ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する。
本開示の第４の態様は、第１の検出可能部分で標識された第１のバイオマーカーを含む基材上に配置された染色された生物学的検体（例えば、単一の連続組織切片）であり；第１の検出可能部分は、約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超の最大吸光度（λｍａｘ）を有し；染色された生物学的検体は、少なくともヘマトキシリンで染色されている。いくつかの実施形態では、染色された生物学的検体は、エオシンでさらに染色される。
いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のＦＷＨＭは、約６０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のＦＷＨＭは、約５０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のＦＷＨＭは、約４０ｎｍ未満である。
いくつかの実施形態では、染色された生物学的検体は、ヘマトキシリン及びエオシン以外の少なくとも１つの従来の色素でさらに染色される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの従来の色素は、ヘマトキシリンを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの従来の色素は、酸性フクシン、アルシアンブルー８ＧＸ、アリザリンレッドＳ、オーラミンＯ、アゾカルミンＢ、アゾカルミンＧ、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、塩基性フクシン、ビスマルックブラウンＹ、ブリリアントクレシルブルー、ブリリアントグリーン、カルミン、クロラゾールブラックＥ、コンゴーレッド、クレシルバイオレット、クリスタルバイオレット、ダローレッド、エチルグリーン、ファストグリーンＦＣＦ、フルオレセインイソチオシアネート、ギムザ染色、インジゴカルミン、ヤヌスグリーンＢ、ジェンナー染色１８９９、ライトグリーンＳＦ、マラカイトグリーン、マーチウスイエロー、メチルオレンジ、メチルバイオレット２Ｂ、メチレンブルー、メチレンブルー、メチレンバイオレット（ベルンツェン）、ニュートラルレッド、ニグロシン、ナイルブルーＡ、ヌクレアファストレッド、オイルレッドＯ、オレンジＧ、オレンジＩＩ、オルセイン、パラロサニリン、フロキシンＢ、プロタルゴールＳ、ピロニンＢ、ピロニンＹ、レザズリン、ローズベンガル、サフラニンＯ、ズダンブラックＢ、ズダンＩＩＩ、ズダンＩＶ、テトラクロム染色（ＭａｃＮｅａｌ）、チオニン、トルイジンブルー、ワイゲルト１８７８、ライト染色及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、染色された生物学的検体は、第２の検出可能部分で標識された第２のバイオマーカーをさらに含み、第２の検出可能部分は、約２００ｎｍ未満（例えば、約１５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満など）のＦＷＨＭ及び約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超のいずれかの最大吸光度（λｍａｘ）を有し、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは異なる。いくつかの実施形態では、第２の検出可能部分は、紫外スペクトル内又は赤外スペクトル内にある。いくつかの実施形態では、第２の検出可能部分は、紫外スペクトル内にある。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは、少なくとも２０ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは、少なくとも３０ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する。
本開示の第５の態様は、第１の検出可能部分で標識された第１のバイオマーカーを含む基材上に配置された染色された生物学的検体（例えば、単一の連続組織切片）であり；第１の検出可能部分は、約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超の最大吸光度（λｍａｘ）を有し；染色された生物学的検体は、可視スペクトル内で検出可能な１つ又は複数の成分を含む少なくとも１つの特殊染色で染色されている。
いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のＦＷＨＭは、約６０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のＦＷＨＭは、約５０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のＦＷＨＭは、約４０ｎｍ未満である。
いくつかの実施形態では、特殊染色は、ファンギーソン染色である。いくつかの実施形態では、特殊染色は、トルジンブルーを含む。いくつかの実施形態では、特殊染色は、アルケインブルーを含む。いくつかの実施形態では、特殊染色は、マッソントリクロームを含む。いくつかの実施形態では、特殊染色は、アザントリクロームを含む。いくつかの実施形態では、特殊染色は、抗酸を含む。
いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、クマリンコア、ヘプタメチンシアニンコア及びクロコネートコアからなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、染色された生物学的検体は、第２の検出可能部分で標識された第２のバイオマーカーをさらに含み、第２の検出可能部分は、約２００ｎｍ未満（例えば、約１５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満など）のＦＷＨＭ及び約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超のいずれかの最大吸光度（λｍａｘ）を有し、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは異なる。いくつかの実施形態では、第２の検出可能部分は、紫外スペクトル内又は赤外スペクトル内にある。いくつかの実施形態では、第２の検出可能部分は、紫外スペクトル内にある。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、クマリンコア、ヘプタメチンシアニンコア及びクロコネートコアからなる群より選択される。
本開示の第６の態様は、第１の検出可能部分で標識された第１のバイオマーカーを含む基材上に配置された染色された生物学的検体であり、第１の検出可能部分は、約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超の最大吸光度（λｍａｘ）を有し；染色された生物学的検体は、少なくとも１つの従来の色素で染色されており、少なくとも１つの従来の色素は、可視スペクトル内に１つ又は複数のピーク吸光度波長を有し、生物学的検体は、生物学的検体を、第１のバイオマーカーに特異的な第１の一次抗体と接触させること；生物学的検体を、第１の一次抗体に特異的な第１の二次抗体と接触させることであって、第１の二次抗体は酵素にコンジュゲートされている、第１の一次抗体に特異的な第１の二次抗体と接触させること；並びに、生物学的検体を、（ａ）チラミド部分、キノンメチド部分、又はチラミド部分若しくはキノンメチド部分の誘導体若しくは類似体；及び（ｂ）第１の検出可能部分を含む第１の検出可能なコンジュゲートと接触させることによって調製される。
いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のＦＷＨＭは、約６０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のＦＷＨＭは、約５０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のＦＷＨＭは、約４０ｎｍ未満である。
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の従来の色素は、ヘマトキシリンを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の従来の色素はエオシンを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の従来の色素は、ヘマトキシリン及びエオシンを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の従来の色素は、酸性フクシン、アルシアンブルー８ＧＸ、アリザリンレッドＳ、オーラミンＯ、アゾカルミンＢ、アゾカルミンＧ、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、塩基性フクシン、ビスマルックブラウンＹ、ブリリアントクレシルブルー、ブリリアントグリーン、カルミン、クロラゾールブラックＥ、コンゴーレッド、クレシルバイオレット、クリスタルバイオレット、ダローレッド、エチルグリーン、ファストグリーンＦＣＦ、フルオレセインイソチオシアネート、ギムザ染色、インジゴカルミン、ヤヌスグリーンＢ、ジェンナー染色１８９９、ライトグリーンＳＦ、マラカイトグリーン、マーチウスイエロー、メチルオレンジ、メチルバイオレット２Ｂ、メチレンブルー、メチレンブルー、メチレンバイオレット（ベルンツェン）、ニュートラルレッド、ニグロシン、ナイルブルーＡ、ヌクレアファストレッド、オイルレッドＯ、オレンジＧ、オレンジＩＩ、オルセイン、パラロサニリン、フロキシンＢ、プロタルゴールＳ、ピロニンＢ、ピロニンＹ、レザズリン、ローズベンガル、サフラニンＯ、ズダンブラックＢ、ズダンＩＩＩ、ズダンＩＶ、テトラクロム染色（ＭａｃＮｅａｌ）、チオニン、トルイジンブルー、ワイゲルト１８７８、ライト染色及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、紫外スペクトル内にある。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、赤外スペクトル内にある。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約４３０ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約４００ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約６７０ｎｍ超のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約７００ｎｍ超のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約４３０ｎｍ未満であるが約４００ｎｍ超のピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の従来の色素の１つ又は複数のピーク吸光度波長は、約４３０ｎｍ超である。
いくつかの実施形態では、染色された生物学的検体は、第２の検出可能部分で標識された第２のバイオマーカーをさらに含み、第２の検出可能部分は、約２００ｎｍ未満（例えば、約１５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満など）のＦＷＨＭ及び約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超の最大吸光度（λｍａｘ）を有する。いくつかの実施形態では、染色された生物学的検体は、生物学的検体を、第２のバイオマーカーに特異的な第２の一次抗体と接触させること；生物学的検体を、第２の一次抗体に特異的な第２の二次抗体と接触させることであって、第２の二次抗体は酵素にコンジュゲートされている、第２の一次抗体に特異的な第２の二次抗体と接触させること；並びに、生物学的検体を、（ａ）チラミド部分、キノンメチド部分、又はチラミド部分若しくはキノンメチド部分の誘導体若しくは類似体；及び（ｂ）第２の検出可能部分を含む第２の検出可能なコンジュゲートと接触させることによって調製される。
本開示の第７の態様は、第１の検出可能部分で標識された第１のバイオマーカーを含む基材上に配置された染色された生物学的検体であり、第１の検出可能部分は、約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超の最大吸光度（λｍａｘ）を有し；染色された生物学的検体は、少なくとも１つの従来の色素で染色されており、少なくとも１つの従来の色素は、可視スペクトル内に１つ又は複数のピーク吸光度波長を有し、生物学的検体は、生物学的検体を、第１のバイオマーカーに特異的な第１の一次抗体と接触させること；生物学的検体を、第１の一次抗体に特異的な第１の二次抗体と接触させることであって、第１の二次抗体は酵素にコンジュゲートされている、第１の一次抗体に特異的な第１の二次抗体と接触させること；生物学的検体を、（ａ）チラミド部分、キノンメチド部分、又はチラミド部分若しくはキノンメチド部分の誘導体若しくは類似体；及び（ｂ）クリックケミストリー反応に関与することができる第１の反応性官能基を含む第１の組織反応性部分と接触させること；生物学的検体を、（ａ）第１の検出可能部分；及び（ｂ）第２の反応性官能基を含む第１の検出可能なコンジュゲートと接触させることによって、調製される。
いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のＦＷＨＭは、約６０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のＦＷＨＭは、約５０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分のＦＷＨＭは、約４０ｎｍ未満である。
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の従来の色素は、ヘマトキシリンを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の従来の色素はエオシンを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の従来の色素は、ヘマトキシリン及びエオシンを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の従来の色素は、酸性フクシン、アルシアンブルー８ＧＸ、アリザリンレッドＳ、オーラミンＯ、アゾカルミンＢ、アゾカルミンＧ、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、塩基性フクシン、ビスマルックブラウンＹ、ブリリアントクレシルブルー、ブリリアントグリーン、カルミン、クロラゾールブラックＥ、コンゴーレッド、クレシルバイオレット、クリスタルバイオレット、ダローレッド、エチルグリーン、ファストグリーンＦＣＦ、フルオレセインイソチオシアネート、ギムザ染色、インジゴカルミン、ヤヌスグリーンＢ、ジェンナー染色１８９９、ライトグリーンＳＦ、マラカイトグリーン、マーチウスイエロー、メチルオレンジ、メチルバイオレット２Ｂ、メチレンブルー、メチレンブルー、メチレンバイオレット（ベルンツェン）、ニュートラルレッド、ニグロシン、ナイルブルーＡ、ヌクレアファストレッド、オイルレッドＯ、オレンジＧ、オレンジＩＩ、オルセイン、パラロサニリン、フロキシンＢ、プロタルゴールＳ、ピロニンＢ、ピロニンＹ、レザズリン、ローズベンガル、サフラニンＯ、ズダンブラックＢ、ズダンＩＩＩ、ズダンＩＶ、テトラクロム染色（ＭａｃＮｅａｌ）、チオニン、トルイジンブルー、ワイゲルト１８７８、ライト染色及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、紫外スペクトル内にある。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、赤外スペクトル内にある。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約４３０ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約４００ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約６７０ｎｍ超のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約７００ｎｍ超のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、約４３０ｎｍ未満であるが約４００ｎｍ超のピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の従来の色素の１つ又は複数のピーク吸光度波長は、約４３０ｎｍ超である。
いくつかの実施形態では、染色された生物学的検体は、第２の検出可能部分で標識された第２のバイオマーカーをさらに含み、第２の検出可能部分は、約２００ｎｍ未満（例えば、約１５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満など）のＦＷＨＭ及び約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超の最大吸光度（λｍａｘ）を有する。いくつかの実施形態では、染色された生物学的検体は、生物学的検体を、第１のバイオマーカーに特異的な第２の一次抗体と接触させること；生物学的検体を、第２の一次抗体に特異的な第２の二次抗体と接触させることであって、第２の二次抗体は酵素にコンジュゲートされている、第２の一次抗体に特異的な第２の二次抗体と接触させること；生物学的検体を、（ａ）チラミド部分、キノンメチド部分、又はチラミド部分若しくはキノンメチド部分の誘導体若しくは類似体；及び（ｂ）クリックケミストリー反応に関与することができる第１の反応性官能基を含む第２の組織反応性部分と接触させること；生物学的検体を、（ａ）第２の検出可能部分；及び（ｂ）第２の反応性官能基を含む第２の検出可能なコンジュゲートと接触させることによって、調製される。
本特許又は出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれている。この特許又は特許出願の出版物のカラー図面付きのコピーは、要求と必要な料金の支払いに応じて庁に提供される。
図１Ａ及び図１Ｂは、本開示の一実施形態による、生物学的試料中の１つ又は複数の従来の色素及び１つ又は複数の検出可能部分で標識された１つ又は複数のバイオマーカーに対応するシグナルを検出する方法を示す。 図１Ａ及び図１Ｂは、本開示の一実施形態による、生物学的試料中の１つ又は複数の従来の色素及び１つ又は複数の検出可能部分で標識された１つ又は複数のバイオマーカーに対応するシグナルを検出する方法を示す。 図２Ａは、本開示の一実施形態による、検出可能部分で生物学的検体中の１つ又は複数のバイオマーカーを標識する方法を示す。 図２Ｂは、本開示の一実施形態による、検出可能部分で生物学的検体中の１つ又は複数のバイオマーカーを標識する方法を示す。 図３は、本開示の一実施形態による、（ｉ）検出可能部分、及び（ｉｉ）チラミド部分、チラミド部分の誘導体、キノンメチド部分、又はキノンメチド部分の誘導体を含む検出可能なコンジュゲートを利用する、生物学的試料中の１つ又は複数の従来の染色及び１つ又は複数の検出可能部分で標識された１つ又は複数のバイオマーカーに対応するシグナルを検出する方法を示す。 図４は、本開示の一実施形態によるキノンメチド部分を含むコンジュゲートの堆積を示す。 図５は、本開示の一実施形態によるチラミド部分を含むコンジュゲートの堆積を示す。 図６は、本開示の一実施形態による、（ｉ）検出可能部分、及び（ｉｉ）クリックケミストリー反応に関与することができる反応性官能基を含む検出可能なコンジュゲートを利用する、生物学的試料中の１つ又は複数の従来の染色及び１つ又は複数のバイオマーカーに対応するシグナルを検出する方法を示す。 図７は、本開示の一実施形態によるキノンメチド部分を含むコンジュゲートの堆積を示す。 図８は、本開示の一実施形態によるチラミド部分を含むコンジュゲートの堆積を示す。 図９は、ヘマトキシリン及びエオシンの吸光度及び対応する視覚応答を示し、ヘマトキシリン及びエオシンが可視スペクトルにわたって吸収するが、吸光度は深青色／ＵＶで減少し、近ＩＲで最小であることを示す。 図１０Ａ～図１０Ｃは、いくつかの検出可能部分のピーク吸光度波長を示す。特に、図１０Ａ及び図１０Ｂは、ヘマトキシリン及びエオシンと比較して、いくつかの検出可能部分のピーク吸光度波長を示す。 図１０Ａ～図１０Ｃは、いくつかの検出可能部分のピーク吸光度波長を示す。特に、図１０Ａ及び図１０Ｂは、ヘマトキシリン及びエオシンと比較して、いくつかの検出可能部分のピーク吸光度波長を示す。 図１０Ａ～図１０Ｃは、いくつかの検出可能部分のピーク吸光度波長を示す。特に、図１０Ａ及び図１０Ｂは、ヘマトキシリン及びエオシンと比較して、いくつかの検出可能部分のピーク吸光度波長を示す。 図１１は、ヘマトキシリン＋エオシン（「Ｈ＆Ｅ」）で染色し、Ｃｙ７（シアニン７）色素原を使用してシナプトフィジンの存在についてＩＨＣアッセイで染色した、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）正常膵臓組織を透過した光のモノクロ画像を示す図である。左側の画像は５１３ｎｍ ＬＥＤで照射され、吸光度は主にエオシンに起因する。中央の画像は６２０ｎｍ ＬＥＤで照射され、吸光度は主にヘマトキシリンに起因する。右側の画像は７７０ｎｍ ＬＥＤで照射され、吸光度は主にＣｙ７に起因し、シナプトフィジン発現を示す。 図１２は、シナプトフィジンＩＨＣ（Ｃｙ７色素原を使用）及びＨ＆Ｅの両方で染色したＦＦＰＥ正常膵臓組織のカラー合成画像を提供する。左側の合成画像は、顕微鏡の接眼鏡を通して白色光下で見たときの視覚的外観を模倣する５１３ ｎｍ（主にエオシンによって吸収される）及び６２０ｎｍ（主にヘマトキシリンによって吸収される）で透過した光から形成される。右側の合成画像は、左側のＨ＆Ｅ合成画像に、７７０ｎｍで透過した（Ｃｙ７によって吸収される）シナプトフィジン発現を示す不可視光を加えることによって形成される。 図１３は、ＤＣＣ色素原を使用したＣＤ２０ ＩＨＣ、Ｃｙ７色素原を使用したＣＤ ８ ＩＨＣ、及びＨ＆Ｅで染色したＦＦＰＥ扁桃組織を透過した光のモノクロ画像を示す。左上の画像は５１３ｎｍ ＬＥＤで照射され、吸光度は主にエオシンに起因する。右上の画像は６２０ｎｍ ＬＥＤで照射され、吸光度は主にヘマトキシリンに起因する。左下の画像は４１５ｎｍ ＬＥＤで照射され、吸光度は主にＤＣＣに起因し、ＣＤ２０発現を示す。右下の画像は７７０ｎｍ ＬＥＤで照射され、吸光度は主にＣｙ７に起因し、ＣＤ８発現を示す。 図１４は、ＤＣＣ色素原を使用したＣＤ２０ ＩＨＣ、Ｃｙ７色素原を使用したＣＤ８ ＩＨＣ、及びＨ＆Ｅで染色したＦＦＰＥ扁桃組織のカラー合成画像を示す。左側の合成画像は、顕微鏡の接眼鏡を通して白色光下で見たときの視覚的外観を模倣する５１３ ｎｍ（主にエオシンによって吸収される）及び６２０ｎｍ（主にヘマトキシリンによって吸収される）で透過した光から形成される。中央の合成画像は、左側のＨ＆Ｅ合成画像に、４１５ｎｍで透過し（主にＤＣＣによって吸収される）ＣＤ２０発現を示す不可視光（擬似的に色付けされた黒色）を加えることによって形成される。右側の合成画像は、左側のＨ＆Ｅ合成画像に、７７０ｎｍで透過した（Ｃｙ７によって吸収される）ＣＤ８発現を示す不可視光（疑似的に色付けされた黒色）を加えることによって形成される。 図１５は、ＤＣＣ色素原を使用したＣＤ２０ ＩＨＣ、Ｃｙ７色素原を使用したＣＤ８ ＩＨＣ、及びＨ＆Ｅで染色したＦＦＰＥ扁桃組織の吸光度スペクトルを提供し、ＤＣＣ及びＣｙ７吸光度が、強いヘマトキシリン及びエオシン吸光度から十分に分離され、区別可能であることを示す。 図１６は、ＨＣＣＡ色素原を使用したＣＤ３ ＩＨＣ、Ｃｙ７色素原を使用したＣＤ８ ＩＨＣ、及びＨ＆Ｅで染色したＦＦＰＥ結腸腫瘍組織を透過した光のモノクロ画像を示す。左上の画像は３９０ｎｍ ＬＥＤで照射され、吸光度は主にＨＣＣＡに起因し、ＣＤ３発現を示す。右上の画像は７７０ｎｍ ＬＥＤで照射され、吸光度はＣｙ７に起因し、ＣＤ８発現を示す。左舌の画像は５１３ｎｍ ＬＥＤで照射され、吸光度は主にエオシンに起因する。右上の画像は６２０ｎｍ ＬＥＤで照射され、吸光度は主にヘマトキシリンに起因する。 図１７は、ＨＣＣＡ色素原を使用したＣＤ３ ＩＨＣ、Ｃｙ７色素原を使用したＣＤ８ ＩＨＣ、及びＨ＆Ｅで染色したＦＦＰＥ結腸腫瘍組織のカラー合成画像を示す。左上の合成画像は、顕微鏡の接眼鏡を通して白色光下で見たときの視覚的外観を模倣する５１３ ｎｍ（主にエオシンによって吸収される）及び６２０ｎｍ（主にヘマトキシリンによって吸収される）で透過した光から形成される。右上の合成画像は、Ｈ＆Ｅ合成画像に、３９０ｎｍで透過し（主にＨＣＣＡによって吸収される）ＣＤ３発現を示す不可視光（擬似的に色付けされた黒色）を加えることによって形成される。Ｈ＆Ｅ吸光度を低下させてＣＤ３染色とのコントラストを改善する。左下の合成画像は、Ｈ＆Ｅ合成画像に、７７０ｎｍで透過した（Ｃｙ７によって吸収される）ＣＤ８発現を示す不可視光（疑似的に色付けされた黒色）を加えることによって形成される。Ｈ＆Ｅ吸光度を減少させてＣＤ３染色とのコントラストを改善する。右下の合成画像は、ＣＤ３モノクロ画像（擬似的に色付けされたマゼンタ色）と、ＣＤ８モノクロ画像（擬似的に色付けされたシアン色）とを組み合わせることによって形成された場合、ＣＤ３＋／ＣＤ８－細胞をマゼンタとして表示し、ＣＤ３＋／ＣＤ８＋細胞をＣＤ３及びＣＤ８の共発現に起因して青色の加法色として表示する。ＣＤ８はｔ細胞上で単独で発現されないので、シアン細胞がないことに留意されたい。 図１８は、Ｃｙ７色素原を使用したＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）ＩＨＣ及びＨ＆Ｅで染色したＦＦＰＥ乳房腫瘍異種移植片に記録した、異なるカラー画像の不透明度を有する２カメラシステムを使用したカラーカメラ（可視白色光照明）及びモノクロカメラ（７７０ｎｍ ＬＥＤ照明）画像のオーバーレイを示す。左から右へのオーバーレイ画像は、１００％のカラー画像不透明度（Ｈ＆Ｅ染色のみが見える）から、２つの中間レベルの不透明度で、０％のカラー画像不透明度（Ｃｙ７染色のみが見え、ＥＲＢＢ２発現を同定する）まで進行する。 図１９は、従来のパパニコロウ（ＰＡＰ）染色で染色した子宮頸部細胞診検体の吸光度スペクトルを提供し、ＰＡＰ染色は可視スペクトルにわたって吸収するが、吸光度は深青色／ＵＶで減少し、近ＩＲでは最小であることを示す。 図２０は、２カメラシステムで記録された、ＤＣＣ色素原を使用したＫｉ６７ ＩＨＣ、Ｃｙ７色素原を使用したｐ１６ ＩＨＣ、及びＰＡＰ染色で染色された子宮頸部細胞診検体の画像を示す。左上の画像は、ＰＡＰ染色を示す白色光照射下でカラーカメラを用いて記録された。上部中央画像は、吸光度が主にＤＣＣに起因し、Ｋｉ６７発現を示す、４０５ｎｍ ＬＥＤで照明されたモノクロカメラを用いて記録された。右上の画像は、吸光度がＣｙ７に起因し、ｐ６３発現を示す、７７０ｎｍ ＬＥＤで照明したモノクロカメラを用いて記録された。画像の右下象限における細胞の長いクラスタは、異常を示すＫｉ６７及びｐ１６の両方の発現を示す。下の画像は、Ｋｉ６７及びｐ１６画像を擬似着色と組み合わせることによって構築されたカラー合成である。左下の画像は、Ｋｉ６７擬似着色マゼンタ及びｐ１６擬似着色シアンを示す。異常細胞はより暗く、各細胞における相対的発現レベルに応じてマゼンタから青（加法色）からシアンまでの色の範囲である。右下の画像は、Ｋｉ６７擬似着色赤及びｐ１６擬似着色を示し、従来の色素原を使用した市販のアッセイの視覚的色を模倣している。 図２１は、２カメラシステムで記録された、ＤＣＣ色素原を使用したＫｉ６７ ＩＨＣ、Ｃｙ７色素原を使用したｐ１６ ＩＨＣ、及びＰＡＰ染色で染色された子宮頸部細胞診スライドの画像を提供する。左上の画像は、ＰＡＰ染色を示す白色光照射下でカラーカメラを用いて記録された。上部中央画像は、吸光度が主にＤＣＣに起因し、Ｋｉ６７発現を示す、４０５ｎｍ ＬＥＤで照明されたモノクロカメラを用いて記録された。右上の画像は、吸光度がＣｙ７に起因し、ｐ６３発現を示す、７７０ｎｍ ＬＥＤで照明したモノクロカメラを用いて記録された。画像の中央左部分の４つの細胞のクラスターは、異常を示すＫｉ６７及びｐ１６の両方の発現を示す。 図２２は、いくつかの従来の色素、例えば、Ａｃｉｄ Ｆａｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＡＦＢ）、Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ Ｂｌｕｅ（Ｔｒｉ Ｂｌｕｅ）、Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ Ｇｒｅｅｎ（Ｔｒｉ Ｇｒｅｅｎ）、Ｊｏｎｅｓ Ｈ＆Ｅ Ｊｏｎｅｓ ＨＥ）及びＪｏｎｅｓ Ｌｉｇｈｔ Ｇｒｅｅｎ（Ｊｏｎｅｓ ＬＧ）を含む特殊染色に使用される従来の色素の吸光度スペクトルを示す。 図２３は、２カメラシステムで記録された、Ｃｙ７色素原を使用してＭＡＲＴ－１／メランＡを標的とするＩＨＣ及びＨ＆Ｅの両方で染色されたメラノーマＦＦＰＥ組織の画像を示す。左側の画像は、Ｈ＆Ｅ染色及び褐色メラニン色素の存在を示す白色光照明下でカラーカメラで記録されている。右側の画像は、７７０ｎｍ ＬＥＤで照明されたモノクロカメラで記録されており、ＭＡＲＴ １／メラニンＡ染色及びメラニン干渉の減少を示している。 図２４は、２カメラシステムで記録された、Ｃｙ７色素原を使用したＩＳＨ標的化カッパｍＲＮＡ及びＨ＆Ｅの両方で染色されたＦＦＰＥ扁桃組織の画像を示す。左側の画像は、Ｈ＆Ｅ染色を示す白色光照射下でカラーカメラを用いて記録されている。右側の画像は、７７０ｎｍ ＬＥＤで照明されたモノクロカメラで記録されており、カッパｍＲＮＡの存在を示している。 図２５は、上の対の画像でＣｙ７－キノンメチド色素原を使用し、下の対の画像でＡＭＣＡ－チラミド色素原を使用して、ＣＤ８ ＩＨＣで染色した扁桃ＦＦＰＥ組織の画像を示す。２カメラシステムを使用して、白色光照明下でカラーカメラで記録された画像が左側に提示され、Ｃｙ７が吸収する７７０ｎｍ照明を使用してモノクロカメラで記録された画像が右側に提示され、異なる色素原化学を利用して不可視の色素原を堆積させるすることができることを示している（注－クリックケミストリー及びチラミドを使用した他の例－アルキンクリックパートナー）。 図２６Ａは、単一のモノクロカメラによるマルチスペクトル撮像を示すフローチャートを提供する。異なる波長のいくつかの照明チャネルは、（１）連続光源（例えば、タングステン、キセノン、水銀、メタルハライドランプ）及び検体に適用された各色素原又は色素の吸光度に合わせた光の帯域を通過するように選択された光学フィルタ、及び／又は（２）発光帯域を色素原及び色素の吸光度に同様に合わせた発光ダイオード（ＬＥＤ）によって提供され、光学フィルタの有無にかかわらずＬＥＤ発光をさらに規定する。隣接する色素原の中間の波長の追加の光チャネルは、オーバーサンプリングに使用され得る。スライドマウントされた検体を顕微鏡ステージ上に置き、所望の光チャネルで、又は連続光源からの白色光で、又は白色光を模倣するＬＥＤの組み合わせで観察し、撮像のために顕微鏡視野を選択する（ステップ１）。このプロセスでは、カメラのダイナミックレンジを利用するために、光チャネル強度及びカメラ露光時間が選択される（ステップ２）。次に、検体を透過した光のモノクロ画像を光チャネルごとに記録しながら、検体に所望の光チャネルを順次照射する（ステップ３）。単一の顕微鏡視野よりも大きい領域、例えば検体全体又はスライド走査全体が記録されている場合、ステージは所望の領域内の隣接する視野（複数可）に移動され、順次の照明及び撮像が繰り返される。ステージ移動、照明、及び撮像は、コンピュータによって調整され、単一の顕微鏡視野又はより大きな検体全体又はスライド領域全体の自動的に記録されたマルチスペクトル画像が生成され得る（ステップ４）。フラットフィールド（顕微鏡視野にわたる照度差を補正する）又は透過及び吸光度画像の計算のために、同じ光強度及び露光時間でスライドの空白領域（組織なし）又は染色されていない組織検体に対して撮像手順が繰り返される（ステップ５）。空白画像は検体の撮像の前又は後に記録されてもよく、又は前後で実施して空白画像を平均化してもよい。次いで、「画像処理及び合成画像形成」フローチャート（図２６Ｅ）に要約されているように、画像が処理される（ステップ６）。 図２６Ｂは、単一のモノクロカメラを利用するマルチスペクトル撮像システムの概略図を提供する。 図２６Ｃは、カラー及びモノクロカメラによるデュアルカメラの観察及び撮像を説明するフローチャートを提供する。デュアルカメラシステムで画像を観察及び記録するには、検体スライドを顕微鏡ステージ上に配置し（ステップ１）、白色光及び所望の不可視照明チャネルをオンにする（ステップ２）。従来の染色のライブカラー画像及びモノクロバイオマーカー画像をコンピュータモニタ上で同時に観察し（ステップ３）、最適な露光のための画像取得時間を選択する（ステップ４）。２つの画像を重ね合わせることができ（任意）、不透明度を調整して、モノクロ画像及びカラー画像の両方で同じ細胞を識別し、従来の染色の全コンテキスト内でバイオマーカー発現を観察することができる（ステップ５）。臨床検体に対して病理学者が一般的に行うように、従来の染色とバイオマーカーの両方をコンピュータモニタで観察し、従来の染色を直接、接眼鏡を通して見るという追加の選択肢を用いて、手動段階の動きで完全な検体を評価することができる（ステップ６）。個々の検体視野のカラー画像及びモノクロ画像は、アーカイブ目的、合成画像形成、及び／又は定量分析のために記録され得る（ステップ７）。「画像処理及び合成画像形成」フローチャート（図２６Ｅ）に例示されるように画像処理を行ってもよい。 図２６Ｄは、カラー及びモノクロカメラによるデュアルカメラの観察及び撮像の概略図である。デュアルカメラシステムは、１つのカラーと１つのモノクロの２つのカメラを利用して、可視スペクトル内の光を吸収する従来の染色と、可視スペクトルの外側又は端部の光を吸収するＩＨＣ堆積色素原とを、同時に観察及び撮像する。デュアルカメラ手法の鍵は、顕微鏡の照明ポートで広帯域白色光を不可視光帯域と組み合わせ、次いで検体を透過した可視光と不可視光を分離し、可視光をカラーカメラに向け、不可視光をモノクロカメラに向ける能力であると考えられる。図２６Ｄに示す模式図では、光学フィルタを用いてタングステン連続光源（Ａ）によって白色光を発生させ、ＵＶ及び遠赤色光を除去し、可視光のみを透過させる。近ＩＲ光を除去するためにフィルタにかけたタングステンランプ発光のスペクトルが含まれる（図２６Ｄ、プロットＡを参照のこと）。非可視光帯域は、光帯域を狭めるための光学フィルタリングの有無にかかわらずＬＥＤ、又は単一のバンドパスフィルタ（Ｂ）を備えたフィルタホイールと組み合わせたタングステンランプを用いて生成される。可視白色光及び非可視光は、部分反射光学素子（ビームスプリッタ、Ｃ）と組み合わされる。深青色／ＵＶ及び遠赤色／近ＩＲ発光ダイオードのスペクトルが図に含まれている（図２６Ｄ、プロットＢを参照のこと）。部分反射光学素子の例は、約４５°で入射する光の約５０％を反射し、約４５°で入射する光の約５０％を透過する、（本質的に波長に依存しない）中性密度コーティングを有するガラス板である。あるいは、反射素子は、より高い光スループットのために、約４５°で入射する可視光の約１００％を透過し、約４５°で入射するＵＶ光及び遠赤色／近ＩＲ光の約１００％を反射するように設計されたダイクロイックコーティング（波長依存透過／反射）を有してもよい。このようなビームスプリッタの透過スペクトルは、図中に含まれている（図２６Ｄ、プロットＣを参照のこと）。検体に向けられる各光帯域の相対量を変更するために、反射器設計において異なる波長での相対反射を制御することができる。検体及び対物レンズを通過した後、光は２つの部分に分割され、各部分は、第１のビームスプリッタと同じスペクトル特性を有し得る別の部分反射光学素子を使用して、異なるカメラに向けられる。約５０％の中性密度ビームスプリッタの場合、光の半分はカラーカメラに透過され、半分はモノクロカメラに反射される（本質的に波長に依存しない）。ダイクロイックビームスプリッタの場合、可視光はカラーカメラに透過され、ＵＶ及び遠赤色／近ＩＲ光はモノクロカメラに反射される。光学フィルタＤ及びＥは、可視光のみがカラーカメラに到達し、ＵＶ光及び遠赤色／近ＩＲ光のみがモノクロカメラにそれぞれ到達することを確実にするために、中性密度ビームスプリッタと共に必要とされる。カラーカメラ（Ｄ）及びモノクロカメラ（Ｅ）のフィルタにそれぞれ対応する潜在的な光フィルタ透過スペクトルのプロットが図に示されている（図２６のプロットＤ及びＥを参照のこと）。各カメラによって取得された顕微鏡視野の画像は、コンピュータモニタ上に提示される。画像は、顕微鏡観察者によって接眼鏡を通して見たときの色で見られる可視光と、モノクロ画像として見られる不可視光とが並べて提示されるか、又はオーバーレイされるように、ビデオレートで取得することができる。対眼レンズ（Ｆ）での光学フィルタリングにより、タングステン顕微鏡ランプからの可視光のみを透過させ、不可視光を遮断して（図２６Ｄ、透過プロットＦを参照のこと）、眼をさらに保護して、接眼鏡を通した眼による観察も可能である。あるいは、眼で見ることができない鏡筒に接眼鏡を置き換えてもよい。他の連続光源、例えばキセノン若しくは水銀アークランプ若しくはメタルハライドランプ又は可視ＬＥＤの組み合わせを使用することができることに留意されたい。バンドパスフィルタ及びレーザーダイオードで光学的にフィルタリングされた連続光源を含む他の不可視光源を使用することができる。また、いくつかの用途は、各々が異なるバイオマーカー発現パターンを表示する２つのモノクロカメラ、又は各カメラタイプのうちの１つの代わりに異なる光学フィルタリングを有する２つのカラーカメラを使用する。単一のモノクロカメラシステム（図２６Ａ参照）と同様に、複数の単一の顕微鏡視野の画像は、検体全体又はスライド走査全体を含むより大きな関心領域に組み合わせることができる。デュアルカメラシステムは、完全な光スペクトルへのアクセスを提供するために、中性密度ビームスプリッタを用いて、又はビームスプリッタを除去してモノクロカメラのみを利用することによって、又はモノクロカメラの取り付け位置に応じて１００％反射ミラーを使用することによって、単一のモノクロカメラシステムとして使用することができる。 図２６Ｅは、画像の処理及び合成画像へのそれらの合成を示すフローチャートを示す。利用される照明チャネル（λ１、λ２、．．．λｎ）の数（ｎ）は、多重ＩＨＣにおいて使用される異なる染色（Ｓ１、Ｓ２、．．．Ｓｎ）の数と最小限に等しく、染色は、色素原及び従来の染色成分（例えばヘマトキシリン及びエオシン）を含む。照明チャネルは、例えば、各染色のピーク吸光度付近に照明チャネルを配置するために、各染色を強調するように選択される。オーバーサンプリングと呼ばれる脱混合を改善するために、吸光度ピークの間に位置する追加のチャネルが追加され得る（図２６Ｅには示されていない）。第１のステップは、各チャネルで検体を透過した光の画像（検体画像、λ１など）を、対応する空白画像（組織なし又は未染色組織；空白画像、λ１など）で割ることによって、各照明チャネルの透過（Ｔ）画像を生成することである。検体画像の画素値は、その位置（Ｉ）において検体を透過した光の強度を表し、空白画像の画素値は、その位置（Ｉ０）において検体に入射した光の強度を表す。全ての動作は画素単位で行われる。Ｔ画像の結果として得られる画素値は、０～１（Ｉ／Ｉ０）の範囲でなければならず、浮動小数点画素値を必要とする。Ｔ画像ピクセルと－１倍したピクセルの対数をとって吸光度（Ａ）画像を得る（Ａ＝－ｌｏｇ［Ｔ］）。吸光度は、本明細書では光学密度（ＯＤ）とも呼ばれ、ビールの法則に従って濃度に比例し、定量化及びスペクトル脱混合に使用される線形アルゴリズムに必要であるため、価値がある。スペクトル脱混合は、重複する吸光度スペクトルを有する他の染色からのスペクトル寄与を除去することによって、１つの染色のみによる吸光度を含む「純粋な」個々の画像が生成されるプロセスである（重複する吸光度は一般にスペクトルクロストークと呼ばれる）。クロストーク補正後の純粋な染色のこれらの画像は、ここでは脱混合画像（Ｕ画像、Ｓ１など）と呼ばれる。マルチプレックスのアッセイで使用される様々な染色の吸光度ピークが波長によって十分に分離されている場合は、クロストークは小さすぎて、単一の染色濃度を表す値を提供するために脱混合の必要がない場合があるが、マルチプレックスのオーダーが増加しスペクトル分離が減少すると、脱混合が必要となる。染色濃度に比例するため、画素値が蛍光染色濃度にも比例する蛍光画像と同様に、Ｕ画像を定量化に直接使用することができる。スペクトル脱混合手順は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＬＥ，Ｌｅｆｅｖｅｒ ＭＲ，Ｂｅｈｍａｎ ＬＪ，Ｌｅｉｂｏｌｄ Ｔ，Ｒｏｂｅｒｔｓ ＥＡ，Ｈｏｒｃｈｎｅｒ ＵＢ，Ｂａｕｅｒ ＤＲ（２０２０）Ｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｗｉｔｈ Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１３７４－０２０－０４２９－０及びその中の参考文献に記載されている。Ｕ画像は、合成画像を形成するためにさらに使用されてもよい。クロストークが許容され得る合成を提供するのに十分に小さい場合、脱混合前のＡ画像をコンポジット画像形成に使用することができ、スペクトル脱混合に必要な追加の計算時間及び追加の複雑さが節約される（前のコメントを参照）。各染色に対応するＵ画像（Ｓ１、Ｓ２、．．．Ｓｎ）を２回コピーして、最終的な合成画像のＲ、Ｇ、及びＢ平面に対する各染色の寄与を形成し、このフローチャートではＲ画像Ｓ１、Ｒ画像Ｓ２、．．．．、Ｇ画像Ｓ１、Ｇ画像Ｓ２、．．．．、及びＢ画像Ｓ１、Ｂ画像Ｓ２、．．．．．とラベル付けされる。各画像コピーには、増幅係数「ａ」及び色重み付け係数「Ｃ」が乗算される。増幅率が１未満であると、最終的な合成画像に対する染色の寄与が減少し、増幅率が１を超えると、合成画像に対する染色の寄与が増加する。色重み付け係数は、合成画像における染色の擬似カラーを提供し、各染色の赤、緑、及び青の成分について０～１の範囲である。例えば、染色１（Ｓ１）が擬似着色の赤色である場合、色重み係数は、Ｒ画像、Ｇ画像、及びＢ画像をそれぞれ生成するための蛍光様合成画像表現においてＣＲ１＝１、ＣＧ１＝０、及びＣＢ１＝０である。明視野様の画像表現の場合、赤色は、ＣＲ１＝０、ＣＧ１＝１、及びＣＢ１＝１の重み係数、又は、同じ色の蛍光様の重み係数を１から引いたものによって生成される。合成画像の最終的な赤色画像平面（Ｒ平面）を作成するために、各染色のＲ画像が合計される。最終的な緑色画像平面及び青色画像平面（Ｇ平面及びＢ平面）は、各染色のＧ画像及びＢ画像をそれぞれ合計することによって同様に作成される。蛍光様の色表現（濃度及び吸光度に比例する値、又はＡ合成画像）の場合、３つの色平面は、各平面を集合的な３つの色平面の最大値で除算することによってスケーリングすることができる。最終画像は、８ビットカラー画像平面に対して２５５倍される。明視野色表現（透過又はＴ合成画像）の場合、合計されたＲ画像、Ｇ画像、及びＢ画像はそれぞれ－１倍され、逆対数が取られる。最終画像平面は、８ビットカラー画像平面に対して２５５倍される。 図２７は、ムチカルミン特殊染色で染色したＦＦＰＥ肺組織で記録した吸光度スペクトルを提供し、ムチカルミン染色の吸光度が、深青色／ＵＶスペクトル領域で吸収するｉＩＨＣ色素原の使用を妨害し得るが、ムチカルミンの吸光度は、遠赤色／近ＩＲスペクトル領域で吸収するｉＩＨＣ色素原を妨害すべきではないことを示す。 図２８は、ＴＴＦ－１（ＩＲ８７０ ｉＣＤＣ）＋ｐ４０（Ｃｙ７ ｉＣＤＣ）二重ｉＩＨＣ及びムチカルミン特殊染色を用いて同時に染色した肺腫瘍ＦＦＰＥ組織のデュアルカメラシステムで記録した画像を示す。ムチカルミン特殊染色の可視吸光度（左画像）をカラーカメラで記録し、遠赤色／近ＩＲ画像（中央及び右画像）をモノクロカメラで記録した。上の画像は腺癌組織で記録され、ＴＴＦ－１（右画像）及びムチン（ＴＴＦ－１発現細胞の細胞質のピンク色染色、左画像）の発現を示し、腺癌の割り当てが確認された。下の画像は扁平上皮癌組織で記録され、ｐ４０陽性細胞及び最小ムチン産生を示し、扁平上皮癌腫の割り当てが確認された。 図２９は、隣接する色素原及び従来の染色からバックグラウンドシグナルを除去するためのスペクトル脱混合を示す。マルチプレックスアッセイで使用される様々な色素の吸光度スペクトルは、有意な重複を有することがあり（例えば、図１０のスペクトルを参照）、単一の染色の吸光度のみを記録することを意図した画像でそれらの吸光度を可視化する。スペクトル脱混合は、このオーバーラップを補正し、干渉信号を低減又は除去するために使用される。これは、スペクトル脱混合前のＨＣＣＡ及びＣｙ７色素原（それぞれ、図の左側及び右側）の吸光度画像（上の画像）をスペクトル脱混合後の画像（下の画像）と比較することによって分かる。脱混合ＨＣＣＡ画像は、ヘマトキシリン染色核からのシグナルの有意な減少を示す。脱混合Ｃｙ７画像は、Ｃｙ７が吸収するスペクトル領域においてヘマトキシリンがほとんど吸収しないので、大きな変化を示さない。 図３０は、マルチスペクトル撮像及び画像処理：ＮＳＣＬＣ ＡＤＣ ＦＦＰＥ組織＋ｐ４０／ＴＴＦ－１二重ＩＨＣにおける合成カラー画像及びスペクトル脱混合を示す。パネルＡ－エオシンが主に光を吸収する５１０ｎｍ及びヘマトキシリンが光を吸収する５９９ｎｍで記録されたスペクトル脱混合モノクロ透過光画像から形成されたカラー合成画像（モノクロ画像は図示せず）。パネルＢ及びＣ－Ｃｙ７ ＣＤＣが主に光を吸収する７６９ｎｍでの透過光、染色ｐ４０（Ｂ）、及びｉｒ８７０ ＣＤＣが光を吸収する８８０ｎｍでの透過光、染色ＴＴＦ－１（Ｃ）のモノクロカメラ画像。パネルＥ及びＦ－ｐ４０（パネルＥ）及びＴＴＦ－１（パネルＦ）のスペクトル脱混合画像。パネルＤ－スペクトル脱混合ヘマトキシリン（図示せず）及びＴＴＦ－１（パネルＦ）画像から形成された２色合成画像。２０倍対物レンズを使用して画像を記録した。
詳細な説明
本明細書には、検出可能部分、及び１つ又は複数の検出可能部分を含む検出可能なコンジュゲートが開示される。いくつかの実施形態では、開示される検出可能部分は、狭い波長を有し、多重化に適している。
定義
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「又は」という単語は、文脈が別途明確に指示しない限り、「及び」を含むことを意図している。「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は、「Ａ又はＢを含む」がＡ、Ｂ、又はＡ及びＢを含むことを意味するように、包括的に定義される。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などの用語は、交換可能に使用され、同じ意味を有する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」などは、交換可能に使用され、同じ意味を有する。具体的には、各用語は、「含む、備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という一般的な米国特許法の定義と一致して定義されているため、「少なくとも以下」を意味するオープンな用語として解釈され、また、追加の特徴、制限、態様などを除外しないように解釈される。したがって、例えば、「構成要素ａ、ｂ、及びｃを有するデバイス」は、デバイスが少なくとも構成要素ａ、ｂ、及びｃを含むことを意味する。同様に、「ステップａ、ｂ、及びｃを含む方法」という語句は、方法が少なくともステップａ、ｂ、及びｃを含むことを意味する。さらに、ステップ及びプロセスは、ここにおいて特定の順序で概説され得るが、当業者は、順序付けのステップ及びプロセスが変化し得ることを認識するであろう。
