JP2002296274A - 子宮頸部塗抹標本における腫瘍細胞およびそれらの前駆体の検出方法 - Google Patents
子宮頸部塗抹標本における腫瘍細胞およびそれらの前駆体の検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 子宮頸部塗抹標本における腫瘍細胞およびそ
れらの前駆体の正確な検出方法の提供。 【解決手段】 細胞において、遺伝子発現における疾病
関連変化を示している少なくとも２種の異なる分子マー
カーを、抗体もしくは核酸プローブを使用して同時に染
色および検出することによって、子宮頸部塗抹標本にお
けるがんおよびその前がん段階の改良された診断を得る
方法。
れらの前駆体の正確な検出方法の提供。 【解決手段】 細胞において、遺伝子発現における疾病
関連変化を示している少なくとも２種の異なる分子マー
カーを、抗体もしくは核酸プローブを使用して同時に染
色および検出することによって、子宮頸部塗抹標本にお
けるがんおよびその前がん段階の改良された診断を得る
方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生体由来の標本か
らのがん疾患の検出方法に関する。
らのがん疾患の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】がん疾患は、今なお、もっとも頻度の高
い世界的な死亡原因の１つである。早期の治療介入によ
って腫瘍の発達を防ぐために、がんおよび前がん段階の
早期認識および特異的検出に対する臨床上の要望が存在
する。この理由で、種々のがん腫（特に頸部、乳房およ
び腸）に対する予防プログラムが、既に１９５０年代以
降提出されていて、これらのプログラムによって多くの
国において死亡率の低減をもたらした。
い世界的な死亡原因の１つである。早期の治療介入によ
って腫瘍の発達を防ぐために、がんおよび前がん段階の
早期認識および特異的検出に対する臨床上の要望が存在
する。この理由で、種々のがん腫（特に頸部、乳房およ
び腸）に対する予防プログラムが、既に１９５０年代以
降提出されていて、これらのプログラムによって多くの
国において死亡率の低減をもたらした。
【０００３】女性における子宮がんの場合、薬物チェッ
クは、本質的に、頸部から採取される細胞塗抹標本の形
態学的／細胞学的検査、すなわちＰＡＰ試験と呼ばれる
検査に基づいている。しかしながら、この試験は限られ
た感度しかもたない（４０％までの誤った陰性診断、Ｄ
ｕｇｇａｎ ｅｔ ａｌ．；１９９８，Ｅｕｒ ＪＧｙ
ｎａｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ；１９：２０９−２１４；Ｂ
ｉｓｈｏｐ ｅｔａｌ．，１９９６，Ｂｕｓｓ Ｐａｎ
Ａｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎ，３０，３７８−８
６）。さらにまた、塗抹標本の１０％までは、ＡＳＣＵ
Ｓ（決定不能の有意性をもつ異常な鱗細胞）として分類
される、すなわち、正常、中等もしくは重度の病巣また
は腫瘍への明確な類別を行うことが不可能である。しか
しながら、経験では、１０％までのこのＡＳＣＵＳ集団
が真の病巣からなり、これが結果的にまた見逃されるこ
とも示している（Ｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９
９，ＪＡＭＡ ２８１，１６０５−１６１０）。異常細
胞が発見されれば、さらなる診断操作、例えば膣鏡また
は生検採取が実施され、これらの操作の結果を用いて、
より正確な診断に達し、そして治療上の決定、例えば罹
病領域の外科的除去もしくはレーザー療法を採用するこ
とが可能になる。
クは、本質的に、頸部から採取される細胞塗抹標本の形
態学的／細胞学的検査、すなわちＰＡＰ試験と呼ばれる
検査に基づいている。しかしながら、この試験は限られ
た感度しかもたない（４０％までの誤った陰性診断、Ｄ
ｕｇｇａｎ ｅｔ ａｌ．；１９９８，Ｅｕｒ ＪＧｙ
ｎａｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ；１９：２０９−２１４；Ｂ
ｉｓｈｏｐ ｅｔａｌ．，１９９６，Ｂｕｓｓ Ｐａｎ
Ａｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎ，３０，３７８−８
６）。さらにまた、塗抹標本の１０％までは、ＡＳＣＵ
Ｓ（決定不能の有意性をもつ異常な鱗細胞）として分類
される、すなわち、正常、中等もしくは重度の病巣また
は腫瘍への明確な類別を行うことが不可能である。しか
しながら、経験では、１０％までのこのＡＳＣＵＳ集団
が真の病巣からなり、これが結果的にまた見逃されるこ
とも示している（Ｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９
９，ＪＡＭＡ ２８１，１６０５−１６１０）。異常細
胞が発見されれば、さらなる診断操作、例えば膣鏡また
は生検採取が実施され、これらの操作の結果を用いて、
より正確な診断に達し、そして治療上の決定、例えば罹
病領域の外科的除去もしくはレーザー療法を採用するこ
とが可能になる。
【０００４】変異の結果として遺伝子の発現に変化を生
じ、そして結果的にがんの発生に役割を演じる多数の遺
伝子が近年同定されている。対応するタンパク質は、両
血清中および細胞レベルにおいて診断マーカーとして潜
在的に検出することができる。タンパク質は、細胞にお
ける生理学的調節過程、例えば成長制御（増殖遺伝子。
例えばＫｉ６７およびｍｃｍ−５；がん遺伝子および腫
瘍サプレッサー遺伝子、例えばｐ１６，ＥＧＦレセプタ
ー、ｈｅｒ２／ｎｅｕおよびｍｄｍ−２）、アポトーシ
ス（自然細胞死、例えばｐ５３およびｂｃｌ−２）、Ｄ
ＮＡ修復（ｍｓｈ−１）および細胞接着（Ｅ−カドヘリ
ン、β−カテニンおよびＡＰＣ）に関与している。マー
カーを検出する適当な方法の例は、これらのタンパク質
に対する特異抗体を使用する免疫組織化学的および免疫
細胞化学的検出方法である（ｖａｎ Ｎｏｏｒｄｅｎ，
１９８６，Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｂｄ Ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｒｉｇｈ
ｔ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，２６−５３）。
じ、そして結果的にがんの発生に役割を演じる多数の遺
伝子が近年同定されている。対応するタンパク質は、両
血清中および細胞レベルにおいて診断マーカーとして潜
在的に検出することができる。タンパク質は、細胞にお
ける生理学的調節過程、例えば成長制御（増殖遺伝子。
例えばＫｉ６７およびｍｃｍ−５；がん遺伝子および腫
瘍サプレッサー遺伝子、例えばｐ１６，ＥＧＦレセプタ
ー、ｈｅｒ２／ｎｅｕおよびｍｄｍ−２）、アポトーシ
ス（自然細胞死、例えばｐ５３およびｂｃｌ−２）、Ｄ
ＮＡ修復（ｍｓｈ−１）および細胞接着（Ｅ−カドヘリ
ン、β−カテニンおよびＡＰＣ）に関与している。マー
カーを検出する適当な方法の例は、これらのタンパク質
に対する特異抗体を使用する免疫組織化学的および免疫
細胞化学的検出方法である（ｖａｎ Ｎｏｏｒｄｅｎ，
１９８６，Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｂｄ Ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｒｉｇｈ
ｔ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，２６−５３）。
【０００５】さらに、ある種のがんでは、ウイルスの出
現が、がんの発達に有意に関連している。ウイルスＤＮ
Ａはハイブリダイゼーション法によって検出され、そし
て例えば頸部塗抹標本におけるヒト・パピローマウイル
スの検出の場合では、診断マーカーとしても役立つ（検
出キットはいくつかの供給者、例えばＤｉｇｅｎｅ，Ｄ
ＡＫＯ，ＢｉｏＧｅｎｅｘ ａｎｄ ＥＮＺＯから得る
ことができる）。
現が、がんの発達に有意に関連している。ウイルスＤＮ
Ａはハイブリダイゼーション法によって検出され、そし
て例えば頸部塗抹標本におけるヒト・パピローマウイル
スの検出の場合では、診断マーカーとしても役立つ（検
出キットはいくつかの供給者、例えばＤｉｇｅｎｅ，Ｄ
ＡＫＯ，ＢｉｏＧｅｎｅｘ ａｎｄ ＥＮＺＯから得る
ことができる）。
【０００６】単一のマーカーは健全な細胞においても少
しは存在するので、それが病理学的に変性した細胞を認
識するために十分には特異的ではないことが多くの場合
に示されてきた。これは、マーカーが健全な細胞におい
ても同様に生理学的調節過程に関与しているタンパク質
であるという事実に基づいている。かくして、例えば、
ＨＰＶは事実上すべての頸部腫瘍において検出できるけ
れども、それはまた、多くの正常な頸部上皮においても
検出できる；すなわち、ＨＰＶを検出する試験は高度に
敏感であるけれども、それは低い特異性しかもたない
（例えば、Ｃｕｚｉｃｋ，２０００，ＪＡＭＡ，２８
３，１０８−１０９）．Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９
８，ＰＮＡＳ，９５，１４９３２−１４９３７）は、頸
部（ｎ＝５８）について試験された病巣／腫瘍２８例を
検出したが、また２８例の正常な塗抹標本のうち２例の
誤った陽性染色を与えたＤＮＡ複製マーカーｍｃｍ−５
を報告している。Ｓａｎｏら（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｉ
ｎｔｌ．，１９９８，４８，５８０−５８５）は、マー
カーｐ１６が、１５例の正常な頸部生検のうち３例を非
特異的に染色することを報告している。
しは存在するので、それが病理学的に変性した細胞を認
識するために十分には特異的ではないことが多くの場合
に示されてきた。これは、マーカーが健全な細胞におい
ても同様に生理学的調節過程に関与しているタンパク質
であるという事実に基づいている。かくして、例えば、
ＨＰＶは事実上すべての頸部腫瘍において検出できるけ
れども、それはまた、多くの正常な頸部上皮においても
検出できる；すなわち、ＨＰＶを検出する試験は高度に
敏感であるけれども、それは低い特異性しかもたない
（例えば、Ｃｕｚｉｃｋ，２０００，ＪＡＭＡ，２８
３，１０８−１０９）．Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９
８，ＰＮＡＳ，９５，１４９３２−１４９３７）は、頸
部（ｎ＝５８）について試験された病巣／腫瘍２８例を
検出したが、また２８例の正常な塗抹標本のうち２例の
誤った陽性染色を与えたＤＮＡ複製マーカーｍｃｍ−５
を報告している。Ｓａｎｏら（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｉ
ｎｔｌ．，１９９８，４８，５８０−５８５）は、マー
カーｐ１６が、１５例の正常な頸部生検のうち３例を非
特異的に染色することを報告している。
【０００７】細胞学／病理学において、生物サンプルに
おける数種のマーカーを検出することに関心がますます
高まっている。一方では、これは、より多くの情報を利
用可能にし；他方では、個々のマーカーにより得られた
非特異的染色は、それらが何であるか、より容易に認識
されるであろう。慣例的には、身体サンプルの得られた
生検標本の連続切片または複数標本（例えば固定剤中の
頸部塗抹標本）が、この目的のために調製され、各々
が、特定のマーカーに関して染色される。この方法はい
くつかの欠点：それが、大量の、通常は限定される患者
のサンプル材料および染色試薬を消費すること、それが
多くの時間を要し、そして高価であること、そしてまた
細胞において２種以上のマーカーを明瞭に同時に場所を
示すことが不可能であるという欠点を有する。生物サン
プルにおける２種以上の異なる生物学的マーカーの同時
検出は、文献（ＤＡＫＯ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉ
ｄｅｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｏｕ
ｂｌｅ ＳｔａｉｎｉｎｇＭｅｔｈｏｄｓ；Ｇｏｍｅｚ
ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．，
１９９７．４１，２５５−２５９）には既に記述されて
いるけれども、このアプローチは、日常的診断において
はまだ使用されなかった。Ｔｅｒｈａｖａｕｔａら（Ｃ
ｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９４，５，２８２−２
９３）は、頸部病巣から採取された生検標本におけるｐ
５３およびＫｉ６７の２重染色を使用し、そしてＨＰＶ
陽性およびＨＰＶ陰性の病巣由来の基底および副基底細
胞において、ある場合は１つの細胞において両マーカー
を検出できた。上記２重染色は頸部生検において実施さ
れ、そして頸部塗抹標本には移行できなかった。同様
に、ほとんどいずれの基底および副基底細胞も含有しな
い塗抹標本の細胞組成は、生検標本のそれとは異なって
いる。本発明者らの発見によれば、上記マーカー組み合
わせを頸部塗抹標本に応用する場合、いずれか診断的に
利用できる結果を得ることは不可能である。その上、本
発明者らは、２重染色から得られた情報を使用して、そ
の結果を組み合わせることによって、このサンプルにお
ける腫瘍細胞の存在に関する、より正確な結論に達する
ことはなかった。
おける数種のマーカーを検出することに関心がますます
高まっている。一方では、これは、より多くの情報を利
用可能にし；他方では、個々のマーカーにより得られた
