CN116868054A - 包括用一个或多个可检测部分标记的一种或多种生物标志物的染色生物学样本 - Google Patents

包括用一个或多个可检测部分标记的一种或多种生物标志物的染色生物学样本 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种用一种或多种普通和/或特殊他汀类药物对生物学样本(例如，来源于生物学样品的单个连续组织切片)进行染色同时用一个或多个可检测部分附随地标记同一生物学样本而无需去除任何染色剂或评估生物学样本的染色连续组织切片的不同图像的方法。在一些实施方案中，本公开涉及用一种或多种常规染料进行染色的生物学样本，并且其中所述生物学样本进一步包含用一个或多个可检测部分标记的一种或多种生物标志物。

Description

包括用一个或多个可检测部分标记的一种或多种生物标志物 的染色生物学样本
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年1月25日提交的美国临时专利申请第63/141,091号的权益，该申请的公开内容全文通过引用并入本文。
技术领域
本申请涉及一种用一种或多种常规染料对生物学样本进行染色并且用一个或多个可检测部分标记该生物学样本内的一种或多种生物标志物的方法，其中用该常规染料进行染色并且用该一个或多个可检测部分标记该生物标志物发生在同一生物学样本上。
背景技术
免疫组织化学(IHC)是指使用对特定抗原具有特异性的抗体检测、定位和/或定量生物学样品中的抗原(例如蛋白质)的方法。IHC具有准确鉴定生物学样品中特异性蛋白质的位点的实质性优点。这也是一种检查组织本身的有效的方法。原位杂交(ISH)是指检测、定位和定量核酸的方法。IHC和ISH均可以用于各种生物学样品，诸如组织(例如，新鲜冷冻、福尔马林固定的、石蜡包埋)和细胞学样品。无论靶标是核酸还是抗原，均可以使用各种标记物(例如，显色、荧光、发光、放射标记物)来检测靶标的识别。为了在临床环境中可靠地检测、定位和定量靶标，期望扩增识别事件，因为可靠地检测低丰度细胞标志物的能力对于诊断用途变得越来越重要。例如，响应于单个抗原检测事件，在标志物位点沉积数百个或数千个标记物分子，通过扩增增强了检测识别事件的能力。
扩增通常伴随有不良事件，诸如随着背景信号的增加，非特异性信号变得明显。增加的背景信号将掩盖可能与较低但有临床意义的表达相关联的微弱信号，从而干扰临床分析。因此，虽然扩增识别事件是期望的，但非常期望限制增加背景信号的扩增方法。一种此类方法是酪酰胺信号放大(TSA)，该方法也称为催化报告沉积(CARD)。美国专利第5,583,001号公开了一种使用分析物依赖性酶活化系统检测和/或定量分析物的方法，该系统依赖催化报告沉积来放大可检测标记物信号。利用TSA的方法有效地增加了从IHC和ISH测定中获得的信号，同时不产生显著的背景信号放大(参见，例如，美国申请公开第2012/0171668号，其有关与酪酰胺扩增试剂的公开内容据此全文通过引用并入本文)。用于这些扩增方法的试剂正被应用于临床上重要的靶标，以提供稳健的诊断能力。
TSA利用辣根过氧化物酶(HRP)与酪酰胺之间的反应。在H2O2存在下，酪酰胺转化为高反应性和短寿命的自由基中间体，该自由基中间体优先与蛋白质上的富电子氨基酸残基反应。自由基中间体的短寿命致使酪酰胺与组织上的靠近生成位点的蛋白质共价结合，产生离散且特异性的信号。然后可以通过各种显色可视化技术和/或荧光显微镜检测共价结合的可检测标记物。
共同在审的名称为“Quinone Methide Analog Signal Amplification”(国际申请日为2015年2月20日)的申请PCT/EP2015/053556描述了一种替代技术(″QMSA″)，其像TSA一样，可用于在不增加背景信号的情况下增加信号放大。事实上，PCT/EP2015/053556描述了新颖的醌甲基化物类似物前体以及使用这些醌甲基化物类似物前体检测生物学样品中的一个或多个靶标的方法。其中，检测方法被描述为包括以下步骤：使样品与检测探针接触，然后使样品与包含酶的标记缀合物接触。该酶与包含可检测标记物的醌甲基化物类似物前体相互作用，形成反应性醌甲基化物类似物，其与生物学样品中的靶标近侧结合或直接结合在靶标上。然后检测可检测标记物。
发明内容
当用一种或多种常规染料(例如，苏木精和伊红)对生物学样本进行染色时以及针对一种或多种生物标志物的存在，传统上使用来源于单个生物学样品的不同连续组织切片。例如，第一连续组织切片可以用苏木精和伊红进行染色以识别生物学样本的形态特征；而第二连续组织切片中的一种或多种生物标志物可以在IHC或ISH测定中用一种或多种色原或荧光团进行标记。由于使用了不同连续组织切片，不同染色的连续组织切片之间没有确切的细胞与细胞和特征与特征的相关性。
为了避免使用不同连续组织切片，普通和/或特殊染色剂(本文分别描述)可以应用于生物学样本、成像并且然后从该生物学样本去除。随后，去除了普通或特殊染色剂的同一生物学样本可以针对一种或多种生物标志物的存在进行染色，并且然后重新成像。虽然这是可行的，但这样的过程增加相当多的时间和精力，包括需要在任何两个生成的图像内重新对准相同的区域以进行评估。
申请人已经开发了一种用一种或多种普通和/或特殊他汀类药物对生物学样本(例如，来源于生物学样品的单个连续组织切片)进行染色同时用一个或多个可检测部分附随地标记同一生物学样本而无需剥离任何染色剂或评估生物学样本的染色连续组织切片的不同图像的方法。申请人认为本文所述的方法与使用带有单独的连续组织切片的单独的载玻片相比提供了对染色生物学样本更准确的评估，因为单独的连续组织切片不包括相同的细胞、细胞的部分或组织形态。