本明細書中で使用される場合、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）は、リン酸－酸素結合を切断し、一時的に中間の酵素－基質結合を形成することによって、リン酸基有機エステルを（加水分解によって）除去し、転移させる酵素である。例えば、ＡＰは、ナフトールホスフェートエステル（基質）をフェノール化合物及びホスフェートに加水分解する。フェノールは、無色のジアゾニウム塩（色素原）に結合して、不溶性の着色したアゾ色素を生成する。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語（「Ａｂ」と略記されることがある）は、免疫グロブリン又は免疫グロブリン様分子を指し、例として、限定されるものではないが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、それらの組み合わせ、並びに任意の脊椎動物における（例えば、ヒト、ヤギ、ウサギ及びマウス等の哺乳動物における）免疫応答中に産生される類似の分子、並びに他の分子への結合を実質的に排除するために、目的の分子（又は目的の非常に類似する分子のグループ）に特異的に結合する抗体断片を指す。抗体は、更に、抗原のエピトープを特異的に認識して結合する少なくとも軽鎖又は重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンドを指す。抗体は、重鎖及び軽鎖で構成されてもよく、それらの各々には可変重（ＶＨ）領域及び可変軽（ＶＬ）領域と呼ばれる可変領域がある。まとめると、ＶＨ領域及びＶＬ領域は、抗体によって認識される抗原を結合することの原因となる。抗体という用語はまた、インタクトの免疫グロブリン、並びに当技術分野でよく知られているそれらの変異体及び部分を含む。
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、抗体分子又はＴ細胞受容体等の特異的体液性又は細胞性免疫の産物によって特異的に結合され得る化合物、組成物又は物質を指す。抗原は、例えば、ハプテン、単純な中間代謝産物、糖（例えば、オリゴ糖）、脂質及びホルモン、並びに複合炭水化物（例えば、多糖類）、リン脂質、核酸及びタンパク質等の高分子を含む任意の種類の分子であり得る。
本明細書で使用される場合、「生物学的検体」という用語は、限定されないが、細菌、酵母、原虫、及びアメーバ等の単細胞生物、とりわけ多細胞生物（例えば、植物又は動物、例えば、健康若しくは見かけ上健康なヒト対象又は癌等の診断若しくは調査される症状若しくは疾患に罹患しているヒト患者からの試料を含む）を含む任意の生物から得られるか、それによって排出されるか、又はそれによって分泌される任意の固体又は流体試料であり得る。例えば、生物学的検体は、例えば、血液、血漿、血清、尿、胆汁、腹水、唾液、脳脊髄液、房水若しくは硝子体液、又は任意の身体分泌物、浸出液、滲出液（例えば、膿瘍、又は感染若しくは炎症の任意の他の部位から得られた体液）、又は関節から得られた体液（例えば、正常な関節又は疾患に罹患した関節）から得られた生物学的流体であり得る。生物学的検体はまた、任意の器官若しくは組織（腫瘍生検等の生検又は剖検検体を含む）から得られた試料であり得るか、又は任意の細胞、組織若しくは器官によって馴化された細胞（初代細胞又は培養細胞にかかわらず）若しくは培地を含み得る。いくつかの例では、生物学的検体は核抽出物である。特定の例では、試料は、開示された細胞ペレット切片試料の１つ等の品質管理試料である。他の例では、試料は試験試料である。試料は、当業者に公知の任意の方法を用いて調製することができる。試料を、日常的なスクリーニングのための対象から、又は遺伝的異常、感染若しくは新生物等の障害を有することが疑われる対象から得ることができる。開示される方法の記載される実施形態はまた、「正常な」試料と呼ばれる、遺伝的異常、疾患、障害等を有さない試料に適用することができる。試料は、１つ又は複数の検出プローブによって特異的に結合され得る複数の標的を含み得る。
本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」という用語は、より大きな構築物に共有結合している２つ以上の分子又は部分（高分子又は超分子分子を含む）を指す。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、１つ又は複数の他の分子部分に共有結合された１つ又は複数の生体分子（ペプチド、タンパク質、酵素、糖、多糖類、脂質、糖タンパク質、及びリポタンパク質等）を含む。
本明細書で使用される場合、「結合」又は「結合する」という用語は、ある分子又は原子の別の分子又は原子への結合（ｊｏｉｎｉｎｇ）、結合（ｂｏｎｄｉｎｇ）（例えば、共有結合）、又は連結を指す。
本明細書で使用される場合、「検出可能部分」という用語は、試料中の標識の存在（すなわち、定性分析）及び／又は濃度（すなわち、定量分析）を示す（視覚的に、電子的に、又はその他の方法等で）検出可能なシグナルを生成することができる分子又は材料を指す。
本明細書で使用される場合、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、標識分子にコンジュゲートされ得る酵素である。適切な基質とインキュベートすると、標識された分子の着色誘導体、蛍光定量的導体、又は発光誘導体が生成され、検出及び定量が可能になる。ＨＲＰは、電子供与体の存在下で作用して、まず酵素基質複合体を形成し、その後、電子供与体を酸化するように作用する。例えば、ＨＲＰは、３，３’－ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）に作用して、検出可能な色を生成し得る。ＨＲＰはまた、標識チラミドコンジュゲート又はチラミド様反応性コンジュゲート（すなわち、フェルレート、クマリン酸、カフェイン酸、シンナメート、ドーパミン等）に作用して、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）のための着色若しくは蛍光又は無色のレポーター部分を堆積させ得る。
本明細書で使用される場合、「免疫組織化学」（ＩＨＣ）という用語は、抗原と抗体などの特異的結合剤又は部分との相互作用を検出することによって、試料中の抗原の存在又は分布を決定する方法を指す。抗原（例えば標的抗原）を含む試料は、抗体－抗原結合を可能にする条件下にて、抗体と共にインキュベートされる。抗体に抱合体化した検出可能な標識により（直接検出）、又は、一次抗体に対して増加した二次に抱合体化した検出可能な標識により（例えば、間接検出）、抗体－抗原結合が検出されることができる。検出可能な標識には、放射性同位体、蛍光色素（フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体など）、酵素及び色素原分子が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション」（ＩＳＨ）タイプのハイブリダイゼーションという用語は、標識された相補的ＤＮＡ又はＲＮＡ鎖（すなわち、プローブ）を使用して、特定のＤＮＡ又はＲＮＡ配列を組織の一部又は切片内に局在化させる（ｉｎ ｓｉｔｕ）か、又は組織が十分に小さい場合（例えば、植物種子、ショウジョウバエ胚）、組織全体内に局在化させる（全体マウントＩＳＨ）。これは、タンパク質を組織切片内に局在化させる免疫組織化学とは異なる。ＤＮＡ ＩＳＨは、染色体の完全性を評価するための医療診断における使用などのために、染色体の構造を決定するために使用することができる。ＲＮＡ ＩＳＨ（ハイブリダイゼーション組織化学）は、ｍＲＮＡ及び他の転写物を測定し、組織切片又は全体マウント内に局在化するために使用される。ハイブリダイゼーション組織化学のために、試料細胞及び組織は通常、標的転写物を定位置に固定し、標的分子へのプローブのアクセスを増加させるために処理される。上記のように、プローブは、標識された相補的ＤＮＡ又は相補的ＲＮＡ（リボプローブ）のいずれかである。プローブは高温で標的配列にハイブリダイズし、次いで過剰のプローブが洗い流される（任意に、ハイブリダイズしていない過剰なＲＮＡプローブの場合はＲＮａｓｅを使用して加水分解される）。温度、塩及び／又は界面活性剤濃度などの溶液パラメータは、任意の同一でない相互作用を除去する（すなわち、正確な配列一致のみが結合したままである）ように操作することができる。次いで、放射標識塩基、蛍光標識塩基又は抗原標識塩基（例えば、ジゴキシゲニン）のいずれかなどで効果的に標識された標識プローブを、オートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡又は免疫組織化学のいずれかをそれぞれ使用して組織内に局在化させ、潜在的に定量化する。
本明細書で使用される場合、「多重化」、「多重化された」又は「多重化している」という用語は、試料中の複数の標的を同時に、実質的に同時に、又は順次検出することを指す。多重化は、複数の異なる核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）及びポリペプチド（例えば、タンパク質）を個別に、及び任意の組み合わせ及び全ての組み合わせの両方で同定及び／又は定量化することを含むことができる。
本明細書で使用される場合、「キノンメチド」は、対応するキノン上のカルボニル酸素の１つがメチレン基（－ＣＨ２－）で置換されてアルケンを形成するキノン類縁体である。
本明細書で使用される場合、「特異的結合実体」という用語は、特異的結合対のメンバーを指す。特異的結合対は、他の分子への結合を実質的に排除して互いに結合することを特徴とする分子の対である（例えば、特異的結合対は、生物学的検体中の他の分子との結合対の２つのメンバーのいずれかの結合定数よりも少なくとも１０－３Ｍ大きい、１０－４Ｍ大きい又は１０－５Ｍ大きい結合定数を有することができる）。特異的結合部分の特定の例は、特異的結合タンパク質（例えば、抗体、レクチン、ストレプトアビジン等のアビジン、及びプロテインＡ）を含む。特異的結合部分はまた、そのような特異的結合タンパク質によって特異的に結合される分子（又はその部分）を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「標的」という用語は、存在、位置、及び／又は濃度が判定される、又は判定されることができる任意の分子を指す。標的分子の例は、タンパク質、核酸配列、及びタンパク質に共有結合したハプテン等のハプテンを含む。標的分子は通常、特異的な結合分子と検出可能な標識との、１つ又は複数のコンジュゲートを用いて検出される。
本明細書で使用される場合、記号
Figure 2024507677000014
は、部分が別の部分に結合している位置を指す。
概要
本出願人は、生物学的検体を１つ又は複数の従来の色素（例えば「日常的染色」又は「特殊染色」）で染色し、生物学的検体内の１つ又は複数のバイオマーカーを（ＩＨＣ又はＩＳＨアッセイにおいて）１つ又は複数の検出可能部分で標識する方法を開発しており、従来の色素による染色及び１つ又は複数の検出可能部分によるバイオマーカーの標識は、同じ生物学的検体（基材上に配置された単一の組織切片など）上で行われる。本明細書中に記載される検出可能部分を従来の色素と併せて使用することにより、１つ又は複数の従来の色素の解釈を妨げることなく、１つ又は複数の標識されたバイオマーカーの検出が容易になる。
ヘマトキシリン＋エオシン（Ｈ＆Ｅ）は、最も一般的な組織学的染色であり、最も重要な癌診断の１つを提供する。簡単に言えば、Ｈ＆Ｅ中のヘマトキシリンはＤＮＡ含有量の領域に結合し、すべての核に青色を付与し、エオシンは細胞質及び結合組織をピンク色に染色する。実際には、Ｈ＆Ｅ染色はかなり微妙であり、多数の細胞及び細胞外の特徴を区別することを可能にする複雑な染色パターン及び着色を提供する。病理学者は、Ｈ＆Ｅ染色組織から、診断、予後、及び治療応答の予測を支援する驚くべき量の情報を得る。
例えば、ある研究では、免疫療法を受けている患者のＨ＆Ｅ染色非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）生検の１０の異なる組織学的特徴を使用して、新しい病理学的応答基準を開発した（Ｃｏｔｔｒｅｌｌ ＴＲ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＥＤ，Ｆｏｒｄｅ ＰＭ，Ｓｔｅｉｎ ＪＥ，Ｄｕｆｆｉｅｌｄ ＡＳ，Ａｎａｇｎｏｓｔｏｕ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ ａｎｔｉ－ＰＤ－１ ｉｎ ｒｅｓｅｃｔｅｄ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ａ ｐｒｏｐｏｓａｌ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ（ｉｒＰＲＣ）．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１８；２９：１８５３－１８６０を参照のこと）。別の研究では、同じグループが、免疫療法で処置された患者からのＨ＆Ｅ染色黒色腫生検検体における１４の組織学的特徴を評価し、客観的奏効及び全生存との有意な関連を示した（Ｓｔｅｉｎ ＪＥ，Ｓｏｎｉ Ａ，Ｄａｎｉｌｏｖａ Ｌ，Ｃｏｔｔｒｅｌｌ ＴＲ，Ｇａｊｅｗｓｋｉ ＴＦ，Ｈｏｄｉ ＦＳ，ｅｔ ａｌ．Ｍａｊｏｒ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｎ ｂｉｏｐｓｙ（ＭＰＲｂｘ）ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ－ＰＤ－１：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａｎ ｅａｒｌｙ，ｏｎ－ｔｈｅｒａｐｙ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１９；３０；５８９－５９６を参照のこと）。病理学者は、明視野顕微鏡検査及びＨ＆Ｅ染色組織の評価に非常に慣れていると思われ、病理学研修期間中にかなりの訓練を受けている。Ｈ＆Ｅ染色の重要性は、１世紀以上にわたるその実施によって証明されている。子宮頸部検体のパパニコロウ（ＰＡＰ）染色などの他の従来の明視野染色、及びギムザ、弾性、ムチカルミン、及びトリクローム染色などの特殊染色は、価値のある使用の長い履歴を有する（Ｃｈａｎｔｚｉａｎｔｏｎｉｏｕ Ｎ，Ｄｏｎｎｅｌｌｙ Ａ，Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ Ｍ，Ｂｏｏｎ ＭＥ，Ａｕｓｔｉｎ ＲＭ．Ｉｎｃｅｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ ｓｔａｉｎ ｍｅｔｈｏｄ．Ａｃｔａ Ｃｙｔｏｌ ２０１７；６１：２６６－２８０；及びＷｉｃｋ ＭＲ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｓ ａ ｔｏｏｌ ｉｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ：ａ ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ．Ａｎｎ Ｄｉａｇｎ Ｐａｔｈｏｌ ２０１２；１６：７１－７８を参照のこと）。
免疫組織化学は、高度に特異的な抗体試薬を介して、及びＨ＆Ｅと組み合わせて、特定の分子種、一般にタンパク質の染色を可能にし、病理学者の診断能力を大幅に強化した（Ｊａｆｆｅｒ Ｓ，Ｂｌｅｉｗｅｉｓｓ ＩＪ．Ｂｅｙｏｎｄ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ－ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ ２００４；２２：４４５－６５を参照のこと）。抗体は、酵素－抗体コンジュゲート及び酵素によって触媒される色素原堆積反応を介して色素原堆積を指示する。ＩＨＣは、エオシンの比較的非特異的なタンパク質染色とは対照的に、特定のタンパク質を染色することができるので、細胞周期及び他の細胞シグナル伝達タンパク質などの重要なタンパク質の過少発現及び過剰発現を同定すること、及び、腫瘍タイプを分類し、予後を確立し、治療応答を予測するために使用することができ、Ｈ＆Ｅ及び他の従来の染色によって提供される情報にかなりより多くの情報を追加する。
例えば、Ｈ＆Ｅは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の存在を確立することができるが、癌を扁平上皮癌腫（ＳＳＣ）又は腺癌（Ａｄ Ｃａ）として明確に分類するためには、ｐ１６、ＴＴＦ－１、サイトケラチン５及び６、並びに／又はナプシンＡの発現がしばしば必要である（Ｋｅｒｒ ＫＭ，Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ Ｌ，Ｅｄｅｌｍａｎ ＭＪ，Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ Ａ，Ｍｏｋ Ｔ，Ｎｏｖｅｌｌｏ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｃｏｎｄ ＥＳＭＯ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ：ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１４；２５：１６８１－１６９０；及びＲｏｂｅｒｔｓ ＥＡ，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＬＥ，Ｂｅｈｍａｎ ＬＪ，Ｄｒａｇａｎｏｖａ－Ｔａｃｈｅｖａ Ｒ，Ｏ’Ｎｅｉｌｌ Ｒ５，Ｓｏｌｏｍｉｄｅｓ ＣＣ．Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａｃｃｕｒａｔｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｎ Ｄｉａｇｎ Ｐａｔｈｏｌ ２０１９；４５：１５１４５４を参照のこと）。乳癌では、上皮増殖因子受容体ＩＩ（ＨＥＲ２）の過剰発現又は遺伝子増幅が予後予測であり、トラスツズマブなどのＨＥＲ２アンタゴニストの有効性を予測する一方、エストロゲン受容体（ＥＲ）及びプロゲステロン受容体（ＰＲ）タンパク質の過剰発現は予後予測であり、タモキシフェンなどのエストロゲン拮抗薬に対する応答を予測する（Ｒｏｓｓ Ｊ，Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ＪＡ．Ｔｈｅ ＨＥＲ－２／ｎｅｕ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ，ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ １９９８；３；２３７－２５２；Ｖｏｇｅｌ ＣＬ，Ｃｏｂｌｅｉｇｈ ＭＡ，Ｔｒｉｐａｔｈｙ Ｄ，Ｇｕｔｈｅｉｌ ＪＣ，Ｈａｒｒｉｓ ＬＮ，Ｆｅｈｒｅｎｂａｃｈｅｒ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ａｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｇｅｎｔ ｉｎ ｆｉｒｓｔ－ｌｉｎｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＨＥＲ２－ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃ ２００２；２０；７１９－７２６；ａｎｄ Ｎａｓｒａｚａｄａｎｉ Ａ，Ｔｈｏｍａｓ ＲＡ，Ｏｅｓｔｅｒｒｅｉｃｈ Ｓ，Ｌｅｅ ＡＶ．Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ Ｏｎｃ ２０１８；８；ａｒｔｉｃｌｅ １４４を参照のこと）。
残念なことに、Ｈ＆Ｅ及びＩＨＣによる特定の腫瘍の完全な分析には、特に針生検及び細針吸引のための特定の生検から、並びに細胞性が低い子宮頸管擦過及び尿などの細胞診検体から入手可能な組織よりも多くの組織が必要となり得る。これは、一般的な臨床診療によって、Ｈ＆Ｅが癌診断を行うためには１枚のスライドが必要であり、各ＩＨＣ染色に１枚の追加のスライドが必要であるためである。ＩＨＣ多重化は、スライドあたりのＩＨＣ染色反応の数を増加させることができるが、依然としてＨ＆Ｅ染色スライドに加えて少なくとも１つのスライドを必要とする。Ｈ＆Ｅスライドの脱染色とそれに続くＩＨＣは可能であるが、エオシン及びヘマトキシリンの完全な除去は困難であり、Ｈ＆Ｅ及びＩＨＣの両方について連続して染色及び評価を行うのにかなりの時間が必要とされる。さらに、２つの染色方法間の同じ正確な領域の比較は、Ｈ＆Ｅの後に撮像してＩＨＣの後に再度撮像し、関心領域の位置を特定し位置合わせすることを必要とする。
いくつかのスライド調製物に十分な試料が利用可能である場合でも、Ｈ＆Ｅ染色パターン及びＩＨＣタンパク質発現パターンの評価を調整することは問題がある。組織の場合、最良の場合は、隣接する（連続的な）腫瘍切片に対してＨ＆Ｅ及びＩＨＣを実施することである。しかしながら、組織形態は、腫瘍検体を通る距離と共に変化し、連続切片でさえ、様々な組織及び細胞特徴の形状及び配向の有意な変化を示す。同じ領域が各スライド上に位置しなければならず、切片切断による腫瘍の変化が考慮され、有益なタンパク質発現を有する細胞の一方のスライド上への配置は、他方のスライド上のＨ＆Ｅ特徴と精神的に整列されなければならない。１つの切片上の細胞が連続切片上に存在しないか、又は部分的にしか存在しないので（細胞内のミクロトーム切片）、Ｈ＆Ｅ及びＩＨＣ情報の正確なアラインメントはほとんど可能でない。２つの異なる検体スライド間の情報の整列が不可能である細胞診検体の場合、状況はより悪い。
同じスライド上のＩＨＣによるＨ＆Ｅ染色の多重化は、限られた検体及び異なる検体スライドから検索された情報の整列という上記の問題に対する解決策となる。しかし、これは、Ｈ＆Ｅ染色が非常に強く、光スペクトルの可視領域全体を覆い、色素原染色が不明瞭になり、読み取りが困難又は不可能になるため、不可能であった。図９は、Ｈ＆Ｅ染色ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）扁桃組織切片の吸光度スペクトルを示す。ヒトの視覚応答もプロットされており、Ｈ＆Ｅ染色が可視範囲にわたって吸収することを示している。ＤＡＢなどの非常に暗い黒色又は茶色の色素原がより視認可能であるが、ＤＡＢはＨ＆Ｅ染色を覆い隠すため、Ｈ＆ＥとＩＨＣの両方の評価は不十分である。
上記のように、本出願人は、生物学的検体内のバイオマーカーの１つ又は複数が本明細書に記載の検出可能部分の１つ又は複数で標識されていても（例えば、２つ以上の検出可能部分で標識されている、３つ以上の検出可能部分で標識されている、４つ以上の検出可能部分で標識されている、５つ以上の検出可能部分で標識されている、６つ以上の検出可能部分で標識されているなど）、生物学的検体に導入された１つ又は複数の従来の色素が依然として解釈され得ることを発見した。
電磁スペクトル
電磁スペクトルは、電磁放射の周波数範囲（スペクトル）並びにそれらのそれぞれの波長及び光子エネルギーである。この周波数範囲は別々の帯域に分割され、各周波数帯域内の電磁波は異なる名称で呼ばれ、スペクトルの低周波（長波長）端から始まり、これらは、電波、マイクロ波、赤外線、可視光、紫外線、Ｘ線、及び高周波（短波長）端でのガンマ線である。
電磁スペクトルの帯域間に正確に定義された境界はない。むしろ、電磁スペクトルの帯域は互いに「フェイド（ｆａｄｅ）」する。その結果、電磁スペクトルの異なる帯域間に重複が存在する。例えば、可視スペクトルと紫外線スペクトルとの間、及び可視スペクトルと赤外線スペクトルとの間に重複が存在する。特に、そのような重複は、約３７０ｎｍ～約４３０ｎｍの波長範囲及び約６７０ｎｍ～約７３０ｎｍの波長範囲などの、「可視スペクトル」に隣接及び／又は包含する波長範囲で生じる。
上記を考慮して、本明細書で使用される場合、「可視スペクトル」という用語は、約４００ｎｍ～約７００ｎｍの範囲の波長のスペクトルを指す。本明細書で使用される場合、「紫外スペクトル」という用語は、約４３０ｎｍ未満の波長を含む。したがって、「紫外スペクトル」は、近紫外波長、すなわち「可視スペクトル」に隣接する波長を含む。本明細書で使用される場合、「赤外スペクトル」という用語は、約６７０ｎｍを超える波長を含む。したがって、「赤外スペクトル」は、近赤外波長、すなわち「可視スペクトル」に隣接する波長を含む。
いくつかの実施形態では、吸収対波長のグラフはスペクトルと呼ばれる。スペクトルは、従来の色素の色（すなわち、可視領域におけるスペクトル応答）又は検出可能部分の特性（例えば検出可能部分の紫外、近紫外、赤外、又は近赤外特性）を決定するために使用することができる。光の最大部分が物質によって吸収される波長は、λｍａｘと呼ばれる。この波長は最大限に吸収されるので、典型的にはピーク吸光度波長と呼ばれる。いくつかの実施形態では、特定の離散波長の放射が試料を照射するために使用される場合、その放射の吸収が存在し得る。他の波長では、このような吸収は減少するか、又は起こらない。材料、例えば従来の色素及び本明細書に記載の検出可能部分を特徴付けるために使用されるのは、この吸収現象である。
本開示の従来の染色（「日常的染色」又は「特殊染色」）は、本明細書に記載されるもののいずれかを含む１つ又は複数の従来の色素を利用する。いくつかの実施形態では、日常的染色及び特殊染色の従来の色素は、「可視スペクトル内で」検出可能な波長、例えば約４００ｎｍ～約７００ｎｍを有する。一例として、図９は、ヘマトキシリン及びエオシン染色扁桃組織の吸光度を、ヒトの視覚応答を重ね合わせて示す。図９は、ヘマトキシリン及びエオシン染色が可視範囲にわたって吸収することを示す。図９はまた、ヘマトキシリン及びエオシンの吸光度が視覚応答の領域外で低下し、約４５０ｎｍ未満及び約７００ｎｍ超で大きく低下することを示す。適切な従来の色素の他の非限定的な例及びそれらのピーク吸光度波長（又は該当する場合は２つのピーク吸光度波長）を本明細書に記載する。
本開示はまた、生物学的検体を染色する際に１つ又は複数の従来の色素と併せて使用される１つ又は複数の検出可能部分に関する。いくつかの実施形態では、本開示の検出可能部分は、一般に、約４３０ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有する。他の実施形態では、本開示の検出可能部分は、一般に、約６７０ｎｍを超えるピーク吸光度波長を有する。したがって、本開示の検出可能部分は、紫外スペクトル又は赤外スペクトルのいずれかの範囲内の波長を有する。合わせて、約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超の波長を有する検出可能部分は、本明細書では検出可能な「可視スペクトル外」と呼ばれる。
例えば、図１０は、紫外スペクトル内の「ＨＣＣＡ」検出可能部分（３６５ｎｍのピーク吸光度波長を有する）、並びに赤外スペクトル内の「Ｃｙ７」及び「ＩＲ８０４」検出可能部分（それぞれ７７４ｎｍ及び８２８ｎｍのピーク吸光度波長を有する）を示す。したがって、ＨＣＣＡ、Ｃｙ７及びＩＲ８０４は「可視スペクトル外」である。
「可視スペクトル外で」検出可能な検出可能部分が、「可視スペクトル内で」検出可能な従来の色素と組み合わせて使用するために選択される場合、これは、上記のように、可視スペクトルと紫外スペクトルとの間（例えば、３７０ｎｍと４３０ｎｍの間の波長）、又は可視スペクトルと赤外スペクトルとの間（例えば、６７０ｎｍと７３０ ｎｍの間の波長）に重複が存在し得ないことを意味しない。例えば、第１の検出可能部分と第１の従来の色素とからのシグナルが独立して検出され得るように、第１の検出可能部分のピーク吸光度波長と第１の従来の色素のピーク吸光度波長との間に十分な分離（例えば２０ｎｍ）があるならば、約４３０ｎｍのピーク吸光度波長を有する第１の検出可能部分を選択してもよく、約４００ｎｍのピーク吸光度波長を有する第１の従来の色素を選択してもよい。これは図１０にもさらに示されており、これはまた、４１０ｎｍ～４２０ｎｍなどの可視スペクトルに隣接するピーク吸光度波長を有し、したがって「可視スペクトル外」である「ＮＭｅｔｈＣｏｕ」及び「ＤＣＣ」検出可能部分を示す。
いくつかの実施形態では、本開示の不可視色素原は、スペクトルの他の可視部分（例えば、４００ｎｍ～４５０ｎｍ）に弱い非ゼロ吸光度を有する。これらの不可視色素原が十分な量、例えば３００μｍで堆積されると、可視（したがって、検出可能な）信号を提供することができる。例えば、図１０を参照すると、ＤＣＣが試料上に堆積されると、ＤＣＣは約４２０ｎｍに最大吸光度ピークを有するが、色素原を可視にし得る４５０ｎｍ～５００ｎｍの間の残留吸光度を有するものの、それは大量に堆積された場合（例えば３００μｍ）にのみである。同様に、再び図１０を参照すると、ＩＲ８０４が堆積されると、約７７０ｎｍに最大吸光度ピークを有する。しかしながら、ＩＲ８０４は、７００ｎｍ未満で比較的低い吸光度（例えば、約６５０ｎｍ～約７００ｎｍ）を有し、これは、十分に高い濃度の不可視色素原が試料上に堆積した場合に可視であり得る。
従来の染色
１つ又は複数の従来の染色による染色は、組織及び細胞を含む生物学的検体の重要な特徴を強調するため、並びに組織コントラストを高めるために使用される。そうでなければ透明な組織切片を着色することによって、これらの従来の染色は、病理学者及び／又は研究者が顕微鏡下で組織形態を観察すること、又は特定の細胞型、構造若しくはさらに細菌などの微生物の存在若しくは有病率を探すことを可能にする。ヘマトキシリンは、このプロセスで一般的に使用される基礎色素であり、核を染色して「青みがかった色」を与え、エオシンは細胞の細胞質及び結合組織を染色して「ピンクがかった色」を与える（本明細書の「日常的染色」を参照のこと）。特定の細胞及び成分に使用される他の染色技術がいくつかある（本明細書の「特殊染色」を参照のこと）。
組織病理学では、「日常的染色」という用語は、基礎となる組織構造及び状態を明らかにするためにすべての組織検体と共に「日常的に」使用されるヘマトキシリン及びエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）を指す。「特殊染色」という用語は、Ｈ＆Ｅによる染色が病理学者又は研究者が必要とするすべての情報を提供しない場合に使用される多数の代替染色技術を指すために長い間使用されてきた。
日常的染色
ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は、世界中で１００年以上にわたって使用されてきた普遍的な「日常的」染色である。簡単に言えば、ヘマトキシリンは核を青色に染色し、エオシンは細胞質をピンク色に染色する。Ｈ＆Ｅ染色は、病理学者が組織の一般的な形態を視覚化することを可能にし、多くの病理組織学的症状の診断及び予後を可能にする。Ｈ＆Ｅ染色スライドでは、病理学者は、ほとんどの疾患、炎症（急性及び慢性の両方）、有糸分裂、細菌感染、壊死、線維症、色素及びタンパク質の蓄積を見ることができる。
いくつかの実施形態では、従来の染色は、ヘマトキシリンである。他の実施形態では、従来の染色はエオシンである。さらに他の実施形態では、従来の染色は、ヘマトキシリン及びエオシンの両方を含む。いくつかの実施形態では、従来のスタチン（ｓｔａｔｉｎ）は、エオシンＢ（Ｃ．Ｉ．４５４００）、エオシンＹ（Ｃ．Ｉ．４５３８０）、エリスロシン（Ｃ．Ｉ．４５４３０）、及び／又はエチルエオシン（Ｃ．Ｉ．４５３８６）である。
組織では、ヘマトキシリンは、約６００で広い最大値を示すが、「ブルーイング」処置などの条件及びある程度は組織に応じて、約５９０～６２０ｎｍの範囲である。組織では、エオシンは約５３３ｎｍの最大吸光度を有する。扁桃組織で記録されたＨ＆Ｅスペクトルを図９及び図１０に示す。
特殊染色
特殊染色は、様々な組織、構造、細胞、細胞小器官、炭水化物、ミネラル及び微生物の顕微鏡による視覚化及び一般的な同定のための基本的な化学反応に依存するスライドベースの染色の多様なファミリーに属する。特殊染色は日常的ではないため、「特殊」である。「特殊染色」は、免疫組織化学的染色、ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション染色、又は「日常的染色」ではない、組織学的分析に有用な任意の化学ベースの染色を指す。特殊染色は、染色が困難な組織タイプ、珍しい疾患、感染症、又は組織に影響を及ぼす他の非典型的な状況に応じて開発された化学ベースの染色である。いくつかの実施形態では、Ｈ＆Ｅ染色によって可視化されない特定の構造及び組織を同定及び実証するために、特殊染色が使用される。
いくつかの実施形態では、特殊染色の有用な用途には、（１）ＤＮＡ及びＤＮＡ含有量の決定、（２）薬物、ホルモン又は潜在的に毒性の食品添加物の作用様式、（３）代謝生化学、（４）疾患過程の生化学、（５）多くの転移性腫瘍の原発部位、（６）非色素性転移性黒色腫の同定、（７）早期浸潤腫瘍の検出、（８）外科的に切除された腫瘍の周縁部の定義、（９）Ｂａｒｒ体の同定、（１０）適切な機器による細胞分離の基礎として使用することができる方法での細胞の染色（例えば、蛍光）、及び／又は（１１）微生物の同定（例えば、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ））が含まれる。
ファンギーソン－ファンギーソン染色は、コラーゲンと筋肉組織などの他の結合組織との間の違いを強調するために使用される染色である。ファンギーソン染色は、多くの場合、異なる種類の腫瘍における線維の特徴的な配置を同定するために使用される。ファンギーソン染色は、ピクリン酸と酸性フクシン（トリスルホン化パラロサミン、最大吸光度約５４４ｎｍ）の混合物を使用して組織試料に浸透し、コラーゲンを赤色にする。周囲の筋肉組織及び血球は黄色に染色される。いくつかの実施形態では、酸性フクシンは、約５２０ｎｍ～約５７０ｎｍの範囲の第１のピーク吸光度波長を有する。
トルイジンブルー－トルイジンブルーは、酸性組織を染色する異色性色素の一種である（最大吸光度約６２８ｎｍ）。トルイジンブルーは、特に核酸に引き付けられるため、高濃度のＤＮＡ及びＲＮＡを有する組織を染色するために使用される。トルイジンブルーと接触すると、核酸は青色になる。
アルシアンブルー－アルシアンブルーは、グリコサミノグリカン及び酸性ムチンなどの物質に対する特異性を提供し（アルシアンブルー８Ｇ、水中での最大吸光度６１５ｎｍ）、酸性ムチン及び粘膜物質を青色に見え、ニュートラルレッドを対比染色すると核を赤みがかったピンク色に見えるフタロシアニン色素である。アルシアンブルー色素は水溶性であり、銅を含むため青色に見える。それらは、硫酸及びカルボキシル化酸性ムコ多糖及び糖タンパク質に結合し、色素結合は純粋に静電的である。この染色は、ムコイド変性を確認し、様々な結合組織腫瘍及び上皮組織腫瘍によって放出される酸性ムチンを同定するために行われる。５０５ｎｍ～５３５ｎｍの範囲の吸光度最大値を有するヌクレアファストレッド染色（Ｃ．Ｉ．６０７６０）を対比染色として使用することができる。ヌクレアファストレッド染色は、ヌクレアファストレッド色素を硫酸アルミニウム媒染剤と組み合わせて、核のクロマチンレッドを選択的に染色し、ピンク色の色調の非特異的なバックグラウンド組織染色を提供する。
ギムザ－これは、クロマチン及び核膜の染色のために組織病理学的に使用することができる血液染色である。それは、ヒト細胞と病原性細胞を異なって染色し、したがって、ヒト細胞を紫色に染色し、細菌細胞をピンク色に染色することによってそれらが区別され得るので、多くの疾患の診断に使用される。これはまた、血液細胞を染色するために使用され、その結果、それらの組成及び構造が観察され得る。核は紫色に染色され、細胞質は細胞型に応じて青色から淡桃色に染色される。ギムザ染色は、異なる血液細胞の顆粒を、異なる色に染色することによって区別する。好塩基球は暗青色顆粒を示し、好酸球は橙色顆粒を示す。典型的には、メチレンブルー（約６５６～約６６１ｎｍの範囲の吸光度最大値を有する）、エオシンＹ（約５１６ｎｍの吸光度最大値を有する）、及びアズールＢ（約６３９ｎｍの吸光度最大値を有する）が適用される。
レチクリン－レチクリン染色は、レチクリン線維（ＩＩＩ型コラーゲン）を強調するために切片の銀含浸の使用を使用する。それは主に肝臓の組織病理学に使用されるが、脾臓、骨髄及び腎臓の異常を評価するためにも使用することができる。肝臓では、壊死と肝硬変の両方が不規則なパターンのレチクリンを引き起こす。染色は、繊維を黒色に染色する原因となり、これは、より淡い灰色又はピンク色の背景とは対照的である。染色手順中、銀を添加する前に、組織を最初に酸化し、次いで鉄ミョウバンで感作しなければならない。銀が添加されたら、それが可視になるようにホルマリンを使用して還元しなければならない。核を可視化するために、ヌクレアファストレッドを使用して核を対比赤色にすることもできる。一次染色は、非常に広い吸光度を有する銀染色であり、場合によってはＩＲにまで及ぶ。
Ｎｉｓｓｌ－Ｎｉｓｓｌ染色は、ニューロンに見られるＮｉｓｓｌ物質（粗面小胞体及び遊離ポリリボソームの塊）を視覚化するために使用される。この染色はニューロンをグリアから区別し、この染色の助けを借りてニューロンの細胞構造を十分に研究することができる。Ｎｉｓｓｌ物質の喪失は、細胞傷害又は変性などの異常を示すことができ、これは疾患を示すことができる。この染色で一般的に使用される色素は、Ｃｒｅｓｙｌ Ｅｃｈｔ Ｖｉｏｌｅｔ Ａｃｅｔａｔｅ（約５９６～約６０１ｎｍの範囲の吸光度最大値を有する）と呼ばれ、蒸留水と溶液中で混合される。これは、Ｎｉｓｓｌ物質を暗青又は暗紫色に染色する。
オルセイン－オルセイン染色は、ウイルスの封入体を同定するために使用される。これらは、ヒト細胞内のウイルス粒子であり、ウイルス自体とは異なり、光学顕微鏡を使用して可視である。オルセイン染色は、肝細胞に封入体形成を引き起こすＢ型肝炎を診断するために一般的に使用される。オルセイン（約５７５ｎｍの範囲の吸光度最大値を有する）は、アミノ－及びヒドロキシフェノキサゾン化合物の混合物から構成される。染色の結果、封入体が濃い茶色～紫色に染色される。銅に関連するタンパク質も濃い紫色に染色される。
ズダンブラックＢ－ズダンブラックＢ（約５９８ｎｍの吸光度最大値を有し、約４１５ｎｍの肩部を有する）は、脂質及びリポフスチンを同定するために使用される非イオン性疎水性色素である。リポフスチンは、ニューロン及び心臓細胞のような永久細胞において高齢者に生じる加齢色素である。リポフスチンは、細胞の難消化性部分を吸収したリソソームの構築に起因する。ズダンブラックＢは、リポフスチンを黒色に染色する。ズダンブラックＢは、脂質及び脂肪を染色するために一般的に使用されるため、リポフスチンを染色するという事実は重要である。ズダンブラックＢは、赤血球も黒色に染色することができる。
マッソントリクローム－トリクローム染色は、結合組織中の筋肉、コラーゲン線維、フィブリン及び赤血球を区別するために使用される３つの色素の混合物である。３つの色素のうちの１つは、通常、核染色であり、他の２つの色素は主に、コラーゲン及び筋線維を区別する。この染色における３つの異なる色素は、異なるサイズの分子を有し、これらは異なって組織に浸透する。より大きな分子が透過することができる場合、より小さな分子は位置が変わる。最初に、ビーブリッヒスカーレット（約５０５ｎｍの吸光度最大値を有する）などの酸性色素を使用し、続いてリンタングステン酸及びリンモリブデン酸を使用し、最後にライトグリーン（約４２２ｎｍ及び約６３０ｎｍの吸光度最大値を有する）などの繊維染色を使用する。ワイゲルトの鉄ヘマトキシリンも使用されるが、手順の開始時に固定剤として使用される。染色が行われた後、核は黒みがかった色又は青色に見え、筋肉及びフィブリンは赤色に見え、コラーゲンは緑色に見える。
マロリー・トリクローム（Ｍａｌｌｏｒｙ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）－マロリー・トリクロームはコラーゲンと筋線維とを区別する。マロリー・トリクロームは３つの色素を含み、１つ目は希釈された酸性フクシン（約５４６ｎｍの吸光度最大値を有する）であり、２つ目は希釈されたリンモリブデン酸であり、３つ目はオレンジＧ（約４７５ｎｍの吸光度最大値を有する）、メチルブルー（アニリンブルー；約６００ｎｍの吸光度最大値を有する）、シュウ酸及び蒸留水の混合物である。手順の最後に、核及び筋細胞は赤色に見え、コラーゲンは青色に見え、赤血球はオレンジ色になる。
アザントリクローム－アザントリクローム染色は、筋肉及びコラーゲンを染色するために使用され、筋肉組織とコラーゲン組織を区別するため、並びに肝障害などの疾患を識別するために使用することができる。アザントリクロームは、細胞を細胞外成分と区別し、筋線維を赤色、軟骨及び骨基質を青色に染色する。マロリー・ホスホモリブデン酸オレンジＧ（約４７５ｎｍの吸光度最大値を有する）及びアニリンブルー（約６００ｎｍの吸光度最大値を有する）溶液と同様に、しかし、核を染色するために酸性フクシンを使用する代わりに、アゾカルミンと呼ばれる色素（吸光度最大値Ｂが約５１６ｎｍ、Ｇが約５１１ｎｍ）を使用し、これを酢酸及び蒸留水と組み合わせる。アニリンブルーは、核を染色するためにアゾカルミンの対比染色として使用される。この手順は、赤色の核、オレンジ色の筋細胞、及び青色のコラーゲンをもたらし、顕微鏡下での区別を可能にする。
Ｃａｓｏｎトリクローム－この染色は、コラーゲンを区別するために使用される。したがって、その用途は、コラーゲン異常に関係する障害の診断を含む。これは、核及び細胞質を赤色に、コラーゲンを青色に、及び赤血球をオレンジ色に染色する。使用される染色は、オレンジＧ（約４７５ｎｍの最大吸光度を有する）、酸性フクシン（約５４６ｎｍの最大吸光度を有する）、アニリンブルー（約６００ｎｍの最大吸光度を有する）、リンタングステン酸及び蒸留水を含む色素の混合物である。
ＰＡＳ（過ヨウ素酸シッフ）－この染色はグリコーゲンを着色し、したがって、膜、粘膜物質並びに真菌の存在を調べるために使用される。ＰＡＳ染色のプロセスは、通常、２つのステップを含み、第１のステップは、アルデヒドの形成をもたらす過ヨウ素酸との酸化反応であり、第２のステップは、シッフ試薬の助けを借りたこれらのアルデヒドの実証である。シッフ試薬中のフクシン色素は、マゼンタから紫色の範囲の色を与える。染色プロセスは、過ヨウ素酸、ヘマトキシリン、並びに、塩基性フクシン（約５４７～約５５２ｎｍの吸光度最大値を有する）及びメタ重亜硫酸ナトリウムを蒸留水及び塩酸と組み合わせて含むシッフ試薬（複合体、約６２８ｎｍの吸光度最大値を有するＤＮＡとの反応生成物）を使用する。この染色により、核は青色になり、グリコーゲン及び真菌はマゼンタ色になる。ＰＡＳは、多くの診断用途において有用である。例えば、糖原病、特定の肉腫及び癌腫、並びに真菌感染症を診断するために使用することができる。
ワイゲルトのレゾルシンフクシン（ワイゲルトの弾性）－このタイプの染色は、弾性繊維を着色するために使用される。これにより、それらは青黒色に染色され、核は明るい青黒色になり、コラーゲンはピンク色又は赤色になり、他の組織は黄色になる。溶液は塩基性フクシン（約５４７～約５５２ｎｍの吸光度最大値を有する）を含み、これは弾性繊維に付着する複合体を生成し、弾性繊維を染色させる。ワイゲルト染色液はまた、レゾルシン、塩化第二鉄、エタノール、蒸留水及び塩酸から構成される。ヘマトキシリン及びファンギーソン染色も対比染色として使用される。
ライト及びライトギムザ染色－ライト及びライトギムザ染色は、エオシン及びメチレンブルーを含有するため、多色染色である。ギムザ染色は、メチレンブルーのアズールをさらに含有し、核の特徴を増強する。次に、エオシンＹは、細胞の細胞質をオレンジ色に染色するために用いられる。これらはいずれも末梢血塗抹及び骨髄塗抹の染色に用いられる。それらは、細胞並びにそれらの形態を調べるために使用され、感染症及び白血病などの血液疾患の診断を助ける。
アルデヒドフクシン－膵臓内の弾性繊維及びベータ細胞顆粒を染色する。これはまた、マスト細胞顆粒及び軟骨マトリックスのような他の高親和性好塩基性部位がほとんどなく、非常に選択的である。弾性組織繊維は、ベータ細胞顆粒及び硫酸化ムチンと同様に、青紫色に染色される。アルデヒドフクシン溶液は、塩基性フクシン（約５４７～約５５２ｎｍの吸光度最大値を有する）、約７０％エタノール、濃塩酸、及びパラアルデヒドの混合物を含有する。アルデヒドフクシンは、一般にアルシアンブルーと組み合わせて使用される。
抗酸－Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属及びＮｏｃａｒｄｉａ属のメンバーなどの抗酸細菌生物を同定するために使用される差次的染色。結核の診断において特に重要である（カルボルフクシン及び一次染色剤として及びメチレンブルーは対比染色剤として）。