非特異的染色は、それらが何であるか、より容易に認識
されるであろう。慣例的には、身体サンプルの得られた
生検標本の連続切片または複数標本（例えば固定剤中の
頸部塗抹標本）が、この目的のために調製され、各々
が、特定のマーカーに関して染色される。この方法はい
くつかの欠点：それが、大量の、通常は限定される患者
のサンプル材料および染色試薬を消費すること、それが
多くの時間を要し、そして高価であること、そしてまた
細胞において２種以上のマーカーを明瞭に同時に場所を
示すことが不可能であるという欠点を有する。生物サン
プルにおける２種以上の異なる生物学的マーカーの同時
検出は、文献（ＤＡＫＯ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉ
ｄｅｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｏｕ
ｂｌｅ ＳｔａｉｎｉｎｇＭｅｔｈｏｄｓ；Ｇｏｍｅｚ
ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．，
１９９７．４１，２５５−２５９）には既に記述されて
いるけれども、このアプローチは、日常的診断において
はまだ使用されなかった。Ｔｅｒｈａｖａｕｔａら（Ｃ
ｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９４，５，２８２−２
９３）は、頸部病巣から採取された生検標本におけるｐ
５３およびＫｉ６７の２重染色を使用し、そしてＨＰＶ
陽性およびＨＰＶ陰性の病巣由来の基底および副基底細
胞において、ある場合は１つの細胞において両マーカー
を検出できた。上記２重染色は頸部生検において実施さ
れ、そして頸部塗抹標本には移行できなかった。同様
に、ほとんどいずれの基底および副基底細胞も含有しな
い塗抹標本の細胞組成は、生検標本のそれとは異なって
いる。本発明者らの発見によれば、上記マーカー組み合
わせを頸部塗抹標本に応用する場合、いずれか診断的に
利用できる結果を得ることは不可能である。その上、本
発明者らは、２重染色から得られた情報を使用して、そ
の結果を組み合わせることによって、このサンプルにお
ける腫瘍細胞の存在に関する、より正確な結論に達する
ことはなかった。
【０００８】Ｒａｏら（１９９８，Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐ
ｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ
Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．７，１０２７−１０３３）は、
乳房組織から得られた針穿刺材料（ＦＮＡ，ｆｉｎｅ
ｎｅｅｄｌｅ ａｓｐｉｒａｔｅｓ）における種々の腫
瘍関連マーカー（ＤＮＡ含量、Ｇアクチンおよびｐ５
３）の多重染色を記述している。彼らは、彼らの結果
を、数種のマーカーを使用することが個々のマーカーの
観察をするよりも高い臨床的特異性をもたらし、結果的
に、乳がんの早期認識において重要な役割を演じること
ができるという効果に対して説明している。著者らによ
って引用された多重染色は、乳房組織から得られた針穿
刺材料に限定される。腫瘍領域の検出を自動化すること
に関して染色情報を使用する試みはない。これに加え
て、記述されている染色方法は、物質の異なる性質のた
めに他の生物材料（すなわち生検および頸部塗抹）に応
用することができない。
ｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ
Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．７，１０２７−１０３３）は、
乳房組織から得られた針穿刺材料（ＦＮＡ，ｆｉｎｅ
ｎｅｅｄｌｅ ａｓｐｉｒａｔｅｓ）における種々の腫
瘍関連マーカー（ＤＮＡ含量、Ｇアクチンおよびｐ５
３）の多重染色を記述している。彼らは、彼らの結果
を、数種のマーカーを使用することが個々のマーカーの
観察をするよりも高い臨床的特異性をもたらし、結果的
に、乳がんの早期認識において重要な役割を演じること
ができるという効果に対して説明している。著者らによ
って引用された多重染色は、乳房組織から得られた針穿
刺材料に限定される。腫瘍領域の検出を自動化すること
に関して染色情報を使用する試みはない。これに加え
て、記述されている染色方法は、物質の異なる性質のた
めに他の生物材料（すなわち生検および頸部塗抹）に応
用することができない。
【０００９】自動化：近年の臨床的腫瘍診断におけるさ
らなる改良は、サンプルの調製および染色の自動化なら
びに診断確定を含む自動画像解析の両方からなる。時間
および人員における節減に加えて、これはまた、より客
観的で、結果的により一様な診断をもたらす。蛍光また
は発色染料を用いる腫瘍細胞およびそれらの前駆体にお
ける生物学的マーカーの染色は、シグナルの定量および
結果的に自動化された読み取りを可能にする。画像解析
による自動診断はないけれども、染色操作の自動的実施
を可能にする装置は既に存在している（ＬｅＮｅｅｌ
ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔ
ａ，２７８，１８５−１９２）。もっとも進歩した装置
は、形態学的画像情報を使用する頸部塗抹標本における
腫瘍細胞とそれらの前駆体の自動検出である（Ｓａｗａ
ｙａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏ
ｂｓｔｅｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ，
４２，９２２−９２８；Ｓｔｏｌｅｒ，２０００ Ｍｏ
ｄ，Ｐａｔｈｏｌ．，１３，２７５−２８４）。
らなる改良は、サンプルの調製および染色の自動化なら
びに診断確定を含む自動画像解析の両方からなる。時間
および人員における節減に加えて、これはまた、より客
観的で、結果的により一様な診断をもたらす。蛍光また
は発色染料を用いる腫瘍細胞およびそれらの前駆体にお
ける生物学的マーカーの染色は、シグナルの定量および
結果的に自動化された読み取りを可能にする。画像解析
による自動診断はないけれども、染色操作の自動的実施
を可能にする装置は既に存在している（ＬｅＮｅｅｌ
ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔ
ａ，２７８，１８５−１９２）。もっとも進歩した装置
は、形態学的画像情報を使用する頸部塗抹標本における
腫瘍細胞とそれらの前駆体の自動検出である（Ｓａｗａ
ｙａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏ
ｂｓｔｅｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ，
４２，９２２−９２８；Ｓｔｏｌｅｒ，２０００ Ｍｏ
ｄ，Ｐａｔｈｏｌ．，１３，２７５−２８４）。
【００１０】ＰＡＰＮＥＴシステムを用いる頸部塗抹標
本における異常細胞の自動形態学的検出に加えて、Ｂｏ
ｏｎら（１９９５，Ｄｉａｇｎ．Ｃｙｔｏｐａｔｈｏ
ｌ．，１３，４２３−４２８）は、また、Ｋｉ６７によ
る増殖細胞の免疫組織学的染色を使用する。しかしなが
ら、この１種の分子マーカーの使用は、良性の増殖細胞
とがん原性細胞を明瞭に区別することを可能にはさせな
い。
本における異常細胞の自動形態学的検出に加えて、Ｂｏ
ｏｎら（１９９５，Ｄｉａｇｎ．Ｃｙｔｏｐａｔｈｏ
ｌ．，１３，４２３−４２８）は、また、Ｋｉ６７によ
る増殖細胞の免疫組織学的染色を使用する。しかしなが
ら、この１種の分子マーカーの使用は、良性の増殖細胞
とがん原性細胞を明瞭に区別することを可能にはさせな
い。
【００１１】Ｂｏｏｎらによる特許（米国特許第５５４
４６５０号）は、免疫化学的マーカーによる染色がサン
プル中の増殖（がん原性および非がん原性）細胞の自動
検出を容易にすること、そして半自動方法において、次
に、モニターしている病理学者／細胞学者が、染色され
た細胞が実際にがん原性細胞であるか否かを決定するこ
とを報告している。
４６５０号）は、免疫化学的マーカーによる染色がサン
プル中の増殖（がん原性および非がん原性）細胞の自動
検出を容易にすること、そして半自動方法において、次
に、モニターしている病理学者／細胞学者が、染色され
た細胞が実際にがん原性細胞であるか否かを決定するこ
とを報告している。
【００１２】ＭｃＧｌｙｎｎおよびＡｋｋａｐｅｄｄｉ
による米国特許第６００５２５６号は、身体サンプルに
おける数種の蛍光標識マーカーを同時検出するためと、
また、がん診断における何か特定の応用をもたらすか、
または特異性を増強する適当なマーカーの組み合わせを
特定することはないが、がん細胞を同定するための応用
および方法を詳細に記述している。
による米国特許第６００５２５６号は、身体サンプルに
おける数種の蛍光標識マーカーを同時検出するためと、
また、がん診断における何か特定の応用をもたらすか、
または特異性を増強する適当なマーカーの組み合わせを
特定することはないが、がん細胞を同定するための応用
および方法を詳細に記述している。
【００１３】Ａｍｐｅｒｓａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ Ｇｒｏｕｐ（ｗｗｗ．ａｍｐｅｒｓａｎ
ｄｍｅｄｉｃａｌ．ｃｏｍ）が、会社の社内サンプル調
製に加えて、不特定の生物学的マーカーの蛍光検出もま
た含む、頸部塗抹標本のための新しいスクリーニングシ
ステム（ＩｎＰａｔｈ）を開発しつつあることは知られ
ている。
ｙｓｔｅｍｓ Ｇｒｏｕｐ（ｗｗｗ．ａｍｐｅｒｓａｎ
ｄｍｅｄｉｃａｌ．ｃｏｍ）が、会社の社内サンプル調
製に加えて、不特定の生物学的マーカーの蛍光検出もま
た含む、頸部塗抹標本のための新しいスクリーニングシ
ステム（ＩｎＰａｔｈ）を開発しつつあることは知られ
ている。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、早期段階に
おいて、そして従来より確実に、調製された頸部塗抹標
本におけるがん腫細胞またはそれらの前駆体を診断する
ために使用できる方法の提供を目的とする。
おいて、そして従来より確実に、調製された頸部塗抹標
本におけるがん腫細胞またはそれらの前駆体を診断する
ために使用できる方法の提供を目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明は、少なくとも２
種の分子マーカー、すなわち遺伝子発現またはウイルス
核酸における疾病関連変化の同時検出が、子宮頸部塗抹
標本における、病理学的に変性した細胞、例えばがん腫
細胞およびそれらの前駆体の検出の特異性を増強し、そ
して組み合わされたマーカー染色の情報価値のために、
より特異的である検出を可能にし、そしてこれに加え
て、自動化することが同様にできるという本出願者らの
発見に基づく。
種の分子マーカー、すなわち遺伝子発現またはウイルス
核酸における疾病関連変化の同時検出が、子宮頸部塗抹
標本における、病理学的に変性した細胞、例えばがん腫
細胞およびそれらの前駆体の検出の特異性を増強し、そ
して組み合わされたマーカー染色の情報価値のために、
より特異的である検出を可能にし、そしてこれに加え
て、自動化することが同様にできるという本出願者らの
発見に基づく。
【００１６】本発明は、分子マーカーが、病理学的に変
性されていない生物材料において、類似または異なる量
においてまた部分的に存在するので、個々に検出される
場合には、病理学的に変性した細胞もしくは組織を認識
することに関して十分な特異性を達成しない分子マーカ
ーに関する。これは、これらのマーカーが、健全な細胞
において同様に生理学的調節過程に関与しているタンパ
ク質であるという事実に基づく。これに加えて、非特異
的に交差反応する抗体のために、分子マーカーの検出
は、明瞭にはできず、そして分子マーカーを含有しない
生物材料の粒子の染色においても表される。本発明者ら
は、異常な細胞もしくは組織切片を検出する場合、細胞
における少なくとも２種のマーカーを同時に検出するこ
とによって、単一のマーカーの検出に伴われる不十分な
特異性が相殺されて、より高い特異性を確定できること
を観察した。その結果、生物サンプルの診断において、
単一マーカーの使用によるよりも一層大きい情報価値
が、細胞における数種のマーカーを組み合わせることに
よって達成される。
性されていない生物材料において、類似または異なる量
においてまた部分的に存在するので、個々に検出される
場合には、病理学的に変性した細胞もしくは組織を認識
することに関して十分な特異性を達成しない分子マーカ
ーに関する。これは、これらのマーカーが、健全な細胞
において同様に生理学的調節過程に関与しているタンパ
ク質であるという事実に基づく。これに加えて、非特異
的に交差反応する抗体のために、分子マーカーの検出
は、明瞭にはできず、そして分子マーカーを含有しない
生物材料の粒子の染色においても表される。本発明者ら
は、異常な細胞もしくは組織切片を検出する場合、細胞
における少なくとも２種のマーカーを同時に検出するこ
とによって、単一のマーカーの検出に伴われる不十分な
特異性が相殺されて、より高い特異性を確定できること
を観察した。その結果、生物サンプルの診断において、
単一マーカーの使用によるよりも一層大きい情報価値
が、細胞における数種のマーカーを組み合わせることに
よって達成される。
【００１７】マーカー組み合わせは、次の遺伝子類：が
ん遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子、アポトーシス遺伝
子、増殖遺伝子、修復遺伝子およびウイルス遺伝子の少
なくとも１種に属する遺伝子の発現の可視化、あるいは
ウイルス核酸の可視化と組み合わせて、列挙された遺伝