鉴于前述，在一些实施例中，本公开涉及用一种或多种常规染料进行染色的生物学样本(例如，置于基底上的单个生物学样本)，并且其中该生物学样本进一步包含用一个或多个可检测部分标记的一种或多种生物标志物。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有在可见光谱之外的峰吸收波长。在一些实施例中，一个或多个可检测部分包含选自由香豆素核、七甲川菁核和克酮酸盐核组成的组的核。合适的可检测部分的非限制性实例如本文所述。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有在紫外光谱或红外光谱内的峰吸收波长。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有小于约430nm或大于约670nm的峰吸收波长。在一些实施例中，一种或多种常规染料为可见染料，即具有在可见光谱内的一个或多个峰吸收波长，例如，具有范围从约400nm至约700nm的一种或多种峰吸收波长，诸如在人眼的适光响应之外的一种或多种峰吸收波长。在一些实施例中，常规染料为苏木精和/或伊红。在其他实施例中，常规染料包括与特殊染色剂一起使用的那些。
在一些实施例中，本公开内容也涉及用在可见光谱内可检测的一种或多种“普通染色剂”(例如，苏木精和/或伊红)对置于基底上的生物学样本进行染色并用一个或多个可检测部分进一步标记一种或多种生物标志物，该一个或多个可检测部分各自具有在可见光谱之外的峰吸收波长。在一些实施例中，一个或多个可检测部分包含选自由香豆素核、七甲川菁核和克酮酸盐核组成的组的核。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有在紫外光谱(包括近紫外光谱)或红外光谱(包括近红外光谱)内的峰吸收波长。在一些实施例中，一个或多个可检测部分各自具有小于约430nm或大于约670nm的峰吸收波长。
在一些实施例中，本公开也涉及用针对光学显微镜在可见光谱内通常可检测的一种或多种“特殊染色剂”(例如，针对铁、粘蛋白、糖原、淀粉样蛋白、核酸等的染色剂)对置于基底上的生物学样本进行染色并用各自具有在该生物学样本的光谱的一部分或多部分之外的峰吸收波长的一个或多个可检测部分进一步标记该生物学样本内的一种或多种生物标志物。在一些实施例中，一个或多个可检测部分包含选自由香豆素核、七甲川菁核和克酮酸盐核组成的组的核。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有在紫外光谱(包括近紫外光谱)或红外光谱(包括近红外光谱)内的峰吸收波长。在一些实施例中，一个或多个可检测部分各自具有小于约430nm或大于约670nm的峰吸收波长。
本公开的第一方面是一种使置于基底上的生物学样本内的一个或多个靶标可视化的方法，该方法包括：用第一可检测部分标记第一生物标志物，其中该第一可检测部分具有小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)；以及用具有在约400nm与约700nm之间的一个或多个峰吸收波长的至少一种常规染料对置于该基底上的该生物学样本进行染色，其中该第一可检测部分的峰吸收波长与一种或多种常规染料的该一个或多个峰吸收波长至少相隔20nm。在一些实施例中，一个或多个可检测部分包含选自由香豆素核、七甲川菁核和克酮酸盐核组成的组的核。
在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约190nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约180nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约170nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约160nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约140nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约130nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约120nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约110nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约90nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约80nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约70nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约60nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约50nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约40nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分的FWHM小于约60nm。