いくつかの実施形態では、従来の色素は、酸性フクシン（Ｃ．Ｉ．４２６８５；吸光度最大５４６ｎｍ）、アルシアンブルー８ＧＸ（Ｃ．Ｉ．７４２４０；吸光度最大６１５ｎｍ）、アリザリンレッドＳ（Ｃ．Ｉ．５８００５；吸光度最大５５６及び５９６ｎｍ）、オーラミンＯ（Ｃ．Ｉ．４１０００；吸光度最大３７０及び４３２ｎｍ）、アゾカルミンＢ（Ｃ．Ｉ．５００９０；吸光度最大５１６ｎｍ）、アゾカルミンＧ（Ｃ．Ｉ．５００８５；吸光度最大５１１ｎｍ）、アズールＡ（Ｃ．Ｉ．５２００５；アズールＢと同様の吸光度）、アズールＢ（Ｃ．Ｉ．５２０１０；吸光度最大６３９ｎｍ）、塩基性フクシン（Ｃ．Ｉ．４２５１０；吸光度最大５４７～５５２ｎｍ）、ビスマルックブラウンＹ（Ｃ．Ｉ．２１０００；吸光度最大６４３ｎｍ）、ブリリアントクレジルブルー（Ｃ．Ｉ．５１０１０；吸光度最大６２２ｎｍ）、カルミン（Ｃ．Ｉ．７５４７０；吸光度最大プロトン化４９０～４９５、塩基中及び金属塩と組み合わせた場合に増加）、クロラゾールブラックＥ（Ｃ．Ｉ．３０２３５；吸光度最大５００～５０４ ｎｍ及び５７４～６０２ｎｍ）、コンゴレッド（Ｃ．Ｉ．２２１２０；吸光度最大４９７ｎｍ）、クレジルバイオレット（最大吸光度５９６～６０１ｎｍ）、クリスタルバイオレット（Ｃ．Ｉ．４２５５５；吸光度最大５９０ｎｍ）、ダローレッド（最大吸光度５０２ｎｍ）、エチルグリーン（Ｃ．Ｉ．４２５９０；吸光度最大６３５ｎｍ ４２０ｎｍ）、ファストグリーンＦＣＦ（Ｃ．Ｉ．４２０５３；吸光度最大６２４ｎｍ、ｐＨ依存性）、ギムザ染色（不純なアズールＢ、メチレンブルー及びエオシンＹの混合物）、インジゴカルミン（Ｃ．Ｉ．７３０１５；吸光度最大６０８ｎｍ）、ヤヌスグリーンＢ（Ｃ．Ｉ．１１０５０；吸光度最大６３０ｎｍ）、ジェンナー染色１８９９、ライトグリーンＳＦ（Ｃ．Ｉ．４２０９５；吸光度最大４２２及び６３０ｎｍ）、マラカイトグリーン（Ｃ．Ｉ．４２０００；吸光度最大６１４及び４２５ｎｍ）、マーチウスイエロー（Ｃ．Ｉ．１０３１５；吸光度最大４２０～４３２ｎｍ）、メチルオレンジ（Ｃ．Ｉ．１３０２５；吸光度最大５０７ｎｍ）、メチルバイオレット２Ｂ（Ｃ．Ｉ．４２５３５；吸光度最大５８３～５８７ｎｍ）、メチレンブルー（Ｃ．Ｉ．５２０１５；吸光度最大６５６～６６１ｎｍ）、メチレンバイオレット（Ｂｅｒｎｔｈｓｅｎ）、（Ｃ．Ｉ．５２０４１；吸光度最大５８０～６０１ｎｍ）、ニュートラルレッド（Ｃ．Ｉ．５００４０；吸光度最大４５４、５２９、５４１ｎｍ、ｐＨ及び溶剤依存性）、ニグロシン（Ｃ．Ｉ．５０４２０；吸光度最大５７０～５８０ｎｍ）、ナイルブルーＡ（Ｃ．Ｉ．５１１８０；吸光度最大６３３～６６０ｎｍ）、ヌクレアファストレッド（Ｃ．Ｉ．６０７６０；吸光度最大５３５及び５０５ｎｍ）、オイルレッドＯ（Ｃ．Ｉ．２６１２５；吸光度最大５１８及び３５９ｎｍ）、オレンジＧ（Ｃ．Ｉ．１６２３０；吸光度最大４７５ｎｍ）、オレンジＩＩ（Ｃ．Ｉ．１５５１０；吸光度最大４８３ｎｍ）、オルセイン（最大吸光度５７５～５９０ ｐＨ依存性、パラロアニリン（Ｃ．Ｉ．４２５００；吸光度最大５４５ｎｍ）、フロキシンＢ（Ｃ．Ｉ．４５４１０；吸光度最大５４８及び５１０ｎｍ）、ピロニンＢ（Ｃ．Ｉ．４５０１０；ピロニンＹに非常に関連）、ピロニンＹ（Ｃ．Ｉ．４５００５；吸光度最大５４６～５４９ｎｍ）、レサズリン（吸光度最大５９８ｎｍ：水中、４７８ｎｍ：メタノール中）、ローズベンガル（Ｃ．Ｉ．４５４３５；吸光度最大５４６ｎｍ）、サフラニンＯ（Ｃ．Ｉ．５０２４０；吸光度最大５３０ｎｍ）、ズダンブラックＢ（Ｃ．Ｉ．２６１５０；吸光度最大５９８及び４１５ｎｍｎｍ）、ズダンＩＩＩ（Ｃ．Ｉ．２６１００；吸光度最大５０３～５０７及び５０３ｎｍ）、ズダンＩＶ（Ｃ．Ｉ．２６１０５；吸光度最大５２０ｎｍ）、テトラクローム染色（ＭａｃＮｅａｌ）、チオニン（Ｃ．Ｉ．５２０００；吸光度最大５９８～６０２ｎｍ）、トルイジンブルー（Ｃ．Ｉ．５２０４０；吸光度最大６２６～６３０ｎｍ）、ワイゲルトのレゾルシンフクシン（吸光度最大５０８ｎｍ）、ライト染色、及びそれらの任意の組み合わせである。これらの例の各々において、「Ｃ．Ｉ．」は、Ｃｏｌｏｒ Ｉｎｄｅｘ（商標）を指す。Ｃｏｌｏｒ Ｉｎｄｅｘ（商標）は、その認識されている使用クラス、その色相及びシリアル番号（関連する着色剤タイプがＣｏｌｏｒ Ｉｎｄｅｘに登録されている時系列を単に反映している）によって市販品を記述する。この定義により、特定の製品を、必須の着色剤が同じ化学構成であり、その必須の着色剤が単一の化学反応又は一連の反応から生じる他の製品と共に分類することが可能になる。
いくつかの実施形態では、可視色素は、コンゴーレッド、ビーブリッヒスカーレット－酸性フクシン、カルボルフクシン、塩化金、マラカイトグリーン、メチルグリーン－ピロニン、リンモリブデン酸、サフラニンＯ、銀染色、及びそれらの任意の組み合わせである。
標識され得るバイオマーカー及びバイオマーカーの非限定的な例
いくつかの実施形態では、生物学的検体内の１つ又は複数の標的はバイオマーカーである。本明細書で使用される「バイオマーカー」という用語は、生物学的検体中で検出され得る指標、例えば、予測指標、診断指標、及び／又は予後指標、例えば、ＰＤ－Ｌ１を指す。バイオマーカーは、ある特定の分子的、病理学的、組織学的、及び／又は臨床的特徴によって特徴付けられる疾患又は障害（例えば、癌）の特定のサブタイプの指標としての機能を果たし得る。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、遺伝子である。バイオマーカーとしては、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）、ポリヌクレオチドコピー数の変化（例えば、ＤＮＡコピー数）、ポリペプチド、ポリペプチド、及びポリヌクレオチド修飾（例えば、翻訳後修飾）、炭水化物、並びに／又は糖脂質に基づく分子マーカーが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な実施形態として、抗原、エピトープ、細胞タンパク質、膜貫通タンパク質、及びＤＮＡ又はＲＮＡ配列が含まれる。Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ遺伝子及びタンパク質は、両方ともバイオマーカーの例示的な実施形態である。
上記のように、バイオマーカー標的は、核酸配列又はタンパク質であり得る。本開示を通して、標的バイオマーカータンパク質に言及する場合、そのタンパク質に関連する核酸配列もバイオマーカー標的として使用できることが理解される。いくつかの実施形態では、バイオマーカー標的は、ウイルス、細菌等の病原体、又はウイルスゲノム等の細胞内寄生体に由来するタンパク質若しくは核酸分子である。例えば、バイオマーカー標的タンパク質は、疾患に関連する（例えば、相関する、因果関係がある等）標的核酸配列から産生され得る。
バイオマーカー標的核酸配列は、サイズが実質的に異なり得る。限定されないが、核酸配列は、可変数の核酸残基を有することができる。例えば、バイオマーカー標的核酸配列は、少なくとも約１０個の核酸残基、又は少なくとも約２０、３０、５０、１００、１５０、５００、１０００個の残基を有することができる。同様に、バイオマーカー標的ポリペプチドは、サイズが実質的に異なり得る。限定されないが、バイオマーカー標的ポリペプチドは、ペプチド特異的抗体又はその断片に結合する少なくとも１つのエピトープを含む。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドは、ペプチド特異的抗体又はその断片に結合する少なくとも２つのエピトープを含むことができる。
特定の非限定的な実施形態では、バイオマーカー標的タンパク質は、新生物（例えば、癌）に関連する標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）によって産生される。腫瘍細胞、特にＢ細胞及びＴ細胞白血病、リンパ腫、乳癌、結腸癌、神経癌等の癌細胞において、多数の染色体異常（転座及び他の再配列、増幅又は欠失を含む）が確認されている。したがって、いくつかの実施形態では、バイオマーカー標的分子の少なくとも一部は、試料中の細胞の少なくともサブセットにおいて増幅又は欠失された核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）によって産生される。
癌遺伝子は、いくつかのヒト悪性腫瘍の原因であることが知られている。例えば、染色体１８ｑ１１．２のブレークポイント領域に位置するＳＹＴ遺伝子を含む染色体再編成は、滑膜肉腫軟部組織腫瘍の間で一般的である。ｔ（１８ｑ１１．２）転座は、例えば、異なる標識を有するプローブを使用して同定することができ、第１のプローブは、ＳＹＴ遺伝子から遠位に伸長する標的核酸配列から生成されたＦＰＣ核酸分子を含み、第２のプローブは、ＳＹＴ遺伝子の３’側又は近位に伸長する標的核酸配列から生成されたＦＰＣ核酸を含む。これらの標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）に対応するプローブをｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション手順で使用すると、ＳＹＴ遺伝子領域にｔ（１８ｑ１１．２）を欠く正常細胞は、ＳＹＴの２つのインタクトなコピーを反映する２つの融合（近接した２つの標識によって生成される）シグナルを示す。ｔ（１８ｑ１１．２）を有する異常細胞は、単一の融合シグナルを示す。
他の実施形態では、悪性細胞において欠失している（失われている）腫瘍抑制遺伝子である核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）から産生されるバイオマーカー標的タンパク質が選択される。例えば、染色体９ｐ２１にあるｐ１６領域（Ｄ９Ｓ１７４９、Ｄ９Ｓ１７４７、ｐ１６（ＩＮＫ４Ａ）、ｐ１４（ＡＲＦ）、Ｄ９Ｓ１７４８、ｐ１５（ＩＮＫ４Ｂ）、及びＤ９Ｓ１７５２を含む）は、特定の膀胱癌で欠失される。第１染色体の短腕の遠位領域（例えば、ＳＨＧＣ５７２４３、ＴＰ７３、ＥＧＦＬ３、ＡＢＬ２、ＡＮＧＰＴＬ１、及びＳＨＧＣ－１３２２を包含する）、及び第１９染色体のセントロメア周辺領域（例えば、１９ｐ１３－１９ｑ１３）（例えば、ＭＡＮ２Ｂ１、ＺＮＦ４４３、ＺＮＦ４４、ＣＲＸ、ＧＬＴＳＣＲ２、及びＧＬＴＳＣＲ１を包含する）が関与する染色体欠失は、中枢神経系の特定のタイプの固形腫瘍の特徴的な分子的特徴である。
前述の実施形態は、例示のみを目的として提供されており、限定することを意図するものではない。腫瘍性形質転換及び／又は増殖と相関する他の多くの細胞遺伝学的異常が、当業者に知られている。また、腫瘍性形質転換と相関しており、開示される方法において有用である核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）によって産生されるバイオマーカー標的タンパク質としては、ＥＧＦＲ遺伝子（７ｐ１２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００７、ヌクレオチド５５０５４２１９－５５２４２５２５）、Ｃ－ＭＹＣ遺伝子（８ｑ２４．２１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００８、ヌクレオチド１２８８１７４９８－１２８８２２８５６）、Ｄ５Ｓ２７１（５ｐ１５．２）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）遺伝子（８ｐ２２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００８、ヌクレオチド１９８４１０５８－１９８６９０４９）、ＲＢ１（１３ｑ１４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１３、ヌクレオチド４７７７５９１２－４７９５４０２３）、ｐ５３（１７ｐ１３．１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１７、補体、ヌクレオチド７５１２４６４－７５３１６４２））、Ｎ－ＭＹＣ（２ｐ２４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００２、補体、ヌクレオチド１５１８３５２３１－１５１８５４６２０）、ＣＨＯＰ（１２ｑ１３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１２、補体、ヌクレオチド５６１９６６３８－５６２００５６７）、ＦＵＳ（１６ｐ１１．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１６、ヌクレオチド３１０９８９５４－３１１１０６０１）、ＦＫＨＲ（１３ｐ１４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１３、補体、ヌクレオチド４００２７８１７－４０１３８７３４）、と並んで、例えば、ＡＬＫ（２ｐ２３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００２、補体、ヌクレオチド２９２６９１４４－２９９９７９３６）、Ｉｇ重鎖、ＣＣＮＤ１（１１ｑ１３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１１、ヌクレオチド６９１６５０５４．６９１７８４２３）、ＢＣＬ２（１８ｑ２１．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１８、補体、ヌクレオチド５８９４１５５９－５９１３７５９３）、ＢＣＬ６（３ｑ２７；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００３、補体、ヌクレオチド１８８９２１８５９－１８８９４６１６９）、ＭＡＬＦ１、ＡＰ１（１ｐ３２－ｐ３１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００１、補体、ヌクレオチド５９０１９０５１－５９０２２３７３）、ＴＯＰ２Ａ（１７ｑ２１－ｑ２２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１７、補体、ヌクレオチド３５７９８３２１－３５８２７６９５）、ＴＭＰＲＳＳ（２１ｑ２２．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００２１、補体、ヌクレオチド４１７５８３５１－４１８０１９４８）、ＥＲＧ（２１ｑ２２．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００２１、補体、ヌクレオチド３８６７５６７１－３８９５５４８８）；ＥＴＶ１（７ｐ２１．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００７、補体、ヌクレオチド１３８９７３７９－１３９９５２８９）、ＥＷＳ（２２ｑ１２．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００２２、ヌクレオチド２７９９４２７１－２８０２６５０５）；ＦＬＩ１（１１ｑ２４．１－ｑ２４．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１１、ヌクレオチド１２８０６９１９９－１２８１８７５２１）、ＰＡＸ３（２ｑ３５－ｑ３７；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００２、補体、ヌクレオチド２２２７７２８５１－２２２８７１９４４）、ＰＡＸ７（１ｐ３６．２－ｐ３６．１２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００１、ヌクレオチド１８８３００８７－１８９３５２１９）、ＰＴＥＮ（１０ｑ２３．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１０、ヌクレオチド８９６１３１７５－８９７１６３８２）、ＡＫＴ２（１９ｑ１３．１－ｑ１３．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１９、補体、ヌクレオチド ４５４３１５５６－４５４８３０３６）、ＭＹＣＬ１（１ｐ３４．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００１、補体、ヌクレオチド４０１３３６８５－４０１４０２７４）、ＲＥＬ（２ｐ１３－ｐ１２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００２、ヌクレオチド６０９６２２５６－６１００３６８２）及びＣＳＦ１Ｒ（５ｑ３３－ｑ３５；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００５、補体、ヌクレオチド１４９４１３０５１－１４９４７３１２８）が挙げられる。
他の実施形態では、バイオマーカー標的タンパク質は、疾患又は症状に関連するウイルス又は他の微生物から選択される。細胞又は生物学的検体中のウイルス又は微生物由来の標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）の検出は、生物の存在を示す。例えば、バイオマーカー標的ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、発癌性又は病原性ウイルス、細菌又は細胞内寄生生物（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）及び他のプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）（種）、小形クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、原虫である赤痢アメ－バ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、及びランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、並びにトキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、アイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）、タイレリア（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）、及びバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）種）のゲノムから選択することができる。
いくつかの実施形態では、バイオマーカー標的タンパク質は、ウイルスゲノムからの核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）から産生される。例示的なウイルス及び対応するゲノム配列（括弧内のＧＥＮＢＡＮＫ（商標）ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号）としては、ヒトアデノウイルスＡ（ＮＣ－００１４６０）、ヒトアデノウイルスＢ（ＮＣ－００４００１）、ヒトアデノウイルスＣ（ＮＣ－００１４０５）、ヒトアデノウイルスＤ（ＮＣ－００２０６７）、ヒトアデノウイルスＥ（ＮＣ－００３２６６）、ヒトアデノウイルスＦ（ＮＣ－００１４５４）、ヒトアストロウイルス（ＮＣ－００１９４３）、ヒトＢＫポリオーマウイルス（Ｖ０１１０９；ＧＩ：６０８５１）ヒトボカウイルス（ＮＣ－００７４５５）、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＮＣ－００２６４５）、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＮＣ－００６５７７）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＮＣ－００５８３１）、ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＮＣ－００５１４７）、ヒトエンテロウイルスＡ（ＮＣ－００１６１２）、ヒトエンテロウイルスＢ（ＮＣ－００１４７２）、ヒトエンテロウイルスＣ（ＮＣ－００１４２８）、ヒトエンテロウイルスＤ（ＮＣ－００１４３０）、ヒトエリスロウイルスＶ９（ＮＣ－００４２９５）、ヒト泡沫状ウイルス（ＮＣ－００１７３６）、ヒトヘルペスウイルス１（単純ヘルペスウイルス１型）（ＮＣ－００１８０６）、ヒトヘルペスウイルス２（単純ヘルペスウイルス２型）（ＮＣ－００１７９８）、ヒトヘルペスウイルス３（水痘帯状疱疹ウイルス）（ＮＣ－００１３４８）、１型ヒトヘルペスウイルス４（エプスタイン・バー・ウイルス１型）（ＮＣ－００７６０５）、２型ヒトヘルペスウイルス４（エプスタイン・バー・ウイルス２型）（ＮＣ－００９３３４）、ヒトヘルペスウイルス５株ＡＤ１６９（ＮＣ－００１３４７）、ヒトヘルペスウイルス５株Ｍｅｒｌｉｎ株（ＮＣ－００６２７３）、ヒトヘルペスウイルス６Ａ（ＮＣ－００１６６４）、ヒトヘルペスウイルス６Ｂ（ＮＣ－０００８９８）、ヒトヘルペスウイルス７（ＮＣ－００１７１６）、ヒトヘルペスウイルス８型Ｍ（ＮＣ－００３４０９）、ヒトヘルペスウイルス８型Ｐ（ＮＣ－００９３３３）、ヒト免疫不全ウイルス１（ＮＣ－００１８０２）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＮＣ－００１７２２）、ヒトメタニューモウイルス（ＮＣ－００４１４８）、ヒトパピローマウイルス－１（ＮＣ－００１３５６）、ヒトパピローマウイルス－１８（ＮＣ－００１３５７）、ヒトパピローマウイルス－２（ＮＣ－００１３５２）、ヒトパピローマウイルス－５４（ＮＣ－００１６７６）、ヒトパピローマウイルス－６１（ＮＣ－００１６９４）、ヒトパピローマウイルス－ｃａｎｄ９０（ＮＣ－００４１０４）、ヒトパピローマウイルスＲＴＲＸ７（ＮＣ－００４７６１）、ヒトパピローマウイルス１０型（ＮＣ－００１５７６）、ヒトパピローマウイルス１０１型（ＮＣ－００８１８９）、ヒトパピローマウイルス１０３型（ＮＣ－００８１８８）、ヒトパピローマウイルス１０７型（ＮＣ－００９２３９）、ヒトパピローマウイルス１６型（ＮＣ－００１５２６）、ヒトパピローマウイルス２４型（ＮＣ－００１６８３）、ヒトパピローマウイルス２６型（ＮＣ－００１５８３）、ヒトパピローマウイルス３２型（ＮＣ－００１５８６）、ヒトパピローマウイルス３４型（ＮＣ－００１５８７）、ヒトパピローマウイルス４型（ＮＣ－００１４５７）、ヒトパピローマウイルス４１型（ＮＣ－００１３５４）、ヒトパピローマウイルス４８型（ＮＣ－００１６９０）、ヒトパピローマウイルス４９型（ＮＣ－００１５９１）、ヒトパピローマウイルス５型（ＮＣ－００１５３１）、ヒトパピローマウイルス５０型（ＮＣ－００１６９１）、ヒトパピローマウイルス５３型（ＮＣ－００１５９３）、ヒトパピローマウイルス６０型（ＮＣ－００１６９３）、ヒトパピローマウイルス６３型（ＮＣ－００１４５８）、ヒトパピローマウイルス６ｂ型（ＮＣ－００１３５５）、ヒトパピローマウイルス７型（ＮＣ－００１５９５）、ヒトパピローマウイルス７１型（ＮＣ－００２６４４）、ヒトパピローマウイルス９型（ＮＣ－００１５９６）、ヒトパピローマウイルス９２型（ＮＣ－００４５００）、ヒトパピローマウイルス９６型（ＮＣ－００５１３４）、ヒトパラインフルエンザウイルス１（ＮＣ－００３４６１）、ヒトパラインフルエンザウイルス２（ＮＣ－００３４４３）、ヒトパラインフルエンザウイルス３（ＮＣ－００１７９６）、ヒトパレコウイルス（ＮＣ－００１８９７）、ヒトパルボウイルス４（ＮＣ－００７０１８）、ヒトパルボウイルスＢ１９（ＮＣ－０００８８３）、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＮＣ－００１７８１）、ヒトライノウイルスＡ（ＮＣ－００１６１７）、ヒトライノウイルスＢ（ＮＣ－００１４９０）、ヒトスピマレトロウイルススプマレトロウイルス（ＮＣ－００１７９５）、ヒトＴリンパ向性ウイルス１（ＮＣ－００１４３６）、ヒトＴリンパ向性ウイルス２（ＮＣ－００１４８８）が挙げられる。
特定の実施形態では、バイオマーカー標的タンパク質は、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）又はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ、例えばＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８）等の発癌性ウイルスからの核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）から産生される。他の実施形態では、核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）から産生される標的タンパク質は、病原性ウイルス、例えば呼吸器合胞体ウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳウイルス）、アデノウイルス、ポリオーマウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に由来する。
検出可能部分
本開示の方法は、１つ又は複数の検出可能部分を利用する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、検出可能なコンジュゲートの成分である。いくつかの実施形態では、本開示の方法で使用され得る検出可能なコンジュゲートは、検出可能部分と、チラミド部分（又はその誘導体若しくは類似体）、キノンメチド部分（又はその誘導体若しくは類似体）、又は「クリックケミストリー」反応に関与することができる官能基（米国特許第１０，０４１，９５０号、並びに米国特許出願公開第２０１９／０２０４３３０号、第２０１７／００８９９１１号、及び第２０１９／０１８７１３０号も参照、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）のうちの１つとを含む。他の実施形態では、本開示の方法で使用され得る検出可能なコンジュゲートは、検出可能部分と、ハプテン、酵素、又は抗体のうちの１つとを含む。
いくつかの実施形態では、適切な検出可能部分は、本明細書でＦＷＨＭ（「半値全幅（ｆｕｌｌ－ｗｉｄｔｈ ｈａｌｆ－ｍａｘ）」）と呼ばれる、最大半値吸光度における吸光度ピークの全幅に従って特徴付けされ得る。ＦＷＨＭは、従属変数がその最大値の半分に等しい独立変数の２つの極値間の差によって与えられる関数の範囲の式である。言い換えれば、最大振幅の半分であるｙ軸上の点の間で測定されたスペクトル曲線の幅である。これは、関数がその最大値の半分に達する曲線上の点間の距離によって与えられる。本質的に、ＦＷＨＭは、曲線又は関数上の「バンプ」の幅を記述するために一般的に使用されるパラメータである。いくつかの実施形態では、吸光度最大値（λｍａｘ）は、検出可能部分の最大吸収の波長を表すことができるが、ＦＷＨＭは、スペクトル吸光度の幅を表す。
いくつかの実施形態では、本開示の検出可能部分は、狭いＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分のＦＷＨＭは、色素、発色団若しくは蛍光団（例えば、ダブシル、ヘマトキシリン）のＦＷＨＭより４０％少ない；色素、発色団若しくは蛍光団のＦＷＨＭより５０％少ない；色素、発色団若しくは蛍光団のＦＷＨＭより５５％少ない；色素、発色団若しくは蛍光団のＦＷＨＭより６５％少ない；色素、発色団若しくは蛍光団のＦＷＨＭより７０％少ない；色素、発色団若しくは蛍光団のＦＷＨＭより７５％少ない；色素、発色団若しくは蛍光団のＦＷＨＭより８０％少ない；色素、発色団若しくは蛍光団のＦＷＨＭより８５％少ない；発色団若しくは蛍光団のＦＷＨＭより９０％小さい；又は色素、発色団若しくは蛍光団のＦＷＨＭより９５％少ない、ＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約１５ｎｍ～約２００ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約１５ｎｍ～約１５０ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約１５ｎｍ～約１００ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約１５ｎｍ～約７０ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約１５ｎｍ～約５０ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約１５ｎｍ～約４０ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約２０ｎｍ～約２００ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約２０ｎｍ～約１５０ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約２０ｎｍ～約１００ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約２０ｎｍ～約７０ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約２０ｎｍ～約５０ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３０ｎｍ～約２００ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３０ｎｍ～約１００ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３０ｎｍ～７０ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、３０ｎｍ～５０ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４０ｎｍ～約２００ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４０ｎｍ～約１００ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４０ｎｍ～７０ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約５０ｎｍ～約２００ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約５０ｎｍ～約１００ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約５０ｎｍ～７０ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約６０ｎｍ～約２００ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約６０ｎｍ～約１５０ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約６０ｎｍ～約１００ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７０ｎｍ～約２００ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７０ｎｍ～約１５０ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７０ｎｍ～約１００ｎｍのＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約１９０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約１８０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約１７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約１６０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約１４０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約１３０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約１２０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約１１０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約９０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約８０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約６０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する吸光度ピークを有する。
紫外スペクトル内の検出可能部分
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、紫外スペクトル内にピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４３０ｎｍ未満のピーク吸光度ピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４２０ｎｍ未満のピーク吸光度ピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４１５ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４１０ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４００ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４０５ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、開示される化合物の検出可能部分は、約３９５ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３９０ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３８５ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３８０ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３７５ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、開示される化合物の検出可能部分は、約３７０ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約１００ｎｍ～約４００ｎｍ、約１００ｎｍ～約３９０ｎｍ、約１００ｎｍ～約３８０ｎｍ、又は約１００ｎｍ～約３７０ｎｍの範囲のピーク吸光度波長を有する。
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４２０ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４１５ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４１０ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４００ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４０５ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、開示される化合物の検出可能部分は、約３９５ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３９０ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３８５ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３８０ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３７５ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、開示される化合物の検出可能部分は、約３７０ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４２０ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４１５ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４１０ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４００ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４０５ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、開示される化合物の検出可能部分は、約３９５ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３９０ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３８５ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３８０ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３７５ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、開示される化合物の検出可能部分は、約３７０ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４２０ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４１５ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４１０ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４００ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４０５ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、開示される化合物の検出可能部分は、約３９５ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３９０ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３８５ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３８０ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３７５ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、開示される化合物の検出可能部分は、約３７０ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４２０ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４１５ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４１０ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４００ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約４０５ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、開示される化合物の検出可能部分は、約３９５ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３９０ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３８５ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３８０ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約３７５ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、開示される化合物の検出可能部分は、約３７０ｎｍ未満のピーク吸光度波長及び約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、クマリンを含むか、又はそれに由来する（すなわち、検出可能部分は、クマリンコアを含む）。クマリンコアを有する適切な検出可能部分の例は、米国特許第１０，０４１，９５０号に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、クマリンコアは、クマリンアミンコアである。いくつかの実施形態では、クマリンコアは、７－クマリンアミンコアである。いくつかの実施形態では、クマリンコアは、クマリノールコアである。いくつかの実施形態では、クマリンコアは７－クマリノールコアである。
いくつかの実施形態では、クマリンコアは、１つ又は複数の電子求引基を含む（又は含むように修飾される）（各電子求引基は同じであっても異なっていてもよい）。いくつかの実施形態では、クマリンコアは、１つの電子求引基を含む（又は含むように修飾される）。いくつかの実施形態では、クマリンコアは、２つの電子求引基を含む（又は含むように修飾される）。いくつかの実施形態では、クマリンコアは、３つの電子求引基を含む（又は含むように修飾されている）。いくつかの実施形態では、クマリンコアは、３つの異なる電子求引基を含む（又は含むように修飾されている）。いくつかの実施形態では、クマリンコアは、４つの電子求引基を含む（又は含むように修飾される）。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の電子求引基は、それぞれ約１．５～約３．５の電気陰性範囲を有する。
いくつかの実施形態では、クマリンコアは、１つ又は複数の電子供与基を含む（又は含むように修飾される）（各電子供与基は同じであっても異なっていてもよい）。いくつかの実施形態では、クマリンコアは、１つの電子供与基を含む（又は含むように修飾される）。いくつかの実施形態では、クマリンコアは、２つの電子供与基を含む（又は含むように修飾される）。いくつかの実施形態では、クマリンコアは、３つの電子供与基を含む（又は含むように修飾されている）。いくつかの実施形態では、クマリンコアは、３つの異なる電子供与基を含む（又は含むように修飾されている）。いくつかの実施形態では、クマリンコアは、４つの電子供与基を含む（又は含むように修飾される）。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の電子供与基は、それぞれ約１．５～約３．５の電気陰性範囲を有する。いくつかの実施形態では、「赤色」スペクトル又は「青色」スペクトルへのシフトを促進するために、１つ又は複数の電子求引基及び／又は電子供与基が組み込まれる。
いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３００ｎｍ～約４６０ｎｍの範囲の波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３２０ｎｍ～約４４０ｎｍの範囲の波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３４０ｎｍ～約４３０ｎｍの範囲の波長を有する。これらの範囲は、多かれ少なかれ電気陰性物質がクマリンコアに導入されるにつれて変化又はシフトし得る。
いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４６０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４５５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４５０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４４５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４４０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４３５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４３０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４２５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４２０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４１５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４１０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４０５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４００ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３９５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３９０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３８５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３８０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３７５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３７０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３６５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３６０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３５５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３５０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３４５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３４０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３３５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３３０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。
いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４６０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４５５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４５０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４４５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４４０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４３５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４３０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４２５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４２０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４１５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４０５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４００ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３９５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３９０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３８５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３８０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３７５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３７０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３６５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３６０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３５５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３５０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３４５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３４０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３３５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３３０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４６０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４５５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４５０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４４５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４４０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４３５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４３０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４２５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４２０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４１５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４０５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４００ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３９５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３９０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３８５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３８０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３７５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３７０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３６５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３６０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３５５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３５０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３４５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３４０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３３５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３３０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４６０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４５５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４５０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４４５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４４０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４３５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４３０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４２５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４２０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４１５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４０５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約４００ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３９５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３９０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３８５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３８０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３７５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３７０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３６５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３６０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３５５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３５０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３４５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３４０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３３５ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クマリンコアを有する検出可能部分は、約３３０ｎｍ＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
クマリンコアを有する検出可能部分の例としては、
Figure 2024507677000015
Figure 2024507677000016
が挙げられる。
式中、記号
Figure 2024507677000017
は、検出可能部分（ここで、クマリンコア）が、検出可能なコンジュゲートの別の部分（例えば、チラミド部分、キノンメチド部分、「クリックケミストリー」反応に関与することが可能な官能基、抗体、酵素、ハプテンなど）に（直接的又は間接的に）結合されている部位を指す。
クマリンコアを有する他の適切な検出可能部分は、米国特許第１０，０４１，９５０号に記載されており、その開示は、それらのクマリン系化合物が約２０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する限り、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
赤外スペクトル内の検出可能部分
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、赤外スペクトル内の波長を有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７４０ｎｍ超の波長を有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７５０ｎｍ超の波長を有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７６０ｎｍ超の波長を有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７６５ｎｍ超の波長を有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７７０ｎｍ超の波長を有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７７５ｎｍ超の波長を有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７８０ｎｍ超の波長を有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７８５ｎｍ超の波長を有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７９０ｎｍ超の波長を有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７６０ｎｍ～約１ｍｍ、約７７０ｎｍ～約１ｍｍ、又は約７８０ｎｍ～約１ｍｍの範囲の波長を有する。
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７４０ｎｍ超の波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７５０ｎｍ超の波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７６０ｎｍ超の波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７６５ｎｍ超の波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７７０ｎｍ超の波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７７５ｎｍ超の波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７８０ｎｍ超の波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７８５ｎｍ超の波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７９０ｎｍ超の波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７４０ｎｍ超の波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７５０ｎｍ超の波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７６０ｎｍ超の波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７６５ｎｍ超の波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７７０ｎｍ超の波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７７５ｎｍ超の波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７８０ｎｍ超の波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７８５ｎｍ超の波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７９０ｎｍ超の波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７４０ｎｍ超の波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７５０ｎｍ超の波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７６０ｎｍ超の波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７６５ｎｍ超の波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７７０ｎｍ超の波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７７５ｎｍ超の波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７８０ｎｍ超の波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７８５ｎｍ超の波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７９０ｎｍ超の波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７４０ｎｍ超の波長及び約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７５０ｎｍ超の波長及び約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７６０ｎｍ超の波長及び約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７６５ｎｍ超の波長及び約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７７０ｎｍ超の波長及び約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７７５ｎｍ超の波長及び約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７８０ｎｍ超の波長及び約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７８５ｎｍ超の波長及び約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、約７９０ｎｍ超の波長及び約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、ヘプタメチンシアニンコアを含むか、又はそれに由来する（すなわち、検出可能部分はヘプタメチンシアニンコアを含む）。
いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアは、１つ又は複数の電子求引基を含む（又は含むように修飾される）（各電子求引基は同じであっても異なっていてもよい）。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアは、１個の電子求引基を含む（又は含むように修飾される）。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアは、２個の電子求引基を含む（又は含むように修飾される）。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアは、３個の電子求引基を含む（又は含むように修飾する）。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアは、３個の異なる電子求引基を含む（又は含むように修飾する）。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアは、４個の電子求引基を含む（又は含むように修飾される）。
いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアは、１個以上の電子供与基を含む（又は含むように修飾される）（各電子求引基は同じであっても異なっていてもよい）。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアは、１個の電子供与基を含む（又は含むように修飾される）。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアは、２個の電子供与基を含む（又は含むように修飾される）。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアは、３個の電子供与基を含む（又は含むように修飾する）。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアは、３個の異なる電子供与基を含む（又は含むように修飾する）。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアは、４個の電子供与基を含む（又は含むように修飾される）。
いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約７８０ｎｍ～約９５０ｎｍの範囲の波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８１０ｎｍ～約９２０ｎｍの範囲の波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンを有する検出可能部分は、約８４０ｎｍ～約８８０ｎｍの範囲の波長を有する。
いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約７８０ｎｍ～約９５０ｎｍの範囲の波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８１０ｎｍ～約９２０ｎｍの範囲の波長及び２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンを有する検出可能部分は、約８４０ｎｍ～約８８０ｎｍの範囲の波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約７８０ｎｍ～約９５０ｎｍの範囲の波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８１０ｎｍ～約９２０ｎｍの範囲の波長及び１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンを有する検出可能部分は、約８４０ｎｍ～約８８０ｎｍの範囲の波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約７８０ｎｍ～約９５０ｎｍの範囲の波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８１０ｎｍ～約９２０ｎｍの範囲の波長及び１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンを有する検出可能部分は、約８４０ｎｍ～約８８０ｎｍの範囲の波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９５０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９４５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９４０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９３５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９３０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９２５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９２０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９１５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９１０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９０５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９００＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８９５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８９０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８８５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８８０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８７０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８６５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８６０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８５５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８５０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８４５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８４０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８３５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８３０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８２５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８２０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８１５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８００＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約７９５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約７９０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約７８５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約７８０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。
いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９５０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９４５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９４０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９３５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９３０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９２５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９２０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９１５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９１０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９０５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９００＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８９５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８９０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８８５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８８０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８７０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８６５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８６０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８５５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８５０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８４５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８４０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８３５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８３０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８２５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８２０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８１５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８００＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約７９５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約７９０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約７８５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約７８０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９５０＋／－１５０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９４５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９４０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９３５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９３０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９２５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９２０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９１５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９１０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９０５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９００＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８９５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８９０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８８５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８８０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８７０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８６５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８６０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８５５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８５０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８４５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８４０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８３５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８３０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８２５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８２０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８１５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８００＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約７９５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約７９０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約７８５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約７８０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９５０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９４５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９４０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９３５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９３０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９２５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９２０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９１５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９１０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９０５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約９００＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８９５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８９０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８８５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８８０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８７０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８６５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８６０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８５５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８５０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８４５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８４０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８３５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８３０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８２５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８２０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８１５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約８００＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約７９５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約７９０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約７８５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、ヘプタメチンシアニンコアを有する検出可能部分は、約７８０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、検出可能部分は、クロコネートコアを含むか、又はそれに由来する（すなわち検出可能部分は、クロコネートコアを含む）。いくつかの実施形態では、クロコネートコアは、１つ又は複数の電子求引基を含む（又は含むように修飾される）（各電子求引基は同じであっても異なっていてもよい）。いくつかの実施形態では、クロコネートコアは、１個の電子求引基を含む（又は含むように修飾される）。いくつかの実施形態では、クロコネートコアは、２個の電子求引基を含む（又は含むように修飾される）。いくつかの実施形態では、クロコネートコアは、３個の電子求引基を含む（又は含むように修飾される）。いくつかの実施形態では、クロコネートコアは、３個の異なる電子求引基を含む（又は含むように修飾される）。いくつかの実施形態では、クロコネートコアは、４個の電子求引基を含む（又は含むように修飾される）。
いくつかの実施形態では、クロコネートコアは、１つ又は複数の電子供与基を含む（又は含むように修飾される）（各電子求引基は同じであっても異なっていてもよい）。いくつかの実施形態では、クロコネートコアは、１個の電子供与基を含む（又は含むように修飾される）。いくつかの実施形態では、クロコネートコアは、２個の電子供与基を含む（又は含むように修飾される）。いくつかの実施形態では、クロコネートコアは、３個の電子供与基を含む（又は含むように修飾する）。いくつかの実施形態では、クロコネートコアは、３個の異なる電子供与基を含む（又は含むように修飾する）。いくつかの実施形態では、クロコネートコアは、４個の電子供与基を含む（又は含むように修飾される）。
いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約７８０ｎｍ～約９００ｎｍの範囲の波長を有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８００ｎｍ～約８８０ｎｍの範囲の波長を有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８２０ｎｍ～約８６０ｎｍの範囲の波長を有する。
いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約７８０ｎｍ～約９００ｎｍの範囲の波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８００ｎｍ～約８８０ｎｍの範囲の波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８２０ｎｍ～約８６０ｎｍの範囲の波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約９００＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８９５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８９０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８８５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８８０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８７０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８６５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８６０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８５５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８５０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８４５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８４０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８３５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８３０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８２５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８２０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８１５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８００＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約７９５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約７９０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約７８５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約７８０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長を有する。
いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約９００＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８９５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８９０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８８５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８８０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８７０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８６５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８６０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８５５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８５０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８４５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８４０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８３５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８３０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８２５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８２０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８１５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８００＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約７９５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約７９０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約７８５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約７８０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約９００＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８９５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８９０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８８５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８８０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８７０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８６５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８６０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８５５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８５０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８４５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８４０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８３５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８３０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８２５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８２０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８１５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８００＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約７９５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約７９０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約７８５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約７８０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約９００＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８９５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８９０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８８５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８８０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８７０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８６５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８６０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８５５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８５０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８４５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８４０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８３５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８３０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８２５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８２０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８１５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約８００＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約７９５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約７９０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約７８５＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、クロコネートコアを有する検出可能部分は、約７８０＋／－１０ｎｍのピーク吸光度波長及び約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