子類の少なくとも１種からの遺伝子の変化された発現の
可視化を必要とする。好適な組み合わせは、次の分子マ
ーカー：ｈｅｒ２／ｎｅｕ，ｐ１６，ｐ５３，ＭＮ，ｍ
ｄｍ−２，ｂｃｌ−２およびＥＧＦレセプターならびに
ＨＰＶサブタイプ６，１１，１６，１８，３０，３１，
３３，３５，４５，５１および５２からのＤＮＡを含
む。次の組み合わせ物が特に好適である：ｐ１６とｈｅ
ｒ２／ｎｅｕまたはｐ１６とＥＧＦ−Ｒまたはｈｅｒ２
／ｎｅｕとｐ５３またはｍｄｍ−２とｈｅｒ２／ｎｅｕ
またはｐ１６とｂｃｌ−２またはｈｅｒ２／ｎｅｕとｂ
ｃｌ−２またはｐ５３とｐ１６。
ん遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子、アポトーシス遺伝
子、増殖遺伝子、修復遺伝子およびウイルス遺伝子の少
なくとも１種に属する遺伝子の発現の可視化、あるいは
ウイルス核酸の可視化と組み合わせて、列挙された遺伝
子類の少なくとも１種からの遺伝子の変化された発現の
可視化を必要とする。好適な組み合わせは、次の分子マ
ーカー：ｈｅｒ２／ｎｅｕ，ｐ１６，ｐ５３，ＭＮ，ｍ
ｄｍ−２，ｂｃｌ−２およびＥＧＦレセプターならびに
ＨＰＶサブタイプ６，１１，１６，１８，３０，３１，
３３，３５，４５，５１および５２からのＤＮＡを含
む。次の組み合わせ物が特に好適である：ｐ１６とｈｅ
ｒ２／ｎｅｕまたはｐ１６とＥＧＦ−Ｒまたはｈｅｒ２
／ｎｅｕとｐ５３またはｍｄｍ−２とｈｅｒ２／ｎｅｕ
またはｐ１６とｂｃｌ−２またはｈｅｒ２／ｎｅｕとｂ
ｃｌ−２またはｐ５３とｐ１６。
【００１８】本発明によれば、本出願者らの発見は、が
ん腫およびそれらの前駆体を検出するための自動装置を
使用する目的で、前記分子マーカーの組み合わせを検出
することを含む、疾病関連細胞もしくは組織切片の早期
診断の方法のために使用される。腫瘍細胞の自動化され
た特異的検出は、次の方法：第１には、少なくとも２種
のシグナルが細胞中に存在しなければならず、そして第
２には、２種のマーカーの各々のシグナルが、各場合、
個々に定められた強度または個々に定められた閾値より
も大きくなければならない方法によって確立することが
できる。これらの２つの基準を用いることによって、例
えば、設定閾値を超えるマーカーを発現するか、または
健全であるような、それぞれ一定のシグナル強度以下で
ある２種のマーカーについての染色を示す細胞を注視す
ることが可能である。
ん腫およびそれらの前駆体を検出するための自動装置を
使用する目的で、前記分子マーカーの組み合わせを検出
することを含む、疾病関連細胞もしくは組織切片の早期
診断の方法のために使用される。腫瘍細胞の自動化され
た特異的検出は、次の方法：第１には、少なくとも２種
のシグナルが細胞中に存在しなければならず、そして第
２には、２種のマーカーの各々のシグナルが、各場合、
個々に定められた強度または個々に定められた閾値より
も大きくなければならない方法によって確立することが
できる。これらの２つの基準を用いることによって、例
えば、設定閾値を超えるマーカーを発現するか、または
健全であるような、それぞれ一定のシグナル強度以下で
ある２種のマーカーについての染色を示す細胞を注視す
ることが可能である。
【００１９】表現「分子マーカー」は、細胞における分
子変化、特に遺伝子発現における変化を含み、これら
は、変性されているか、または病的である細胞構成と関
連して観察された。分子マーカーを検出する方法は、い
ずれか核酸レベルまたはタンパク質レベルにおいて、マ
ーカーの量または存在を決定するいかなる方法も含む。
タンパク質レベルにおける検出では、後に、発色および
／または蛍光検出を用いて細胞化学的または組織化学的
同定を可能にする抗体または他の特異的結合タンパク質
（例えば、抗クリン（ａｎｔｉ−ｃｕｌｌｉｎ））を使
用することが可能である。核酸レベルにおける検出で
は、さらなる同様の増幅段階（例えば、標的配列への結
合後、標識プローブの免疫細胞化学的増幅）後のある時
点で、細胞化学的または組織化学的染色反応を用いて同
様に同定できるハイブリダイゼーション技術を使用する
ことが可能である。
子変化、特に遺伝子発現における変化を含み、これら
は、変性されているか、または病的である細胞構成と関
連して観察された。分子マーカーを検出する方法は、い
ずれか核酸レベルまたはタンパク質レベルにおいて、マ
ーカーの量または存在を決定するいかなる方法も含む。
タンパク質レベルにおける検出では、後に、発色および
／または蛍光検出を用いて細胞化学的または組織化学的
同定を可能にする抗体または他の特異的結合タンパク質
（例えば、抗クリン（ａｎｔｉ−ｃｕｌｌｉｎ））を使
用することが可能である。核酸レベルにおける検出で
は、さらなる同様の増幅段階（例えば、標的配列への結
合後、標識プローブの免疫細胞化学的増幅）後のある時
点で、細胞化学的または組織化学的染色反応を用いて同
様に同定できるハイブリダイゼーション技術を使用する
ことが可能である。
【００２０】表現「少なくとも２種の分子マーカーの同
時検出」は、身体サンプル、特に同様の身体サンプルの
単一標本、好ましくは遺伝子発現が互いに関連して観察
できる単一細胞において少なくとも２種の遺伝子の発現
を可視化する方法を含む。
時検出」は、身体サンプル、特に同様の身体サンプルの
単一標本、好ましくは遺伝子発現が互いに関連して観察
できる単一細胞において少なくとも２種の遺伝子の発現
を可視化する方法を含む。
【００２１】表現「組み合わされたマーカー染色の情報
価値」は、身体サンプル、好ましくは単一細胞における
少なくとも２種のマーカーの検出に基づいて得られた少
なくとも２つの情報量の組み合わせを含む。されに、健
全細胞は、マーカー強度に関する閾値を定めることによ
って罹病細胞から特異的に区別できる。
価値」は、身体サンプル、好ましくは単一細胞における
少なくとも２種のマーカーの検出に基づいて得られた少
なくとも２つの情報量の組み合わせを含む。されに、健
全細胞は、マーカー強度に関する閾値を定めることによ
って罹病細胞から特異的に区別できる。
【００２２】表現「病理学的に変性された頸部塗抹細
胞」は、女性の子宮膣管から得られ、そして日常の婦人
科サンプリングによって、顕微鏡スライドに適用される
か、または流動蛍光光度計（ＦＡＣＳ）において測定さ
れるがん腫およびそれらの前駆体を含む。
胞」は、女性の子宮膣管から得られ、そして日常の婦人
科サンプリングによって、顕微鏡スライドに適用される
か、または流動蛍光光度計（ＦＡＣＳ）において測定さ
れるがん腫およびそれらの前駆体を含む。
【００２３】表現「自動検出」は、完全に、または構成
段階においてのみ、人の手作業を置換し、そして特に、
検出操作の段階において、または続く文書もしくは情報
処理に関連して使用される方法を含む。これは、サンプ
ル調製、サンプル染色、サンプル読み取りおよび情報処
理の段階を含む。
段階においてのみ、人の手作業を置換し、そして特に、
検出操作の段階において、または続く文書もしくは情報
処理に関連して使用される方法を含む。これは、サンプ
ル調製、サンプル染色、サンプル読み取りおよび情報処
理の段階を含む。
【００２４】検出は、吸光測定、反射測定もしくは蛍光
測定の手段によって実施できる。
測定の手段によって実施できる。
【００２５】表現「診断専門システム」は、画像情報を
提案される診断に変換するコンピューターソフトウエア
を含む。この専門システムは、すべての利用しうる情報
またはその一部を、ソフトウエア中に存在するパラメー
ターか、またはソフトウエアがアクセスできる外部情報
に基づいて、提案される診断に合体することができる。
さらなるパラメーターが、提案される診断を実証するた
めに必要であれば、ソフトウエアは、これらのパラメー
ターの収集を提起できるか、あるいはレフレックス（ｒ
ｅｆｌｅｘ）アルゴリズムの意味における適当な解析装
置と結合させることによってそれを自動的に要求でき
る。
提案される診断に変換するコンピューターソフトウエア
を含む。この専門システムは、すべての利用しうる情報
またはその一部を、ソフトウエア中に存在するパラメー
ターか、またはソフトウエアがアクセスできる外部情報
に基づいて、提案される診断に合体することができる。
さらなるパラメーターが、提案される診断を実証するた
めに必要であれば、ソフトウエアは、これらのパラメー
ターの収集を提起できるか、あるいはレフレックス（ｒ
ｅｆｌｅｘ）アルゴリズムの意味における適当な解析装
置と結合させることによってそれを自動的に要求でき
る。
【００２６】表現「増幅システム」は、シグナル強度を
増強して分子マーカーを特異的に検出するために、より
好ましいシグナル／ノイズ比率を生み出す生化学的方法
を含む。これは、正常には、さらなる抗体および／また
は酵素的検出反応を用いることによって達成される。
増強して分子マーカーを特異的に検出するために、より
好ましいシグナル／ノイズ比率を生み出す生化学的方法
を含む。これは、正常には、さらなる抗体および／また
は酵素的検出反応を用いることによって達成される。
【００２７】本発明を使用して、頸部における病理学的
に変性した細胞、例えばがん腫およびそれらの前駆体を
特異的に検出することが可能である。また、本発明は、
本発明による方法を実施するためのキットであって、次
の成分： （ａ）少なくとも２種の分子マーカーを検出するための
試薬、すなわちｈｅｒ２／ｎｅｕ，ｐ１６，ｐ５３，Ｍ
Ｎ，ｍｄｍ−２，ｂｃｌ−２、ＥＧＦレセプターおよび
ＨＰＶ Ｌ１に対する標識および／または非標識抗体、
ならびにまたＨＰＶウイルスゲノムの領域を含有してい
る標識ＤＮＡプローブ、（ｂ）慣用の補助物質、例えば
バッファー、担体（ｓｕｐｐｏｒｔｓ）、シグナル増幅
物質、染色試薬など、（ｃ）サンプル調製および染色の
ため、そしてシグナル検出のための自動化された方法、
（ｄ）対照反応として細胞系を染色するための方法およ
び試薬、を含有するキットに関する。
に変性した細胞、例えばがん腫およびそれらの前駆体を
特異的に検出することが可能である。また、本発明は、
本発明による方法を実施するためのキットであって、次
の成分： （ａ）少なくとも２種の分子マーカーを検出するための
試薬、すなわちｈｅｒ２／ｎｅｕ，ｐ１６，ｐ５３，Ｍ
Ｎ，ｍｄｍ−２，ｂｃｌ−２、ＥＧＦレセプターおよび
ＨＰＶ Ｌ１に対する標識および／または非標識抗体、
ならびにまたＨＰＶウイルスゲノムの領域を含有してい
る標識ＤＮＡプローブ、（ｂ）慣用の補助物質、例えば
バッファー、担体（ｓｕｐｐｏｒｔｓ）、シグナル増幅
物質、染色試薬など、（ｃ）サンプル調製および染色の
ため、そしてシグナル検出のための自動化された方法、
（ｄ）対照反応として細胞系を染色するための方法およ
び試薬、を含有するキットに関する。
【００２８】上記説明は、キットの個々の成分に適合す
る。また、キットの個々の成分、または数種の成分は改
変形態で使用されてもよい。
る。また、キットの個々の成分、または数種の成分は改
変形態で使用されてもよい。
【００２９】本発明を使用して、頸部塗抹標本において
がん腫およびそれらの前駆体を、いずれか手動または部
分的もしくは完全に自動化された方法を用いて検出する
ことが可能である。少なくとも２種の分子マーカーの同
時検出から、本発明により達成される結果は、いかなる
主観的検査も受けず、反対に、生物材料における病理学
的変化の客観的な自動検出を促進するので、形態学的発
見、例えばＰＡＰ試験において作成される発見は、例え
ば同様に反射試験の形式での客観的パラメーターによっ
て補足することができる。方法は急速に実施することが
でき、そしてこの実施は自動化できるので、それらは、
費用および人員に関して経済的である大規模なスクリー
ニング方法に適している。
がん腫およびそれらの前駆体を、いずれか手動または部
分的もしくは完全に自動化された方法を用いて検出する
ことが可能である。少なくとも２種の分子マーカーの同
時検出から、本発明により達成される結果は、いかなる
主観的検査も受けず、反対に、生物材料における病理学
的変化の客観的な自動検出を促進するので、形態学的発
見、例えばＰＡＰ試験において作成される発見は、例え
ば同様に反射試験の形式での客観的パラメーターによっ
て補足することができる。方法は急速に実施することが
でき、そしてこの実施は自動化できるので、それらは、
費用および人員に関して経済的である大規模なスクリー
ニング方法に適している。
【００３０】その結果、本発明は、塗抹標本の診断にお
いて頸部がんの早期認識に関連して腫瘍細胞およびそれ
らの前駆体の特異的検出に対して重要な貢献を示す。
いて頸部がんの早期認識に関連して腫瘍細胞およびそれ
らの前駆体の特異的検出に対して重要な貢献を示す。
【００３１】
【実施例】上記本発明を実施するための方法は実施例に
よって以下に示される。これらの実施例において、正確
な反応条件が、例えば反応性抗体もしくはＤＮＡプロー
ブについて指定されるので、種々のパラメーター、例え
ばインキュベーション温度および洗浄温度、インキュベ
ーション時間および洗浄時間、ならびに抗体および他の
試薬の濃度は、それぞれの抗体もしくはＤＮＡプローブ
に応じて変えることができる。同様にして、本明細書に
記述されている増幅システムは、省略または付加するこ
とができる。
よって以下に示される。これらの実施例において、正確
な反応条件が、例えば反応性抗体もしくはＤＮＡプロー
ブについて指定されるので、種々のパラメーター、例え
ばインキュベーション温度および洗浄温度、インキュベ
ーション時間および洗浄時間、ならびに抗体および他の
試薬の濃度は、それぞれの抗体もしくはＤＮＡプローブ
に応じて変えることができる。同様にして、本明細書に
記述されている増幅システムは、省略または付加するこ
とができる。
【００３２】特異的抗体を使用して頸部塗抹標本におけ
る２種の分子マーカーを同時に検出するための実験の記
述 Ｔｈｉｎ−Ｐｒｅｐ（Ｃｙｔｙｃ製）のような調製技術