在一些实施例中，第一可检测部分的FWHM小于约50nm。在一些实施例中，第一可检测部分的FWHM小于约40nm。在一些实施例中，第一可检测部分的峰吸收波长与一种或多种常规染料的一个或多个峰吸收波长至少相隔10nm。在一些实施例中，第一可检测部分的峰吸收波长与一种或多种常规染料的一个或多个峰吸收波长至少相隔15nm。在一些实施例中，第一可检测部分的峰吸收波长与一种或多种常规染料的一个或多个峰吸收波长至少相隔20nm。在一些实施例中，第一可检测部分的峰吸收波长与一种或多种常规染料的一个或多个峰吸收波长至少相隔25nm。在一些实施例中，第一可检测部分的峰吸收波长与一种或多种常规染料的一个或多个峰吸收波长至少相隔30nm。在一些实施例中，第一可检测部分的峰吸收波长与一种或多种常规染料的一个或多个峰吸收波长至少相隔35nm。在一些实施例中，第一可检测部分的峰吸收波长与一种或多种常规染料的一个或多个峰吸收波长至少相隔40nm。在一些实施例中，第一可检测部分的峰吸收波长与一种或多种常规染料的一个或多个峰吸收波长至少相隔45nm。在一些实施例中，第一可检测部分的峰吸收波长与一种或多种常规染料的一个或多个峰吸收波长至少相隔50nm。在一些实施例中，第一可检测部分的峰吸收波长与一种或多种常规染料的一个或多个峰吸收波长至少相隔55nm。在一些实施例中，第一可检测部分的峰吸收波长与一种或多种常规染料的一个或多个峰吸收波长至少相隔60nm。在一些实施例中，第一可检测部分的峰吸收波长与一种或多种常规染料的一个或多个峰吸收波长至少相隔70nm。在一些实施例中，第一可检测部分的峰吸收波长与一种或多种常规染料的一个或多个峰吸收波长至少相隔80nm。在一些实施例中，一个或多个可检测部分包含选自由香豆素核、七甲川菁核和克酮酸盐核组成的组的核。
在一些实施例中，一种或多种常规染料包括苏木精。在一些实施例中，一种或多种常规染料包括伊红。在一些实施例中，一种或多种常规染料包括苏木精和伊红。在一些实施例中，一个或多个可检测部分包含选自由香豆素核、七甲川菁核和克酮酸盐核组成的组的核。
在一些实施例中，一种或多种常规染料选自由以下项组成的组：酸性品红、阿尔新蓝8GX、茜素红S、金胺O、偶氮胭脂红B、偶氮胭脂红G、天青A、天青B、天青C、碱性品红、俾斯麦棕Y、亮甲酚蓝、亮绿、胭脂红、氯唑黑E、刚果红、甲酚紫、结晶紫、达罗红、乙基绿、固绿FCF、异硫氰酸荧光素、姬姆萨染色剂、靛蓝胭脂红、詹纳斯绿B、哲纳尔氏染色素1899、浅绿SF、孔雀石绿、马休黄、甲基橙、甲基紫2B、亚甲蓝、亚甲蓝、亚甲紫(Bernthsen)、中性红、苯胺黑、尼罗蓝A、核固红、油红O、橙黄G、橙黄II、地衣红、副品红、根皮红B、蛋白银S、派洛宁B、派洛宁Y、刃天青、玫瑰红、番红O、苏丹黑B、苏丹III、苏丹IV、四铬染色(MacNeal)、硫堇、甲苯胺蓝、Weigert 1878、瑞氏色素及它们的组合。
在一些实施例中，用第一可检测部分标记第一生物标志物包括：(a)使生物学样本与抗生物标志物一抗接触；(b)使该生物学样本与对该抗生物标志物一抗具有特异性的抗特异性二抗接触，其中抗物种抗体直接或间接与至少一种酶缀合；以及(c)使该生物学样本与可检测缀合物接触，该可检测缀合物包含：(i)第一可检测部分和(ii)酪酰胺部分、醌甲基化物部分、或者酪酰胺部分或醌甲基化物部分的衍生物或类似物。
在一些实施例中，用第一可检测部分标记第一生物标志物包括：(a)使生物学样本与抗生物标志物一抗接触；(b)使该生物学样本与对抗生物标志物抗体具有特异性的抗特异性二抗接触，其中抗物种抗体直接或间接与至少一种酶缀合；(c)使该生物学样本与第一组织反应性缀合物接触，该第一组织反应性缀合物包含：(i)能够参与点击化学反应的一对反应性官能团的第一成员和(ii)酪酰胺部分、醌甲基化物部分、或者酪酰胺部分或醌甲基化物部分的衍生物或类似物；以及(d)使该生物学样本与可检测缀合物接触，该可检测缀合物包含：(i)第一可检测部分和(ii)该一对反应性官能团的第二成员。
在一些实施例中，第一生物标志物为蛋白质生物标志物。在一些实施例中，第一生物标志物选自PD-L1、PD-1、Ki-67、CD3、CD8、Ki67、CD5、CD20、泛细胞角蛋白、HER2、ER、PR、p16、p63、p40、TTF-1、天冬氨酸蛋白酶、突触素和MART-1/MelanA。在一些实施例中，第一生物标志物为核酸生物标志物。在一些实施例中，一个或多个可检测部分包含选自由香豆素核、七甲川菁核和克酮酸盐核组成的组的核。
在一些实施例中，该方法其进一步包括：用第二可检测部分标记第二生物标志物。在一些实施例中，第二可检测部分具有小于约200nm(例如，小于约150nm、小于约100nm、小于约70nm等)的FWHM和小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)，并且其中第一检测部分和第二可检测部分是不同的。在一些实施例中，第二可检测部分在紫外光谱范围内或红外光谱范围内。在一些实施例中，第二可检测部分在紫外光谱范围内。在一些实施例中，一个或多个可检测部分包含选自由香豆素核、七甲川菁核和克酮酸盐核组成的组的核。