ヘプタメチンシアニンコア又はクロコネートコアを含む検出可能部分の非限定的な例としては、
Figure 2024507677000018
Figure 2024507677000019
Figure 2024507677000020
Figure 2024507677000021
が挙げられる。
式中、記号
Figure 2024507677000022
は、検出可能部分（ここでは、ヘプタメチンシアニンコア又はクロコネートコア）が、検出可能なコンジュゲートの別の部分（例えば、チラミド部分、キノンメチド部分、「クリックケミストリー」反応に関与することが可能な官能基、抗体、酵素、ハプテンなど）に（直接的又は間接的に）結合されている部位を指す。さらに他の例を本明細書に開示する。
本開示の方法と共に使用するのに適した他の検出可能部分としては、ジアゾコアを有するもののいずれか、例えば米国特許第１０，０４１，９５０号に開示されているものが挙げられ、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
紫外スペクトル又は赤外スペクトル内の波長を有し、適切である他の検出可能部分は、米国特許第１０，０４１，９５０号に開示されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
（ｉｉ）検出可能部分に結合された、（ｉ）チラミド又はキノンメチド部分を含む検出可能なコンジュゲートの非限定的な例としては、
Figure 2024507677000023
Figure 2024507677000024
Figure 2024507677000025
Figure 2024507677000026
Figure 2024507677000027
Figure 2024507677000028
が挙げられる。
（ｉｉ）検出可能部分に結合された、（ｉ）クリックケミストリー反応に関与することができる官能基を含む検出可能なコンジュゲートの非限定的な例としては、
Figure 2024507677000029
Figure 2024507677000030
Figure 2024507677000031
Figure 2024507677000032
Figure 2024507677000033
Figure 2024507677000034
Figure 2024507677000035
Figure 2024507677000036
Figure 2024507677000037
Figure 2024507677000038
Figure 2024507677000039
が挙げられる。
例示された化合物の各々はアジド基（すなわち、Ｎ３）を含むが、「クリックケミストリー」反応に関与することができる別の官能基は、以下の表１に列挙されるクリック官能基のいずれかを含むアジド基で置換されてもよいことが当業者には理解されよう。
Figure 2024507677000040
いくつかの実施形態では、検出可能なコンジュゲートは、
Figure 2024507677000041
Figure 2024507677000042
から選択される。
方法
本開示はまた、生物学的検体を１つ又は複数の従来の色素で染色し（「日常的染色」又は「特殊染色」のいずれか）、生物学的検体内の１つ又は複数のバイオマーカーを１つ又は複数の検出可能部分でさらに標識する方法に関する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の従来の色素は、可視スペクトル内で検出可能である。例えば、１つ又は複数の従来の色素は、約４００ｎｍ～約７００ｎｍの範囲のピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数検出可能部分は、可視スペクトル外で、例えば、紫外スペクトル内又は赤外スペクトル内で検出可能である。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのバイオマーカーは、２つの異なる検出可能部分で標識される。他の実施形態では、少なくとも３つのバイオマーカーは、３つの異なる検出可能部分で標識される。さらに他の実施形態では、少なくとも４つのバイオマーカーは、４つの異なる検出可能部分で標識される。さらなる実施形態では、５つ以上のバイオマーカーは、５つ以上の異なる検出可能部分で標識される。
図１Ａを参照すると、いくつかの実施形態では、生物学的検体は、第１の従来の色素で染色される（ステップ１０１）。いくつかの実施形態では、第１の従来の色素は、ヘマトキシリン、エオシン、酸性フクシン、アルシアンブルー８ＧＸ、アリザリンレッドＳ、オーラミンＯ、アゾカルミンＢ、アゾカルミンＧ、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、塩基性フクシン、ビスマルックブラウンＹ、ブリリアントクレシルブルー、ブリリアントグリーン、カルミン、クロラゾールブラックＥ、コンゴーレッド、クレシルバイオレット、クリスタルバイオレット、ダローレッド、エチルグリーン、ファストグリーンＦＣＦ、フルオレセインイソチオシアネート、ギムザ染色、インジゴカルミン、ヤヌスグリーンＢ、ジェンナー染色１８９９、ライトグリーンＳＦ、マラカイトグリーン、マーチウスイエロー、メチルオレンジ、メチルバイオレット２Ｂ、メチレンブルー、メチレンブルー、メチレンバイオレット（ベルンツェン）、ニュートラルレッド、ニグロシン、ナイルブルーＡ、ヌクレアファストレッド、オイルレッドＯ、オレンジＧ、オレンジＩＩ、オルセイン、パラロサニリン、フロキシンＢ、プロタルゴールＳ、ピロニンＢ、ピロニンＹ、レザズリン、ローズベンガル、サフラニンＯ、ズダンブラックＢ、ズダンＩＩＩ、ズダンＩＶ、テトラクロム染色（ＭａｃＮｅａｌ）、チオニン、トルイジンブルー、ワイゲルト１８７８、ライト染色（１９０８）又はこれらの任意の組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態では、ステップ１０１は、異なる従来の色素を用いて複数回繰り返されてもよい（ステップ１０２）。このようにして、生物学的検体が１つ又は複数の従来の色素で染色され得る。例えば、生物学的検体は、ヘマトキシリン及びエオシンで染色され得る。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の従来の色素は、可視スペクトル内で検出可能である。例えば、１つ又は複数の従来の色素は、約４００ｎｍ～約７００ｎｍの範囲のピーク吸光度波長を有する。
次に、第１のバイオマーカーを第１の検出可能部分で標識し（ステップ１０３）、第１の検出可能部分は可視スペクトル外で検出可能なシグナルを生成する。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、紫外スペクトル内又は赤外スペクトル内で検出可能である。いくつかの実施形態では、第１の検出可能部分は、クマリンコア、ヘプタメチンシアニンコア又はクロコネートコアを有する検出可能部分を含む。
いくつかの実施形態では、ステップ１０３を複数回繰り返して（ステップ１０４）、１つ又は複数のバイオマーカーを１つ又は複数の検出可能部分で標識し、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは互いに異なり、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは可視スペクトル外である。いくつかの実施形態では、ステップ１０３及び１０４はまた、必要に応じて繰り返されてもよい（ステップ１０５）。続いて、１つ又は複数の従来の色素及び１つ又は複数の検出可能部分のシグナルが検出される（ステップ１０６）。図２６Ａ～図２６Ｅは、シグナルを検出及び脱混合する方法を示す。いくつかの実施形態では、生物学的検体の合成画像は、１つ又は複数の従来の色素からの１つ又は複数のシグナルと、１つ又は複数の検出可能部分からの１つ又は複数のシグナルとを組み合わせることによって生成される。いくつかの実施形態では、生成された画像内の１つ又は複数の検出可能部分からの１つ又は複数のシグナルは、偽色を含む。
いくつかの実施形態では、ステップ１０３又は１０４が最初に実行され、ステップ１０１及び１０２が続いて実行される（例えば、図１Ｂを参照）。他の実施形態では、ステップ１０１及び１０３が順次実行され、次いでステップ１０１及び１０３の両方が１回又は複数回さらに繰り返される。さらに他の実施形態では、ステップ１０１及び１０３は同時に実行される。
１つ又は複数のバイオマーカーが１つ又は複数の検出可能部分（例えば、可視スペクトル外で検出可能な検出可能部分）で標識される実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分の各々は、検出可能部分の各々が、（ｉ）異なるピーク吸光度波長を有し、（ｉｉ）可視スペクトル外のピーク吸光度波長を有し（例えば、約４３０ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有するか、又は６７０ｎｍ超のピーク吸光度波長を有する）、及び／又は（ｉｉｉ）実質的に重複しないピーク吸光度波長を有する（例えば、異なるピーク吸光度波長は、少なくとも２０ｎｍ、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、少なくとも１２０ｎｍ、少なくとも１３０ｎｍ、少なくとも１４０ｎｍ、少なくとも１５０ｎｍ、少なくとも１７０ｎｍ、少なくとも１９０ｎｍ、少なくとも２１０ｎｍ、少なくとも２３０ｎｍ、少なくとも２５０ｎｍ、少なくとも２７０ｎｍ、少なくとも２９０ｎｍ、少なくとも３１０ｎｍ異なる）ように選択される。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、それらのピーク吸光度波長が、生物学的検体に適用される従来の色素のピーク吸光度波長と重複しないようにさらに選択される（スペクトルのどこでピーク吸光度波長が生じるかにかかわらず）。例えば、第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとは、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とで標識されてもよく、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは異なり、両方とも可視スペクトル外であり、そのピーク吸光度波長は実質的に重複しない。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとは、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とで標識されてもよく、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは異なり、両方とも可視スペクトル外であり、そのピーク吸光度波長は、少なくとも２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍなど異なる。
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれの異なるピーク吸光度波長は、少なくとも２０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも３０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも４０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも５０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも７０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも２０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも３０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも４０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも５０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも７０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも２０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも３０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも４０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも５０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも７０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも２０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも３０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも４０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも５０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも２０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも３０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも４０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
生物学的検体（例えば、従来の色素で予め染色された、又は後で従来の色素で染色された生物学的検体など）中の１つ又は複数のバイオマーカーを標識する２つの方法が本明細書に記載される。第１の方法は、チラミド又はキノンメチド部分に（直接的に又は１つ又は複数のリンカーを介して間接的に）コンジュゲートした検出可能部分（本明細書に記載されるもののいずれかを含む）を利用する。第２の方法は、クリックケミストリー反応に関与することができる反応性官能基に（直接的又は１つ又は複数のリンカーを介して間接的に）コンジュゲートされた検出可能部分（本明細書に記載されるもののいずれかを含む）を利用する。チラミド化学、キノンメチド化学及びクリックケミストリーを使用して生物学的検体中の標的を検出するための方法及び試薬は、米国特許第１０，０４１，９５０号、並びに米国特許出願公開第２０１９／０２０４３３０号、同第２０１７／００８９９１１号及び同第２０１９／０１８７１３０号に記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
両方の方法において、生物学的検体中の１つ又は複数のバイオマーカーは、最初に酵素で標識される。言い換えれば、いずれも、方法の第１のステップは、１つ又は複数のバイオマーカー－酵素複合体を形成することである。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のバイオマーカー－酵素複合体は、本明細書中に記載される２つの方法のいずれかにおける更なる反応のための中間体として働く。１つ又は複数のバイオマーカーを標識するのに適した酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ又はβ－ラクタマーゼが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のバイオマーカーは、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼで標識される。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のバイオマーカーはそれぞれ、同じ酵素で標識される。他の実施形態では、１つ又は複数のバイオマーカーは、異なる酵素で標識される。
酵素による１つ又は複数のバイオマーカーの標識化を容易にするために、いくつかの実施形態では、１つ又は複数のバイオマーカーに特異的な１つ又は複数の特異的結合実体を生物学的検体に導入する。図２Ａ及び図２Ｂを参照すると、いくつかの実施形態では、１つ又は複数のバイオマーカーに特異的な１つ又は複数の特異的結合実体は、一次抗体である（ステップ２０１、２１１）。一次抗体の導入に続いて、標識に（直接的又はリンカーを介して間接的に）コンジュゲートされた１つ又は複数の二次抗体を導入することができ、二次抗体は一次抗体に特異的である（例えば、二次抗体は抗一次抗体抗体である）（ステップ２０２、２１２）。いくつかの実施形態では、二次抗体のそれぞれの標識は、上記のいずれかを含む酵素である（図２Ｂのステップ２１２を参照）。
他の実施形態では、１つ又は複数の二次抗体の標識はハプテンである（図２Ａのステップ２０２を参照）。ハプテンの非限定的な例としては、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、ローダミンチオ尿素以外のチオ尿素、ジニトロフェニル又はトリニトロフェニル以外のニトロアリール、ロテノイド、シクロリグナン、ヘテロビアリール、アゾアリール、ベンゾジアゼピン、２，３，６，７－テトラヒドロ－１１－オキソ－１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ－［１］ベンゾピラノ［６，７，８－ｉｊ］キノリジン－１０－カルボン酸又は７－ジエチルアミノ－３－カルボキシクマリンが挙げられる。他の適切なハプテンは米国特許第８，８４６，３２０号に開示されており、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。二次抗体がハプテンにコンジュゲートされる実施形態では、酵素（上記のいずれかを含む）にコンジュゲートされた抗ハプテン抗体を生物学的検体に導入して、標的を１つ又は複数の酵素で標識することができる（ステップ２０３）。続いて、適切な検出試薬を生物学的検体に導入して、１つ又は複数の検出可能部分（本明細書に記載の検出可能部分のいずれかを含む）による１つ又は複数のバイオマーカー（ここでは酵素に間接的に結合されている）の標識化を促進することができる（ステップ２０４、２１４）。図２Ａ及び図２Ｂのステップは、任意の回数繰り返されてもよい（工程２０５及び２１５参照）。
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の特異的結合実体は、一次抗体コンジュゲート及び／又は核酸プローブコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の特異的結合実体は、酵素に結合された一次抗体コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、一次抗体コンジュゲートは、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼにコンジュゲートされる。他の実施形態では、１つ又は複数の特異的結合実体は、酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼにコンジュゲートされた核酸プローブである。酵素にコンジュゲートされた１つ又は複数の特異的結合実体の導入は、１つ又は複数のバイオマーカー－酵素複合体の形成を促進する。
いくつかの実施形態では、１つ又は複数特異的結合実体は、ハプテンに結合された一次抗体コンジュゲート及び／又はハプテンにコンジュゲートされた１つ又は複数の核酸プローブ（米国特許第８，８４６，３２０号（その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているハプテンのいずれかを含む）である。これらの実施形態では、ハプテンにコンジュゲートされた１つ又は複数の特異的結合実体の導入は、１つ又は複数のハプテン標識バイオマーカーの形成を容易にする。これらの実施形態では、１つ又は複数のハプテン標識バイオマーカーのハプテンに特異的な１つ又は複数の抗ハプテン抗体－酵素コンジュゲートを生物学的検体に導入して、１つ又は複数のハプテン標識バイオマーカーを酵素で標識して、１つ又は複数のバイオマーカー－酵素複合体を提供する。一次抗体コンジュゲート、二次抗体及び／又は核酸プローブは、酵素による生物学的検体中の１つ又は複数の標的の標識を達成するために、及び本明細書に例示されるように、当業者に公知の手順に従って試料に導入され得る。
生物学的検体を１つ又は複数の従来の色素で染色するステップ（従来の色素での染色は、１つ又は複数の検出可能部分での１つ又は複数のバイオマーカーの標識の前又は後のいずれかで行われ得る）を含む上述の方法の各々は、本明細書においてより詳細に記載される。
チラミド及び／又はキノンメチドコンジュゲートを使用して生物学的検体中の１つ又は複数の標識されたバイオマーカーを検出する方法であって、生物学的検体が１つ又は複数の従来の色素で染色されている方法
本開示はまた、（ｉ）本明細書に記載の「日常的染色」又は「特殊染色」のいずれかを含む、可視スペクトル内で検出可能な１つ又は複数の従来の色素で生物学的検体を染色する方法、及び（ｉｉ）１つ又は複数の検出可能なコンジュゲートで生物学的検体内の１つ又は複数のバイオマーカーを標識する方法であって、検出可能なコンジュゲートのそれぞれが、（ｉ）チラミド及び／又はキノンメチド部分、及び（ｉｉ）可視スペクトル外のピーク吸光度波長を有する検出可能部分を含む方法に関する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、紫外スペクトル又は赤外スペクトルのいずれかの範囲内にピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分はそれぞれ、約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超のピーク吸光度波長を有する。
いくつかの実施形態では、図３を参照すると、生物学的検体は、最初に第１の従来の色素で染色される（ステップ３０１）。ステップ３０１を１回又は複数回繰り返して、１つ又は複数の従来の色素で染色された生物学的検体が提供され得る。例えば、生物学的検体は、ヘマトキシリン及びエオシンの両方で染色され得る。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の従来の色素は、日常的染色である。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の従来の色素は、特殊染色である。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の従来の色素は、ヘマトキシリン、エオシン、酸性フクシン、アルシアンブルー８ＧＸ、アリザリンレッドＳ、オーラミンＯ、アゾカルミンＢ、アゾカルミンＧ、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、塩基性フクシン、ビスマルックブラウンＹ、ブリリアントクレシルブルー、ブリリアントグリーン、カルミン、クロラゾールブラックＥ、コンゴーレッド、クレシルバイオレット、クリスタルバイオレット、ダローレッド、エチルグリーン、ファストグリーンＦＣＦ、フルオレセインイソチオシアネート、ギムザ染色、インジゴカルミン、ヤヌスグリーンＢ、ジェンナー染色１８９９、ライトグリーンＳＦ、マラカイトグリーン、マーチウスイエロー、メチルオレンジ、メチルバイオレット２Ｂ、メチレンブルー、メチレンブルー、メチレンバイオレット（ベルンツェン）、ニュートラルレッド、ニグロシン、ナイルブルーＡ、ヌクレアファストレッド、オイルレッドＯ、オレンジＧ、オレンジＩＩ、オルセイン、パラロサニリン、フロキシンＢ、プロタルゴールＳ、ピロニンＢ、ピロニンＹ、レザズリン、ローズベンガル、サフラニンＯ、ズダンブラックＢ、ズダンＩＩＩ、ズダンＩＶ、テトラクロム染色（ＭａｃＮｅａｌ）、チオニン、トルイジンブルー、ワイゲルト１８７８、及びライト染色（１９０８）から選択される。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の従来の色素は、ヘマトキシリン及びエオシンである。
次に、生物学的検体中の第１のバイオマーカーを第１の酵素で標識し（ステップ３０３）、第１のバイオマーカー－酵素複合体を形成する。第１のバイオマーカーを第１の酵素で標識する方法は上述されており、図２Ａ及び図２Ｂにも示されている。次いで、第１のバイオマーカー－酵素複合体を含む生物学的検体を、可視スペクトル外のピーク吸光度波長を有する第１の検出可能部分（本明細書に記載のいずれかを含む）と、チラミド、キノンメチド、又はそれらの誘導体若しくは類似体のいずれかとを含む第１の検出可能なコンジュゲートと接触させる（ステップ３０４）。第１のバイオマーカー－酵素複合体の第１の酵素が第１の検出可能なコンジュゲートのチラミド又はキノンメチド部分と相互作用すると、第１の検出可能なコンジュゲートの少なくとも第１の検出可能部分は、第１のバイオマーカー標的の近位又は上に堆積する（生物学的検体内の標的分子の近位又は上への検出可能部分の対ア隻を示す図４及び図５も参照のこと。標的分子５又は５０はバイオマーカーであり得る）。
バイオマーカーを酵素で標識するステップ（ステップ３０３）及びその後に検出可能部分で標識するステップ（ステップ３０４）は、生物学的検体内の任意の異なる種類のバイオマーカー（例えば、タンパク質、核酸）について、任意の回数繰り返すことができる（ステップ３０５）。いくつかの実施形態では、生物学的検体内の各バイオマーカーは、異なる検出可能部分で標識される。例えば、Ｋｉ－６７バイオマーカーは、５０ｎｍ未満のＦＷＨＭ及び３３０ｎｍ～３９０ｎｍのピーク吸光度波長を有する検出可能部分で標識され得る。ＰＤ－Ｌ１バイオマーカーは、５０ｎｍ未満のＦＷＨＭ及び７６０ｎｍ～８２０ｎｍのピーク吸光度波長を有する検出可能部分で標識され得る。
最後に、１つ又は複数の従来の色素及び１つ又は複数の検出可能部分のシグナルが検出される（ステップ１０６）。図２６Ａ～図２６Ｅは、シグナルを検出及び脱混合する方法を示す。いくつかの実施形態において、１つ又は複数の検出可能部分は、検出可能部分に特異的な波長の光で生物学的検体を照射することによって検出される。１つ又は複数の検出可能部分から１つ又は複数のシグナルを検出する方法は、ＰＣＴ出願番号ＷＯ／２０１４／１４３１５５に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書にさらに記載される。いくつかの実施形態では、生物学的検体の合成画像は、１つ又は複数の従来の色素からの１つ又は複数のシグナルと、１つ又は複数の検出可能部分からの１つ又は複数のシグナルとを組み合わせることによって生成される。いくつかの実施形態では、生成された画像内の１つ又は複数の検出可能部分からの１つ又は複数のシグナルは、偽色を含む（例えば、図２６Ｅを参照）。
１つ又は複数のバイオマーカーが１つ又は複数の検出可能部分（例えば、可視スペクトル外で検出可能な検出可能部分）で標識される実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分の各々は、検出可能部分の各々が、（ｉ）異なるピーク吸光度波長を有し、（ｉｉ）可視スペクトル外のピーク吸光度波長を有し（例えば、約４３０ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有するか、又は６７０ｎｍ超のピーク吸光度波長を有する）、及び／又は（ｉｉｉ）実質的に重複しないピーク吸光度波長を有する（例えば、異なるピーク吸光度波長は、少なくとも２０ｎｍ、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、少なくとも１２０ｎｍ、少なくとも１３０ｎｍ、少なくとも１４０ｎｍ、少なくとも１５０ｎｍ、少なくとも１７０ｎｍ、少なくとも１９０ｎｍ、少なくとも２１０ｎｍ、少なくとも２３０ｎｍ、少なくとも２５０ｎｍ、少なくとも２７０ｎｍ、少なくとも２９０ｎｍ、少なくとも３１０ｎｍ異なる）ように選択される。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、それらのピーク吸光度波長が、生物学的検体に適用される従来の色素のピーク吸光度波長と重複しないようにさらに選択される（スペクトルのどこでピーク吸光度波長が生じるかにかかわらず）。例えば、第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとは、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とで標識されてもよく、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは異なり、両方とも可視スペクトル外であり、そのピーク吸光度波長は実質的に重複しない。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとは、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とで標識されてもよく、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは異なり、両方とも可視スペクトル外であり、そのピーク吸光度波長は、少なくとも２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍなど異なる。
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれの異なるピーク吸光度波長は、少なくとも２０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも３０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも４０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも５０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも７０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも２０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも３０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも４０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも５０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも７０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも２０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも３０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも４０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも５０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも７０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも２０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも３０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも４０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも５０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
図４及び図５は、生物学的検体に導入された様々な成分間で起こる反応を更に示す。図４を参照すると、標的５を有する生物学的検体に特異的結合実体１５を最初に導入して、標的検出プローブ複合体を形成する。いくつかの実施形態では、標的５はバイオマーカーであり、形成された標的検出プローブ複合体はバイオマーカー検出プローブ複合体である。いくつかの実施形態では、特異的結合実体１５は一次抗体である。続いて、標識コンジュゲート２５が生物学的検体に導入され、標識コンジュゲート２５は、それにコンジュゲートされた少なくとも１つの酵素を含む。図示される実施形態では、標識コンジュゲート２５は二次抗体であり、二次抗体は酵素にコンジュゲートされた抗種抗体である。次に、検出可能なコンジュゲート１０、例えば、キノンメチド部分又はその誘導体若しくは類縁体に直接的又は間接的に結合された本明細書に記載の検出可能部分のいずれかを含む検出可能なコンジュゲートが導入される。酵素（例えば、ＡＰ又はＢ－Ｇａｌ）が検出可能なコンジュゲート１０と相互作用すると、検出可能なコンジュゲート１０は、構造変化、立体構造変化、又は電子的変化２０を受けて、組織反応性中間体３０を形成する。この特定の実施形態では、検出可能なコンジュゲートはキノンメチド前駆体部分を含み、このキノンメチド前駆体部分は、（標識コンジュゲート２５の）アルカリホスファターゼ酵素と相互作用すると、フッ素脱離基が放出されて、それぞれのキノンメチド中間体３０が得られる。次いで、キノンメチド中間体３０は、組織の近位又は直接に組織と共有結合を形成して、検出可能部分の複合体４０を形成する。次いで、検出可能部分の複合体４０からのシグナルは、米国特許第１０，０４１，９５０号、並びに米国特許出願公開第２０１９／０２０４３３０号、米国特許出願公開第２０１７／００８９９１１号及び米国特許出願公開第２０１９／０１８７１３０号、並びにＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０１４／１４３１５５に記載されているもの等、当業者に公知の方法に従って検出することができ、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。図４のステップは、標的内の１つ又は複数のバイオマーカーについて繰り返されてもよい。
図５を参照すると、標的５０を有する生物学的検体に特異的結合実体５５を最初に導入して標的検出プローブ複合体を形成し、形成された標的検出プローブ複合体はバイオマーカーマーカー検出プローブ複合体である。いくつかの実施形態では、特異的結合実体５５は一次抗体である。続いて、標識コンジュゲート６０が生物学的検体に導入され、標識コンジュゲート６０は、それにコンジュゲートされた少なくとも１つの酵素を含む。図示される実施形態では、標識コンジュゲートは二次抗体であり、二次抗体は酵素にコンジュゲートされた抗種抗体である。次に、検出可能なコンジュゲート７０、例えば、チラミド部分又はその誘導体若しくは類縁体に直接的又は間接的に結合された本明細書に記載の検出可能部分のいずれかを含む検出可能なコンジュゲートが導入される。酵素が検出可能なコンジュゲート７０と相互作用すると、組織反応性中間体８０が形成される。この特定の実施形態では、検出可能なコンジュゲート７０は、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素と相互作用するとラジカル種８０の形成を引き起こすチラミド部分を含む。次いで、ラジカル中間体８０は、組織の近位又は直接に組織と共有結合を形成して、検出可能部分の複合体９０を形成する。次いで、検出可能部分の複合体９０からのシグナルは、米国特許第１０，０４１，９５０号、並びに米国特許出願公開第２０１９／０２０４３３０号、米国特許出願公開第２０１７／００８９９１１号及び米国特許出願公開第２０１９／０１８７１３０号、並びにＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０１４／１４３１５５に記載されているもの等、当業者に公知の方法に従って検出することができ、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。図５のステップは、標的内の１つ又は複数のバイオマーカーについて繰り返されてもよい。
いくつかの実施形態では、生物学的検体を酵素不活性化組成物で前処理して、内因性ペルオキシダーゼ活性を実質的に又は完全に不活性化する。例えば、いくつかの細胞又は組織は、内因性ペルオキシダーゼを含有する。ＨＲＰコンジュゲート抗体の使用は、高い非特異的バックグラウンド染色をもたらし得る。この非特異的バックグラウンドは、本明細書に開示される酵素不活性化組成物で試料を前処理することによって減少させることができる。いくつかの実施形態では、内因性ペルオキシダーゼ活性を低下させるために、試料を過酸化水素のみ（適切な前処理溶液の約１重量％～約３重量％）で前処理する。内因性ペルオキシダーゼ活性が低下又は不活性化されたら、上記のように、検出キットを添加し、続いて検出キットに存在する酵素を不活性化してもよい。開示される酵素不活性化組成物及び方法は、内因性酵素ペルオキシダーゼ活性を不活性化する方法としても使用することができる。更なる不活化組成物は、米国特許出願公開第２０１８／０１２０２０２号に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、検体がパラフィンに埋め込まれた試料である場合、適切な脱パラフィン流体を使用して試料を脱パラフィンすることができる。廃液除去剤が脱パラフィン液（複数の場合がある）を除去した後、任意の数の物質が連続して検体に塗布されることができる。物質は、前処理（例えば、タンパク質架橋、核酸を露出させる等）、変性、ハイブリッド形成、洗浄（例えば、厳密洗浄）、検出（例えば、視覚的又はマーカー分子のプローブへの連結）、増幅（例えば、タンパク質、遺伝子等の増幅）、逆染色、カバーガラス等のためのものとすることができる。
本開示の方法で使用するための他のコンジュゲートは、米国特許第８，６５８，３８９号及び第８，６８６，１２２号に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、米国特許第８，６５８，３８９号は、シグナル生成部分に共有結合した抗体を含むコンジュゲートを開示している。
一対のクリックコンジュゲートを使用して試料中の標的を検出する方法
本開示はまた、（ｉ）本明細書に記載の「日常的染色」又は「特殊染色」のいずれかを含む、可視スペクトル内で検出可能な１つ又は複数の従来の染色で生物学的検体を染色する方法、及び（ｉｉ）生物学的検体内の１つ又は複数のバイオマーカーを一対のクリックコンジュゲートで標識する方法に関する。これらのアッセイでは、一対のクリックコンジュゲートの一方のメンバーは、（ｉ）クリックケミストリー反応に関与することができる第１の官能基と、（ｉｉ）本明細書に記載の検出可能部分のいずれかを含む検出可能部分とを含む、検出可能なコンジュゲートを含む。適切な検出可能なコンジュゲートの非限定的な例は、本明細書に記載されている。一対のクリックコンジュゲートの別のメンバー（以下、「組織反応性コンジュゲート」と称する）は、（ｉ）チラミド部分、キノンメチド部分、又はチラミド部分若しくはキノンメチド部分の誘導体若しくは類縁体と、（ｉｉ）検出可能なコンジュゲートの第１の官能基と反応することができる第２の官能基とを含む、コンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、紫外スペクトル又は赤外スペクトルのいずれかの範囲内にピーク吸光度波長を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分はそれぞれ、約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超のピーク吸光度波長を有する。検出可能なコンジュゲート及び組織反応性コンジュゲートに結合し、互いに反応することができる適切な第１の官能基及び第２の官能基を表２に示す。
Figure 2024507677000043
適切な組織反応性コンジュゲートの非限定的な例を以下：
Figure 2024507677000044
Figure 2024507677000045
に示す。
他の適切な「組織反応性コンジュゲート」は、米国特許出願公開第２０１９／０２０４３３０号、同第２０１７／００８９９１１号、及び同第２０１９／０１８７１３０号に記載されており、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、図６を参照すると、生物学的検体は、最初に第１の従来の色素で染色される（ステップ６０１）。ステップ６０１を１回又は複数回繰り返して、１つ又は複数の従来の色素で染色された生物学的検体が提供され得る（ステップ６０２）。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の従来の色素は、日常的染色である。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の従来の色素は、特殊染色である。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の従来の色素は、ヘマトキシリン、エオシン、酸性フクシン、アルシアンブルー８ＧＸ、アリザリンレッドＳ、オーラミンＯ、アゾカルミンＢ、アゾカルミンＧ、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、塩基性フクシン、ビスマルックブラウンＹ、ブリリアントクレシルブルー、ブリリアントグリーン、カルミン、クロラゾールブラックＥ、コンゴーレッド、クレシルバイオレット、クリスタルバイオレット、ダローレッド、エチルグリーン、ファストグリーンＦＣＦ、フルオレセインイソチオシアネート、ギムザ染色、インジゴカルミン、ヤヌスグリーンＢ、ジェンナー染色１８９９、ライトグリーンＳＦ、マラカイトグリーン、マーチウスイエロー、メチルオレンジ、メチルバイオレット２Ｂ、メチレンブルー、メチレンブルー、メチレンバイオレット（ベルンツェン）、ニュートラルレッド、ニグロシン、ナイルブルーＡ、ヌクレアファストレッド、オイルレッドＯ、オレンジＧ、オレンジＩＩ、オルセイン、パラロサニリン、フロキシンＢ、プロタルゴールＳ、ピロニンＢ、ピロニンＹ、レザズリン、ローズベンガル、サフラニンＯ、ズダンブラックＢ、ズダンＩＩＩ、ズダンＩＶ、テトラクロム染色（ＭａｃＮｅａｌ）、チオニン、トルイジンブルー、ワイゲルト１８７８、ライト染色（１９０８）、及びこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の従来の色素は、ヘマトキシリン及びエオシンである。
続いて、生物学的検体中の第１のバイオマーカーを第１の酵素で標識し（ステップ６０３）、第１のバイオマーカー－酵素複合体を形成する。第１のバイオマーカーを第１の酵素で標識する方法は上述されており、図２Ａ及び図２Ｂにも示されている。次いで、生物学的検体を第１の組織反応性コンジュゲートと接触させ（ステップ６０４）、第１の組織反応性コンジュゲートは、クリックケミストリー反応に関与することができる第１の官能基（本明細書の表１及び表２に記載のもののいずれかを含む）及びチラミド、キノンメチド、又はその誘導体若しくは類縁体のいずれかを含む。組織反応性コンジュゲートの非限定的な例を本明細書で提供する。第１のバイオマーカー酵素複合体の第１の酵素が第１の組織反応性コンジュゲートのチラミド又はキノンメチド部分と相互作用すると、少なくとも第１の固定化組織クリックコンジュゲート複合体が第１のバイオマーカー標的の近位又は上に堆積する（起こり得る「クリックケミストリー」反応並びに得られた「第１の固定化組織クリックコンジュゲート複合体」及び「第１の固定化組織クリック付加物複合体」の形成を更に示す図８及び図９も参照）。次いで、第１の固定化組織クリックコンジュゲート複合体の形成に続いて、生物学的検体を、（ｉ）第１の固定化組織クリックコンジュゲート複合体の第１の反応性官能基と反応することができる第２の官能基と、（ｉｉ）本明細書に記載の検出可能部分のいずれかを含む第１の検出可能部分とを含む第１の検出可能なコンジュゲートと接触させる（ステップ６０５）。第１の固定化組織クリックコンジュゲート複合体と第１の検出可能なコンジュゲートとの反応生成物は、検出され得る第１の固定化組織クリック付加物複合体を生成する。