が、Ｐｒｅｓｅｒｖｃｙｔ（Ｃｙｔｙｃ製）中に保存さ
れている細胞を顕微鏡スライド（ＭＳ）に適用するため
に使用される。細胞は冷エタノールにより３分間固定さ
れ、その後、顕微鏡スライドはＰＢＳ（１３７ｍＭＮａ
Ｃｌ，３ｍＭＫＣｌ，４ｍＭＮａ2ＨＰＯ4，２ｍＭＫＨ
2ＰＯ4）中で洗浄される。非特異的結合部位が、ＰＢＳ
バッファー中５％胎児ウシ血清により室温（ＲＴ）で３
０分間ブロックされた後、ＭＳが、２種の特異的モノク
ローナル抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ／Ｂ
ＡＹＥＲ製のｈｅｒ２／ｎｅｕ（クローン３Ｂ５，２０
μｇ／ｍｌ）およびｐ１６（クローンＤＣＳ５０．１，
１０μｇ／ｍｌ））とともに、湿潤チャンバーにおいて
６０分間同時にインキュベートされる。抗体の一方はフ
ルオレセインに共役されるが、他方はビオチンに共役さ
れる。各々次のインキュベーション段階後、ＭＳは、各
場合５分間ＰＢＳにより３回洗浄される。２種の異なる
染色システムが、個々の抗原・抗体結合を検出するため
に交互に１種づつ使用される。最初の染色システムで
は、ＭＳは、シグナルを増幅するために、ストレプトア
ビジン−Ｃｙ３（Ｍｏｂｉ Ｔｅｃ，５％ウシ血清を含
有するＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ）とともに３０分間、次い
で、その後、抗ストレプトアビジン−ビオチン（Ｖｅｃ
ｔｏｒ；５％ウシ血清を含有するＰＢＳ中２μｇ／ｍ
ｌ）とともにさらに３０分間インキュベートされる。最
後に、ＭＳは再びストレプトアビジン−Ｃｙ３とともに
１回インキュベートされる。第２の染色システムは、Ａ
ｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−４８８ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐ
ｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＫｉｔTM（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ，ｏｒｄｅｒ Ｎｏ．Ａ−１１０５３）
からなる。最後に、ＭＳは、ＭｏｗｉｏｌTM（Ｈｏｅｃ
ｈｓｔ）により被覆される。
る２種の分子マーカーを同時に検出するための実験の記
述 Ｔｈｉｎ−Ｐｒｅｐ（Ｃｙｔｙｃ製）のような調製技術
が、Ｐｒｅｓｅｒｖｃｙｔ（Ｃｙｔｙｃ製）中に保存さ
れている細胞を顕微鏡スライド（ＭＳ）に適用するため
に使用される。細胞は冷エタノールにより３分間固定さ
れ、その後、顕微鏡スライドはＰＢＳ（１３７ｍＭＮａ
Ｃｌ，３ｍＭＫＣｌ，４ｍＭＮａ2ＨＰＯ4，２ｍＭＫＨ
2ＰＯ4）中で洗浄される。非特異的結合部位が、ＰＢＳ
バッファー中５％胎児ウシ血清により室温（ＲＴ）で３
０分間ブロックされた後、ＭＳが、２種の特異的モノク
ローナル抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ／Ｂ
ＡＹＥＲ製のｈｅｒ２／ｎｅｕ（クローン３Ｂ５，２０
μｇ／ｍｌ）およびｐ１６（クローンＤＣＳ５０．１，
１０μｇ／ｍｌ））とともに、湿潤チャンバーにおいて
６０分間同時にインキュベートされる。抗体の一方はフ
ルオレセインに共役されるが、他方はビオチンに共役さ
れる。各々次のインキュベーション段階後、ＭＳは、各
場合５分間ＰＢＳにより３回洗浄される。２種の異なる
染色システムが、個々の抗原・抗体結合を検出するため
に交互に１種づつ使用される。最初の染色システムで
は、ＭＳは、シグナルを増幅するために、ストレプトア
ビジン−Ｃｙ３（Ｍｏｂｉ Ｔｅｃ，５％ウシ血清を含
有するＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ）とともに３０分間、次い
で、その後、抗ストレプトアビジン−ビオチン（Ｖｅｃ
ｔｏｒ；５％ウシ血清を含有するＰＢＳ中２μｇ／ｍ
ｌ）とともにさらに３０分間インキュベートされる。最
後に、ＭＳは再びストレプトアビジン−Ｃｙ３とともに
１回インキュベートされる。第２の染色システムは、Ａ
ｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−４８８ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐ
ｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＫｉｔTM（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ，ｏｒｄｅｒ Ｎｏ．Ａ−１１０５３）
からなる。最後に、ＭＳは、ＭｏｗｉｏｌTM（Ｈｏｅｃ
ｈｓｔ）により被覆される。
【００３３】特異的抗体を使用して頸部塗抹標本におけ
る３種の分子マーカーを同時に検出するための実験の記
述 Ｔｈｉｎ−Ｐｒｅｐ（Ｃｙｔｙｃ製）のような調製技術
が、例えばＰｒｅｓｅｒｖｃｙｔ（Ｃｙｔｙｃ製）中に
保存されている細胞を顕微鏡スライド（ＭＳ）に適用す
るために使用される。細胞は冷エタノールにより３分間
固定され、次いで、顕微鏡スライドはＰＢＳ（１３７ｍ
ＭＮａＣｌ，３ｍＭＫＣｌ，４ｍＭＮａ 2ＨＰＯ4，２ｍ
ＭＫＨ2ＰＯ4，ｐＨ７．４）中で洗浄される。非特異的
結合部位が、ＰＢＳバッファー中レバミソール（Ｓｉｇ
ｍａ製）４ｍｍｏｌ／ｌを含有する５％胎児ウシ血清に
より室温（ＲＴ）で３０分間ブロックされた後、ＭＳ
は、３種の特異的モノクローナル抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎ
ｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ／ＢＡＹＥＲ製のｈｅｒ２／ｎｅｕ
（クローン３Ｂ５，２０μｇ／ｍｌ）、ｂｃｌ−２（ク
ローン１００，２μｇ／ｍｌ）およびｐ１６（クローン
ＤＣＳ５０．１，１０μｇ／ｍｌ））とともに、湿潤チ
ャンバーにおいて室温で６０分間同時にインキュベート
される。第１の抗体はフルオレセインに共役されるが、
第２の抗体はジゴキシゲニンに、そして第３の抗体はビ
オチンに共役される。各々次のインキュベーション段階
後、ＭＳは、各場合５分間ＰＢＳにより３回洗浄され
る。３種の異なる染色システムが、個々の抗原・抗体結
合を検出するために交互に１種づつ使用される。第１の
染色システムでは、ＭＳは、シグナルを増幅するため
に、ストレプトアビジン−Ｃｙ３（Ｍｏｂｉ Ｔｅｃ，
レバミソール４ｍｍｏｌ／ｌを含有する５％ウシ血清を
含有するＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ）とともに３０分間、次
いで、その後、ビオチン化抗ストレプトアビジン抗体
（Ｖｅｃｔｏｒ；レバミソール４ｍｍｏｌ／ｌを含有す
る５％ウシ血清を含有するＰＢＳ中２μｇ／ｍｌ）とと
もにさらに３０分間インキュベートされる。最後に、Ｍ
Ｓは再びストレプトアビジン−Ｃｙ３とともに１回イン
キュベートされる。第２の染色システムは、Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ−４８８ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎＫｉｔTM（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂ
ｅｓ，ｏｒｄｅｒ Ｎｏ．Ａ−１１０５３）からなる。
第３の染色システムでは、ＭＳは、ヒツジ抗ジゴキシゲ
ニン抗体およびアルカリホスファターゼ（ＤＡＫＯ，レ
バミソール４ｍｍｏｌ／ｌを含有する５％ウシ血清を含
有するＰＢＳ中で１：１５０希釈される）からなる共役
体とともに３０分間インキュベートされる。蛍光の読み
取りは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ製ＥＬＦ９
７ Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋ
ｉｔ（ｏｒｄｅｒ Ｎｏ．Ｅ６６０２）を用いて製造者
の指示にしたがって実施される。最後に、ＭＳは、Ｍｏ
ｗｉｏｌTM（Ｈｏｅｃｈｓｔ）により被覆される。
る３種の分子マーカーを同時に検出するための実験の記
述 Ｔｈｉｎ−Ｐｒｅｐ（Ｃｙｔｙｃ製）のような調製技術
が、例えばＰｒｅｓｅｒｖｃｙｔ（Ｃｙｔｙｃ製）中に
保存されている細胞を顕微鏡スライド（ＭＳ）に適用す
るために使用される。細胞は冷エタノールにより３分間
固定され、次いで、顕微鏡スライドはＰＢＳ（１３７ｍ
ＭＮａＣｌ，３ｍＭＫＣｌ，４ｍＭＮａ 2ＨＰＯ4，２ｍ
ＭＫＨ2ＰＯ4，ｐＨ７．４）中で洗浄される。非特異的
結合部位が、ＰＢＳバッファー中レバミソール（Ｓｉｇ
ｍａ製）４ｍｍｏｌ／ｌを含有する５％胎児ウシ血清に
より室温（ＲＴ）で３０分間ブロックされた後、ＭＳ
は、３種の特異的モノクローナル抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎ
ｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ／ＢＡＹＥＲ製のｈｅｒ２／ｎｅｕ
（クローン３Ｂ５，２０μｇ／ｍｌ）、ｂｃｌ−２（ク
ローン１００，２μｇ／ｍｌ）およびｐ１６（クローン
ＤＣＳ５０．１，１０μｇ／ｍｌ））とともに、湿潤チ
ャンバーにおいて室温で６０分間同時にインキュベート
される。第１の抗体はフルオレセインに共役されるが、
第２の抗体はジゴキシゲニンに、そして第３の抗体はビ
オチンに共役される。各々次のインキュベーション段階
後、ＭＳは、各場合５分間ＰＢＳにより３回洗浄され
る。３種の異なる染色システムが、個々の抗原・抗体結
合を検出するために交互に１種づつ使用される。第１の
染色システムでは、ＭＳは、シグナルを増幅するため
に、ストレプトアビジン−Ｃｙ３（Ｍｏｂｉ Ｔｅｃ，
レバミソール４ｍｍｏｌ／ｌを含有する５％ウシ血清を
含有するＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ）とともに３０分間、次
いで、その後、ビオチン化抗ストレプトアビジン抗体
（Ｖｅｃｔｏｒ；レバミソール４ｍｍｏｌ／ｌを含有す
る５％ウシ血清を含有するＰＢＳ中２μｇ／ｍｌ）とと
もにさらに３０分間インキュベートされる。最後に、Ｍ
Ｓは再びストレプトアビジン−Ｃｙ３とともに１回イン
キュベートされる。第２の染色システムは、Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ−４８８ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎＫｉｔTM（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂ
ｅｓ，ｏｒｄｅｒ Ｎｏ．Ａ−１１０５３）からなる。
第３の染色システムでは、ＭＳは、ヒツジ抗ジゴキシゲ
ニン抗体およびアルカリホスファターゼ（ＤＡＫＯ，レ
バミソール４ｍｍｏｌ／ｌを含有する５％ウシ血清を含
有するＰＢＳ中で１：１５０希釈される）からなる共役
体とともに３０分間インキュベートされる。蛍光の読み
取りは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ製ＥＬＦ９
７ Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋ
ｉｔ（ｏｒｄｅｒ Ｎｏ．Ｅ６６０２）を用いて製造者
の指示にしたがって実施される。最後に、ＭＳは、Ｍｏ
ｗｉｏｌTM（Ｈｏｅｃｈｓｔ）により被覆される。
【００３４】特異的抗体およびＨＰＶ ＤＮＡプローブ
を使用して頸部塗抹標本における２種の分子マーカーを
同時に検出するための実験の記述 免疫細胞化学的抗体染色とインサイチューＤＮＡハイブ
リダイゼーションとを組み合わせる場合、サンプル調製
および固定、およびブロッキングおよび第１抗体とのイ
ンキュベーションは、抗体染色のための上記方法におけ
るように実施される。第１の抗体は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ／ＢＡＹＥＲ製のタンパク質ｐ１６
（クローンＤＣＳ５０．１）に対向するフルオレセイン
共役抗体であり、そして濃度１０μｇ／ｍｌにおいて使
用される。抗原・抗体結合を検出するために、ＭＳは、
まず第１に、第２の抗体、すなわち濃度１５μｇ／ｍｌ
におけるウサギ抗ＦＩＴＣ（ＭｏＢｉＴｅｃ）ととも
に、次いで、ＰＢＳ中１：１００希釈におけるＤｉａｎ
ｏｖａ製アルカリホスファターゼ共役ヤギ抗ウサギ抗体
とともに、室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートされ
る。染色システムでは、ＭＳは、ＤＡＫＯ製の発色性ア
ルカリホスファターゼ基質Ｆｕｃｈｓｉｎとともに、製
造者の指示にしたがって室温で５分間インキュベートさ
れる。染色の固定では、続いてＭＳは、５分間ＰＢＳ中
５％パラホルムアルデヒドにより固定される。次にイン
サイチュー染色が続く。このためには、まず第１に、２
ｘＳＳＣ（０．３ＭＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸Ｎａ）
中で２回洗浄され、次いで、３７℃で６０分間、２ｘＳ
ＳＣ中ＲＮアーゼ４０μｇ／ｍｌにより消化される。Ｐ
ＢＳによる２回の２分間洗浄段階後、消化が、プロテナ
ーゼＫ２μｇ／ｍｌにより３７℃で１０分間実施され
る。蒸留水による３ｘ２分間洗浄後、ハイブリダイゼー
ションバッファー（Ｋｒｅａｔｅｃｈ）中即使用可能の
ジゴキシゲニン標識のＨＰＶ１６ ＤＮＡプローブ（Ｋ
ｒｅａｔｅｃｈ）２０μｇがＭＳに添加され、これが次
にカバースリップで覆われ、密閉され、変性のために９