在一些实施例中，第一可检测部分和第二可检测部分具有相隔至少10nm的最大吸光度(λmax)。在一些实施例中，第一可检测部分和第二可检测部分具有相隔至少15nm的最大吸光度(λmax)。在一些实施例中，第一可检测部分和第二可检测部分具有相隔至少20nm的最大吸光度(λmax)。在一些实施例中，第一可检测部分和第二可检测部分具有相隔至少30nm的最大吸光度(λmax)。在一些实施例中，第一可检测部分和第二可检测部分具有相隔至少35nm的最大吸光度(λmax)。在一些实施例中，第一可检测部分和第二可检测部分具有相隔至少40nm的最大吸光度(λmax)。在一些实施例中，第一可检测部分和第二可检测部分具有相隔至少45nm的最大吸光度(λmax)。在一些实施例中，第一可检测部分和第二可检测部分具有相隔至少50nm的最大吸光度(λmax)。在一些实施例中，第一可检测部分和第二可检测部分包含选自由香豆素核、七甲川菁核和克酮酸盐核组成的组的核。
本公开的第二方面是一种使置于基底上的生物学样本内的一个或多个靶标可视化的方法，该方法包括：用第一可检测部分标记第一生物标志物标志物，其中该第一可检测部分包含选自由香豆素核、七甲川菁核和克酮酸盐核组成的组的核；以及用具有在约400nm与约700nm之间的一个或多个峰吸收波长的至少一种常规染料对置于该基底上的该生物学样本进行染色，其中该第一可检测部分的峰吸收波长与一种或多种常规染料的该一个或多个峰吸收波长至少相隔20nm。
在一些实施例中，第一可检测部分在紫外光谱内。在一些实施例中，第一可检测部分在红外光谱内。
在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约430nm的峰吸收波长。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约400nm的峰吸收波长。在一些实施例中，第一可检测部分具有大于约670nm的峰吸收波长。在一些实施例中，第一可检测部分具有大于约700nm的峰吸收波长。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约430nm但大于约400nm的峰吸收波长，并且其中一种或多种常规染料的一个或多个峰吸收波长大于约430nm。在一些实施例中，第一可检测部分具有大于约670nm但小于约700nm的峰吸收波长，并且其中一种或多种常规染料的一个或多个峰吸收波长小于约670nm。
在一些实施例中，该方法其进一步包括：用第二可检测部分标记第二生物标志物。在一些实施例中，第二可检测部分具有小于约200nm(例如，小于约150nm、小于约100nm、小于约70nm等)的FWHM和小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)，并且其中第一检测部分和第二可检测部分是不同的。在一些实施例中，第二可检测部分在紫外光谱范围内或红外光谱范围内。在一些实施例中，第二可检测部分在紫外光谱范围内。在一些实施例中，第一可检测部分和第二可检测部分具有相隔至少20nm的最大吸光度(λmax)。在一些实施例中，第一可检测部分和第二可检测部分具有相隔至少30nm的最大吸光度(λmax)。
在一些实施例中，第一可检测部分选自由以下项组成的组：
其中符号是指可检测部分与可检测缀合物的另一部分缀合的位点。
本公开的第三方面是一种置于基底上的染色生物学样本(例如，单个染色连续组织切片)，该染色生物学样本包含用第一可检测部分标记的第一生物标志物；其中该第一可检测部分具有小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)；并且其中该染色生物学样本用至少一种常规染料进行染色，其中该至少一种常规染料具有在可见光谱内的一个或多个峰吸收波长。
在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约70nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分的FWHM小于约60nm。在一些实施例中，第一可检测部分的FWHM小于约50nm。在一些实施例中，第一可检测部分的FWHM小于约40nm。
在一些实施例中，至少一种常规染料包括苏木精。在一些实施例中，至少一种常规染料包括伊红。在一些实施例中，至少一种常规染料包括苏木精和伊红。在一些实施例中，至少一种常规染料选自由以下项组成的组：酸性品红、阿尔新蓝8GX、茜素红S、金胺O、偶氮胭脂红B、偶氮胭脂红G、天青A、天青B、天青C、碱性品红、俾斯麦棕Y、亮甲酚蓝、亮绿、胭脂红、氯唑黑E、刚果红、甲酚紫、结晶紫、达罗红、乙基绿、固绿FCF、异硫氰酸荧光素、姬姆萨染色剂、靛蓝胭脂红、詹纳斯绿B、哲纳尔氏染色素1899、浅绿SF、孔雀石绿、马休黄、甲基橙、甲基紫2B、亚甲蓝、亚甲蓝、亚甲紫(Bernthsen)、中性红、苯胺黑、尼罗蓝A、核固红、油红O、橙黄G、橙黄II、地衣红、副品红、根皮红B、蛋白银S、派洛宁B、派洛宁Y、刃天青、玫瑰红、番红O、苏丹黑B、苏丹III、苏丹IV、四铬染色(MacNeal)、硫堇、甲苯胺蓝、Weigert 1878、瑞氏色素及它们的组合。
在一些实施例中，染色生物学样本进一步包含用第二可检测部分标记的第二生物标志物，其中该第二可检测部分具有小于约200nm(例如，小于约150nm、小于约100nm、小于约70nm等)的FWHM和小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)，并且其中第一可检测部分和第二可检测部分是不同的。在一些实施例中，第二可检测部分在紫外光谱范围内或红外光谱范围内。在一些实施例中，第二可检测部分在紫外光谱范围内。在一些实施例中，第一可检测部分和第二可检测部分具有相隔至少20nm的最大吸光度(λmax)。在一些实施例中，第一可检测部分和第二可检测部分具有相隔至少30nm的最大吸光度(λmax)。