生物学的検体内の任意の数のバイオマーカーについて、上述のプロセス（ステップ６０３、６０４、６０５）が繰り返され得る（ステップ６０６）。いくつかの実施形態では、各バイオマーカーは、異なる検出可能部分で標識される。例えば、Ｋｉ－６７バイオマーカーは、５０ｎｍ未満のＦＷＨＭ及び３３０ｎｍ～３９０ｎｍのピーク吸光度波長を有する検出可能部分で標識され得る。ＰＤ－Ｌ１バイオマーカーは、５０ｎｍ未満のＦＷＨＭ及び７６０ｎｍ～８２０ｎｍのピーク吸光度波長を有する検出可能部分で標識され得る。
最後に、１つ又は複数の従来の色素及び１つ又は複数の検出可能部分のシグナルが検出される（ステップ６０７）。図２６Ａ～図２６Ｅは、シグナルを検出及び脱混合する方法を示す。いくつかの実施形態において、１つ又は複数の検出可能部分は、検出可能部分に特異的な波長の光で生物学的検体を照射することによって検出される。１つ又は複数の検出可能部分から１つ又は複数のシグナルを検出する方法は、ＰＣＴ出願番号ＷＯ／２０１４／１４３１５５に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書にさらに記載される。いくつかの実施形態では、生物学的検体の合成画像は、１つ又は複数の従来の色素からの１つ又は複数のシグナルと、１つ又は複数の検出可能部分からの１つ又は複数のシグナルとを組み合わせることによって生成される。いくつかの実施形態では、生成された画像内の１つ又は複数の検出可能部分からの１つ又は複数のシグナルは、偽色を含む（例えば、図２６Ｅを参照）。
１つ又は複数のバイオマーカーが１つ又は複数の検出可能部分（例えば、可視スペクトル外で検出可能な検出可能部分）で標識される実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分の各々は、検出可能の各々が、（ｉ）異なるピーク吸光度波長を有し、（ｉｉ）可視スペクトル外のピーク吸光度波長を有し（例えば、約４３０ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有するか、又は６７０ｎｍ超のピーク吸光度波長を有する）、及び／又は（ｉｉｉ）実質的に重複しないピーク吸光度波長を有する（例えば、異なるピーク吸光度波長は、少なくとも２０ｎｍ、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、少なくとも１２０ｎｍ、少なくとも１３０ｎｍ、少なくとも１４０ｎｍ、少なくとも１５０ｎｍ、少なくとも１７０ｎｍ、少なくとも１９０ｎｍ、少なくとも２１０ｎｍ、少なくとも２３０ｎｍ、少なくとも２５０ｎｍ、少なくとも２７０ｎｍ、少なくとも２９０ｎｍ、少なくとも３１０ｎｍ異なる）ように選択される。いくつかの実施形態では、検出可能部分は、それらのピーク吸光度波長が、生物学的検体に適用される従来の色素のピーク吸光度波長と重複しないようにさらに選択される（スペクトルのどこでピーク吸光度波長が生じるかにかかわらず）。例えば、第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとは、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とで標識されてもよく、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは異なり、両方とも可視スペクトル外であり、そのピーク吸光度波長は実質的に重複しない。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーと第２のバイオマーカーとは、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とで標識されてもよく、第１の検出可能部分と第２の検出可能部分とは異なり、両方とも可視スペクトル外であり、そのピーク吸光度波長は、少なくとも２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍなど異なる。
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれの異なるピーク吸光度波長は、少なくとも２０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも３０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも４０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも５０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも７０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも２０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも３０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも４０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも５０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも７０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１５０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも２０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも３０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも４０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも５０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも７０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、約１００ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも２０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも３０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも４０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、３０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の検出可能部分は、異なるピーク吸光度波長を有し、１つ又は複数の検出可能部分の異なるピーク吸光度波長は、少なくとも５０ｎｍ離れており、１つ又は複数の検出可能部分のそれぞれは、７０ｎｍ未満のＦＷＨＭを有する。
図７及び図８は、固定化組織クリックコンジュゲート複合体（１３、２３）を形成するための、組織反応性部分（１０、２０）を有するクリックコンジュゲート対の第１のメンバーと標的結合酵素（１１、２１）との間の反応を更に示す。増幅プロセスのこの第１の部分は、ＱＭＳＡ及びＴＳＡ増幅プロセスで使用されるものと同様である。図８及び図９は、検出可能なレポーター部分を含む固定化組織クリック付加物複合体（１５、２５）を提供するための、固定化組織クリックコンジュゲート（１３、２３）複合体と一対のクリックコンジュゲートの第２のメンバー（１４、２４）との間のその後の反応を示す。
図７を参照すると、反応性官能基（１０）を含む組織反応性コンジュゲートを標的結合酵素（１１）と接触させて、反応性中間体（１２）を生成する。いくつかの実施形態では、標的結合酵素（１１）はバイオマーカー結合酵素である。この例では、反応性中間体であるキノンメチドは、生物学的試料上又は生物学的検体内で求核剤と共有結合を形成し、したがって固定化組織クリックコンジュゲート複合体を提供する（１３）。次いで、固定化された組織クリックコンジュゲート複合体は、組織反応性コンジュゲート１０及び検出可能なコンジュゲート１４が互いに反応して共有結合を形成し得る反応性官能基を有する限り、本明細書に記載の検出可能部分のいずれかを有する検出可能なコンジュゲート（１４）と反応し得る。固定化組織クリックコンジュゲート複合体１３とクリックコンジュゲート１４との反応生成物は、固定化組織クリック付加物複合体１５を生成する。組織クリック付加物複合体１５は、連結された検出可能部分から伝達されるシグナルによって検出され得る。いくつかの実施形態では、図７のステップは、任意の数のバイオマーカーについて繰り返され得る。
同様に、図８を参照すると、反応性官能基（２０）を含む組織反応性コンジュゲートを標的結合酵素（２１）と接触させて、反応性中間体（２２）、すなわちチラミドラジカル種（又はその誘導体）を生成する。いくつかの実施形態では、標的結合酵素（２１）はバイオマーカー結合酵素である。次いで、チラミドラジカル中間体は、生物学的検体と共有結合を形成し得、したがって、固定化組織クリックコンジュゲート複合体を提供し得る（２３）。次いで、固定化された組織クリックコンジュゲート複合体は、組織反応性コンジュゲート及び検出可能なコンジュゲート２０及び２４がそれぞれ互いに反応して共有結合を形成し得る反応性官能基を有する限り、本明細書に記載の検出可能部分のいずれかを含む検出可能なコンジュゲート（２４）と反応し得る。固定化された組織クリックコンジュゲート複合体２３とクリックコンジュゲート２４との反応生成物は、組織クリック付加物複合体２５を生成する。いくつかの実施形態では、図８のステップは、任意の数のバイオマーカーについて繰り返され得る。
自動化
本開示のアッセイ及び方法は、自動化することができ、検体処理装置と組み合わせることができる。検体処理装置は、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．によって販売されているＢＥＮＣＨＭＡＲＫ ＸＴ機器及びＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＸＴ機器等の自動装置とすることができ、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．は、米国特許第５，６５０，３２７号、第５，６５４，２００号、第６，２９６，８０９号、第６，３５２，８６１号、第６，８２７，９０１号及び第６，９４３，０２９号、並びに米国特許出願公開第２００３０２１１６３０号及び第２００４００５２６８５号を含む、自動分析を実行するシステム及び方法を開示する複数の米国特許の譲受人であり、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。或いは、検体を手動で処理することもできる。
検体処理装置は、検体に固定剤を塗布することができる。固定剤は、架橋剤（例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、及びグルタルアルデヒド等のアルデヒド、並びに非アルデヒド架橋剤）、酸化剤（例えば、四酸化オスミウム及びクロム酸等の金属イオン及び複合体）、タンパク質変性剤（例えば、酢酸、メタノール、エタノール）、メカニズム不明の固定剤（例えば、塩化水銀、アセトン、及びピクリン酸）、配合試薬（例えば、カルノイ固定剤、メタカーン、ブアン液、Ｂ５固定剤）、ロスマンの液体、及びゲンドレの液体、マイクロ波、及びその他の固定剤（例えば、容積固定及び蒸気固定を除外）を含むことができる。
検体がパラフィンに埋め込まれた試料である場合、適切な脱パラフィン液を使用して、検体処理装置により試料を脱パラフィン化することができる。廃液除去剤が脱パラフィン液（複数の場合がある）を除去した後、任意の数の物質が連続して検体に塗布されることができる。物質は、前処理（例えば、タンパク質架橋、核酸を露出させる等）、変性、ハイブリッド形成、洗浄（例えば、厳密洗浄）、検出（例えば、視覚的又はマーカー分子のプローブへの連結）、増幅（例えば、タンパク質、遺伝子等の増幅）、逆染色、カバーガラス等のためのものとすることができる。
検体処理装置は、検体に幅広い物質を塗布することができる。物質は、これらに限定されるものではないが、染色剤、プローブ、試薬、リンス、及び／又はコンディショナを含む。物質は、流体（例えば、気体、液体、又は気体／液体混合物）等とすることができる。液体は、溶媒（例えば、極性溶媒、非極性溶媒等）、溶液（例えば、水溶液又は他のタイプの溶液）等とすることができる。試薬には、染色剤、湿潤剤、抗体（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等）、抗原回収液（例えば、水性又は非水性ベースの抗原回収溶液、抗原回収緩衝液等）が含まれ得るが、これらに限定されない。プローブは、検出可能な標識に付着した、単離された核酸又は単離された合成オリゴヌクレオチドとすることができる。標識は、放射性同位元素、酵素基質、補因子、リガンド、化学発光又は蛍光剤、ハプテン、及び酵素を含むことができる。
検出及び／又は撮像
開示される実施形態の特定の態様、又はすべてをコンピュータ分析及び／又は画像分析システムによって自動化し、容易にすることができる。いくつかの適用では、正確な色又は蛍光比が測定される。いくつかの実施形態では、光学顕微鏡法が画像分析に利用される。特定の開示される実施形態は、デジタル画像の取得を含む。これは、デジタルカメラを顕微鏡に連関させることによって行うことができる。染色された試料から得られたデジタル画像は、画像分析ソフトウェアを使用して分析される。色又は蛍光をいくつかの異なる方法で測定できる。例えば、色を赤色、青色、緑色の値；色相、彩度、及び強度の値；及び／又はスペクトル撮像カメラを使用して特定の波長若しくは波長範囲を測定することによって測定することができる。試料はまた、定性的及び半定量的に評価されることもできる。定性的評価には、染色強度の評価、染色に関与する陽性染色細胞及び細胞内コンパートメントの特定、並びに試料全体又はスライドの品質の評価が含まれる。試験試料に対して個別の評価を実行し、この分析には、試料が異常な状態を表しているかどうかを判断するための既知の平均値との比較を含めることができる。
適切な検出方法は、ＰＣＴ出願番号ＷＯ／２０１４／１４３１５５に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、適切な検出システムは、撮像装置と、１つ又は複数のレンズと、撮像装置と通信するディスプレイとを備える。撮像装置は、エネルギーを順次放出する手段と、画像／ビデオを捕捉する手段とを含む。いくつかの実施形態では、捕捉するための手段は、それぞれがエネルギーに曝露いる検体に対応する検体画像を捕捉するように配置される。いくつかの実施形態では、捕捉する手段は、生物学的検体を担持する顕微鏡スライドの前面及び／又は背面に配置された１つ又は複数のカメラを含むことができる。表示手段は、いくつかの実施形態では、モニタ又はスクリーンを含む。いくつかの実施形態では、エネルギーを順次放出する手段は、複数のエネルギーエミッタを含む。各エネルギーエミッタは、１つ又は複数のＩＲエネルギーエミッタ、ＵＶエネルギーエミッタ、ＬＥＤ光エミッタ、それらの組み合わせ、又は他のタイプのエネルギー放出デバイスを含むことができる。撮像システムは、撮像手段によって撮像された検体画像に基づいてコントラスト強調カラー画像データを生成する手段を更に含むことができる。表示手段は、コントラスト強調カラー画像データに基づいて検体を表示する。
追加の検出方法を図２６Ａ～図２６Ｅに示し、本明細書でさらに説明する。
実施例１．一般的な単一及び多重ＩＨＣ手順。
検出可能部分と共に使用した酵素－抗体コンジュゲートは、ＯｍｎｉＭａｐ ａｎｔｉ－Ｍｓ ＨＲＰ（ＲＵＯ）、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（ＶＭＳＩカタログ番号７６０－４３１０）、ＯｍｎｉＭａｐ ａｎｔｉ－Ｒｂ ＨＲＰ（ＲＵＯ）、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（ＶＭＳＩカタログ番号７６０－４３１１）、ＵｌｔｒａＭａｐ ａｎｔｉ－Ｍｓ Ａｌｋ Ｐｈｏｓ、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（ＶＭＳＩカタログ番号７６０－４３１２）、及びＵｌｔｒａＭａｐ ａｎｔｉ－Ｒｂ Ａｌｋ Ｐｈｏｓ、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（ＶＭＳＩカタログ番号７６０－４３１４）であった。上記の一次抗体及び検出試薬を使用して、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ Ｕｌｔｒａシステムで完全に自動化された多重検出を行った。ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅを使用して、単一バイオマーカーＩＨＣ及び多重ＩＨＣのプロトコルを作成した。一般に、ＩＨＣは、特に断らない限り、３７°Ｃで行い、反応緩衝洗浄液を１０倍濃縮物（カタログ番号９５０－３００）から希釈した。スライドに取り付けたパラフィン切片を、スライドを７０℃に３サイクル、それぞれ８分間加温することによって脱パラフィンした。Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ １（ＶＭＳＩ Ｃａｔ＃９５０－１２４）を適用し、スライドを９４℃に６４分間加温して抗原回復を行った。各バイオマーカーの染色は、そのバイオマーカーを標的とする一次抗体とのインキュベーション、未結合抗体を除去するための反応緩衝液での洗浄、色素原がそれぞれチラミド誘導体又はキノンメチド誘導体であるかどうかに応じて、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼのいずれかにコンジュゲートされた一次抗体（抗マウス又は抗ウサギのいずれか）を標的とする抗種抗体とのインキュベーション、反応緩衝液での洗浄、チラミド修飾ＤＢＣＯ若しくはチラミド修飾発色試薬又はキノンメチド前駆体修飾発色試薬とのインキュベーション、及び反応緩衝液での洗浄を含む連続ステップで実施した。チラミドについては、希釈Ｈ２Ｏ２をチラミド添加後に添加して堆積を開始した。すべての堆積ステップの後、反応緩衝液中で洗浄した。チラミド修飾ＤＢＣＯを使用する場合、スライドをアジド修飾色素原とさらにインキュベートし、洗浄した。多重ＩＨＣの場合、順番に次のバイオマーカーを染色する前に、スライドをＣｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ２（ＶＭＳＩカタログ番号９５０－１２３）と共に１００℃で８分間インキュベートした後、反応緩衝液で洗浄した。最後に、スライドを、周囲温度で一連のエタノール（２×８０％エタノール、各１分、２×９０％エタノール、各１分、３×１００％エタノール、各１分、３×キシレン、各１分）によって手動で脱水することができる。一次抗体及び酵素－抗体コンジュゲートを、製造業者によって推奨される濃度、体積及びインキュベーション時間で使用した。チラミド修飾された検出可能なコンジュゲート（本明細書に記載されるものなど）、チラミド－色素原又はチラミド－ＤＢＣＯを、ＶＭＳＩ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＴＳＡ希釈液（カタログ番号００００６０９００）中２５～１，２００μＭの範囲の濃度で１００μＬ容量でスライドに添加した。アジド修飾された検出可能なコンジュゲートを、典型的にはチラミド－ＤＢＣＯに使用されるのと同じ濃度で、ＴＳＡ希釈剤中に１００μＬ容量として添加した。検出可能なコンジュゲート（本明細書中に記載される検出可能部分を含む）の溶液の濃度は、それらのピーク吸光係数及びバイオマーカー発現レベルを反映し、典型的には、７－アミノ－４－メチルクマリン－３－アセチル（ＡＭＣＡ）については１，２００μＭ、７－ヒドロキシクマリン－３－カルボキシル（ＨＣＣＡ）については４００μＭ、７－ジエチルアミノクマリン－３－カルボキシル（ＤＣＣ）については６００～８００μＭ、及びＣｙ７検出可能部分については５０～３００μＭであった。キノンメチド前駆体修飾Ｃｙ５を、ＴＳＡ希釈液中の１００μＬの４００μＭ Ｃｙ５検出可能部分でスライドに添加した。
実施例２．従来の組織学的な染色及び検出可能部分の染色の顕微鏡検査及びシングルカメラモノクロ撮像。
Ｈ＆Ｅ＋ＩＨＣ検体のマルチスペクトル撮像を、前述のように［Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＬＥ，Ｌｅｆｅｖｅｒ ＭＲ，Ｂｅｈｍａｎ ＬＪ，Ｌｅｉｂｏｌｄ Ｔ，Ｒｏｂｅｒｔｓ ＥＡ，Ｈｏｒｃｈｎｅｒ ＵＢ，Ｂａｕｅｒ ＤＲ．Ｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｗｉｔｈ Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ（２０２０）ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１３７４－０２０－０４２９－０］、１２ビットの解像度の１３９２×１０４０ピクセルのセンサ（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）及びＬＥＤ照明を備えたＣｏｏｌＳＮＡＰ ＥＳ２ ＣＣＤカメラを取り付けたＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ－５１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で行った。顕微鏡対物レンズは、最初はＯｌｙｍｐｕｓ ＵＰｌａｎＳＡｐｏ ２０ｘ（ＮＡ ０．７５）及び１０ｘ（ＮＡ ０．４０）空気対物レンズであったが、その後、色収差補正が改善されたＵＰＬＸＡＰＯ ２０Ｘ（ＮＡ ０．８０）及びＵＰＬＸＡＰＯ １０Ｘ（ＮＡ ０．４）対物レンズで更新された。照明は、光学的にフィルタリングされた連続光源とＬＥＤ照明器との組み合わせによって提供された。前者については、Ｓｕｔｔｅｒ Ｌａｍｂｄａ １０－３ １０－位置フィルターホイール（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）をＯｌｙｍｐｕｓ １００ Ｗタングステンハロゲンランプと共に使用して、最大９つの波長チャネルを画定した。ＬＥＤ照明は、ＣｏｏｌＬＥＤ（Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）ｐＥ－４０００ １６－チャネル照明器及び２つのＬｕｍｅｎｃｏｒＳｐｅｃｔｒａ Ｘライトエンジン（Ｌｕｍｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．，Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ，ＯＲ）を備え、それぞれ６つのカスタム選択されたＬＥＤを含む。照明器の出力は、３ｍｍの液体ライトガイドに集束され、ライトガイドは、１つ又は２つのＬｕｍｅｎｃｏｒコンバイナを有する単一の直径３ｍｍの液体ライトガイドに組み合わされた。最終的なライトガイドを、ＣｏｏｌＬＥＤ ｐＥコリメータ／顕微鏡アダプタを介して顕微鏡の照明ポートに接続した。照明帯域幅をさらに減少させるために、各Ｌｕｍｅｎｃｏｒ ＬＥＤを単一のバンドパス光学フィルタでフィルタリングした。フィルターホイールのフィルタ選択及びＬＥＤ選択は、コンピュータ制御のオプションを備えた手動制御を使用して達成された。顕微鏡を透過した光のＣＣＤカメラ上の個々の顕微鏡視野の撮像を、Ｍｉｃｒｏ－Ｍａｎａｇｅｒソフトウェア［Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ ＡＤ，Ｔｓｕｃｈｉｄａ ＭＡ，Ａｍｏｄａｊ Ｎ，Ｐｉｎｋａｒｄ Ｈ，Ｗａｌｅ ＲＤ，Ｓｔｕｕｍａｎ Ｎ．Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｕｓｉｎｇ μＭａｎａｇｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１４；１：ｅ１０］によって制御した。透過画像と吸光度画像との間の変換、スペクトルの脱混合、及び色合成画像の形成を含む画像処理を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア［Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ＣＡ，Ｒａｓｂａｎｄ ＷＳ，Ｅｌｉｃｅｉｒｉ ＫＷ．ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ ｔｏ ＩｍａｇｅＪ：２５ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１２；９：６７１－６７５］又はＭＡＴＬＡＢソフトウェア（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。
典型的には、マルチカラー検体は、フィルターホイール及び／又はＬＥＤ上の複数のフィルタで撮像され、各フィルタ及び／又はＬＥＤは、検体を染色するために使用される色素の１つの最大吸光度に近い波長の光の帯域を提供した（例えば、エオシン及びＨＴＸ又は検体に適用された他の従来の染色に加えて、各検出可能部分）。利用される異なる光チャネルの数は、少なくとも色素の数と同等であった。透過画像及び吸光度画像の計算のために、染色検体内の所望の対象領域において同じ一連の光チャネルを有する画像を記録する前及び／又は後に、スライドの非染色領域上（例えば、組織／細胞検体側）の各光チャネルを使用して画像を記録した。染色された領域の透過光画像を、染色されていない領域（１００％透過）の画像で除算することにより、透過率（Ｔ）画像が得られた。対数変換により、吸光度（Ａ）画像（Ａ＝－ｌｏｇ１０Ｔ）が得られ、Ａはビールの法則に従って色素濃度に比例する。カラー合成画像は、合成画像の赤、緑、及び青の色平面を形成するために、所望の擬似着色のための適切な重み付けで、モノクロＡ画像を追加することによって生成された。これらの合成画像は、「蛍光様」表現を提供し、Ａ画像からＴ画像への逆対数変換によって明視野表現に変換することができる。接眼鏡はマルチスペクトル撮像に必要ではなく、撮像に使用される可能性のある明るい光への意図しない曝露を回避するために、接眼鏡なしの鏡筒と交換することができることに留意されたい。接眼鏡を使用する場合、不可視光を遮断し、可視光のみを透過させるなど、透過光を減少させるフィルタを対眼レンズに配置してもよい（本明細書の実施例３を参照）。
実施例３．従来の組織学的な染色及び検出可能部分の染色の顕微鏡検査及びデュアルカメラカラー／モノクロ撮像。
図２６Ｄは、コンピュータモニタ上の可視の従来の染色及び不可視のＩＨＣ色素原の同時観察を可能にするデュアルカメラ顕微鏡システムの概略図を提供する。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ－５１及びＢＸ－６３顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を、ＵＰＬＸＡＰＯ ２０Ｘ（ＮＡ ０．８０）及びＵＰＬＸＡＰＯ １０Ｘ（ＮＡ ０．４）対物レンズと共に使用した。再び図２６Ｄを参照すると、可視照明は、Ｓｕｔｔｅｒ Ｌａｍｂｄａ １０－３ １０－位置フィルターホイール（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）に取り付けられた、４２０ｎｍ～６９０ｎｍの光を透過するホットミラー（Ｎｅｗｐｏｒｔ Ｃｏｒｐ．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ；カタログ番号１０ＨＭＲ－０）を備えたＯｌｙｍｐｕｓ １００ Ｗタングステンハロゲンランプ（Ａ；Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｕ－ＬＨ１００）によって提供された。スペクトルの青端を強調して直視及びカラーカメラのホワイトバランスを改善するために、ホットミラーの後ろにカラーバランスフィルタ（ＦＧＴ１６５フィルタ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ、Ｎｅｗｔｏｎ ＮＪ ＵＳＡ）を取り付けてもよい。ｐＥ－４０００ １６チャネルＬＥＤ発光体（ＣｏｏｌＬＥＤ（Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）及びＬｕｍｅｎｃｏｒ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｘ ＬＥＤライトエンジン（Ｌｕｍｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．，Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ，ＯＲ）、又は追加のＯｌｙｍｐｕｓ １００ Ｗタングステンハロゲンランプを含む第２の照明源（Ｂ）によって、一体型ＩＲブロッキングフィルタを除去し、単一のバンドパスフィルタセットの集合体を含むフィルタホイールと組み合わせて、遠青色／ＵＶ及び遠赤色／近ＩＲ光を提供した。照明帯域幅をさらに減少させるために、各Ｌｕｍｅｎｃｏｒ ＬＥＤを単一のバンドパス光学フィルタでフィルタリングした。ＬＥＤ及びフィルタ特性のいくつかは、以下に示す表に示されている。可視照明（Ａ）及び不可視照明（Ｂ）は、５０－５０中性密度ビームスプリッタ又はダイクロイックミラーのいずれかを含む反射素子（Ｃ）を含むｐＥ Ｃｏｍｂｉｎｅｒ（ＣｏｏｌＬＥＤ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）内で組み合わされ、カスタムコーティングは、４２０～７００ｎｍの光を透過し、４２０ｎｍ未満及び７００ｎｍ超の光（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｌｌｏｗｓ Ｆａｌｌｓ，ＶＴ ＵＳＡ）を４５°に向けて各照明源に反射する。ＬＥＤが使用される場合、不可視照明源（Ｂ）は、３ｍｍの液体ライトガイドと、ｐＥ－Ｃｏｍｂｉｎｅｒの前の１つ又は複数のライトガイドコンバイナ（Ｌｕｍｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．，Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ，ＯＲ ＵＳＡ）とを使用して複数のＬＥＤ源を組み合わせることによって拡張することができる。顕微鏡の明視野照明ポートに入った後、可視光及び不可視光の組み合わせは、検体スライド及び顕微鏡対物レンズを通過してカメラポート及びデュアルカメラマウント（２ＳＣＭ１－ＤＣ；Ｔｈｏｒｌａｂｓ）に至る。コンバイナ反射素子（Ｃ）と同じ反射コーティングを有するデュアルカメラマウント内の反射素子は、可視光から不可視に分割され（ダイクロイック素子を使用する場合）、可視光透過フィルタ（Ｄ；カメラと一体）を介して可視光をカラーカメラ（Ｋｉｒａｌｕｘ ＣＳ５０５ＣＵ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）に透過する（これは、ジエチルクマリンＣＤＣを使用して黄色化を抑制する場合、４３５ｎｍロングパスフィルタ（Ｎｅｗｐｏｒｔ，１０ＣＧＡ－４３５）も含み得る）。５０－５０中性密度ミラーが反射素子（各カメラで受信されるすべての波長）に使用された場合、４２０ｎｍのロングパスフィルタが一体型カラーカメラフィルタと共に使用される。不可視光（ダイクロイック素子使用時）は、ビームスプリッタで反射され、４２０ｎｍ未満及び７００ｎｍ超の光を透過するフィルタ（Ｅ）（カスタムＥＴ５６０／２８０ノッチフィルタ、Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ；ダイクロイック反射素子使用時）、又は４００ｎｍ未満及び６９０ｎｍ超の光を透過するＮｅｗｐｏｒｔ ＦＳＲ－ＵＧ５カラーガラスフィルタ（５０－５０中性密度反射素子使用時）を介して、モノクロカメラ（Ｋｉｒａｌｕｘ ＣＳ５０５ＭＵ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）に送られる。両方のカメラは、同じ下にある２４４８×２０４８ピクセルＣＭＯＳセンサを使用し、２カメラマウント内の並進及び回転調整を使用して２つのカメラの正確な位置合わせを可能にした。Ｔｈｏｒｃａｍソフトウェア（Ｔｈｏｒｌａｂｓ）は、各カメラからのライブビデオ、画像オーバーレイ、及び単一フレーム画像取得の制御を提供した。顕微鏡光学系を通る近ＵＶ光の不十分な透過に加えて、不可視光からの眼の保護は、顕微鏡の対眼レンズ内のレチクル空間に挿入されたカスタムバリアフィルタ（Ｆ；ＥＴ ５６０／２８０ｍ、Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．）によって提供された。デュアルカメラモードでは、標準タングステン顕微鏡ランプからの可視広帯域光のみが眼に到達できるように、不可視光源を４２０ｎｍ未満又は７００ｎｍ超の波長に制限した。あるいは、接眼鏡は、コンピュータモニタ上のビデオ画像の観察を制限する鏡筒に置き換えることができた（オリンパス部品Ｕ－ＴＬＵ）。
デュアルカメラ顕微鏡システムは、実施例２に記載されている単一モノクロカメラマルチスペクトル撮像システムとして使用することもできる。可視光チャネルと不可視光チャネルの両方のマルチスペクトル撮像のために、デュアルカメラマウント内のダイクロイックビームスプリッタを１００％反射ミラーに置き換えて、すべての光をモノクロカメラに向け、モノクロカメラフィルタ（Ｅ）を除去した。各光チャネルを透過した光の画像をモノクロカメラにおいて順次取得し、実施例２で説明したように、定量分析、カラー合成画像の作成、及びスペクトル脱混合の実行のために画像処理を用いた。マルチスペクトルモードでは接眼鏡を通して検体を見ることはないが、対眼レンズ内の可視光のみの透過フィルタ、又は接眼鏡を鏡筒のみの部分（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｕ－ＴＬＵ）で置き換えることによって、不注意な観察が保護される。
他の光源及びフィルタリングを使用して、同様の照明及び撮像結果を得ることができる。例えば、適切なフィルタリングと組み合わせて、タングステンハロゲン顕微鏡ランプ（ＩＲフィルタが除去されている）、キセノンランプ、又はメタルハライドランプなど、Ｈ＆Ｅを照明するための可視光と１つ又は複数の検出可能部分を照明するための不可視光の両方を放射する単一の光源を使用することができる。白色光は、連続光源の代わりにＬＥＤの組み合わせによって生成することができ、不可視ＬＥＤと組み合わせて従来の染色及び不可視色素原の両方を同時に照らすことができる。
Figure 2024507677000046
実施例４．スライド上分光測定。
堆積した色素原及び従来の染色の吸光度スペクトルを、タングステン照明下でＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ－６３顕微鏡のステージ上に配置されたスライドマウント検体上に記録した。透過光は、Ｐｒｙｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ロックランド）Ｌｕｍａｓｐｅｃ ８００パワーメーターを使用して、およそ０．５ｎｍ刻みで３５０ｎｍ～８００ｎｍの間で測定した。２００ｎｍ～１１００ｎｍのスペクトル測定を可能にしたＯｃｅａｎ ＨＤＸ ＵＶ－ＮＩＲ分光計を用いて出力計をアップグレードした。スライドの染色された領域を透過した光のスペクトルを、染色されていない領域を透過したスペクトルで除して透過（Ｔ）スペクトルを得、これを関係Ａ＝ｌｏｇ１０（１／Ｔ）を用いて色素原吸光度（Ａ）スペクトルに変換した。
いくつかの検出可能部分を、扁桃組織上のＫｉ６７を標的とするＩＨＣにおいて個別に使用し、得られた染色組織の吸光度スペクトルを図１０にプロットする。扁桃腺組織上のＨ＆Ｅ吸光度スペクトルもプロットされ、可視範囲（顕微鏡下での快適なレベルの可視光照明のために４２０ｎｍ～７００ｎｍと近似される）は薄い水色であった。示された検出可能部分の一部は可視領域内にあったが、それらの吸光度の大部分は可視領域外であり、検出可能部分の吸光度範囲の大部分にわたって視覚感度は依然として低かった。さらに、Ｈ＆Ｅ及び検出可能部分のスペクトルは、図１０の同じピーク値に対して正規化されたが、実際には、Ｈ＆Ｅ吸光度は、検出可能部分よりもかなり大きく、その結果、検出可能部分の着色は、顕微鏡下で見たときに無視できるほど識別可能である。
実施例５．ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）及びシナプトフィジン不可視性ＩＨＣ（ｉＩＨＣ）で染色した膵臓ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織。
匿名化された患者の（癌に対して）正常な膵臓組織からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）スライドマウント切片を、ＶＭＳＩ検体バンクから得られたブロックからＶｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＶＭＳＩ）の組織学の職員が調製した。半自動免疫組織化学を、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ Ｕｌｔｒａシステム（ＶＭＳＩ、Ｔｕｃｓｏｎ ＡＺ）で行った。ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅを使用して、染色ステップを制御するためのプロトコルを作成した。この手順は、以下の手順に示すように、市販の染色剤試薬を利用してすべてのステップを自動化し、カスタム色素原試薬の手動添加のために染色剤を一時停止した。各ステップは、記載した場合を除き、混合しながら３７°Ｃで行い、自動化された洗浄ステップは、反応緩衝液（１０倍濃縮物から希釈；ＶＭＳＩカタログ番号９５０－３００）を使用した。スライドに取り付けられたパラフィン切片（最大３０個／ラン）を、スライドを７０°Ｃに加温して脱パラフィンすることから始めて、各８分間の３サイクルにわたって装置上で処理した。Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ １（ＶＭＳＩ Ｃａｔ＃９５０－１２４）を適用し、スライドを９４℃に６４分間加温して抗原回復を行った。抗シナプトフィジン一次抗体（ウサギ；カタログ番号７９０－４４０７）０．１ ｍＬを添加し、１６～３２分間インキュベートした後、洗浄して未結合抗体を除去した。ＯｍｎｉＭａｐ ａｎｔｉ－Ｒｂ ＨＲＰ（ＲＵＯ）、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（ＶＭＳＩカタログ番号７６０－４３１１）、０．１ｍＬを加え、８分間インキュベートした後、洗浄した。ホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中の４００μＭチラミド修飾ＤＢＣＯ（０．１ｍＬ）を手動ピペッティングによって添加し、４分間インキュベートした後、ホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中の０．０１％ Ｈ２Ｏ２（０．１ｍＬ）を添加した。これを３２分間インキュベートした後、洗浄し、０．１ｍＬの４００μＭアジド修飾Ｃｙ７を手動でピペッティングし、３２分間インキュベートした。洗浄後、スライドを染色装置から取り出し、数百ｍＬの反応緩衝液で洗浄した。次いで、スライドを直ちにＨ＆Ｅで染色するか、又は最初に周囲温度でエタノール及びキシレン（２×８０％エタノール、各１分、２×９０％エタノール、各１分、３×１００％エタノール、各１分、３×キシレン、各１分）によって脱水した。脱水された場合、スライドを最初に、周囲温度で１００％エタノールに１分間、９０％エタノールに１分間、８０％エタノールに１分間及び水に１分間浸漬することによって再水和した後にＨ＆Ｅ染色した。Ｈ＆Ｅ染色を、一連のＣｏｐｌｉｎジャーにおいて周囲温度で、ジャー間でスライドを手動で移して行った。スライドを最初にヘマトキシリン溶液（Ｖｅｎｔａｎａ ＨＥ ６００ヘマトキシリン；オーダーコード０７０２４２８２００１）に２分間浸漬した後、水に２分間浸漬し、ディファイン溶液（Ｌｅｉｃａ Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ ＳｅｌｅｃｔＴｅｃｈ Ｄｅｆｉｎｅ ＭＸ－ａｑ、カタログ番号３８０３５９５）に１分間、水に１分間、ブルーイング溶液（ＶＷＲ Ｂｌｕｉｎｇ試薬；カタログ番号９５０５７－８５２）に１分間、水に１分間、９５％エタノールに３０秒間、エオシン溶液（Ｖｅｎｔａｎａ ＨＥ ６００エオシン；オーダーコード０６５４４３０４００１）に１分間、７０％エタノールに１分間、１００％エタノールに２回各１分間、キシレンに３回各１分間浸漬した。次いで、スライドを乾燥させ、Ｒｉｃｈａｒｄ Ａｌｌａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｙｔｏｓｅａｌ ＸＹＬ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ，Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ）を適用し、タイプ１．５のカバースリップで覆うことによって取り付けた。又はＳａｋｕｒａ ＦｉｎｅｔｅＫ ＵＳＡ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ Ｆｉｌｍ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｐｅｒに取り付けた。
不可視ＩＨＣをＨ＆Ｅ染色と組み合わせる能力を試験するために、タンパク質シナプトフィジンを標的とするＩＨＣをＦＦＰＥ正常膵臓組織で実施し、続いて従来のＨ＆Ｅ染色を実施した。ＩＨＣは、スペクトルの遠赤色／近ＩＲ領域の光を吸収する色素Ｃ７を含む検出可能部分を利用した（図１０を参照のこと）。白色光照射（タングステンハロゲンランプ）下で顕微鏡の接眼鏡を通して目視検査すると、検体の正常なＨ＆Ｅ染色が明らかになった。図１１は、エオシンが光を吸収する５１３ｎｍ、ヘマトキシリンが光を吸収する６２０ｎｍ、及びＣｙ７が光を吸収する７７０ｎｍのＬＥＤ照明を使用してモノクロカメラで記録された透過光の画像を提供する。これらの３つの画像は、図１２に示すように色合成画像に合成された。左側のカラー画像は、白色光照明を用いた顕微鏡下での視覚化を忠実に再現する擬似着色を用いた５１３ｎｍ及び６２０ｎｍの画像の組み合わせから得られる。右側のカラー画像は、擬似的に色付けされた黒色の７７０ｎｍ画像を５１３ｎｍ及び６２０ｎｍ画像と組み合わせたものであり、Ｈ＆Ｅによって明らかにされるように、膵臓組織との関連におけるシナプトフィジンの存在を示している。
実施例６．Ｈ＆Ｅ及びＣＤ２０＋ＣＤ８多重ｉＩＨＣで染色したＦＦＰＥ扁桃組織（癌に関して正常）。
匿名化された患者由来の（癌に対して）正常な扁桃組織からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）スライドマウント切片を、ＶＭＳＩ検体バンクから得られたブロックからＶｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＶＭＳＩ）の組織学の職員が調製した。半自動免疫組織化学を、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ Ｕｌｔｒａシステム（ＶＭＳＩ、Ｔｕｃｓｏｎ ＡＺ）で行った。ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅを使用して、染色ステップを制御するためのプロトコルを作成した。この手順は、以下の手順に示すように、市販の染色剤試薬を利用してすべてのステップを自動化し、カスタム色素原試薬の手動添加のために染色剤を一時停止した。各ステップは、記載した場合を除き、混合しながら３７°Ｃで行い、自動化された洗浄ステップは、反応緩衝液（１０倍濃縮物から希釈；ＶＭＳＩカタログ番号９５０－３００）を使用した。スライドに取り付けられたパラフィン切片（最大３０個／ラン）を、スライドを７０°Ｃに加温して脱パラフィンすることから始めて、各８分間の３サイクルにわたって装置上で処理した。Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ １（ＶＭＳＩ Ｃａｔ＃９５０－１２４）を適用し、スライドを９４℃に６４分間加温して抗原回復を行った。抗ＣＤ２０一次抗体（マウス；ＶＭＳＩカタログ番号７６０－２５３１）、０．１ｍＬを添加し、１６～３２分間インキュベートした後、洗浄して未結合抗体を除去した。ＯｍｎｉＭａｐ ａｎｔｉ－Ｒｂ ＨＲＰ（ＲＵＯ）、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（ＶＭＳＩカタログ番号７６０－４３１１）、０．１ｍＬを加え、８分間インキュベートした後、洗浄した。ホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中の６００μＭチラミド修飾ＤＢＣＯ（０．１ｍＬ）を手動ピペッティングによって添加し、４分間インキュベートした後、ホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中の０．０１％ Ｈ２Ｏ２（０．１ｍＬ）を添加した。これを３２分間インキュベートした後、洗浄し、０．１ｍＬの６００μＭアジド修飾ＤＣＣを手動でピペッティングし、３２分間インキュベートした。洗浄後、スライドをＣｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ２（ＶＭＳＩカタログ番号９５０－１２３）と共に１００℃で８分間インキュベートした後、反応緩衝液で洗浄した。抗ＣＤ８一次抗体（ウサギ；ＶＭＳＩカタログ番号７９０－４４６０）０．１ ｍＬを添加し、１６～３２分間インキュベートした後、洗浄して未結合抗体を除去した。ＯｍｎｉＭａｐ ａｎｔｉ－Ｒｂ ＨＲＰ（ＲＵＯ）、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（ＶＭＳＩカタログ番号７６０－４３１１）、０．１ｍＬを加え、８分間インキュベートした後、洗浄した。０．１ｍＬの４００μＭチラミド修飾ＤＢＣＯを手動ピペッティングによって添加し、４分間インキュベートした。ホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中０．０１％ Ｈ２Ｏ２（０．１ｍＬ）を添加し、３２分間インキュベートした後、洗浄し、３２分間インキュベートしながらスライド上に０．１ｍＬの４００μＭアジド修飾Ｃｙ７を手動でピペッティングした。洗浄後、スライドを染色装置から取り出し、数百ｍＬの反応緩衝液中で洗浄し、次いで、スライドをＨ＆Ｅで染色し、マウントし、実施例５に記載されるようにカバーガラスで覆った。