４℃で８分間加熱され、次いで３７℃で一夜インキュベ
ートされる。ハイブリダイゼーション溶液が除去された
後、ＭＳは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒブロッキングバッフ
ァー（ブロッキングバッファー（１５０ｍＭＮａＣｌ，
１００ｍＭｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）５ｍｌ中ブ
ロッカー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ １２０１１０７）
０．０５ｇ）中３％ウサギ血清を用いて再び１回３０分
間ブロックされる。発色の読み取りでは、ＭＳは、各場
合室温で１５分間、ＤＡＫＯペルオキシダーゼ共役ウサ
ギ抗ジゴキシゲニン抗体（ブロッキングバッファーによ
り１：１５０希釈）、ＰＢＳ／０．１Ｍイミダゾール，
ｐＨ７．６／０．００１％Ｈ2Ｏ2中Ｄｉｇ−Ｔｙｒａｍ
ｉｄｅ（５．７１μｇ／ｍｌ）（Ｈｏｐｍａｎ ｅｔ
ａｌ．，１９９８，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏ
ｃｈｅｍ．，４６（６）．７７１−７７７に記述される
ように調製）、そしてさらに１回ペルオキシダーゼ共役
ウサギ抗ジゴキシゲニン抗体（ＤＡＫＯ，３％ウサギ血
清を含有するＴＢＳＴ（５０ｍＭｔｒｉｓ／ＨＣｌ，
０．３ＭＮａＣｌ，１％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．６）
中で１：１５０希釈）とともに連続してインキュベート
される。間では、ＭＳは各場合ＰＢＳＴ３ｘ５分間洗浄
される。色原体の発色反応では、ＭＳは、ＤＡＢ基質と
ともに製造者の指示にしたがって１０分間染色される。
最後に、ＭＳは、ＭｏｗｉｏｌTMにおいて被覆される。
を使用して頸部塗抹標本における２種の分子マーカーを
同時に検出するための実験の記述 免疫細胞化学的抗体染色とインサイチューＤＮＡハイブ
リダイゼーションとを組み合わせる場合、サンプル調製
および固定、およびブロッキングおよび第１抗体とのイ
ンキュベーションは、抗体染色のための上記方法におけ
るように実施される。第１の抗体は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ／ＢＡＹＥＲ製のタンパク質ｐ１６
（クローンＤＣＳ５０．１）に対向するフルオレセイン
共役抗体であり、そして濃度１０μｇ／ｍｌにおいて使
用される。抗原・抗体結合を検出するために、ＭＳは、
まず第１に、第２の抗体、すなわち濃度１５μｇ／ｍｌ
におけるウサギ抗ＦＩＴＣ（ＭｏＢｉＴｅｃ）ととも
に、次いで、ＰＢＳ中１：１００希釈におけるＤｉａｎ
ｏｖａ製アルカリホスファターゼ共役ヤギ抗ウサギ抗体
とともに、室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートされ
る。染色システムでは、ＭＳは、ＤＡＫＯ製の発色性ア
ルカリホスファターゼ基質Ｆｕｃｈｓｉｎとともに、製
造者の指示にしたがって室温で５分間インキュベートさ
れる。染色の固定では、続いてＭＳは、５分間ＰＢＳ中
５％パラホルムアルデヒドにより固定される。次にイン
サイチュー染色が続く。このためには、まず第１に、２
ｘＳＳＣ（０．３ＭＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸Ｎａ）
中で２回洗浄され、次いで、３７℃で６０分間、２ｘＳ
ＳＣ中ＲＮアーゼ４０μｇ／ｍｌにより消化される。Ｐ
ＢＳによる２回の２分間洗浄段階後、消化が、プロテナ
ーゼＫ２μｇ／ｍｌにより３７℃で１０分間実施され
る。蒸留水による３ｘ２分間洗浄後、ハイブリダイゼー
ションバッファー（Ｋｒｅａｔｅｃｈ）中即使用可能の
ジゴキシゲニン標識のＨＰＶ１６ ＤＮＡプローブ（Ｋ
ｒｅａｔｅｃｈ）２０μｇがＭＳに添加され、これが次
にカバースリップで覆われ、密閉され、変性のために９
４℃で８分間加熱され、次いで３７℃で一夜インキュベ
ートされる。ハイブリダイゼーション溶液が除去された
後、ＭＳは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒブロッキングバッフ
ァー（ブロッキングバッファー（１５０ｍＭＮａＣｌ，
１００ｍＭｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）５ｍｌ中ブ
ロッカー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ １２０１１０７）
０．０５ｇ）中３％ウサギ血清を用いて再び１回３０分
間ブロックされる。発色の読み取りでは、ＭＳは、各場
合室温で１５分間、ＤＡＫＯペルオキシダーゼ共役ウサ
ギ抗ジゴキシゲニン抗体（ブロッキングバッファーによ
り１：１５０希釈）、ＰＢＳ／０．１Ｍイミダゾール，
ｐＨ７．６／０．００１％Ｈ2Ｏ2中Ｄｉｇ−Ｔｙｒａｍ
ｉｄｅ（５．７１μｇ／ｍｌ）（Ｈｏｐｍａｎ ｅｔ
ａｌ．，１９９８，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏ
ｃｈｅｍ．，４６（６）．７７１−７７７に記述される
ように調製）、そしてさらに１回ペルオキシダーゼ共役
ウサギ抗ジゴキシゲニン抗体（ＤＡＫＯ，３％ウサギ血
清を含有するＴＢＳＴ（５０ｍＭｔｒｉｓ／ＨＣｌ，
０．３ＭＮａＣｌ，１％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．６）
中で１：１５０希釈）とともに連続してインキュベート
される。間では、ＭＳは各場合ＰＢＳＴ３ｘ５分間洗浄
される。色原体の発色反応では、ＭＳは、ＤＡＢ基質と
ともに製造者の指示にしたがって１０分間染色される。
最後に、ＭＳは、ＭｏｗｉｏｌTMにおいて被覆される。
【００３５】少なくとも２種の分子マーカーの同時検出
によって染色された異常細胞を自動的に検出するための
実験の記述 少なくとも２種の分子マーカーが上記方法を用いて抗体
によって検出された頸部塗抹標本は、顕微鏡スライド８
枚までの可動クロスステージをもつ蛍光顕微鏡（Ｍｕｌ
ｔｉｃｏｎｔｒｏｌ−Ｂｏｘ ２０００−３およびａｎ
ａｌｙＳＩＳ「Ｍｏｄｕｌｅ ＳｔａｇｅTM」ドライブ
ソフトウエアをもつＯｌｙｍｐｕｓ ＡＸ７０）および
Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ
（ＳＩＳ）製のａｎａｌｙＳＩＳ ３．０ソフトウエア
の改訂版を使用して解釈されるが、これは、「Ｇｒａｂ
ｂｉｔ Ｄｕａｌ Ｐｒｏ」ＳＩＳパッケージとして、
付属モジュール、特にＦＦＴ（＝「Ｆａｓｔ Ｆｏｕｒ
ｉｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」）モジュー
ル、ＭＩＡ（＝「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｉｍａｇｅ Ａｌ
ｉｇｎｍｅｎｔ」）モジュールおよびＣモジュールを含
有する。高分解能黒白（ＭＶ２ Ｓｌｏｗ Ｓｃａｎ
Ｃａｍｅｒａ，１２ｂｉｔ，ＳＩＳ製）およびカラー
（ＤＸＣ−９５０Ｐ ３ＣＣＤ ｃｈｉｐ，Ｓｏｎｙ
製）カメラが画像記録のために使用される。組み合わせ
において、これらのシステムは、１６−ｂｉｔ Ｇｒａ
ｕｔｏｎ画像解析ならびに２４−ｂｉｔ画像深度までの
ＲＧＢおよびＨＳＩ色彩空間におけるカラー画像解析の
ために適当である。
によって染色された異常細胞を自動的に検出するための
実験の記述 少なくとも２種の分子マーカーが上記方法を用いて抗体
によって検出された頸部塗抹標本は、顕微鏡スライド８
枚までの可動クロスステージをもつ蛍光顕微鏡（Ｍｕｌ
ｔｉｃｏｎｔｒｏｌ−Ｂｏｘ ２０００−３およびａｎ
ａｌｙＳＩＳ「Ｍｏｄｕｌｅ ＳｔａｇｅTM」ドライブ
ソフトウエアをもつＯｌｙｍｐｕｓ ＡＸ７０）および
Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ
（ＳＩＳ）製のａｎａｌｙＳＩＳ ３．０ソフトウエア
の改訂版を使用して解釈されるが、これは、「Ｇｒａｂ
ｂｉｔ Ｄｕａｌ Ｐｒｏ」ＳＩＳパッケージとして、
付属モジュール、特にＦＦＴ（＝「Ｆａｓｔ Ｆｏｕｒ
ｉｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」）モジュー
ル、ＭＩＡ（＝「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｉｍａｇｅ Ａｌ
ｉｇｎｍｅｎｔ」）モジュールおよびＣモジュールを含
有する。高分解能黒白（ＭＶ２ Ｓｌｏｗ Ｓｃａｎ
Ｃａｍｅｒａ，１２ｂｉｔ，ＳＩＳ製）およびカラー
（ＤＸＣ−９５０Ｐ ３ＣＣＤ ｃｈｉｐ，Ｓｏｎｙ
製）カメラが画像記録のために使用される。組み合わせ
において、これらのシステムは、１６−ｂｉｔ Ｇｒａ
ｕｔｏｎ画像解析ならびに２４−ｂｉｔ画像深度までの
ＲＧＢおよびＨＳＩ色彩空間におけるカラー画像解析の
ために適当である。
【００３６】可動クロスステージ（ａｎａｌｙＳＩＳ
「Ｍｏｄｕｌｅ Ｓｔａｇｅ」）測定後、顕微鏡スライ
ド８枚までのすべての位置が、「オートメーション」メ
ニュー（ａｎａｌｙＳＩＳ「Ｍｏｄｕｌｅ Ｇｒａｉｎ
ｓ」）において８連続ステージパスを決定することによ
って、「論理的ゼロ点」に比較して記録される。自動Ｔ
ｈｉｎ−Ｐｒｅｐ（Ｃｙｔｙｃ）法が確定する生物サン
プルの全域は、常に顕微鏡スライドの一定領域内に置か
れ、サイズ５７１．２μｍｘ４５７．０６μｍをもち、
そして顕微鏡単位を用いて倍率２０倍の写真の画像分野
に対応する個々の領域に、総合方式で分解される。各生
物サンプルは、１ステージパスを通して解析される。各
ステージパスは、７５０の個別ステージパス位置（３０
行、２５列）からなり、定められた顕微鏡スライドの位
置の生物サンプルの各領域が、ステージパス位置によっ
て隣接しているが重複しない方式で検出されるように、
一連のステージパス位置として、ゆっくり流れる方式
で、顕微鏡は水平に描写する。その結果、同一のステー
ジパスが、作動ステージ上の各標本について定められ
る。「オートメーション」メニューに８ステージパスを
加えて、自動方式で作動ステージ上に置かれているすべ
ての標本を解析することが可能である。
「Ｍｏｄｕｌｅ Ｓｔａｇｅ」）測定後、顕微鏡スライ
ド８枚までのすべての位置が、「オートメーション」メ
ニュー（ａｎａｌｙＳＩＳ「Ｍｏｄｕｌｅ Ｇｒａｉｎ
ｓ」）において８連続ステージパスを決定することによ
って、「論理的ゼロ点」に比較して記録される。自動Ｔ
ｈｉｎ−Ｐｒｅｐ（Ｃｙｔｙｃ）法が確定する生物サン
プルの全域は、常に顕微鏡スライドの一定領域内に置か
れ、サイズ５７１．２μｍｘ４５７．０６μｍをもち、
そして顕微鏡単位を用いて倍率２０倍の写真の画像分野
に対応する個々の領域に、総合方式で分解される。各生
物サンプルは、１ステージパスを通して解析される。各
ステージパスは、７５０の個別ステージパス位置（３０
行、２５列）からなり、定められた顕微鏡スライドの位
置の生物サンプルの各領域が、ステージパス位置によっ
て隣接しているが重複しない方式で検出されるように、
一連のステージパス位置として、ゆっくり流れる方式
で、顕微鏡は水平に描写する。その結果、同一のステー
ジパスが、作動ステージ上の各標本について定められ
る。「オートメーション」メニューに８ステージパスを
加えて、自動方式で作動ステージ上に置かれているすべ
ての標本を解析することが可能である。
【００３７】一般に、３種の異なる蛍光波長により励起
された後、各ステージパス位置が、各場合高分解能Ｂ／
Ｗカメラおよび適当な蛍光カラーフィルターを用いて１
ｘ写真撮影される。次いで、個々の写真の蛍光強度が測
定される。これは、「オートメーション」メニューにお
いて「測定」記録カードを用いて実施される。同一ステ
ージパス位置における個々の画像の蛍光強度と相関する
カラー混合物が、個々の青色、赤色および緑色画像を重
ねることによって作成される。次いで、「相解析（ｐｈ
ａｓｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）」が続く、すなわち示され
たカラー混合物の領域が測定され、そして面積として定
量的に再現される。これに関連して、与えられたカラー
混合物は、病理学的に変性した細胞の特徴を表し、診断
予測をすることが可能であることを意味する。
された後、各ステージパス位置が、各場合高分解能Ｂ／
Ｗカメラおよび適当な蛍光カラーフィルターを用いて１
ｘ写真撮影される。次いで、個々の写真の蛍光強度が測
定される。これは、「オートメーション」メニューにお
いて「測定」記録カードを用いて実施される。同一ステ
ージパス位置における個々の画像の蛍光強度と相関する
カラー混合物が、個々の青色、赤色および緑色画像を重
ねることによって作成される。次いで、「相解析（ｐｈ
ａｓｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）」が続く、すなわち示され
たカラー混合物の領域が測定され、そして面積として定
量的に再現される。これに関連して、与えられたカラー
混合物は、病理学的に変性した細胞の特徴を表し、診断
予測をすることが可能であることを意味する。
【００３８】詳細には、数種の分子マーカーを用いる蛍
光測定では、黒白写真が、各蛍光フィルターチャンネル
についてステージパス位置毎に作成される。次いで、カ
ラーが、ステージパス位置に属する個々の画像に割り当
てられ、そして得られる仮のカラー画像が、カラー混合
物が異なる蛍光カラーの「付加（ａｄｄｉｎｇ）」によ
って、蛍光強度に応じて得られるように、「ＦＩＰモジ
ュール」を用いて重ねられる。例えば、黄色の２次カラ
ーは、赤色および緑色のカラーチャンネルにおいて等し