在一些实施例中，染色生物学样本进一步包含用第三可检测部分标记的第三生物标志物，其中该第三可检测部分具有小于约200nm(例如，小于约150nm、小于约100nm、小于约70nm等)的FWHM和小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)，并且其中第一可检测部分、第二可检测部分和第三可检测部分是不同的。在一些实施例中，第三可检测部分在紫外光谱内或红外光谱内。在一些实施例中，第三可检测部分在紫外光谱内。在一些实施例中，第一可检测部分、第二可检测部分和第三可检测部分具有相隔至少20nm的最大吸光度(λmax)。在一些实施例中，第一可检测部分、第二可检测部分和第三可检测部分具有相隔至少30nm的最大吸光度(λmax)。
本公开的第四方面是一种置于基底上的染色生物学样本(例如，单个连续组织切片)，该染色生物学样本包含用第一可检测部分标记的第一生物标志物；其中第一可检测部分具有小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)；其中该染色生物学样本至少用苏木精进行染色。在一些实施例中，染色生物学样本进一步用伊红进行染色。
在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约70nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分的FWHM小于约60nm。在一些实施例中，第一可检测部分的FWHM小于约50nm。在一些实施例中，第一可检测部分的FWHM小于约40nm。
在一些实施例中，染色生物学样本进一步用除苏木精和伊红外的至少一种常规染料进行染色。在一些实施例中，至少一种常规染料包括苏木精。在一些实施例中，至少一种常规染料选自由以下项组成的组：酸性品红、阿尔新蓝8GX、茜素红S、金胺O、偶氮胭脂红B、偶氮胭脂红G、天青A、天青B、天青C、碱性品红、俾斯麦棕Y、亮甲酚蓝、亮绿、胭脂红、氯唑黑E、刚果红、甲酚紫、结晶紫、达罗红、乙基绿、固绿FCF、异硫氰酸荧光素、姬姆萨染色剂、靛蓝胭脂红、詹纳斯绿B、哲纳尔氏染色素1899、浅绿SF、孔雀石绿、马休黄、甲基橙、甲基紫2B、亚甲蓝、亚甲蓝、亚甲紫(Bernthsen)、中性红、苯胺黑、尼罗蓝A、核固红、油红O、橙黄G、橙黄II、地衣红、副品红、根皮红B、蛋白银S、派洛宁B、派洛宁Y、刃天青、玫瑰红、番红O、苏丹黑B、苏丹III、苏丹IV、四铬染色(MacNeal)、硫堇、甲苯胺蓝、Weigert 1878、瑞氏色素及它们的组合。
在一些实施例中，染色生物学样本进一步包含用第二可检测部分标记的第二生物标志物，其中该第二可检测部分具有小于约200nm(例如，小于约150nm、小于约100nm、小于约70nm等)的FWHM和小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)，并且其中第一可检测部分和第二可检测部分是不同的。在一些实施例中，第二可检测部分在紫外光谱范围内或红外光谱范围内。在一些实施例中，第二可检测部分在紫外光谱范围内。在一些实施例中，第一可检测部分和第二可检测部分具有相隔至少20nm的最大吸光度(λmax)。在一些实施例中，第一可检测部分和第二可检测部分具有相隔至少30nm的最大吸光度(λmax)。
本公开的第五方面是一种置于基底上的染色生物学样本(例如，单个连续组织切片)，该染色生物学样本包含用第一可检测部分标记的第一生物标志物；其中该第一可检测部分具有小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)；其中该染色生物学样本用至少一种特殊染色剂进行染色，该特殊染色剂包括在可见光谱内可检测的一种或多种组分。
在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约70nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分的FWHM小于约60nm。在一些实施例中，第一可检测部分的FWHM小于约50nm。在一些实施例中，第一可检测部分的FWHM小于约40nm。
在一些实施例中，特殊染色剂为Van Gieson染色剂。在一些实施例中，特殊染色剂包括甲苯胺蓝。在一些实施例中，特殊染色剂包括阿尔坎蓝。在一些实施例中，特殊染色剂包括Masson三色。在一些实施例中，特殊染色剂包括Azan三色。在一些实施例中，特殊染色剂包括抗酸。
在一些实施例中，第一可检测部分选自由香豆素核、七甲川菁核和克酮酸盐核组成的组。
在一些实施例中，染色生物学样本进一步包含用第二可检测部分标记的第二生物标志物，其中该第二可检测部分具有小于约200nm(例如，小于约150nm、小于约100nm、小于约70nm等)的FWHM和小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)，并且其中第一可检测部分和第二可检测部分是不同的。在一些实施例中，第二可检测部分在紫外光谱范围内或红外光谱范围内。在一些实施例中，第二可检测部分在紫外光谱范围内。在一些实施例中，第一可检测部分选自由香豆素核、七甲川菁核和克酮酸盐核组成的组。