ＦＦＰＥ扁桃組織（癌に関して正常）に対してＣＤ２０及びＣＤ８を標的とする逐次的なＩＨＣを行い、続いてＨ＆Ｅ染色を行うことによって、Ｈ＆Ｅ染色を伴う多重不可視ＩＨＣを実証した。ＣＤ２０を、遠青色の吸収色素であるジエチルアミオクマリンカルボキシレート（ＤＣＣ）に由来する検出可能部分で染色し、ＣＤ８をＣｙ７検出可能部分で染色した。ＤＣＣは、視覚的知覚の縁付近の遠青色で吸収されるため、強い染色では眼によって弱く黄色に見ることができるが、Ｈ＆Ｅ染色の存在下ではほとんど知覚できない。図１３は、膵臓の実施例からの５１３、６２０ｎｍ及び７７０ｎｍのＬＥＤ、並びにＤＣＣが光を吸収する４１５ｎｍのＬＥＤによって記録された４つのモノクロ画像を表示する。扁桃全体にわたるＣＤ２０の特徴的なＢ細胞膜染色は、４１５ｎｍ画像において明らかであり、ＣＤ８の特徴的な活性化ｔ細胞膜染色は、７７０ｎｍ画像において明らかであるように、胚中心の大部分外側であった。色合成画像が図１４に示されており、左側のＨ＆Ｅ画像は、目視観察を忠実に再現する５１３ｎｍ及び６２０ｎｍの画像から構成されている。中央の画像は、Ｈ＆Ｅ合成への４１５ｎｍ（ＣＤ２０）画像の追加を示し、右の画像は、Ｈ＆Ｅ合成への７７０ｎｍ（ＣＤ８）画像の追加を示し、両方のＩＨＣ標的はＨ＆Ｅ染色と区別するために擬似的に黒く着色されている。図１５は、２つの検出可能部分の吸光度ピークがエオシン及びヘマトキシリンの吸光度から明確に分離されているこの組織の吸光度スペクトルを示す。
実施例７．Ｈ＆Ｅ及びＣＤ３＋ＣＤ８多重ｉＩＨＣで染色したＦＦＰＥ結腸腫瘍組織。
匿名化された患者由来の結腸腫瘍組織からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）スライドマウント切片を、ＶＭＳＩ検体バンクから得られたブロックからＶｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＶＭＳＩ）の組織学の職員が調製した。半自動免疫組織化学を、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ Ｕｌｔｒａシステム（ＶＭＳＩ、Ｔｕｃｓｏｎ ＡＺ）で行った。ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅを使用して、染色ステップを制御するためのプロトコルを作成した。この手順は、以下の手順に示すように、市販の染色剤試薬を利用してすべてのステップを自動化し、カスタム色素原試薬の手動添加のために染色剤を一時停止した。各ステップは、記載した場合を除き、混合しながら３７°Ｃで行い、自動化された洗浄ステップは、反応緩衝液（１０倍濃縮物から希釈；ＶＭＳＩカタログ番号９５０－３００）を使用した。スライドに取り付けられたパラフィン切片（最大３０個／ラン）を、スライドを７０°Ｃに加温して脱パラフィンすることから始めて、各８分間の３サイクルにわたって装置上で処理した。Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ １（ＶＭＳＩ Ｃａｔ＃９５０－１２４）を適用し、スライドを９４℃に６４分間加温して抗原回復を行った。抗ＣＤ３一次抗体（ＶＭＳＩカタログ番号７９０－４３４１）、０．１ｍＬを添加し、１６～３２分間インキュベートした後、洗浄して未結合抗体を除去した。ＯｍｎｉＭａｐ ａｎｔｉ－Ｒｂ ＨＲＰ（ＲＵＯ）、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（ＶＭＳＩカタログ番号７６０－４３１１）、０．１ｍＬを加え、８分間インキュベートした後、洗浄した。ホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中の４００μＭチラミド修飾ＤＢＣＯ（０．１ｍＬ）を手動ピペッティングによって添加し、４分間インキュベートした後、ホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中の０．０１％ Ｈ２Ｏ２（０．１ｍＬ）を添加した。これを３２分間インキュベートした後、洗浄し、０．１ｍＬの４００μＭアジド修飾ＨＣＣＡを手動でピペッティングし、３２分間インキュベートした。洗浄後、スライドをＣｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ２（ＶＭＳＩカタログ番号９５０－１２３）と共に１００℃で８分間インキュベートした後、反応緩衝液で洗浄した。抗ＣＤ８一次抗体（カタログ番号７９０－４４６０）、０．１ｍＬを添加し、１６～３２分間インキュベートした後、洗浄して未結合抗体を除去した。ＯｍｎｉＭａｐ ａｎｔｉ－Ｒｂ ＨＲＰ（ＲＵＯ）、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（ＶＭＳＩカタログ番号７６０－４３１１）、０．１ｍＬを加え、８分間インキュベートした後、洗浄した。０．１ｍＬの２００μＭチラミド修飾ＤＢＣＯを手動ピペッティングによって添加し、４分間インキュベートした。ホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中０．０１％ Ｈ２Ｏ２（０．１ｍＬ）を添加し、３２分間インキュベートした後、洗浄し、３２分間インキュベートしながらスライド上に０．１ ｍＬの２００μＭアジド修飾Ｃｙ７を手動でピペッティングした。洗浄後、スライドを染色装置から取り出し、数百ｍＬの反応緩衝液中で洗浄し、次いで、スライドをＨ＆Ｅで染色し、マウントし、実施例５に記載されるようにマウント／カバーガラスで覆った。
Ｈ＆Ｅ染色を伴う多重ＩＨＣをＦＦＰＥ結腸腫瘍組織に適用し、一般的なｔ細胞マーカーＣＤ３及びｔ細胞活性化ＣＤ８のマーカーを標的とした。ＣＤ３をＨＣＣＡ検出可能部分で染色し、ＣＤ８をＣｙ７検出可能部分で染色した。図１６は、ＨＣＣＡ及びＣｙ７、並びにエオシン及びヘマトキシリンの吸光度をそれぞれ強調し、ｔ細胞集団を明確に識別する、３９０ｎｍ、７７０ｎｍ、５１３ｎｍ及び６２０ｎｍの４つのＬＥＤ光チャネルを使用して記録されたモノクロ透過光画像を示す。図１６は、４つの画像の組み合わせから構成されるカラー合成画像を示す。図１７の左上のカラー合成は、視覚的なＨ＆Ｅ染色パターンを再現し、右上及び左下の画像は、それぞれ、黒色として擬似的に着色された不可視ＣＤ３及びＣＤ８染色を追加する。ＣＤ３及びＣＤ８合成画像において、Ｈ＆Ｅ染色は、バイオマーカーをより良好に可視化するために減少している。右下の画像は、ＣＤ８画像、擬似カラーシアン、ＣＤ３画像、擬似カラーマゼンタのみを合成したものである。ＣＤ８をＣＤ３と共発現した活性化ｔ細胞は青色に見え（マゼンタ＋シアン＝青色）、非活性化ｔ細胞はマゼンタに見える。
この結腸腫瘍例は、Ｈ＆Ｅ及びＩＨＣを単一のスライド上で同時に実施することの重要な利点を実証した。結腸癌腫では、コア腫瘍及び浸潤縁におけるＣＤ３細胞及びＣＤ８細胞の分布が、結腸直腸癌における無病生存率及び全生存率の強力な予後マーカーであることが実証されている（Ｇａｌｏｎ Ｊ，Ｍｌｅｃｎｉｋ Ｂ，Ｂｉｎｄｅａ Ｇ，Ａｎｇｅｌｌ ＨＫ，Ｂｅｒｇｅｒ Ａ，Ｌａｇｏｒｃｅ，ＡＬ，ｅｔ ａｌ．Ｔｏｗａｒｄｓ ｔｈｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ「ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅ」ｉｎ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２０１４；２３２：１９９－２０９を参照のこと）。典型的には、分析には３つのＦＦＰＥ切片が必要であり、１つはＨ＆Ｅ用であり、１つはＣＤ３及びＣＤ８用である。浸潤縁の位置をＨ＆Ｅスライド上で特定し、次いで、ＣＤ３染色スライド及びＣＤ８染色スライドに移し、その上で縁に対するそれぞれの細胞密度を測定した。しかしながら、ＣＤ３及びＣＤ８細胞は連続的な（一連の）ＦＦＰＥ切片上に列挙されたので、腫瘍周辺部は、スライドに適用されたときに３つの切片が異なる配向に起因して、また、各切片が腫瘍のより深い部分を切断し、大きさ、形状及び配向が切断の深さ及び数とともに変化するので、各スライド上でいくらか変化した。これには、Ｈ＆Ｅスライド上で測定された腫瘍辺縁を、各単一ＩＨＣ染色及びヘマトキシリン核染色を使用して同定された腫瘍形態に基づいて、ＣＤ３及びＣＤ８スライド上で生じた任意の配向及び腫瘍変化について調整する必要があった。ＩＨＣスライド上の腫瘍辺縁部のこの近似は臨床的に有意な結果を提供することが示されているが、同じスライド上でＨ＆Ｅ及び二重ＩＨＣを実施することは、辺縁部の位置を移す不確実性を除去し、したがってより正確な結果を提供するはずである。これはおそらく、腫瘍周縁部と比較したＣＤ３／ＣＤ８細胞密度と転帰との関連性を高め、アッセイの予後強度をさらに改善するであろう。
実施例８．ＦＦＰＥ乳房腫瘍異種移植片組織をＨ＆Ｅ及びＨＥＲ２ ｉＩＨＣで染色し、デュアルカメラのカラー／モノクロ撮像システムを使用して評価した。
乳房腫瘍異種移植片（ＶＭＳＩ Ｖｅｎｔａｎａ ＨＥＲ２ Ｄｕａｌ ＩＳＨ ３－ｉｎ－１異種移植片スライド、ＲＥＦ ７８３－４４２２）からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）スライドマウント切片を、実施例５と同様のＤＩＳＣＯＶＥＲＹ Ｕｌｔｒａシステム（ＶＭＳＩ、Ｔｕｃｓｏｎ ＡＺ）で半自動免疫組織化学を使用してＩＨＣによって染色した。各ステップは、記載した場合を除き、混合しながら３７°Ｃで行い、自動化された洗浄ステップは、反応緩衝液（１０倍濃縮物から希釈；ＶＭＳＩカタログ番号９５０－３００）を使用した。スライドに取り付けられたパラフィン切片（最大３０個／ラン）を、スライドを７０°Ｃに加温して脱パラフィンすることから始めて、各８分間の３サイクルにわたって装置上で処理した。Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ １（ＶＭＳＩ Ｃａｔ＃９５０－１２４）を適用し、スライドを９４℃に６４分間加温して抗原回復を行った。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ一次抗体（ＶＭＳＩカタログ番号７９０－２９９１）０．１ｍＬを添加し、１６～３２分間インキュベートした後、洗浄して未結合抗体を除去した。ＯｍｎｉＭａｐ ａｎｔｉ－Ｒｂ ＨＲＰ（ＲＵＯ）、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（ＶＭＳＩカタログ番号７６０－４３１１）、０．１ｍＬを加え、８分間インキュベートした後、洗浄した。ホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中の３００μＭチラミド修飾ＤＢＣＯ（０．１ｍＬ）を手動ピペッティングによって添加し、４分間インキュベートした後、ホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中の０．０１％ Ｈ２Ｏ２（０．１ｍＬ）を添加した。これを３２分間インキュベートした後、洗浄し、０．１ｍＬの３００μＭアジド修飾Ｃｙ７を手動でピペッティングし、３２分間インキュベートした。洗浄後、スライドを染色装置から取り出し、数百ｍＬの反応緩衝液で洗浄した。Ｈ＆Ｅ染色及びマウント／カバースリップを実施例５に記載のように行った。
実施例５、６、及び７では、ヘマトキシリン、エオシン、及び不可視色素原を、各色素又は色素原のピーク吸光度付近の光のバンドで順次照射し、それぞれモノクロカメラで撮像し、得られた画像を別々に見るか、又は合成画像に合成した（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＬＥ，Ｌｅｆｅｖｅｒ ＭＲ，Ｂｅｈｍａｎ ＬＪ，Ｌｅｉｂｏｌｄ Ｔ，Ｒｏｂｅｒｔｓ ＥＡ，Ｈｏｒｃｈｎｅｒ ＵＢ，Ｂａｕｅｒ ＤＲ．Ｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｗｉｔｈ Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ２０２０を参照のこと）。別の手法は、白色光及び不可視光と同時に照射し、カラーカメラとモノクロカメラとの間で透過光を分割することである。適切なフィルタリングにより、Ｈ＆Ｅ画像は、モノクロカメラ上の検出可能部分画像と同時にカラーカメラ上で見ることができ、並べて提示され、及び／又はコンピュータモニタ上に単一の画像としてオーバーレイされる。両方の画像は、顕微鏡ステージの位置、焦点、及びオーバーレイ画像（２つの画像の相対寄与）がライブ画像を見ながら変更され得るように、ビデオレートで提示され得る。必要に応じて、オペレータは顕微鏡の接眼鏡を通して見ることもできる。
ＨＥＲ２ ＩＨＣを、Ｃｙ７検出可能部分を使用して乳房腫瘍異種移植片に対して行い、続いてＨ＆Ｅ染色を行い、２カメラシステムで記録した画像を図１８に示す。カラーカメラで記録したＨ＆Ｅ画像を図の左端に表示し、Ｃｙ７検出可能部分染色のモノクロ画像を右端に表示した。間には、Ｃｙ７（ＨＥＲ２）画像と比較してＨ＆Ｅ画像の寄与（不透明度）が大きい及び小さい２つのオーバーレイ画像がある。分割画像アプローチの値は、病理学者がＨ＆Ｅ及びＩＨＣ染色パターンの両方をリアルタイムで対話的に見ることができ、従来のスライド評価のようにスライド全体を横断するようなものであった。診断対象の領域は、必要に応じて、両方のカメラで個々の視野を停止及び撮像することによって文書化することができる。以前の例における合成画像を使用する逐次画像アプローチと同様に、Ｈ＆Ｅ及びＩＨＣ染色は、単一細胞レベルまでのオーバーレイの視覚的評価によって相関させることができ、連続組織切片又は複数の細胞診スライド上の別々のＨ＆Ｅ及びＩＨＣ染色よりも明確な利点を提供する。
図１８の分割画像アプローチは、Ｈ＆Ｅ染色パターン及び１つのバイオマーカーの同時観察を可能にした。多重ＩＨＣが使用される場合、分割画像アプローチは、不可視照明チャネルを各検出可能部分の吸光度と一致する光に変更することによって、各バイオマーカー画像の隣に連続的にＨ＆Ｅ画像を表示することができる。Ｈ＆Ｅ及び複数のバイオマーカーを同時に見るために、顕微鏡透過光の分割は、２倍の分割を超えて拡張することができる。ＨＥＲ２／Ｈ＆Ｅの例（図１８）で使用される市販のＴｈｏｒｌａｂｓの２－カメラスプリッタと同様に、Ｃａｉｒｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｋｅｎｔ，ＵＫ；Ｔｅｌｅｄｙｎｅ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺによっても配布されている）は、２－及び４－カメラスプリッタ、並びに個別にフィルタリングされた同じ顕微鏡視野の最大４つの異なるオフセット画像を単一のカメラセンサに送達するスプリッタを市販している。この後者のスプリッタは、４つの分割画像の各々を、結果として得られる単一のカメラ画像の別個の象限に表示する。４カメラスプリッタ及びオフセット画像を有する単一カメラの両方は、最大３つの多重化バイオマーカーのＨ＆Ｅ染色及び検出可能部分の染色の同時観察を可能にする。
実施例９．ＰＡＰ従来染色及びＫｉ－６７＋ｐ１６多重不可視免疫細胞化学（ｉＩＣＣ）で染色した子宮頸部細胞診検体。
複数の匿名化された患者からプールされた子宮頸部細胞の検体を、ＴｈｉｎＰｒｅｐ（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）手順を使用して顕微鏡スライドに適用した。ＶＭＳＩ ＣＩＮｔｅｃ ＰＬＵＳ Ｃｙｔｏｌｏｇｙプロトコル（添付文書）に従って調製物に対してＩＣＣを行った。ＣＩＮｔｅｃ ＰＬＵＳ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ検出は、ＣＩＮｔｅｃ ＰＬＵＳ Ｃｙｔｏｌｏｇｙカクテル処理（ｐ１６／Ｋｉ－６７）一次抗体及び検出試薬を使用してＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ｕｌｔｒａシステムで実施した。一般に、ＩＣＣは、特に断らない限り、３６°Ｃで行い、反応緩衝洗浄液を１０倍濃縮物から希釈した。子宮頸部検体プールの抗原回復は、Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ １を適用し、スライドを７５°Ｃに４分間加温し、次いで１００°Ｃに２４分間加温することによって行った。ＣＩＮＴｅｃ ＰＬＵＳ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ抗体は一緒にカクテル処理されるので、両方の一次抗体とのインキュベーションを同時に行い、続いて反応緩衝液中で洗浄して未結合抗体を除去した。ペルオキシダーゼにコンジュゲートした一次抗体（抗マウス又は抗ウサギのいずれか）を順次標的とする抗種抗体とのインキュベーションを行った。多重ＩＨＣについて上述したように、チラミドＤＢＣＯ並びにアジド修飾ＤＣＣ及びＣｙ７を使用して、ＤＣＣ及びＣｙ７ ｉＣＤＣを従来のＤＡＢ及びＦａｓｔ Ｒｅｄ色素原に置換した。染色操作の終了時に、スライドを希釈洗剤溶液（２００ｍＬの水中の１滴のＤａｗｎディッシュ液体（Ｐｒｏｃｔｏｒ＆Ｇａｍｂｌｅ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ））で洗浄した。従来のＰＡＰ染色は、以下のように、スライドを依然として濡らしながら直ちに行った。湿ったスライドを蒸留水に１分間、Ｒｉｃｈａｒｄ－Ａｌｌａｎ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ Ｉ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に３０秒間、蒸留水に２回各１５秒間、Ｒｉｃｈａｒｄ－Ａｌｌａｎ Ｃｌａｒｉｆｉｅｒ １に３０秒間、蒸留水に３０秒間、Ｒｉｃｈａｒｄ－Ａｌｌａｎ Ｂｌｕｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔに３０秒間、５０％エタノールに３０秒間、９５％エタノールに３０秒間、Ｒｉｃｈａｒｄ－Ａｌｌａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｃｙｔｏ－Ｓｔａｉｎ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に１分間、９５％エタノールに２回各３０秒間浸した後、１００％エタノールの３つの清浄浴に３回各３０秒間通し、キシレンに３回（２回各１分間、最後に３分間）通した。次いで、ＰＡＰ染色スライドを、Ｈ＆Ｅ染色のために実施例５に記載されるようにカバーガラスで覆った。
この実施例では、腫瘍抑制因子ｐ１６及び細胞増殖のマーカーＫｉ６７を標的とする子宮頸部細胞診検体のＰＡＰ染色と多重ｉＩＣＣを組み合わせることによって、Ｈ＆Ｅ＋不可視色素原概念を別の従来の病理染色及び別の調製タイプに拡張した。図１９は、ＰＡＰ染色された子宮頸部細胞診検体の吸光度スペクトルを示しており、これは、Ｈ＆Ｅと同様に、ＰＡＰ染色が可視スペクトルで強く吸収され、深青色／ＵＶではより少なく、遠赤色／近赤外ではほとんど吸収されないことを示している。図２０は、頸部細胞の集合の画像を表示し、左上の画像は、２カメラシステムのカラーカメラに記録されている。画像の下部における細胞のクラスターは異常に見え、これは、上部中央及び右側のモノクロ画像にそれぞれ示されるＤＣＣ色素原（４０５ｎｍＬＥＤ）によるｐ１６染色及びＣｙ７色素原（７７０ｎｍＬＥＤ）によるＫｉ６７染色によって確認され、モノクロカメラで記録された。下の２つの画像は、異なる擬似着色を有するＤＣＣ及びＣｙ７画像を組み合わせて、より良好な同時染色を示した。右下の画像は、Ｋｉ－６７を赤色で、ｐ１６を茶色で表し、ＰＡＰ染色の非存在下で実施したこれら２つのタンパク質の発現のためのＣＩＮＴｅｃｈ市販アッセイを模倣した。左下の画像は、鮮明度を向上させるために、Ｋｉ－６７をマゼンタで表し、ｐ１６をシアンで表している。図２１は、カラーカメラで記録された左画像におけるＰＡＰ染色、並びにモノクロカメラで記録された中央及び右画像におけるＫｉ６７（ＤＣＣ）及びｐ１６（Ｃｙ７）染色を有する子宮頸部細胞の別のコレクションを示す。３つの画像の中央の左側にある４つの細胞のグループ分けは、両方のバイオマーカーについて強い染色を伴う異常を明確に示した。
子宮頸部細胞診の例は、Ｈ＆Ｅ以外の一般的な従来の染色を使用して不可視ＩＨＣを有利にすることができ、細胞診調製物も適切な検体であることを実証した。ＰＡＰ染色は、子宮頸癌に至る経路にある女性を特定するために、ブラッシング検体中の異常な子宮頸部細胞を見つけるために使用される。検体は、分散された子宮頸部細胞及び細胞凝集体であり、塗抹として、又はＴｈｉｎＰｒｅｐ（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）及びＳｕｒｅｐａｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＪ）などの市販の液体細胞学的方法によってスライドに適用される。歴史的に、ＰＡＰ染色によって明らかにされるような子宮頸部細胞の細胞形態は、潜在的に子宮頸癌につながる子宮頸癌及び異形成について患者をスクリーニングするための主要な方法として役立った。より最近では、ＩＨＣによって同定されたｐ１６及びＫｉ－６７の両方を過剰発現する子宮頸部細胞は、異常細胞の同定においてさらなる利益を追加することが示されている（Ｗｒｉｇｈｔ Ｊｒ ＴＣ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒｉａｇｉｎｇ ＨＰＶ－Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ｐ１６／Ｋｉ－６７ Ｄｕａｌ－ｓｔａｉｎｅｄ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ：Ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ａ Ｓｕｂ－ｓｔｕｄｙ Ｎｅｓｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ＡＴＨＥＮＡ Ｔｒｉａｌ．Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２０１７；１４４：５１－５６．Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌを参照のこと）。本明細書中に示されるように、ＰＡＰと二重ＩＨＣとを組み合わせることによって全ての細胞におけるＰＡＰ染色パターン、ｐ１６発現及びＫｉ－６７発現を評価する能力は、さらにより高い診断精度を提供することが十分に期待され得る。
実施例１０．ｉＩＨＣによる特殊染色の使用。
以下の特殊染色を、Ｖｅｎｔａｎａ特殊染色キットを使用して、Ｖｅｎｔａｎａ特殊染色自動化スライド染色装置で、製造業者の提案プロトコルに従って行った。：Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ Ｇｒｅｅｎ（オーダーコード０６５２１９１６００１）、Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ Ｂｌｕｅ（オーダーコード０６５２１９０８００１）、Ｊｏｎｅｓ Ｌｉｇｈｔ Ｇｒｅｅｎ（オーダーコード０５２７９３５６００１）、）、Ｊｏｎｅｓ Ｈ＆Ｅ（オーダーコード０５２７９３４８００１）及びＡｃｉｄ Ｆａｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＡＦＢ；オーダーコード０８４３２５０３００１）。
Ｈ＆Ｅ及びＰＡＰ以外のいくつかの従来の組織学及び細胞染色は、異常及び疾患の同定を助けるために解剖学的病理学において日常的に使用され、一般に特殊染色と呼ばれる。スライドマウントされた細胞検体に適用されたいくつかの特殊染色の吸光度スペクトルを図２２にプロットし、それらは可視スペクトル内で強い吸光度を有するが、吸光度は深青色／ＵＶ若しくは遠赤色／近ＩＲスペクトル領域のいずれか、又はその両方で大幅に低下することを示す。したがって、Ｈ＆Ｅ及びＰＡＰ染色と同様に、多くの特殊染色もまた、ｉＩＨＣ及びｉＩＣＣの同時適用を可能にする。
実施例１１．Ｈ＆Ｅ及びＭＡＲＴ－１／ｍｅｌａｎ Ａ ｉＩＨＣで染色したメラノーマＦＦＰＥ組織。
メラノーマＦＦＰＥ組織を、実施例５と同様のＤＩＳＣＯＶＥＲＹ Ｕｌｔｒａシステム（ＶＭＳＩ、Ｔｕｃｓｏｎ ＡＺ）で半自動免疫組織化学を使用してＩＨＣによって染色した。各ステップは、記載した場合を除き、混合しながら３７°Ｃで行い、自動化された洗浄ステップは、反応緩衝液（１０倍濃縮物から希釈；ＶＭＳＩカタログ番号９５０－３００）を使用した。スライドに取り付けられたパラフィン切片を、スライドを７０°Ｃに加温して脱パラフィンすることから始めて、各８分間の３サイクルにわたって装置上で処理した。Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ １（ＶＭＳＩ Ｃａｔ＃９５０－１２４）を適用し、スライドを９４℃に６４分間加温して抗原回復を行った。抗ＭＡＲＴ１／ｍｅｌａｎＡ一次抗体（ＶＭＳＩカタログ番号７９０－２９９０）０．１ｍＬを添加し、１６～３２分間インキュベートした後、洗浄して未結合抗体を除去した。ＯｍｎｉＭａｐ ａｎｔｉ－Ｒｂ ＨＲＰ（ＲＵＯ）、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（ＶＭＳＩカタログ番号７６０－４３１１）、０．１ｍＬを加え、８分間インキュベートした後、洗浄した。ホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中の４００μＭチラミド修飾ＤＢＣＯ（０．１ｍＬ）を手動ピペッティングによって添加し、４分間インキュベートした後、ホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中の０．０１％ Ｈ２Ｏ２（０．１ｍＬ）を添加した。これを３２分間インキュベートした後、洗浄し、０．１ｍＬの４００μＭアジド修飾Ｃｙ７を手動でピペッティングし、３２分間インキュベートした。洗浄後、スライドを染色装置から取り出し、数百ｍＬの反応緩衝液で洗浄した。Ｈ＆Ｅ染色及びマウント／カバースリップを実施例５に記載のように行った。
検出可能部分の別の用途は、可視スペクトルで強く吸収し、ＩＨＣ染色の可視化又は撮像を妨げる内因性又は外因性色素を含有する組織に対するＩＨＣである。内因性色素の例はメラニンであり、皮膚メラノサイトに見られるポリマーであり、有害なＵＶ照射から身体を保護する。皮膚中のメラニンの吸光度スペクトルは、寛解分光法によって決定されるように、遠赤色及び近ＩＲ．１７で大きく減少する点までスペクトルの可視部分を通して減少するＵＶで強い吸光度を示す。Ｃｙ７検出可能部分で染色されたＭＡＲＴ－１／ｍｅｌａｎ Ａを標的とするＨ＆Ｅ及びＩＨＣの両方で染色されたメラノーマＦＦＰＥ組織の画像を図２３に示す。２カメラシステムで記録されたカラー画像は、Ｈ＆Ｅ染色内の褐色メラニン色素の存在を明らかにしたが、モノクロ画像は、本質的にメラニン干渉を伴わずに、ＭＡＲＴ１／ｍｅｌａｎＡを明確に定義するＣｙ７検出可能部分による７７０ｎｍ ＬＥＤ光の吸光度を示した。重度のメラニン堆積を有する組織では、メラニン吸光度及び／又は光散乱が７７０ｎｍで明らかであったが、著しく減衰した。
メラニンの実施例は、不可視ＩＨＣが、Ｈ＆Ｅ、ＰＡＰ、及び特殊染色などの適用された染色による適用に有益であるだけでなく、強く吸収する内因性色素、又はさらには刺青色素を含む吸入、摂取、又は接触による工業的又は環境的曝露による外因性色素と組み合わせて使用するのにも有益であることを実証した。メラニンを含む検体では、従来の色素原によるＩＨＣの解釈が困難な場合がある。メラニンの化学漂白は、ＩＨＣの評価を可能にするレベルまでメラニン吸光度を低下させるためにしばしば用いられた。しかしながら、漂白は、時に標的抗原を変化させ、それらの検出効率を低下させる可能性があり、ＩＨＣ色素原を漂白する可能性もある。（本明細書に記載されるような）不可視色素原の使用は、漂白を完全に回避することを可能にすると考えられる。
実施例１１．カッパｍＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）及びＨ＆Ｅによって染色した扁桃ＦＦＰＥ組織。
ＴＳＡ希釈液中１００μＬの５０又は１００μＭのＣｙ７検出可能部分を置換することにより、ｍＲＮＡ ＩＳＨを以前に記載されたように実施した。Ｈ＆Ｅ染色及びマウント／カバースリップを実施例５に記載のように行った。
図２４に扁桃ＦＦＰＥ組織で示されるように、不可視ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）と組み合わせたＨ＆Ｅも実証された。左画像を２カメラシステムのカラーカメラで記録し、右画像を、Ｃｙ７検出可能部分によって吸収された７７０ｎｍのＬＥＤ光を観察するモノクロカメラで記録した。ＩＨＣにおいて使用される一次抗体試薬の代わりに、カッパｍＲＮＡ配列にハイブリダイズしたハプテン化核酸プローブは、酵素的共有結合堆積及び酵素コンジュゲート抗ハプテン抗体を介したＣｙ７検出可能部分による染色を指示する。予想されたように、扁桃におけるカッパ発現は、非常に強く発現する細胞から非常に弱く発現する細胞まで変化し、弱く発現する細胞あたりわずか１～数スポットとして見られた。ＩＳＨは、組織及び細胞形態の欠如についてしばしば批判されているが、この実施例は、プローブへの核酸標的のアクセスを改善するためにタンパク質分解を含むよりストリンジェントな検体前処理に起因するＨ＆Ｅ品質のいくらかの低下があるにもかかわらず、ＩＳＨがＨ＆Ｅ染色の関連内で提示され得ることを証明している。
実施例１２．色素原堆積化学。
匿名化された患者由来の（癌に対して）正常な扁桃組織からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）スライドマウント切片を、ＶＭＳＩ検体バンクから得られたブロックからＶｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＶＭＳＩ）の組織学の職員が調製した。検体スライドを、以下に記載されるような色素原堆積を除いて実施例５と同様のＤＩＳＣＯＶＥＲＹ Ｕｌｔｒａシステム（ＶＭＳＩ、Ｔｕｃｓｏｎ ＡＺ）で半自動免疫組織化学を使用してＩＨＣによって染色した。各ステップは、記載した場合を除き、混合しながら３７°Ｃで行い、自動化された洗浄ステップは、反応緩衝液（１０倍濃縮物から希釈；ＶＭＳＩカタログ番号９５０－３００）を使用した。スライドに取り付けられたパラフィン切片（最大３０個／ラン）を、スライドを７０°Ｃに加温して脱パラフィンすることから始めて、各８分間の３サイクルにわたって装置上で処理した。Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ １（ＶＭＳＩ Ｃａｔ＃９５０－１２４）を適用し、スライドを９４℃に６４分間加温して抗原回復を行った。抗ＣＤ８一次抗体（カタログ番号７９０－４４６０）、０．１ ｍＬを添加し、１６～３２分間インキュベートした後、洗浄して未結合抗体を除去した。チラミド色素原についてはＯｍｎｉＭａｐ ａｎｔｉ－Ｒｂ ＨＲＰ（ＲＵＯ）、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（ＶＭＳＩカタログ番号７６０－４３１１）、又はキノンメチド前駆体色素原についてはＵｌｔｒａＭａｐ ａｎｔｉ－Ｒｂ Ａｌｋ Ｐｈｏｓ、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（ＶＭＳＩカタログ番号７６０－４３１４）、０．１ｍＬを添加し、８分間インキュベートした後、洗浄した。ホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中の７－アミノ－４－メチルクマリン－３－アセテートの１２００μＭチラミド誘導体（０．１ｍＬ）（ＡＭＣＡ－チラミド）又はホウ酸緩衝液ｐＨ８．，５中の４００ｕＭのキノンメチド前駆体修飾Ｃｙ７を、手動ピペッティングによって添加した。チラミド色素原を４分間インキュベートした後、ホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中の０．０１％ Ｈ２Ｏ２（０．１ｍＬ）を添加し、３２分間インキュベートした後、洗浄した。キノンメチド前駆体修飾色素原を３２分間インキュベートした後、洗浄した。次いで、スライドを染色装置から取り出し、数百ｍＬの反応緩衝液で洗浄した。Ｈ＆Ｅ染色及びマウント／カバースリップを実施例５に記載のように行った。
先の実施例では、ＤＢＣＯ－チラミド誘導体のペルオキシダーゼ触媒共有結合堆積とそれに続くアジド誘導体化色素とのカップリングを用いて、検出可能部分を「クリックケミストリー 」中間体を介して共有結合的に堆積させた。ペルオキシダーゼ触媒フリーラジカル形成によって堆積された色素のチラミド誘導体、及び反応性キノンメチドを形成するためにアルカリホスファターゼ加水分解によって堆積されたキノンメチド前駆体色素誘導体も、バイオマーカーの不可視染色に有効であった。これは図２５に示されており、扁桃ＦＦＰＥ組織は、キノンメチド－Ｃｙ７検出可能部分（上）及びチラミド－ＡＭＣＡ ＵＶ吸収検出可能部分（下）を使用してＣＤ８不可視ＩＨＣで染色されている。２カメラシステムは、図の左側に示すカラーカメラ画像及び右側に示すモノクロ画像で利用した。これは、主にスペクトルの不可視領域に吸光度を有する任意の色素原が、堆積化学にかかわらず、Ｈ＆Ｅなどの従来の可視吸収染色での使用が考慮され得ることを実証した。１つの注意点は、ＩＨＣ後に適用される場合、色素原は、従来の染色で利用される試薬及び条件による除去に耐えなければならないことである。これに関して、検出可能なコンジュゲート（検出可能部分を含む）は、細胞及び組織成分に共有結合しており、Ｆａｓｔ Ｒｅｄなどの従来の色素原とは対照的に、有機試薬又は水性試薬によって可溶化されないので、特に有用である。
実施例１３．肺腫瘍組織上のムシカルミン特殊染色＋不可視ＴＴＦ－１及びｐ４０二重ＩＨＣ
匿名化された患者由来の肺腫瘍組織からのＦＦＰＥスライドマウント切片を、ＶＭＳＩ検体バンクから得られたブロックからＶｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＶＭＳＩ）の組織学の職員が調製した。半自動免疫組織化学を、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ Ｕｌｔｒａシステム（ＶＭＳＩ、Ｔｕｃｓｏｎ ＡＺ）で行った。ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅを使用して、染色ステップを制御するためのプロトコルを作成した。この手順は、以下の手順に示すように、市販の染色剤試薬を利用してすべてのステップを自動化し、カスタム色素原試薬の手動添加のために染色剤を一時停止した。各ステップは、記載した場合を除き、混合しながら３７°Ｃで行い、自動化された洗浄ステップは、反応緩衝液（１０倍濃縮物から希釈；ＶＭＳＩカタログ番号９５０－３００）を使用した。スライドに取り付けられたパラフィン切片（最大３０個／ラン）を、スライドを７０°Ｃに加温して脱パラフィンすることから始めて、各８分間の３サイクルにわたって装置上で処理した。Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ １（ＶＭＳＩ Ｃａｔ＃９５０－１２４）を適用し、スライドを９４℃に６４分間加温して抗原回復を行った。抗甲状腺転写因子－１（ＴＴＦ－１；ＳＰ１４１）ウサギモノクローナル一次抗体（カタログ番号７９０－４７５６）、０．１ｍＬを添加し、１６～３２分間インキュベートした後、洗浄して未結合抗体を除去した。ＯｍｎｉＭａｐ ａｎｔｉ－Ｒｂ ＨＲＰ（ＲＵＯ）、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（ＶＭＳＩカタログ番号７６０－４３１１）、０．１ｍＬを加え、８分間インキュベートした後、洗浄した。ホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中の１００～４００μＭチラミド修飾ＤＢＣＯ（０．１ｍＬ）を手動ピペッティングによって添加し、４分間インキュベートした後、ホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中の０．０１％ Ｈ２Ｏ２（０．１ｍＬ）を添加した。これを３２分間インキュベートした後、洗浄し、０．１ｍＬの１００～４００μＭアジド修飾ＩＲ８７０を手動でピペッティングし、３２分間インキュベートした。洗浄後、スライドをＣｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ２（ＶＭＳＩカタログ番号９５０－１２３）と共に１００℃で８分間インキュベートした後、反応緩衝液で洗浄した。抗ｐ４０（ＢＣ２８）マウスモノクローナル一次抗体（ＶＭＳＩカタログ番号７９０－４９５０）０．１ｍＬを添加し、１６～３２分間インキュベートした後、洗浄して未結合抗体を除去した。ＯｍｎｉＭａｐ ａｎｔｉ－Ｍｓ ＨＲＰ（ＲＵＯ）、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（ＶＭＳＩカタログ番号７６０－４３１０）、０．１ｍＬを加え、８分間インキュベートした後、洗浄した。０．１ｍＬの２００～４００μＭチラミド修飾ＤＢＣＯを手動ピペッティングによって添加し、４分間インキュベートした。ホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中０．０１％ Ｈ２Ｏ２（０．１ｍＬ）を添加し、３２分間インキュベートした後、洗浄し、３２分間インキュベートしながらスライド上に０．１ｍＬの２００～４００μＭアジド修飾Ｃｙ７を手動でピペッティングした。洗浄後、スライドを染色装置から取り出し、以下のうちの１つ又は複数で洗浄した。２５０ｍＬの反応緩衝液スライド、０．２ｇのＤａｗｎ食器洗い用洗剤を含有する２５０ｍｌの水、２５０ ｍｌの水。次いで、スライドを直ちにＨ＆Ｅで染色するか、又は最初に周囲温度でエタノール及びキシレン（２×８０％エタノール、各１分、２×９０％エタノール、各１分、３×１００％エタノール、各１分、３×キシレン、各１分）によって脱水した。脱水された場合、スライドを最初に、周囲温度で１００％エタノールに１分間、９０％エタノールに１分間、８０％エタノールに１分間及び水に１分間浸漬することによって再水和した後にムチカルミン染色した。ムチカルミン染色を、一連のＣｏｐｌｉｎジャーにおいて周囲温度で、製造業者の指示に従ってムチカルミン染色キット（カタログ番号ａｂ１５０６７７；Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用してジャー間でスライドを手動で移して行った。これには、スライドをヘマトキシリン溶液に３分間浸漬すること、水中で洗浄すること、スライドをブルーイング試薬に３０秒間浸漬すること、水中で洗浄すること、スライドをムシカルミン溶液に１０分間浸漬すること、スライドを水中で洗浄すること、スライドをタートラジン溶液に１分間浸漬すること、スライドをエタノールのいくつかの変化ですすぐこと、及びスライドをキシレンに浸漬することが含まれた。次いで、スライドを水切りし、Ｒｉｃｈａｒｄ Ａｌｌａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｙｔｏｓｅａｌ ＸＹＬ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ，Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ）を適用して１．５型カバースリップで覆うことによって取り付けた。
ムシカルミン特殊染色は、肺腫瘍組織の分類を助けるために病理学者によってしばしば使用される。脱パラフィン処理した肺腫瘍組織（１つは扁平上皮癌腫であり、１つは腺癌である）を上記手順（ＩＨＣなし）に従って染色し、吸光度スペクトルを記録し、図２７にプロットした。ＩＨＣは、扁平上皮癌腫と腺癌とを区別するさらに大きな能力を提供することができ、したがって、ムチカルミン特殊染色に対する良好な補完であろう。ＴＴＦ－１ ＩＨＣは腺癌において細胞を特異的に染色し、ｐ４０ ＩＨＣは扁平上皮癌腫において細胞を特異的に染色する。スペクトルは、ムチカルミン染色の吸光度が、深青色及びＵＶ吸収性ＨＣ色素原の使用を妨げる可能性があるが、遠赤色／近ＩＲ吸収性色素原の使用を妨げないはずであることを示している。ＩＨＣと組み合わせたムチカルミン特殊染色の使用を実証するために、扁平上皮癌腫及び腺癌肺腫瘍組織を、それぞれＣｙ７（最大吸光度７７４ｎｍ）及びＩＲ８７０（最大吸光度８６９ｎｍ）色素原を使用してｐ４０及びＴＴＦ－１発現細胞を同定するための二重ｉＩＨＣによって染色し、続いて上記の手順に記載のムチカルミン染色を行った。各染色組織の画像を、Ｓｅｍｒｏｃｋ ７６９ｎｍ中心波長、４９．３ｎｍ ＦＷＨＭバンドパスフィルタ（カタログ番号ＦＦ ０１－７６９／４１；ＩＤＥＸ Ｈｅａｌｔｈ＆Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＬＬＣ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）及びＣｈｒｏｍａ ８８０ｎｍ中心波長、４０ｎｍ ＦＷＨＭバンドパスフィルタ（カタログ番号ＭＶ ８８０／４０；Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ，Ｂｅｌｌｏｗｓ Ｆａｌｌｓ，ＶＴ）を有するタングステンランプ源を使用してデュアルカメラ顕微鏡システムで記録して、それぞれＣｙ７及びＩＲ８７０照明チャネルを作成した。これらの画像を図２８に示し、予想通り、腺癌組織におけるＴＴＦ－１発現細胞（右上の画像）及び扁平上皮癌腫画像におけるｐ４０発現細胞（中央下の画像）の存在を示す。また、同じく腺癌に関連するカラーカメラで記録されたムチカルミン染色の画像（左上の画像）において、ＴＴＦ－１発現細胞の細胞質中のムチン発現を示すピンク色に注目されたい。これにより、肺の腺癌の分類が、単一の組織切片上で同時に特殊染色とＩＨＣとの一致によって確認される。
不可視ＩＨＣはまた、位相コントラスト及び示差干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡法などの非染色技術と組み合わせることができる。一般的に行われるように、可視スペクトルはコントラスト強調撮像に使用され、不可視色素原吸光度の存在によって影響されない。
本明細書中に提示される実施例において、Ｈ＆Ｅ染色又はＰＡＰ染色とそれぞれの不可視色素原との間のスペクトル分離が十分に大きく、可視白色光又は不可視ＬＥＤ照明のいずれかで観察又は記録された画像は、各色素を他から効果的に分離するのに十分であり、スペクトルクロストークの証拠はほとんどなかったことに留意されたい。しかしながら、クロストークの残留量は、スペクトル脱混合アルゴリズムの適用によって除去することができ、例えば、ＤＣＣ、ＨＣＣＡ及びＡＭＣＡ．１５、２０、２１などの深青色／ＵＶ吸収性色素原に対してより高い染色コントラストを提供するために、Ｈ＆Ｅ染色の深青色／ＵＶ吸光度の一部を除去することができる。さらに、より多くの色素を追加するとスペクトル重複が増加し、補正が必要になるので、スペクトルクロストークは、より不可視の色素を多重ＩＨＣで使用することを可能にする。スペクトル脱混合により、Ｈ＆Ｅ又はＰＡＰ吸光度により近い吸光度を有する色素原を使用することができ、ヘマトキシリン及びエオシンの個々の参照スペクトルを、Ｈ＆Ｅ染色液から不可視の色素原吸光度を除去するための脱混合において各色素原の参照スペクトルと共に含めることができる。さらに、スペクトル脱混合により、Ｈ＆Ｅのヘマトキシリン及びエオシン成分を減少させて、ヘマトキシリン又はエオシンにより近い吸光度を有する色素原を使用することができる。次いで、Ｈ＆Ｅ画像を、色素原吸光度を含まず、病理学者の好みに適合するようにヘマトキシリン及びエオシン成分を個別に調整可能に増強した２色素合成画像として再構成した。ヘマトキシリン及びエオシン染色の減少は、周知のＨ＆Ｅ染色の一般的な外観及び解釈性を変化させ得るので、これはＩＨＣの多重化レベルを増加させる能力とのトレードオフで実行される。
実施例１３及び図２８は、ムチカルミン特殊染色と共に使用される二重不可視ＩＨＣを記載しており、これは、ＵＶにおける強いムチカルミン特殊染色吸光度に起因して、両方の不可視色素原がスペクトルの近ＩＲ部分で光を吸収することを必要とする。これは、Ｃｙ７吸光度がモニターされる波長でＩＲ８７０色素原の有意な吸光度をもたらす（８８０ｎｍ光チャネルでのＩＲ８７０吸光度の約４５％が７６９ｎｍ光チャネルで観察される）。図２８（上部中央パネル）におけるＣｙ７チャネルへのＩＲ８７０のスペクトルクロストークはそれほど明白ではない；しかしながら、より濃く染色されたＴＴＦ－１陽性細胞のクロストークは、図３０の上部中央パネルに示されるように顕著である。このスライドは、図２８に示す同じＮＳＣＬＣ腺癌検体からのものであり、同じ二重ＩＨＣ手順によって染色されるが、ムチカルミン特殊染色の代わりにＨ＆Ｅで手動で染色される。マルチスペクトル画像は、４つのフィルタリングされたタングステンランプチャネルで照明されたモノクロカメラで記録された。５１０ｎｍ（主にエオシン）、５９９ｎｍ（ヘマトキシリン）、７６９ｎｍ（主にＣｙ７）及び８８０ｎｍ（ＩＲ８７０）。脱混合５１０ｎｍ及び５９９ｎｍの画像からカラーＨ＆Ｅ画像（図３０、パネルＡ）を調製し、接眼鏡を通しての視界を再現した。７６９ｎｍ光チャネル（主にＣ７吸光度；図３０、パネルＢ）及び８８０ｎｍ光チャネル（ＩＲ８７０吸光度；図３０、パネルＣ）を使用して記録した画像を処理して、脱混合ｐ４０及びＴＴＦ－１画像（それぞれ、図３０のパネルＥ、Ｆ）を得た。図３０パネルＢにおいて明らかであるように、この実施例のために選択される特に暗い染色ＩＲ８７０細胞（おそらくは、正常なＴＴＦ－１陽性細胞）は、７６９ｎｍ光チャネルへの顕著なクロストークを有し、これは、脱混合後に排除される（図３０、パネルＥ）。脱混合ＩＲ８７０（図３０、パネルＦ）は、８８０ｎｍでの他の色素の最小吸光度のために、圧混合の影響をほとんど示さない。図３０のパネルＤは、脱混合ヘマトキシリン及びＴＴＦ－１画像のみを組み合わせ、ヘマトキシリン対比染色を用いて従来の単一ＩＨＣを模倣して作製したカラー合成を示す。予想通り、ｐ４０染色は腺癌組織には存在しない。
実施例１４．隣接する染色吸光度間の干渉を低減するための画像処理－スペクトル脱混合。