い強さの同時蛍光配色である場合に、対応する画像位置
において得られる。蛍光強度の強さに応じて、２次カラ
ーは、また、赤色もしくは緑色の方に傾くことがある。
同様にして、白の２次カラーは、等しい強度の青色、緑
色および赤色蛍光が重ねられる場合に形成される。次い
で、これらの重ねられた画像は、閾値を設定し、続いて
ＲＧＢモード（画像メニュー）においてカラー閾値を設
定することによって直接生じる「相解析」を遂行するこ
とによって測定される。すべてこれらの段階は、手動で
行われてもよいが、また、それらは、「プロットマクロ
ス（ｐｌｏｔ ｍａｃｒｏｓ）」下で「Ｅｘｔｒａｓ」
メニューにおけるマクロスを作成し、続いて、それらを
「オートメーション」メニューにおいて回復することに
よって自動方式で実施することもできる。最後に、特定
のカラー混合物についての定量的検査が、面積値（＝特
定の強度における少なくとも２種の分子マーカーにより
染色されたことにより正確に定められた２次カラーを保
持する生物サンプルにおける面積）の作成において得ら
れる。それぞれのステージパス位置についての両解析画
像および面積値は、「オートメーション」メニューにお
ける「プロトコール」記録カードを用いて自動的に保存
することができる。この方法で、この領域において測定
された蛍光強度もしくはカラー混合物に関する定量的検
査が、各ステージパス位置について得られる。各ステー
ジパス位置におけるカラー混合物の値（＝３種の個々の
写真の重ね合わせ）は、各場合１つのＥｘｃｅｌデータ
ファイルにおける各ステージパス位置（＝個々の標本）
について表示される。Ｅｘｃｅｌ表は、結果的に、８種
の異なるカラー混合物について、７５０列、例えばステ
ージパス毎に７５０の個別ステージパス位置、および８
行からなる。特定のカラー混合物（例えば赤色と緑色に
おける２種の個々のマーカーを表示する場合の黄色混合
物）は、同時に高レベルにおいて発現される数種の疾病
関連マーカーに因るものとされるので、これらのステー
ジパス位置は、対応する蛍光写真が、対照目的のため
に、その後個々の画像として可視的に検査できるよう
に、「病理的」であるとして標識（＝「フラッギング
（ｆｌａｇｇｉｎｇ）」）される。８種のカラー混合物
に関するＥｘｃｅｌ表に示された領域は、Ｅｘｃｅｌに
おけるマクロスを用いて信認される、すなわち行中のす
べての値（＝特定のカラー混合物）が総括される。その
結果、８種の２次カラーの各々についての数値が与えら
れた生物標本（＝ステージパス）について得られる。病
理学的に変性した細胞の特徴をもつ特定のカラー混合物
（例えば既に上述した黄色カラー混合物）の総計が臨界
最小値を越える場合は、対応するステージパスによって
解析される生物サンプルまたは与えられた頸部塗抹標本
は、病理的であると分類される。その結果、生物サンプ
ルに関する診断予測は、信認される個々の蛍光強度を定
量的に解析することによって自動的に達成される。
光測定では、黒白写真が、各蛍光フィルターチャンネル
についてステージパス位置毎に作成される。次いで、カ
ラーが、ステージパス位置に属する個々の画像に割り当
てられ、そして得られる仮のカラー画像が、カラー混合
物が異なる蛍光カラーの「付加（ａｄｄｉｎｇ）」によ
って、蛍光強度に応じて得られるように、「ＦＩＰモジ
ュール」を用いて重ねられる。例えば、黄色の２次カラ
ーは、赤色および緑色のカラーチャンネルにおいて等し
い強さの同時蛍光配色である場合に、対応する画像位置
において得られる。蛍光強度の強さに応じて、２次カラ
ーは、また、赤色もしくは緑色の方に傾くことがある。
同様にして、白の２次カラーは、等しい強度の青色、緑
色および赤色蛍光が重ねられる場合に形成される。次い
で、これらの重ねられた画像は、閾値を設定し、続いて
ＲＧＢモード（画像メニュー）においてカラー閾値を設
定することによって直接生じる「相解析」を遂行するこ
とによって測定される。すべてこれらの段階は、手動で
行われてもよいが、また、それらは、「プロットマクロ
ス（ｐｌｏｔ ｍａｃｒｏｓ）」下で「Ｅｘｔｒａｓ」
メニューにおけるマクロスを作成し、続いて、それらを
「オートメーション」メニューにおいて回復することに
よって自動方式で実施することもできる。最後に、特定
のカラー混合物についての定量的検査が、面積値（＝特
定の強度における少なくとも２種の分子マーカーにより
染色されたことにより正確に定められた２次カラーを保
持する生物サンプルにおける面積）の作成において得ら
れる。それぞれのステージパス位置についての両解析画
像および面積値は、「オートメーション」メニューにお
ける「プロトコール」記録カードを用いて自動的に保存
することができる。この方法で、この領域において測定
された蛍光強度もしくはカラー混合物に関する定量的検
査が、各ステージパス位置について得られる。各ステー
ジパス位置におけるカラー混合物の値（＝３種の個々の
写真の重ね合わせ）は、各場合１つのＥｘｃｅｌデータ
ファイルにおける各ステージパス位置（＝個々の標本）
について表示される。Ｅｘｃｅｌ表は、結果的に、８種
の異なるカラー混合物について、７５０列、例えばステ
ージパス毎に７５０の個別ステージパス位置、および８
行からなる。特定のカラー混合物（例えば赤色と緑色に
おける２種の個々のマーカーを表示する場合の黄色混合
物）は、同時に高レベルにおいて発現される数種の疾病
関連マーカーに因るものとされるので、これらのステー
ジパス位置は、対応する蛍光写真が、対照目的のため
に、その後個々の画像として可視的に検査できるよう
に、「病理的」であるとして標識（＝「フラッギング
（ｆｌａｇｇｉｎｇ）」）される。８種のカラー混合物
に関するＥｘｃｅｌ表に示された領域は、Ｅｘｃｅｌに
おけるマクロスを用いて信認される、すなわち行中のす
べての値（＝特定のカラー混合物）が総括される。その
結果、８種の２次カラーの各々についての数値が与えら
れた生物標本（＝ステージパス）について得られる。病
理学的に変性した細胞の特徴をもつ特定のカラー混合物
（例えば既に上述した黄色カラー混合物）の総計が臨界
最小値を越える場合は、対応するステージパスによって
解析される生物サンプルまたは与えられた頸部塗抹標本
は、病理的であると分類される。その結果、生物サンプ
ルに関する診断予測は、信認される個々の蛍光強度を定
量的に解析することによって自動的に達成される。
【００３９】特異的抗体を使用して流動細胞計（ｆｌｏ
ｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）において２
種の分子マーカーを同時検出するための実験の記述 Ｐｒｅｓｅｒｖｃｙｔ（Ｃｙｔｙｃ）において保存され
ていた塗抹細胞が、細胞塊を個々の細胞に崩壊するため
に１００μｍ孔径のナイロン布を通して圧縮される。細
胞が遠心によって沈降された後、それらはＰＢＳで１ｘ
洗浄され、続いて次の方法、ａ）ＯＰＦ法（ＯＲＴＨＯ
ＰｅｒｍｅａＦｉｘＴＭ）、ｂ）Ｆ＆Ｐ（ＦＩＸ＆ＰＥ
ＲＭ Ｃｅｌｌ Ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚａｔｉｏｎ Ｋ
ｉｔ，Ｉｍｔｅｃ）およびｃ）ＭＷＨ（マイクロ波加
熱）：の１つを用いて透過性にされる。すべての方法
は、製造者の指示にしたがうか、またはＭｉｌｌａｒｄ
ら（Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９８，４４，２３２０−
２３３０）にしたがって実施されねばならない。透過性
にされた細胞は、２種のマウス抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ／ＢＡＹＥＲ製のｈｅｒ２／ｎｅｕ（ク
ローン３Ｂ５，２０μｇ／ｍｌ）およびｐ１６（クロー
ンＤＣＳ５０．１，１０μｇ／ｍｌ））とともに６０分
間インキュベートされる。第１の抗体はフルオレセイン
に共役されるが、第２はビオチンに共役される。各々次
のインキュベーション段階後、細胞は沈降され、そして
ＰＢＳにより全２回洗浄される。２種の異なる染色シス
テムが、個々の抗原・抗体結合を検出するために連続し
て使用される。最初の染色システムの場合、細胞は、ス
トレプトアビジン−Ｃｙ３（Ｍｏｂｉ Ｔｅｃ，５μｇ
／ｍｌ）とともに３０分間インキュベートされる。第２
の染色システムは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−４８８
Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＫｉｔTM
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，ｏｒｄｅｒ Ｎ
ｏ．Ａ−１１０５３）からなる。続いて、細胞はＩＳＯ
ＴＯＮ ＩＩ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）中に採取され、そして
緑色と赤色蛍光のためにレーザー励起を固定された流動
細胞計（ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎ
ｓｏｎ）において測定される。陰性細胞、および単一陽
性もしくは２重陽性細胞の比較および絶対数が、シグナ
ル強度について閾値を定めた後に検出される。診断専門
システムが、この情報を提案される診断に変換する。
ｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）において２
種の分子マーカーを同時検出するための実験の記述 Ｐｒｅｓｅｒｖｃｙｔ（Ｃｙｔｙｃ）において保存され
ていた塗抹細胞が、細胞塊を個々の細胞に崩壊するため
に１００μｍ孔径のナイロン布を通して圧縮される。細
胞が遠心によって沈降された後、それらはＰＢＳで１ｘ
洗浄され、続いて次の方法、ａ）ＯＰＦ法（ＯＲＴＨＯ
ＰｅｒｍｅａＦｉｘＴＭ）、ｂ）Ｆ＆Ｐ（ＦＩＸ＆ＰＥ
ＲＭ Ｃｅｌｌ Ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚａｔｉｏｎ Ｋ
ｉｔ，Ｉｍｔｅｃ）およびｃ）ＭＷＨ（マイクロ波加
熱）：の１つを用いて透過性にされる。すべての方法
は、製造者の指示にしたがうか、またはＭｉｌｌａｒｄ
ら（Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９８，４４，２３２０−
２３３０）にしたがって実施されねばならない。透過性
にされた細胞は、２種のマウス抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ／ＢＡＹＥＲ製のｈｅｒ２／ｎｅｕ（ク
ローン３Ｂ５，２０μｇ／ｍｌ）およびｐ１６（クロー
ンＤＣＳ５０．１，１０μｇ／ｍｌ））とともに６０分
間インキュベートされる。第１の抗体はフルオレセイン
に共役されるが、第２はビオチンに共役される。各々次
のインキュベーション段階後、細胞は沈降され、そして
ＰＢＳにより全２回洗浄される。２種の異なる染色シス
テムが、個々の抗原・抗体結合を検出するために連続し
て使用される。最初の染色システムの場合、細胞は、ス
トレプトアビジン−Ｃｙ３（Ｍｏｂｉ Ｔｅｃ，５μｇ
／ｍｌ）とともに３０分間インキュベートされる。第２
の染色システムは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−４８８
Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＫｉｔTM
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，ｏｒｄｅｒ Ｎ
ｏ．Ａ−１１０５３）からなる。続いて、細胞はＩＳＯ
ＴＯＮ ＩＩ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）中に採取され、そして
緑色と赤色蛍光のためにレーザー励起を固定された流動
細胞計（ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎ
ｓｏｎ）において測定される。陰性細胞、および単一陽
性もしくは２重陽性細胞の比較および絶対数が、シグナ
ル強度について閾値を定めた後に検出される。診断専門
システムが、この情報を提案される診断に変換する。
【００４０】本発明の特徴および態様は以下のとおりで
ある。
ある。
【００４１】１． 細胞における少なくとも２種の分子
マーカーを同時に検出することによって、子宮頸部塗抹
標本における腫瘍細胞およびそれらの前駆体を検出する
方法。
マーカーを同時に検出することによって、子宮頸部塗抹
標本における腫瘍細胞およびそれらの前駆体を検出する
方法。
【００４２】２． マーカーが、次の群：腫瘍サプレッ
サー遺伝子、アポトーシス遺伝子、増殖遺伝子、修復遺
伝子およびウイルス遺伝子の少なくとも１種から選ばれ
ることを特徴とする、第１項記載の方法。
サー遺伝子、アポトーシス遺伝子、増殖遺伝子、修復遺
伝子およびウイルス遺伝子の少なくとも１種から選ばれ
ることを特徴とする、第１項記載の方法。
【００４３】３． 次のマーカー：ｈｅｒ２／ｎｅｕ，
ｐ１６，ｐ５３，ＭＮ，ｍｄｍ−２，ｂｃｌ−２，ＥＧ
Ｆレセプター、ならびにＨＰＶサブタイプ６，１１，１
６，１８，３０，３１，３３，３５，４５，５１および
５２からの特異的ＤＮＡが、組み合わせにおいて存在し
ていることを特徴とする、第１および２項記載の方法。
ｐ１６，ｐ５３，ＭＮ，ｍｄｍ−２，ｂｃｌ−２，ＥＧ
Ｆレセプター、ならびにＨＰＶサブタイプ６，１１，１
６，１８，３０，３１，３３，３５，４５，５１および
５２からの特異的ＤＮＡが、組み合わせにおいて存在し
ていることを特徴とする、第１および２項記載の方法。
【００４４】４． マーカー組み合わせ：ｐ１６とｈｅ
ｒ２／ｎｅｕまたはｐ１６とＥＧＦ−Ｒまたはｈｅｒ２
／ｎｅｕとｐ５３またはｍｄｍ−２とｈｅｒ２／ｎｅｕ
またはｐ１６とｂｃｌ−２またはｈｅｒ２／ｎｅｕとｂ