本公开的第六方面是一种置于基底上的染色生物学样本，该染色生物学样本包含用第一可检测部分标记的第一生物标志物；其中该第一可检测部分具有小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)；其中该染色生物学样本用至少一种常规染料进行染色，其中该至少一种常规染料具有在可见光谱内的一个或多个峰吸收波长，其中生物学样本通过以下来制备：使该生物学样本与对该第一生物标志物具有特异性的第一一抗接触；使该生物学样本与对该第一一抗具有特异性的第一二抗接触，其中该第一二抗与酶缀合；以及使该生物学样本与第一可检测缀合物接触，该第一可检测缀合物包含：(a)酪酰胺部分、醌甲基化物部分、或者酪酰胺部分或醌甲基化物部分的衍生物或类似物；和(b)该第一可检测部分。
在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约70nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分的FWHM小于约60nm。在一些实施例中，第一可检测部分的FWHM小于约50nm。在一些实施例中，第一可检测部分的FWHM小于约40nm。
在一些实施例中，一种或多种常规染料包括苏木精。在一些实施例中，一种或多种常规染料包括伊红。在一些实施例中，一种或多种常规染料包括苏木精和伊红。在一些实施例中，一种或多种常规染料选自由以下项组成的组：酸性品红、阿尔新蓝8GX、茜素红S、金胺O、偶氮胭脂红B、偶氮胭脂红G、天青A、天青B、天青C、碱性品红、俾斯麦棕Y、亮甲酚蓝、亮绿、胭脂红、氯唑黑E、刚果红、甲酚紫、结晶紫、达罗红、乙基绿、固绿FCF、异硫氰酸荧光素、姬姆萨染色剂、靛蓝胭脂红、詹纳斯绿B、哲纳尔氏染色素1899、浅绿SF、孔雀石绿、马休黄、甲基橙、甲基紫2B、亚甲蓝、亚甲蓝、亚甲紫(Bernthsen)、中性红、苯胺黑、尼罗蓝A、核固红、油红O、橙黄G、橙黄II、地衣红、副品红、根皮红B、蛋白银S、派洛宁B、派洛宁Y、刃天青、玫瑰红、番红O、苏丹黑B、苏丹III、苏丹IV、四铬染色(MacNeal)、硫堇、甲苯胺蓝、Weigert 1878、瑞氏色素及它们的组合。
在一些实施例中，第一可检测部分在紫外光谱内。在一些实施例中，第一可检测部分在红外光谱内。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约430nm的峰吸收波长。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约400nm的峰吸收波长。在一些实施例中，第一可检测部分具有大于约670nm的峰吸收波长。在一些实施例中，第一可检测部分具有大于约700nm的峰吸收波长。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约430nm但大于约400nm的峰吸收波长，并且其中一种或多种常规染料的一个或多个峰吸收波长大于约430nm。
在一些实施例中，染色生物学样本进一步包含用第二可检测部分标记的第二生物标志物；其中第二可检测部分具有小于约200nm(例如，小于约150nm、小于约100nm、小于约70nm等)的FWHM和小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)。在一些实施例中，染色生物学样本通过以下来制备：使生物学样本与对第二生物标志物具有特异性的第二一抗接触；使该生物学样本与对该第二一抗具有特异性的第二二抗接触，其中该第二二抗与酶缀合；以及使该生物学样本与第二可检测缀合物接触，该第二可检测缀合物包含：(a)酪酰胺部分、醌甲基化物部分、或者酪酰胺部分或醌甲基化物部分的衍生物或类似物；和(b)该第二可检测部分。
本公开的第七方面是一种置于基底上的染色生物学样本，该染色生物学样本包含用第一可检测部分标记的第一生物标志物；其中该第一可检测部分具有小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)；其中该染色生物学样本用至少一种常规染料进行染色，其中该至少一种常规染料具有在可见光谱内的一个或多个峰吸收波长，其中生物学样本通过以下来制备：使该生物学样本与对该第一生物标志物具有特异性的第一一抗接触；使该生物学样本与对该第一一抗具有特异性的第一二抗接触，其中该第一二抗与酶缀合；使该生物学样本与第一组织反应性部分接触，该第一组织反应性部分包括：(a)酪酰胺部分、醌甲基化物部分、或者酪酰胺部分或醌甲基化物部分的衍生物或类似物；和(b)能够参与点击化学反应的第一反应性官能团；使该生物学样本与第一可检测缀合物接触，该第一可检测缀合物包含：(a)该第一可检测部分；和(b)第二反应性官能团。
在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约70nm的FWHM。在一些实施例中，第一可检测部分的FWHM小于约60nm。在一些实施例中，第一可检测部分的FWHM小于约50nm。在一些实施例中，第一可检测部分的FWHM小于约40nm。
在一些实施例中，一种或多种常规染料包括苏木精。在一些实施例中，一种或多种常规染料包括伊红。在一些实施例中，一种或多种常规染料包括苏木精和伊红。在一些实施例中，一种或多种常规染料选自由以下项组成的组：酸性品红、阿尔新蓝8GX、茜素红S、金胺O、偶氮胭脂红B、偶氮胭脂红G、天青A、天青B、天青C、碱性品红、俾斯麦棕Y、亮甲酚蓝、亮绿、胭脂红、氯唑黑E、刚果红、甲酚紫、结晶紫、达罗红、乙基绿、固绿F C F、异硫氰酸荧光素、姬姆萨染色剂、靛蓝胭脂红、詹纳斯绿B、哲纳尔氏染色素1899、浅绿SF、孔雀石绿、马休黄、甲基橙、甲基紫2B、亚甲蓝、亚甲蓝、亚甲紫(Bernthsen)、中性红、苯胺黑、尼罗蓝A、核固红、油红O、橙黄G、橙黄II、地衣红、副品红、根皮红B、蛋白银S、派洛宁B、派洛宁Y、刃天青、玫瑰红、番红O、苏丹黑B、苏丹III、苏丹IV、四铬染色(MacNeal)、硫堇、甲苯胺蓝、Weigert 1878、瑞氏色素及它们的组合。