画像処理は、スペクトルクロストークを低減し、多重化アッセイで使用された他の色素原及び染色からの干渉を低減又は排除した個々の色素原及び染色の画像を提供するために、色素原及び従来の染色の記録画像に適用することができる。例えば、図１６の左上の透過光画像では、ＣＤ３発現領域のＨＣＣＡ色素原染色が明確に区別される。しかしながら、全ての細胞核の染色はまた、ＨＣＣＡを撮像するために使用される３９０ｎｍ光チャネル内に広がるヘマトキシリンの従来の染色の広い吸光度のためにかすかに視認可能である。これは、定量分析を実行するときに典型的に行われるように、図２９の左上の画像に示されるように、透過率が吸光度に変換されるときにより明確に見られる。脱混合は、重複する色素吸光度を補正するために、各光チャネルにおける個々の各色素の相対吸光度を使用する。このプロセスは、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＬＥ，Ｌｅｆｅｖｅｒ ＭＲ，Ｂｅｈｍａｎ ＬＪ，Ｌｅｉｂｏｌｄ Ｔ，Ｒｏｂｅｒｔｓ ＥＡ，Ｈｏｒｃｈｎｅｒ ＵＢ，Ｂａｕｅｒ ＤＲ（２０２０）Ｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｗｉｔｈ Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１３７４－０２０－０４２９－０及びその中の参考文献に詳細に記載されている。各色素のＩＨＣから個々に決定される各色素の相対吸光度は、反転時に補正係数を提供するマトリックスのクロストーク係数を形成する。補正係数は、多色染色された顕微鏡視野の様々な吸光度画像によって乗算され、次いで、それらが一緒に加算されて、クロストークが除去された純粋な染色の画像が作成される。ＨＣＣＡ及びＣｙ７画像の結果を図２９に示し、上の二行はクロストーク補正前の画像であり（図１６の対応する透過光画像を参照のこと）、下の二行はクロストーク補正後の画像である。脱混合ＨＣＣＡは、ヘマトキシリン染色核の抑制によってかなりのバックグラウンド低減を示す。ヘマトキシリンは、Ｃｙ７が吸収するスペクトルの遠赤色／近ＩＲ部分にほとんど又は全く吸光度を有さないので、Ｃｙ７画像は大きく異なって見える。
スペクトルクロストークは、例えば図１６に示されるように、顕微鏡を通る透過光の視覚的解釈を妨げないほど十分に小さいものであり得るが、吸光度画像の定量的分析は、例えば、異なるタンパク質発現の領域を区別するための閾値の適用をより効果的にすることによって利益を得ることができる。これは、異なる細胞集団の計数、細胞内距離の測定、タンパク質発現レベルの測定などの精度を高める。より多くの色素の使用に伴うスペクトルクロストークの増加を補正することができるので、多重アッセイにおいてスペクトル脱混合を適用することにより、デジタル評価アッセイにおいてより高いレベルの多重化が可能になる。
本明細書中で言及される及び／又は出願データシートにおいてリスト化される全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、及び非特許刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、必要に応じて、様々な特許、出願、及び刊行物の概念を使用して更に別の実施形態を提供するように変更されることができる。
本明細書の開示は特定の実施形態を参照して説明されているが、これらの実施形態は本開示の原理及び用途の単なる例示であることを理解されたい。したがって、例示的な実施形態に対して多数の修正を行うことができ、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく他の構成を考案することができることが理解される。

Claims (117)

  1. 基材上に配置された生物学的検体内の１つ又は複数の標的を可視化する方法であって、
    （ａ）第１のバイオマーカーを、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭ及び約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超のいずれかの最大吸光度（λｍａｘ）を有する第１の検出可能部分で標識すること；及び
    （ｂ）約４００ｎｍ～約７００ｎｍの１つ又は複数のピーク吸光度波長を有する少なくとも１つの従来の色素で前記基材上に配置された前記生物学的検体を染色することであって、前記第１の検出可能部分のピーク吸光度波長と前記１つ又は複数の従来の色素の前記１つ又は複数のピーク吸光度波長とが少なくとも２０ｎｍ離れている、前記生物学的検体を染色すること
    を含む、方法。
  2. 前記第１の検出可能部分の前記ＦＷＨＭが約１５０ｎｍ未満である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第１の検出可能部分の前記ＦＷＨＭが約１００ｎｍ未満である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記第１の検出可能部分の前記ＦＷＨＭが約７０ｎｍ未満である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記１つ又は複数の従来の色素がヘマトキシリンを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記１つ又は複数の従来の色素がエオシンを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記１つ又は複数の従来の色素がヘマトキシリン及びエオシンを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記１つ又は複数の従来の色素が、酸性フクシン、アルシアンブルー８ＧＸ、アリザリンレッドＳ、オーラミンＯ、アゾカルミンＢ、アゾカルミンＧ、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、塩基性フクシン、ビスマルックブラウンＹ、ブリリアントクレシルブルー、ブリリアントグリーン、カルミン、クロラゾールブラックＥ、コンゴーレッド、クレシルバイオレット、クリスタルバイオレット、ダローレッド、エチルグリーン、ファストグリーンＦＣＦ、フルオレセインイソチオシアネート、ギムザ染色、インジゴカルミン、ヤヌスグリーンＢ、ジェンナー染色１８９９、ライトグリーンＳＦ、マラカイトグリーン、マーチウスイエロー、メチルオレンジ、メチルバイオレット２Ｂ、メチレンブルー、メチレンブルー、メチレンバイオレット（ベルンツェン）、ニュートラルレッド、ニグロシン、ナイルブルーＡ、ヌクレアファストレッド、オイルレッドＯ、オレンジＧ、オレンジＩＩ、オルセイン、パラロサニリン、フロキシンＢ、プロタルゴールＳ、ピロニンＢ、ピロニンＹ、レザズリン、ローズベンガル、サフラニンＯ、ズダンブラックＢ、ズダンＩＩＩ、ズダンＩＶ、テトラクロム染色（ＭａｃＮｅａｌ）、チオニン、トルイジンブルー、ワイゲルト１８７８、ライト染色及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記第１のバイオマーカーを前記第１の検出可能部分で標識することが、（ａ）前記生物学的検体を抗バイオマーカー一次抗体と接触させること；（ｂ）前記生物学的検体を、前記抗バイオマーカー一次抗体に特異的な抗特異的（ａｎｔｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｅｓ）二次抗体と接触させることであって、抗種（ａｎｔｉ－ｓｐｅｃｉｅｓ）抗体が、少なくとも１つの酵素に直接的又は間接的にコンジュゲートされている、抗特異的二次抗体と接触させること；並びに、（ｃ）前記生物学的検体を、（ｉ）前記第１の検出可能部分、及び（ｉｉ）チラミド部分、キノンメチド部分、又はチラミド部分若しくはキノンメチド部分の誘導体若しくは類似体を含む第１の検出可能なコンジュゲートと接触させること、を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記第１のバイオマーカーを前記第１の検出可能部分で標識することが、（ａ）前記生物学的検体を抗バイオマーカー一次抗体と接触させること；（ｂ）前記生物学的検体を、前記抗バイオマーカー抗体に特異的な抗特異的（ａｎｔｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｅｓ）二次抗体と接触させることであって、抗種（ａｎｔｉ－ｓｐｅｃｉｅｓ）抗体が、少なくとも１つの酵素に直接的又は間接的にコンジュゲートされている、抗特異的二次抗体と接触させること；（ｃ）前記生物学的検体を、（ｉ）クリックケミストリー反応に関与することができる一対の反応性官能基の第１のメンバー、及び（ｉｉ）チラミド部分、キノンメチド部分、又はチラミド部分若しくはキノンメチド部分の誘導体若しくは類似体を含む第１の組織反応性コンジュゲートと接触させること；並びに、（ｄ）前記生物学的検体を、（ｉ）前記第１の検出可能部分、及び（ｉｉ）前記一対の反応性官能基の第２のメンバーを含む検出可能なコンジュゲートと接触させること、を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記第１のバイオマーカーがタンパク質バイオマーカーである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記第１のバイオマーカーが、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、Ｋｉ－６７、ＣＤ３、ＣＤ８、Ｋｉ６７、ＣＤ５、ＣＤ２０、パンサイトケラチン、ＨＥＲ２、ＥＲ、ＰＲ、ｐ１６、ｐ６３、ｐ４０、ＴＴＦ－１、ナプシンＡ、シナプトフィシン、及びＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡからなる群から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記第１のバイオマーカーが核酸バイオマーカーである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記第１の検出可能部分が、クマリンコア、ヘプタメチンシアニンコア及びクロコネートコアからなる群より選択される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 第２の検出可能部分で第２のバイオマーカーを標識することをさらに含み、前記第２の検出可能部分が、約７０ｎｍ未満のＦＷＨＭ及び約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超のいずれかの最大吸光度（λｍａｘ）を有し、前記第１の検出可能部分と前記第２の検出可能部分とが異なる、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記第２の検出可能部分が、紫外スペクトル内又は赤外スペクトル内にある、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記第２の検出可能部分が、紫外スペクトル内にある、請求項１５に記載の方法。
  18. 前記第１の検出可能部分と前記第２の検出可能部分とが、少なくとも２０ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する、請求項１５に記載の方法。
  19. 前記第１の検出可能部分と前記第２の検出可能部分とが、少なくとも３０ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する、請求項１５に記載の方法。
  20. 前記１つ又は複数の従来の色素が、ヘマトキシリン、エオシン、酸性フクシン、アルシアンブルー８ＧＸ、アリザリンレッドＳ、オーラミンＯ、アゾカルミンＢ、アゾカルミンＧ、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、塩基性フクシン、ビスマルックブラウンＹ、ブリリアントクレシルブルー、ブリリアントグリーン、カルミン、クロラゾールブラックＥ、コンゴーレッド、クレシルバイオレット、クリスタルバイオレット、ダローレッド、エチルグリーン、ファストグリーンＦＣＦ、フルオレセインイソチオシアネート、ギムザ染色、インジゴカルミン、ヤヌスグリーンＢ、ジェンナー染色１８９９、ライトグリーンＳＦ、マラカイトグリーン、マーチウスイエロー、メチルオレンジ、メチルバイオレット２Ｂ、メチレンブルー、メチレンブルー、メチレンバイオレット（ベルンツェン）、ニュートラルレッド、ニグロシン、ナイルブルーＡ、ヌクレアファストレッド、オイルレッドＯ、オレンジＧ、オレンジＩＩ、オルセイン、パラロサニリン、フロキシンＢ、プロタルゴールＳ、ピロニンＢ、ピロニンＹ、レザズリン、ローズベンガル、サフラニンＯ、ズダンブラックＢ、ズダンＩＩＩ、ズダンＩＶ、テトラクロム染色（ＭａｃＮｅａｌ）、チオニン、トルイジンブルー、ワイゲルト１８７８、ライト染色、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  21. 基材上に配置された生物学的検体内の１つ又は複数の標的を検出する方法であって、
    （ａ）第１のバイオマーカーマーカーを、クマリンコア、ヘプタメチンシアニンコア及びクロコネートコアからなる群より選択される第１の検出可能部分で標識すること；及び
    （ｂ）約４００ｎｍ～約７００ｎｍの１つ又は複数のピーク吸光度波長を有する少なくとも１つの従来の色素で前記基材上に配置された前記生物学的検体を染色することであって、前記第１の検出可能部分のピーク吸光度波長と前記１つ又は複数の従来の色素の前記１つ又は複数のピーク吸光度波長とが少なくとも２０ｎｍ離れている、前記生物学的検体を染色すること
    を含む、方法。
  22. 前記第１の検出可能部分が、紫外スペクトル内にある、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記第１の検出可能部分が、赤外スペクトル内にある、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記第１の検出可能部分が、約４３０ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有する、請求項２１に記載の方法。
  25. 前記第１の検出可能部分が、約４００ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有する、請求項２１に記載の方法。
  26. 前記第１の検出可能部分が、約６７０ｎｍ超のピーク吸光度波長を有する、請求項２１に記載の方法。
  27. 前記第１の検出可能部分が、約７００ｎｍ超のピーク吸光度波長を有する、請求項２１に記載の方法。
  28. 前記第１の検出可能部分が、約４３０ｎｍ未満であるが約４００ｎｍ超のピーク吸光度波長を有し、前記１つ又は複数の従来の色素の前記１つ又は複数のピーク吸光度波長が、約４３０ｎｍ超である、請求項２１に記載の方法。
  29. 前記第１の検出可能部分が、約６７０ｎｍ超であるが約４００ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有し、前記１つ又は複数の従来の色素の前記１つ又は複数のピーク吸光度波長が、約６７０ｎｍ未満である、請求項２１に記載の方法。
  30. 第２の検出可能部分で第２のバイオマーカーを標識することをさらに含み、前記第２の検出可能部分が、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭ及び約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超のいずれかの最大吸光度（λｍａｘ）を有し、前記第１の検出可能部分と前記第２の検出可能部分とが異なる、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記第２の検出可能部分が、赤外スペクトル内にある、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記第２の検出可能部分が、紫外スペクトル内にある、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記第１の検出可能部分と前記第２の検出可能部分とが、少なくとも２０ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する、請求項３０に記載の方法。
  34. 前記第１の検出可能部分と前記第２の検出可能部分とが、少なくとも３０ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する、請求項３０に記載の方法。
  35. 前記１つ又は複数の従来の色素が、ヘマトキシリン、エオシン、酸性フクシン、アルシアンブルー８ＧＸ、アリザリンレッドＳ、オーラミンＯ、アゾカルミンＢ、アゾカルミンＧ、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、塩基性フクシン、ビスマルックブラウンＹ、ブリリアントクレシルブルー、ブリリアントグリーン、カルミン、クロラゾールブラックＥ、コンゴーレッド、クレシルバイオレット、クリスタルバイオレット、ダローレッド、エチルグリーン、ファストグリーンＦＣＦ、フルオレセインイソチオシアネート、ギムザ染色、インジゴカルミン、ヤヌスグリーンＢ、ジェンナー染色１８９９、ライトグリーンＳＦ、マラカイトグリーン、マーチウスイエロー、メチルオレンジ、メチルバイオレット２Ｂ、メチレンブルー、メチレンブルー、メチレンバイオレット（ベルンツェン）、ニュートラルレッド、ニグロシン、ナイルブルーＡ、ヌクレアファストレッド、オイルレッドＯ、オレンジＧ、オレンジＩＩ、オルセイン、パラロサニリン、フロキシンＢ、プロタルゴールＳ、ピロニンＢ、ピロニンＹ、レザズリン、ローズベンガル、サフラニンＯ、ズダンブラックＢ、ズダンＩＩＩ、ズダンＩＶ、テトラクロム染色（ＭａｃＮｅａｌ）、チオニン、トルイジンブルー、ワイゲルト１８７８、ライト染色、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
  36. 前記第１の検出可能部分が、
    Figure 2024507677000047
    Figure 2024507677000048
    Figure 2024507677000049
    Figure 2024507677000050
    Figure 2024507677000051
    Figure 2024507677000052
    Figure 2024507677000053
    Figure 2024507677000054
    Figure 2024507677000055
    Figure 2024507677000056
    Figure 2024507677000057
     （式中、記号
    Figure 2024507677000058
     は、前記検出可能部分が、検出可能なコンジュゲートの別の部分にコンジュゲートされている部位を指す）
    からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
  37. 第１の検出可能部分で標識された第１のバイオマーカーを含む基材上に配置された染色された生物学的検体であって、前記第１の検出可能部分が、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭ及び約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超の最大吸光度（λｍａｘ）を有し、前記染色された生物学的検体が、少なくとも１つの従来の色素で染色されており、前記少なくとも１つの従来の色素が、可視スペクトル内に１つ又は複数のピーク吸光度波長を有する、染色された生物学的検体。
  38. 前記第１の検出可能部分の前記ＦＷＨＭが約１５０ｎｍ未満である、請求項３７に記載の染色された生物学的検体。
  39. 前記第１の検出可能部分の前記ＦＷＨＭが約１００ｎｍ未満である、請求項３７に記載の染色された生物学的検体。
  40. 前記第１の検出可能部分の前記ＦＷＨＭが約７０ｎｍ未満である、請求項３７に記載の染色された生物学的検体。
  41. 前記少なくとも１つの従来の色素がヘマトキシリンを含む、請求項３７に記載の染色された生物学的検体。
  42. 前記少なくとも１つの従来の色素がエオシンを含む、請求項３７に記載の染色された生物学的検体。
  43. 前記少なくとも１つの従来の色素がヘマトキシリン及びエオシンを含む、請求項３７に記載の染色された生物学的検体。
  44. 前記少なくとも１つの従来の色素が、酸性フクシン、アルシアンブルー８ＧＸ、アリザリンレッドＳ、オーラミンＯ、アゾカルミンＢ、アゾカルミンＧ、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、塩基性フクシン、ビスマルックブラウンＹ、ブリリアントクレシルブルー、ブリリアントグリーン、カルミン、クロラゾールブラックＥ、コンゴーレッド、クレシルバイオレット、クリスタルバイオレット、ダローレッド、エチルグリーン、ファストグリーンＦＣＦ、フルオレセインイソチオシアネート、ギムザ染色、インジゴカルミン、ヤヌスグリーンＢ、ジェンナー染色１８９９、ライトグリーンＳＦ、マラカイトグリーン、マーチウスイエロー、メチルオレンジ、メチルバイオレット２Ｂ、メチレンブルー、メチレンブルー、メチレンバイオレット（ベルンツェン）、ニュートラルレッド、ニグロシン、ナイルブルーＡ、ヌクレアファストレッド、オイルレッドＯ、オレンジＧ、オレンジＩＩ、オルセイン、パラロサニリン、フロキシンＢ、プロタルゴールＳ、ピロニンＢ、ピロニンＹ、レザズリン、ローズベンガル、サフラニンＯ、ズダンブラックＢ、ズダンＩＩＩ、ズダンＩＶ、テトラクロム染色（ＭａｃＮｅａｌ）、チオニン、トルイジンブルー、ワイゲルト１８７８、ライト染色及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  45. 前記染色された生物学的検体が、第２の検出可能部分で標識された第２のバイオマーカーをさらに含み、前記第２の検出可能部分が、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭ及び約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超のいずれかの最大吸光度（λｍａｘ）を有し、前記第１の検出可能部分と前記第２の検出可能部分とが異なる、請求項１～４４のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  46. 前記第２の検出可能部分が、赤外スペクトル内にある、請求項４５に記載の染色された生物学的検体。
  47. 前記第２の検出可能部分が、紫外スペクトル内にある、請求項４５に記載の染色された生物学的検体。
  48. 前記第１の検出可能部分と前記第２の検出可能部分とが、少なくとも２０ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する、請求項４５に記載の染色された生物学的検体。
  49. 前記第１の検出可能部分と前記第２の検出可能部分とが、少なくとも３０ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する、請求項４５に記載の染色された生物学的検体。
  50. 前記１つ又は複数の従来の色素が、ヘマトキシリン、エオシン、酸性フクシン、アルシアンブルー８ＧＸ、アリザリンレッドＳ、オーラミンＯ、アゾカルミンＢ、アゾカルミンＧ、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、塩基性フクシン、ビスマルックブラウンＹ、ブリリアントクレシルブルー、ブリリアントグリーン、カルミン、クロラゾールブラックＥ、コンゴーレッド、クレシルバイオレット、クリスタルバイオレット、ダローレッド、エチルグリーン、ファストグリーンＦＣＦ、フルオレセインイソチオシアネート、ギムザ染色、インジゴカルミン、ヤヌスグリーンＢ、ジェンナー染色１８９９、ライトグリーンＳＦ、マラカイトグリーン、マーチウスイエロー、メチルオレンジ、メチルバイオレット２Ｂ、メチレンブルー、メチレンブルー、メチレンバイオレット（ベルンツェン）、ニュートラルレッド、ニグロシン、ナイルブルーＡ、ヌクレアファストレッド、オイルレッドＯ、オレンジＧ、オレンジＩＩ、オルセイン、パラロサニリン、フロキシンＢ、プロタルゴールＳ、ピロニンＢ、ピロニンＹ、レザズリン、ローズベンガル、サフラニンＯ、ズダンブラックＢ、ズダンＩＩＩ、ズダンＩＶ、テトラクロム染色（ＭａｃＮｅａｌ）、チオニン、トルイジンブルー、ワイゲルト１８７８、ライト染色、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４５に記載の染色された生物学的検体。
  51. 前記染色された生物学的検体が、第３の検出可能部分で標識された第３のバイオマーカーをさらに含み、前記第３の検出可能部分が、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭ及び約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超のいずれかの最大吸光度（λｍａｘ）を有し、前記第１の検出可能部分と、前記第２の検出可能部分と、前記第３の検出可能部分とが異なる、請求項４５に記載の染色された生物学的検体。
  52. 前記第３の検出可能部分が、赤外スペクトル内にある、請求項５１に記載の染色された生物学的検体。
  53. 前記第３の検出可能部分が、紫外スペクトル内にある、請求項５１に記載の染色された生物学的検体。
  54. 前記第１の検出可能部分と、前記第２の検出可能部分と、前記第３の検出可能部分とが、少なくとも２０ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する、請求項５１に記載の染色された生物学的検体。
  55. 前記第１の検出可能部分と、前記第２の検出可能部分と、前記第３の検出可能部分とが、少なくとも３０ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する、請求項５１に記載の染色された生物学的検体。
  56. 第１の検出可能部分で標識された第１のバイオマーカーを含む基材上に配置された染色された生物学的検体であって、前記第１の検出可能部分が、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭ及び約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超の最大吸光度（λｍａｘ）を有し、前記染色された生物学的検体が少なくともヘマトキシリンで染色されている、染色された生物学的検体。
  57. エオシンでさらに染色されている、請求項５６に記載の染色された生物学的検体。
  58. ヘマトキシリン及びエオシン以外の第３の従来の色素でさらに染色されている、請求項５７に記載の染色された生物学的検体。
  59. 前記第１の検出可能部分の前記ＦＷＨＭが約１５０ｎｍ未満である、請求項５６に記載の染色された生物学的検体。
  60. 前記第１の検出可能部分の前記ＦＷＨＭが約１００ｎｍ未満である、請求項５６に記載の染色された生物学的検体。
  61. 前記第１の検出可能部分の前記ＦＷＨＭが約７０ｎｍ未満である、請求項５６に記載の染色された生物学的検体。
  62. 前記少なくとも１つの従来の色素がヘマトキシリンを含む、請求項５６～６１のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  63. 前記少なくとも１つの従来の色素が、ヘマトキシリン、エオシン、酸性フクシン、アルシアンブルー８ＧＸ、アリザリンレッドＳ、オーラミンＯ、アゾカルミンＢ、アゾカルミンＧ、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、塩基性フクシン、ビスマルックブラウンＹ、ブリリアントクレシルブルー、ブリリアントグリーン、カルミン、クロラゾールブラックＥ、コンゴーレッド、クレシルバイオレット、クリスタルバイオレット、ダローレッド、エチルグリーン、ファストグリーンＦＣＦ、フルオレセインイソチオシアネート、ギムザ染色、インジゴカルミン、ヤヌスグリーンＢ、ジェンナー染色１８９９、ライトグリーンＳＦ、マラカイトグリーン、マーチウスイエロー、メチルオレンジ、メチルバイオレット２Ｂ、メチレンブルー、メチレンブルー、メチレンバイオレット（ベルンツェン）、ニュートラルレッド、ニグロシン、ナイルブルーＡ、ヌクレアファストレッド、オイルレッドＯ、オレンジＧ、オレンジＩＩ、オルセイン、パラロサニリン、フロキシンＢ、プロタルゴールＳ、ピロニンＢ、ピロニンＹ、レザズリン、ローズベンガル、サフラニンＯ、ズダンブラックＢ、ズダンＩＩＩ、ズダンＩＶ、テトラクロム染色（ＭａｃＮｅａｌ）、チオニン、トルイジンブルー、ワイゲルト１８７８、ライト染色及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５６～６１のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  64. 前記染色された生物学的検体が、第２の検出可能部分で標識された第２のバイオマーカーをさらに含み、前記第２の検出可能部分が、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭ及び約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超のいずれかの最大吸光度（λｍａｘ）を有し、前記第１の検出可能部分と前記第２の検出可能部分とが異なる、請求項５６～６３のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  65. 前記第２の検出可能部分が、赤外スペクトル内にある、請求項６４に記載の染色された生物学的検体。
  66. 前記第２の検出可能部分が、紫外スペクトル内にある、請求項６４に記載の染色された生物学的検体。
  67. 前記第１の検出可能部分と前記第２の検出可能部分とが、少なくとも２０ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する、請求項６４に記載の染色された生物学的検体。
  68. 前記第１の検出可能部分と前記第２の検出可能部分とが、少なくとも３０ｎｍ離れている最大吸光度（λｍａｘ）を有する、請求項６４に記載の染色された生物学的検体。
  69. 第１の検出可能部分で標識された第１のバイオマーカーを含む基材上に配置された染色された生物学的検体であって、前記第１の検出可能部分が、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭ及び約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超の最大吸光度（λｍａｘ）を有し、前記染色された生物学的検体が、可視スペクトル内で検出可能な１つ又は複数の成分を含む少なくとも１つの特殊染色で染色されている、染色された生物学的検体。
  70. 前記特殊染色が、ファンギーソン染色を含む、請求項６９に記載の染色された生物学的検体。
  71. 前記特殊染色が、トルジンブルーを含む、請求項６９に記載の染色された生物学的検体。
  72. 前記特殊染色が、アルケインブルーを含む、請求項６９に記載の染色された生物学的検体。
  73. 前記特殊染色が、マッソントリクロームを含む、請求項６９に記載の染色された生物学的検体。
  74. 前記特殊染色が、アザントリクロームを含む、請求項６９に記載の染色された生物学的検体。
  75. 前記特殊染色が、抗酸を含む、請求項６９に記載の染色された生物学的検体。
  76. 前記第１の検出可能部分が、クマリンコア、ヘプタメチンシアニンコア及びクロコネートコアからなる群より選択される、請求項６９～７５のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  77. 前記第１の検出可能部分の前記ＦＷＨＭが約１５０ｎｍ未満である、請求項６９～７５のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  78. 前記第１の検出可能部分の前記ＦＷＨＭが約１００ｎｍ未満である、請求項６９～７５のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  79. 前記第１の検出可能部分の前記ＦＷＨＭが約７０ｎｍ未満である、請求項６９～７５のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  80. 前記染色された生物学的検体が、第２の検出可能部分で標識された第２のバイオマーカーをさらに含み、前記第２の検出可能部分が、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭ及び約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超のいずれかの最大吸光度（λｍａｘ）を有し、前記第１の検出可能部分と前記第２の検出可能部分とが異なる、請求項６９～７９のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  81. 前記第２の検出可能部分が、赤外スペクトル内にある、請求項８０に記載の染色された生物学的検体。
  82. 前記第２の検出可能部分が、紫外スペクトル内にある、請求項８０に記載の染色された生物学的検体。
  83. 前記第１の検出可能部分が、クマリンコア、ヘプタメチンシアニンコア及びクロコネートコアからなる群より選択される、請求項８０に記載の染色された生物学的検体。
  84. 第１の検出可能部分で標識された第１のバイオマーカーを含む基材上に配置された染色された生物学的検体であって、前記第１の検出可能部分が、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭ及び約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超の最大吸光度（λｍａｘ）を有し、前記染色された生物学的検体が、少なくとも１つの従来の色素で染色されており、前記少なくとも１つの従来の色素が、可視スペクトル内に１つ又は複数のピーク吸光度波長を有し、前記生物学的検体が、
    （ｉ）前記生物学的検体を、前記第１のバイオマーカーに特異的な第１の一次抗体と接触させること；
    （ｉｉ）前記生物学的検体を、前記第１の一次抗体に特異的な第１の二次抗体と接触させることであって、前記第１の二次抗体が酵素にコンジュゲートされている、前記第１の一次抗体に特異的な第１の二次抗体と接触させること；及び
    （ｉｉｉ）前記生物学的検体を、（ａ）チラミド部分、キノンメチド部分、又はチラミド部分若しくはキノンメチド部分の誘導体若しくは類似体；及び（ｂ）前記第１の検出可能部分を含む第１の検出可能なコンジュゲートと接触させること
    によって調製される、染色された生物学的検体。
  85. 前記第１の検出可能部分の前記ＦＷＨＭが約１５０ｎｍ未満である、請求項８４に記載の染色された生物学的検体。
  86. 前記第１の検出可能部分の前記ＦＷＨＭが約１００ｎｍ未満である、請求項８４に記載の染色された生物学的検体。
  87. 前記第１の検出可能部分の前記ＦＷＨＭが約７０ｎｍ未満である、請求項８４に記載の染色された生物学的検体。
  88. 前記１つ又は複数の従来の色素がヘマトキシリンを含む、請求項８４～８７のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  89. 前記１つ又は複数の従来の色素がエオシンを含む、請求項８４～８７のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  90. 前記１つ又は複数の従来の色素がヘマトキシリン及びエオシンを含む、請求項８４～８７のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  91. 前記１つ又は複数の従来の色素が、酸性フクシン、アルシアンブルー８ＧＸ、アリザリンレッドＳ、オーラミンＯ、アゾカルミンＢ、アゾカルミンＧ、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、塩基性フクシン、ビスマルックブラウンＹ、ブリリアントクレシルブルー、ブリリアントグリーン、カルミン、クロラゾールブラックＥ、コンゴーレッド、クレシルバイオレット、クリスタルバイオレット、ダローレッド、エチルグリーン、ファストグリーンＦＣＦ、フルオレセインイソチオシアネート、ギムザ染色、インジゴカルミン、ヤヌスグリーンＢ、ジェンナー染色１８９９、ライトグリーンＳＦ、マラカイトグリーン、マーチウスイエロー、メチルオレンジ、メチルバイオレット２Ｂ、メチレンブルー、メチレンブルー、メチレンバイオレット（ベルンツェン）、ニュートラルレッド、ニグロシン、ナイルブルーＡ、ヌクレアファストレッド、オイルレッドＯ、オレンジＧ、オレンジＩＩ、オルセイン、パラロサニリン、フロキシンＢ、プロタルゴールＳ、ピロニンＢ、ピロニンＹ、レザズリン、ローズベンガル、サフラニンＯ、ズダンブラックＢ、ズダンＩＩＩ、ズダンＩＶ、テトラクロム染色（ＭａｃＮｅａｌ）、チオニン、トルイジンブルー、ワイゲルト１８７８、ライト染色及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８４～８７のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  92. 前記第１の検出可能部分が、紫外スペクトル内にある、請求項８４～９１のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  93. 前記第１の検出可能部分が、赤外スペクトル内にある、請求項８４～９１のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  94. 前記第１の検出可能部分が、約４３０ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有する、請求項８４～９１のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  95. 前記第１の検出可能部分が、約４００ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有する、請求項８４～９１のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  96. 前記第１の検出可能部分が、約６７０ｎｍ超のピーク吸光度波長を有する、請求項８４～９１のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  97. 前記第１の検出可能部分が、約７００ｎｍ超のピーク吸光度波長を有する、請求項８４～９１のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  98. 前記第１の検出可能部分が、約４３０ｎｍ未満であるが約４００ｎｍ超のピーク吸光度波長を有し、前記１つ又は複数の従来の色素の前記１つ又は複数のピーク吸光度波長が、約４３０ｎｍ超である、請求項８４～９１のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  99. 前記染色された生物学的検体が、第２の検出可能部分で標識された第２のバイオマーカーをさらに含み、前記第２の検出可能部分が、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭ及び約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超の最大吸光度（λｍａｘ）を有する、請求項８４～９８のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  100. 前記染色された生物学的検体が、前記生物学的検体を、前記第２のバイオマーカーに特異的な第２の一次抗体と接触させること；前記生物学的検体を、前記第２の一次抗体に特異的な第２の二次抗体と接触させることであって、前記第２の二次抗体が酵素にコンジュゲートされている、前記第２の一次抗体に特異的な第２の二次抗体と接触させること；並びに、前記生物学的検体を、（ａ）チラミド部分、キノンメチド部分、又はチラミド部分若しくはキノンメチド部分の誘導体若しくは類似体；及び（ｂ）前記第２の検出可能部分を含む第２の検出可能なコンジュゲートと接触させること、によってさらに調製される、請求項９９に記載の染色された生物学的検体。
  101. 第１の検出可能部分で標識された第１のバイオマーカーを含む基材上に配置された染色された生物学的検体であって、前記第１の検出可能部分が、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭ及び約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超の最大吸光度（λｍａｘ）を有し、前記染色された生物学的検体が、少なくとも１つの従来の色素で染色されており、前記少なくとも１つの従来の色素が、可視スペクトル内に１つ又は複数のピーク吸光度波長を有し、前記生物学的検体が、
    （ｉ）前記生物学的検体を、前記第１のバイオマーカーに特異的な第１の一次抗体と接触させること；
    （ｉｉ）前記生物学的検体を、前記第２の一次抗体に特異的な第１の二次抗体と接触させることであって、前記第１の二次抗体が酵素にコンジュゲートされている、前記第２の一次抗体に特異的な第１の二次抗体と接触させること；
    （ｉｉｉ）前記生物学的検体を、（ａ）チラミド部分、キノンメチド部分、又はチラミド部分若しくはキノンメチド部分の誘導体若しくは類似体；及び（ｂ）クリックケミストリー反応に関与することができる第１の反応性官能基を含む第１の組織反応性部分と接触させること；
    （ｉｖ）前記生物学的検体を、（ａ）前記第２の検出可能部分；及び（ｂ）第２の反応性官能基を含む第１の検出可能なコンジュゲートと接触させること
    によって調製される、染色された生物学的検体。
  102. 前記第１の検出可能部分の前記ＦＷＨＭが約１５０ｎｍ未満である、請求項１０１に記載の染色された生物学的検体。
  103. 前記第１の検出可能部分の前記ＦＷＨＭが約１００ｎｍ未満である、請求項１０１に記載の染色された生物学的検体。
  104. 前記第１の検出可能部分の前記ＦＷＨＭが約７０ｎｍ未満である、請求項１０１に記載の染色された生物学的検体。
  105. 前記１つ又は複数の従来の色素がヘマトキシリンを含む、請求項１０１～１０４のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  106. 前記１つ又は複数の従来の色素がエオシンを含む、請求項１０１～１０４のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  107. 前記１つ又は複数の従来の色素がヘマトキシリン及びエオシンを含む、請求項１０１～１０４のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  108. 前記１つ又は複数の従来の色素が、酸性フクシン、アルシアンブルー８ＧＸ、アリザリンレッドＳ、オーラミンＯ、アゾカルミンＢ、アゾカルミンＧ、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、塩基性フクシン、ビスマルックブラウンＹ、ブリリアントクレシルブルー、ブリリアントグリーン、カルミン、クロラゾールブラックＥ、コンゴーレッド、クレシルバイオレット、クリスタルバイオレット、ダローレッド、エチルグリーン、ファストグリーンＦＣＦ、フルオレセインイソチオシアネート、ギムザ染色、インジゴカルミン、ヤヌスグリーンＢ、ジェンナー染色１８９９、ライトグリーンＳＦ、マラカイトグリーン、マーチウスイエロー、メチルオレンジ、メチルバイオレット２Ｂ、メチレンブルー、メチレンブルー、メチレンバイオレット（ベルンツェン）、ニュートラルレッド、ニグロシン、ナイルブルーＡ、ヌクレアファストレッド、オイルレッドＯ、オレンジＧ、オレンジＩＩ、オルセイン、パラロサニリン、フロキシンＢ、プロタルゴールＳ、ピロニンＢ、ピロニンＹ、レザズリン、ローズベンガル、サフラニンＯ、ズダンブラックＢ、ズダンＩＩＩ、ズダンＩＶ、テトラクロム染色（ＭａｃＮｅａｌ）、チオニン、トルイジンブルー、ワイゲルト１８７８、ライト染色及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０１～１０４のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  109. 前記第１の検出可能部分が、紫外スペクトル内にある、請求項１０１～１０８のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  110. 前記第１の検出可能部分が、赤外スペクトル内にある、請求項１０１～１０８のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  111. 前記第１の検出可能部分が、約４３０ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有する、請求項１０１～１１０のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  112. 前記第１の検出可能部分が、約４００ｎｍ未満のピーク吸光度波長を有する、請求項１０１～１１０のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  113. 前記第１の検出可能部分が、約６７０ｎｍ超のピーク吸光度波長を有する、請求項１０１～１１０のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  114. 前記第１の検出可能部分が、約７００ｎｍ超のピーク吸光度波長を有する、請求項１０１～１１０のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  115. 前記第１の検出可能部分が、約４３０ｎｍ未満であるが約４００ｎｍ超のピーク吸光度波長を有し、前記１つ又は複数の従来の色素の前記１つ又は複数のピーク吸光度波長が、約４３０ｎｍ超である、請求項１０１～１１０のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  116. 前記染色された生物学的検体が、第２の検出可能部分で標識された第２のバイオマーカーをさらに含み、前記第２の検出可能部分が、約２００ｎｍ未満のＦＷＨＭ及び約４３０ｎｍ未満又は約６７０ｎｍ超の最大吸光度（λｍａｘ）を有する、請求項１０１～１１５のいずれか一項に記載の染色された生物学的検体。
  117. 前記染色された生物学的検体が、前記生物学的検体を、前記第１のバイオマーカーに特異的な第２の一次抗体と接触させること；前記生物学的検体を、前記第２の一次抗体に特異的な第２の二次抗体と接触させることであって、前記第２の二次抗体が酵素にコンジュゲートされている、前記第２の一次抗体に特異的な第２の二次抗体と接触させること；前記生物学的検体を、（ａ）チラミド部分、キノンメチド部分、又はチラミド部分若しくはキノンメチド部分の誘導体若しくは類似体；及び（ｂ）クリックケミストリー反応に関与することができる第１の反応性官能基を含む第２の組織反応性部分と接触させること；前記生物学的検体を、（ａ）前記第２の検出可能部分；及び（ｂ）第２の反応性官能基を含む第２の検出可能なコンジュゲートと接触させること、によってさらに調製される、請求項１１６に記載の染色された生物学的検体。
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