ｃｌ−２またはｐ５３とｐ１６が存在していることを特
徴とする、第１〜３項の１つに記載の方法。
ｒ２／ｎｅｕまたはｐ１６とＥＧＦ−Ｒまたはｈｅｒ２
／ｎｅｕとｐ５３またはｍｄｍ−２とｈｅｒ２／ｎｅｕ
またはｐ１６とｂｃｌ−２またはｈｅｒ２／ｎｅｕとｂ
ｃｌ−２またはｐ５３とｐ１６が存在していることを特
徴とする、第１〜３項の１つに記載の方法。
【００４５】５． ３種のマーカーが検出されることを
特徴とする、第１〜４項の１つに記載の方法。
特徴とする、第１〜４項の１つに記載の方法。
【００４６】６． 第１〜５項の１つに記載の方法を実
施するためのキット。
施するためのキット。
【００４７】７． 試薬が抗体もしくは核酸であること
を特徴とする、第６項記載のキット。
を特徴とする、第６項記載のキット。
【００４８】８． 抗体もしくは核酸プローブが、蛍光
または発色性染料物質を用いて直接または間接に読まれ
ることを特徴とする、第６および７項記載のキット。
または発色性染料物質を用いて直接または間接に読まれ
ることを特徴とする、第６および７項記載のキット。
【００４９】９． 少なくとも２種のマーカーが検出さ
れ、そしてシグナル強度が合体され、加算されることを
特徴とする自動方式において、異常細胞を検出すること
が可能になることを特徴とする、第１〜８項の１つに記
載の方法。
れ、そしてシグナル強度が合体され、加算されることを
特徴とする自動方式において、異常細胞を検出すること
が可能になることを特徴とする、第１〜８項の１つに記
載の方法。
【００５０】１０． 自動情報処理が、画像情報を提案
される診断に統合させ、そして適当であれば反射試験を
実施させる診断専門システムと組み合わされることを特
徴とする、第９項記載の方法。
される診断に統合させ、そして適当であれば反射試験を
実施させる診断専門システムと組み合わされることを特
徴とする、第９項記載の方法。
【００５１】１１． プロセスが、完全に自動のサンプ
ル調製、サンプル染色、サンプル読み取りおよび少なく
とも２種の与えられたサブプロセスを含む情報処理もし
くはサブプロセスからなることを特徴とする、第１〜１
０項記載の完全プロセス。
ル調製、サンプル染色、サンプル読み取りおよび少なく
とも２種の与えられたサブプロセスを含む情報処理もし
くはサブプロセスからなることを特徴とする、第１〜１
０項記載の完全プロセス。
フロントページの続き (72)発明者 ラルフ・ビルツ ドイツ50674ケルン・マイスター−ゲルハ ルト−シユトラーセ23 (72)発明者 マルジト・ドト ドイツ51371レーフエルクーゼン・フエー ルシユトラーセ１ベー (72)発明者 ケルステイン・ボーマン ドイツ47798クレーフエルト・フランケン リング109 (72)発明者 シルビア・ウンガー ドイツ69120ハイデルベルク・ベルダーシ ユトラーセ42アー Ｆターム(参考） 2G045 AA26 BA14 BB14 BB22 BB24 BB50 BB51 CB02 DA13 FA16 FA29 FB02 FB03 FB07 FB12 GC15 4B063 QA19 QQ08 QR32 QR55 QS03 QS33 QS34
Claims (1)
- 【請求項１】 細胞における少なくとも２種の分子マー
カーを同時に検出することによって、子宮頸部塗抹標本
における腫瘍細胞およびそれらの前駆体を検出する方
法。
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005534313A (ja) * | 2002-08-01 | 2005-11-17 | エムティーエム ラボラトリーズ アクチェンゲゼルシャフト | 溶液ベースの診断のための方法 |
| JP2012526286A (ja) * | 2009-05-07 | 2012-10-25 | オンコヘルス コーポレーション | ヒトパピローマウイルス（ｈｐｖ）およびｈｐｖ関連癌の初期段階および後期段階の検出、スクリーニング、および診断のための高度または≧ｃｉｎ２の同定 |
| US8859218B2 (en) | 2008-06-13 | 2014-10-14 | Oncohealth Corp. | In situ detection of early stages and late stages HPV infection |
| US8968995B2 (en) | 2008-11-12 | 2015-03-03 | Oncohealth Corp. | Detection, screening, and diagnosis of HPV-associated cancers |
| US9128094B2 (en) | 2010-01-08 | 2015-09-08 | Oncohealth Corp. | High throughput cell-based HPV immunoassays for diagnosis and screening of HPV-associated cancers |
Families Citing this family (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7306926B2 (en) * | 1998-07-01 | 2007-12-11 | Mtm Laboratories Ag | Method for detecting carcinomas in a solubilized cervical body sample |
| US7906102B2 (en) | 2001-10-03 | 2011-03-15 | Vanderbilt University | Ligands to radiation-induced molecules |
| US7306925B2 (en) | 2001-11-09 | 2007-12-11 | Vanderbilt University | Phage antibodies to radiation-inducible neoantigens |
| EP1369694A1 (en) * | 2002-04-09 | 2003-12-10 | MTM Laboratories AG | Method for discrimination of metaplasias from neoplastic or preneoplastic lesions |
| CN100429320C (zh) * | 2002-06-28 | 2008-10-29 | 香港科技大学 | 用于癌症检测的血浆或血清标记及方法 |
| EP1422526A1 (en) | 2002-10-28 | 2004-05-26 | MTM Laboratories AG | Method for improved diagnosis of dysplasias |
| US20040197839A1 (en) * | 2003-04-04 | 2004-10-07 | Bioview Ltd. | Methods of detecting cancer cells in biological samples |
| US7361460B2 (en) * | 2003-04-11 | 2008-04-22 | Digene Corporation | Approach to molecular diagnosis of human papillomavirus-related diseases |
| US20040260157A1 (en) * | 2003-06-20 | 2004-12-23 | Montes Miguel A. | Method for automated screening of cervical/endocervical malignant and premalignant epithelial lesions using flow cytometry with HPV DNA fluorescent in-situ hybridization ( FISH) technology |
| ATE289685T1 (de) * | 2003-08-25 | 2005-03-15 | Mtm Lab Ag | Verfahren zum nachweis von karzinomen in solubilisierten zervikalen körperproben |
| US20050186642A1 (en) | 2004-02-24 | 2005-08-25 | Biocare Medical, Inc. | Immunoassay reagents and methods of use thereof |
| EP1756577B1 (en) * | 2004-03-24 | 2012-03-14 | Tripath Imaging, Inc. | Methods and compositions for the detection of cervical disease |
| CN1677109A (zh) * | 2004-03-30 | 2005-10-05 | 希森美康株式会社 | 子宫颈癌的筛选方法 |
| US7316904B1 (en) | 2004-06-30 | 2008-01-08 | Chromodynamics, Inc. | Automated pap screening using optical detection of HPV with or without multispectral imaging |
| US8951746B2 (en) * | 2004-11-05 | 2015-02-10 | Southwest Research Institute | Method and devices for screening cervical cancer |
| US20060189893A1 (en) * | 2005-01-06 | 2006-08-24 | Diamics, Inc. | Systems and methods for detecting abnormal cells |
| US7595380B2 (en) * | 2005-04-27 | 2009-09-29 | Tripath Imaging, Inc. | Monoclonal antibodies and methods for their use in the detection of cervical disease |
| JP5223237B2 (ja) * | 2007-05-14 | 2013-06-26 | ソニー株式会社 | 検出用核酸鎖及び物質間の結合又は相互作用検出方法 |
| US8394638B2 (en) * | 2008-11-10 | 2013-03-12 | The Invention Science Fund I, Llc | Administering a therapeutic agent with more than one taggant |
| US20100121187A1 (en) * | 2008-11-10 | 2010-05-13 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Administering a therapeutic agent with more than one taggant |
| US8535261B2 (en) * | 2008-11-10 | 2013-09-17 | The Invention Science Fund I, Llc | Administering a therapeutic agent with more than one taggant |
| US20100121176A1 (en) * | 2008-11-10 | 2010-05-13 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Administering a therapeutic agent with more than one taggant |
| US20100119455A1 (en) * | 2008-11-10 | 2010-05-13 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Administering a therapeutic agent with more than one taggant |
| US20100121581A1 (en) * | 2008-11-10 | 2010-05-13 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Administering a therapeutic agent with more than one taggant |
| US20100121177A1 (en) * | 2008-11-10 | 2010-05-13 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Administering a therapeutic agent with more than one taggant |
| US8591454B2 (en) * | 2008-11-10 | 2013-11-26 | The Invention Science Fund I, Llc | Administering a therapeutic agent with more than one taggant |
| US9551700B2 (en) * | 2010-12-20 | 2017-01-24 | Milagen, Inc. | Device and methods for the detection of cervical disease |