在一些实施例中，第一可检测部分在紫外光谱内。在一些实施例中，第一可检测部分在红外光谱内。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约430nm的峰吸收波长。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约400nm的峰吸收波长。在一些实施例中，第一可检测部分具有大于约670nm的峰吸收波长。在一些实施例中，第一可检测部分具有大于约700nm的峰吸收波长。在一些实施例中，第一可检测部分具有小于约430nm但大于约400nm的峰吸收波长，并且其中一种或多种常规染料的一个或多个峰吸收波长大于约430nm。
在一些实施例中，染色生物学样本进一步包含用第二可检测部分标记的第二生物标志物；其中第二可检测部分具有小于约200nm(例如，小于约150nm、小于约100nm、小于约70nm等)的FWHM和小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)。在一些实施例中，染色生物学样本通过以下来制备：使该生物学样本与对第一生物标志物具有特异性的第二一抗接触；使该生物学样本与对该第二一抗具有特异性的第二二抗接触，其中该第二二抗与酶缀合；使该生物学样本与第二组织反应性部分接触，该第二组织反应性部分包括：(a)酪酰胺部分、醌甲基化物部分、或者酪酰胺部分或醌甲基化物部分的衍生物或类似物；和(b)能够参与点击化学反应的第一反应性官能团；使该生物学样本与第二可检测缀合物接触，该第二可检测缀合物包含：(a)第二可检测部分；和(b)第二反应性官能团。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在提出请求并支付必要的费用后，将向专利局提供带有彩色附图的专利或专利申请公布的拷贝。
图1A和图1B示出根据本公开的一个实施例的检测与一种或多种常规染料和生物学样品中用一个或多个可检测部分标记的一种或多种生物标志物对应的信号的方法。
图2A示出根据本公开的一个实施例的用可检测部分标记生物学样本中的一种或多种生物标志物的方法。
图2B示出根据本公开的一个实施例的用可检测部分标记生物学样本中的一种或多种生物标志物的方法。
图3示出根据本公开的一个实施例的检测与一种或多种常规染料和生物学样品中用一个或多个可检测部分标记的一种或多种生物标志物对应的信号的方法，其中该方法利用可检测缀合物，该可检测缀合物包含：(i)可检测部分和(ii)酪酰胺部分、酪酰胺部分的衍生物、醌甲基化物部分或醌甲基化物部分的衍生物。
图4示出根据本公开的一个实施例的包括醌甲基化物部分的缀合物的沉积。
图5示出根据本公开的一个实施例的包含酪酰胺部分的缀合物的沉积。
图6示出根据本公开的一个实施例的检测与一种或多种常规染料和生物学样品中的一种或多种生物标志物对应的信号的方法，其中该方法利用可检测缀合物，该可检测缀合物包含：(i)可检测部分和(ii)能够参与点击化学反应的反应性官能团。
图7示出根据本公开的一个实施例的包括醌甲基化物部分的缀合物的沉积。
图8示出根据本公开的一个实施例的包含酪酰胺部分的缀合物的沉积。
图9示出苏木精和伊红的吸光度以及对应视觉响应，表明苏木精和伊红在可见光谱内吸收，但吸光度在深蓝色/UV中降低并且在近IR中最小。
图10A至图10C示出几个可检测部分的峰吸收波长。特别地，图10A和图10B示出与苏木精和伊红相比的几个可检测部分的峰吸收波长。
图11描绘了透射通过福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)正常胰腺组织的光的单色图像，该正常胰腺组织用苏木精加伊红(“H&E”)进行染色并且也在针对突触素的存在的IHC测定中使用Cy7(花青7)色原进行染色。左侧的图像使用513nm LED照射，其中吸光度主要由伊红引起。中心图像用620nm LED照射，其中吸光度主要由苏木精引起。右侧的图像用770nm LED照射，其中吸光度主要由Cy7引起并指示突触素表达。
图12提供了用使用Cy7色原的突触素IHC以及H&E两者染色的FFPE正常胰腺组织的彩色合成图像。左侧的合成图像由在513nm(主要被伊红吸收)和620nm(主要被苏木精吸收)处透射的光形成，模拟在白光下通过显微镜目镜观察时的视觉外观。右侧的合成图像通过将在770nm处透射(被Cy7吸收)并指示突触素表达的不可见光添加到左侧的H&E合成图像而形成。
图13示出透射通过FFPE扁桃体组织的光的单色图像，该扁桃体组织用使用DCC色原的CD20 IHC、使用Cy7色原的CD8 IHC以及H&E进行染色。左上方的图像使用513nm LED照射，其中吸光度主要由伊红引起。右上方的图像使用620nm LED照射，其中吸光度主要由苏木精引起。左下方的图像用415nm LED照射，其中吸光度主要由DCC引起并指示CD20表达。右下方的图像用770nm LED照射，其中吸光度主要由Cy7引起并指示CD8表达。
图14列出了FFPE扁桃体组织的彩色合成图像，该扁桃体组织用使用DCC色原的CD20 IHC、使用Cy7色原的CD8 IHC以及H&E进行染色。左侧的合成图像由在513nm(主要被伊红吸收)和620nm(主要被苏木精吸收)处透射的光形成，模拟在白光下通过显微镜目镜观察时的视觉外观。中间的合成图像通过将在415nm处透射(主要被DCC吸收)并指示CD20表达的不可见光(伪彩色黑色)添加到左侧的H&E合成图像而形成。右侧的合成图像通过将在770nm处透射(被Cy7吸收)并指示CD8表达的不可见光(伪彩色黑色)添加到左侧的H&E合成图像而形成。