| ES2625288T3 (es) | 2011-04-15 | 2017-07-19 | The Johns Hopkins University | Sistema de secuenciación segura |
| US8852592B2 (en) | 2011-05-10 | 2014-10-07 | Biocare Medical, Llc | Systems and methods for anti-PAX8 antibodies |
| WO2013019730A1 (en) | 2011-07-29 | 2013-02-07 | The Washington University | Antibodies to tip-1 and grp78 |
| US10316103B1 (en) | 2012-03-30 | 2019-06-11 | Biocare Medical, Llc | Systems and methods for anti-Uroplakin III antibodies |
| JP6324970B2 (ja) | 2012-09-27 | 2018-05-23 | バイオケア メディカル， エルエルシー | 抗ウロプラキンｉｉ抗体システムおよび方法 |
| AU2013338393B2 (en) | 2012-10-29 | 2017-05-11 | The Johns Hopkins University | Papanicolaou test for ovarian and endometrial cancers |
| US10429390B2 (en) | 2012-12-18 | 2019-10-01 | Biocare Medical, Llc | Antibody cocktail systems and methods for classification of histologic subtypes in lung cancer |
| CN103323448B (zh) * | 2013-01-20 | 2018-01-16 | 温州医科大学 | 一种辣根过氧化物酶黑色显色剂及其制备方法与应用 |
| DK2962113T3 (da) | 2013-02-28 | 2019-07-01 | Biocare Medical Llc | Systemer og fremgangsmåder med anti-p40-antistoffer |
| CN103196731A (zh) * | 2013-04-18 | 2013-07-10 | 王刚平 | 用于鉴别乳腺肌上皮病变的多重染色试剂及其检测方法 |
| WO2015008885A1 (ko) * | 2013-07-19 | 2015-01-22 | 엠앤디(주) | 자궁경부암 진단 방법 및 그 진단용 키트 |
| CN103558150B (zh) * | 2013-09-18 | 2015-12-23 | 石河子大学 | 一种改良巴氏涂片的制备方法 |
| DK3052522T3 (da) | 2013-10-03 | 2020-02-24 | Biocare Medical Llc | Anti-sox 10 antistofsystemer og -fremgangsmåder |
| EP3172222A4 (en) | 2014-07-24 | 2018-03-21 | Washington University | Compositions targeting radiation-induced molecules and methods of use thereof |
| WO2017027653A1 (en) | 2015-08-11 | 2017-02-16 | The Johns Hopkins University | Assaying ovarian cyst fluid |
| CN105241726A (zh) * | 2015-09-14 | 2016-01-13 | 黄小军 | 一种免疫细胞化学染色方法及其在宫颈肿瘤性病变筛查中的应用 |
| EP3634459A4 (en) | 2017-02-10 | 2021-01-06 | Washington University | ANTIBODIES DIRECTED AGAINST TIP1 AND THEIR PROCEDURES FOR USE |
| CN108893534A (zh) * | 2018-06-26 | 2018-11-27 | 华中科技大学鄂州工业技术研究院 | 泛癌症诊断标记物 |
| CN110684827A (zh) * | 2019-11-15 | 2020-01-14 | 南京市妇幼保健院 | 基于子宫颈脱落细胞基因检测的宫颈癌分期方法与检测试剂盒 |
| CN111337666B (zh) * | 2020-02-12 | 2021-04-02 | 山东大学 | I-motif重组介导的FRET探针及其原位成像癌细胞表面蛋白质同源二聚化的应用 |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5109429A (en) * | 1985-11-04 | 1992-04-28 | Cell Analysis Systems,Inc. | Apparatus and method for analyses of biological specimens |
| US5544650A (en) * | 1988-04-08 | 1996-08-13 | Neuromedical Systems, Inc. | Automated specimen classification system and method |
| US5932412A (en) * | 1990-05-11 | 1999-08-03 | Euro-Diagnostica Ab | Synthetic peptides in human papillomaviruses 1, 5, 6, 8, 11, 16, 18, 31, 33 and 56, useful in immunoassay for diagnostic purposes |
| US5784162A (en) * | 1993-08-18 | 1998-07-21 | Applied Spectral Imaging Ltd. | Spectral bio-imaging methods for biological research, medical diagnostics and therapy |
| US5733721A (en) * | 1992-11-20 | 1998-03-31 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Cell analysis method using quantitative fluorescence image analysis |
| AU1837495A (en) * | 1994-10-13 | 1996-05-06 | Horus Therapeutics, Inc. | Computer assisted methods for diagnosing diseases |
| ATE270712T1 (de) * | 1995-03-17 | 2004-07-15 | Wayne John Cancer Inst | Nachweis von melanomenmetastasen unter verwendung eines mehrfachmarker-tests |
| US5698410A (en) * | 1995-06-07 | 1997-12-16 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Highly sensitive immunocytochemical method for diagnosis of malignant effusions |
| EP0806668B1 (en) * | 1996-05-10 | 2002-07-31 | Becton, Dickinson and Company | Method and kit for determining malignant potential in tissue cells |
| US6756207B1 (en) * | 1997-02-27 | 2004-06-29 | Cellomics, Inc. | System for cell-based screening |
| PT1025444E (pt) * | 1997-10-21 | 2005-07-29 | Cancer Rec Tech Ltd | Determinacao de anomalia do crescimento celular |
| US6005256A (en) * | 1998-02-12 | 1999-12-21 | Raytheon Company | Method and apparatus for performing cell analysis based on simultaneous multiple marker emissions from neoplasia (CASMMEN) |
| IL124650A0 (en) * | 1998-05-26 | 1998-12-06 | Yeda Res & Dev | Methods and therapeutic compositions for treating cancer |
| DE19829473C2 (de) * | 1998-07-01 | 2000-08-10 | Magnus Von Knebel Doeberitz Ch | Verfahren zur frühen Diagnose von Carcinomen |
| MXPA01004287A (es) * | 1998-10-26 | 2002-06-04 | Ventana Med Syst Inc | Deteccion del virus del papiloma humano en frotis de papanicolau (pap). |
| WO2001037738A2 (en) | 1999-11-29 | 2001-05-31 | Molecular Diagnostics, Inc. | Cervical screening system |
| DE10063112A1 (de) * | 2000-12-18 | 2002-06-20 | Bayer Ag | Verfahren zur Erhöhung der klinischen Spezifität bei der Detektion von Tumoren und ihren Vorstufen durch simultane Messung von mindestens zwei verschiedenen molekularen Markern |
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-
2007
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Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005534313A (ja) * | 2002-08-01 | 2005-11-17 | エムティーエム ラボラトリーズ アクチェンゲゼルシャフト | 溶液ベースの診断のための方法 |
| US8916342B2 (en) | 2006-11-13 | 2014-12-23 | Oncohealth Corp. | Identification of high grade or ≧ CIN2 for early stages and late stages detection, screening, and diagnosis of human papillomavirus (HPV) and HPV-associated cancers |
| US8859218B2 (en) | 2008-06-13 | 2014-10-14 | Oncohealth Corp. | In situ detection of early stages and late stages HPV infection |
| US8865162B2 (en) | 2008-06-13 | 2014-10-21 | Oncohealth Corp. | Monoclonal antibodies against HPV proteins |
| US9568474B2 (en) | 2008-06-13 | 2017-02-14 | Oncohealth Corp. | In situ detection of early stages and late stages HPV infection |
| US8968995B2 (en) | 2008-11-12 | 2015-03-03 | Oncohealth Corp. | Detection, screening, and diagnosis of HPV-associated cancers |
| JP2012526286A (ja) * | 2009-05-07 | 2012-10-25 | オンコヘルス コーポレーション | ヒトパピローマウイルス（ｈｐｖ）およびｈｐｖ関連癌の初期段階および後期段階の検出、スクリーニング、および診断のための高度または≧ｃｉｎ２の同定 |
| US9128094B2 (en) | 2010-01-08 | 2015-09-08 | Oncohealth Corp. | High throughput cell-based HPV immunoassays for diagnosis and screening of HPV-associated cancers |
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