图15提供了用使用DCC色原的CD20 IHC、使用Cy7色原的CD8IHC以及H&E进行染色的FFPE扁桃体组织的吸光度光谱，表明DCC和Cy7吸光度被很好地间隔并且可与强苏木精和伊红吸光度区分。
图16示出透射通过FFPE结肠肿瘤组织的光的单色图像，该结肠肿瘤组织用使用HCCA色原的CD3 IHC、使用Cy7色原的CD8 IHC以及H&E进行染色。左上方的图像用390nm LED照射，其中吸光度主要由HCCA引起并指示CD3表达。右上方的图像用770nm LED照射，其中吸光度由Cy7引起并指示CD8表达。左下方的图像用513nm LED照射，其中吸光度主要由伊红引起。右上方的图像使用620nm LED照射，其中吸光度主要由苏木精引起。
图17列出了FFPE结肠肿瘤组织的彩色合成图像，该结肠肿瘤组织用使用HCCA色原的CD3 IHC、使用Cy7色原的CD8 IHC以及H&E进行染色。左上方的合成图像由在513nm(主要被伊红吸收)和620nm(主要被苏木精吸收)处透射的光形成，模拟在白光下通过显微镜目镜观察时的视觉外观。右上方的合成图像通过将在390nm处透射(主要被HCCA吸收)并指示CD3表达的不可见光(伪彩色黑色)添加到H&E合成图像而形成。降低H&E吸光度以改善与CD3染色剂的对比度。左下方的合成图像通过将在770nm处透射(被Cy7吸收)并指示CD8表达的不可见光(伪彩色黑色)添加到H&E合成图像而形成。降低H&E吸光度以改善与CD3染色剂的对比度。右下方的合成图像通过将CD3单色图像(伪彩色品红色)与CD8单色图像(伪彩色青色)组合而形成，从而由于CD3和CD8共表达而将CD3+/CD8-细胞显示为品红色并将CD3+/CD8+细胞显示为蓝色的相加色。注意缺少青色细胞，因为CD8不单独在t细胞上表达。
图18描绘了使用具有不同彩色图像不透明度的双相机系统的彩色相机(可见白光照射)和单色相机(770nm LED照射)图像的叠加，其记录在用使用Cy7色原的ERBB2(HER2)IHC以及H&E染色的FFPE乳腺肿瘤异种移植物上。叠加图像从左到右从100％彩色图像不透明度(仅H&E染色剂可见)进展到0％彩色图像不透明度(仅Cy7染色剂可见，识别ERBB2表达)，具有两个中间水平的不透明度。
图19提供了用常规巴氏(PAP)染色剂进行染色的宫颈细胞学样本的吸光度光谱，显示PAP染色剂在可见光谱上吸收，但吸光度在深蓝/UV中降低并在近IR中最小。
图20描绘了用使用DCC色原的Ki67 IHC、使用Cy7色原的p16 IHC以及PAP染色剂进行染色的宫颈细胞学样本的图像，用双相机系统记录。左上方的图像在白光照射下用彩色相机记录，显示PAP染色剂。顶部中心图像用405nm LED照射的单色相机记录，其中吸光度主要是由DCC引起并指示Ki67表达。右上方的图像用770nm LED照射的单色相机记录，其中吸光度由Cy7引起并指示p63表达。图像右下象限中的长细胞簇显示Ki67和p16两者的表达，指示异常。下方图像是通过将Ki67和p16图像与伪着色相结合而构建的彩色合成。左下方图像显示Ki67伪彩色品红色和p16伪彩色青色。异常细胞较暗，颜色范围从品红色到蓝色(相加色)到青色，取决于每个细胞中的相对表达水平。右下方图像显示Ki67伪彩色红色和p16伪彩色，以使用传统色原模拟商业测定的视觉颜色。
图21提供了用使用DCC色原的Ki67 IHC、使用Cy7色原的p16 IHC以及PAP染色剂进行染色的宫颈细胞学载玻片的图像，用双相机系统记录。左上方的图像在白光照射下用彩色相机记录，显示PAP染色剂。顶部中心图像用405nm LED照射的单色相机记录，其中吸光度主要是由DCC引起并指示Ki67表达。右上方的图像用770nm LED照射的单色相机记录，其中吸光度由Cy7引起并指示p63表达。图像左中部分中的四个细胞的簇显示Ki67和p16的表达，指示异常。
图22示出几种常规染料的吸光度光谱，诸如在特殊染色剂中使用的常规染料，包括耐酸细菌(AFB)、三色蓝(Tri Blue)、三色绿(Tri Green)、琼斯H&E(Jones HE)和琼斯浅绿(Jones LG)。
图23列出了用使用Cy7色原的靶向MART-1/melan A的IHC和H&E两者进行染色的黑色素瘤FFPE组织的图像，记录在双相机系统上。左侧的图像在白光照射下用彩色相机记录，显示H&E染色剂和棕色黑色素的存在。右侧的图像用770nm LED照射的单色相机记录，显示MART1/melanA染色和减少的黑色素干扰。
图24描绘了用使用Cy7色原的ISH靶向kappa mRNA以及H&E染色的FFPE扁桃体组织的图像，记录在双相机系统上。左侧的图像在白光照射下用彩色相机记录，显示H&E染色剂。右侧的图像用770nm LED照射的单色相机记录，显示kappa mRNA的存在。
图25列出了用CD8 IHC进行染色的扁桃体FFPE组织的图像，在顶部的一对图像中使用Cy7-醌甲基化物色原并且在底部的一对图像中使用AMCA-酪酰胺色原。使用双相机系统，在白光照射下用彩色相机记录的图像呈现在左侧，并且用使用770nm照射(其中Cy7吸收)的单色相机记录的图像呈现在右侧，显示不同的色原化学物质可以用于沉积不可见色原(注意：其他实例使用点击化学和酪酰胺-炔烃点击配偶体)。
图26A提供了示出使用单个单色照相机的多光谱成像的流程图。通过以下项提供多个不同波长的照射通道：(1)连续光源(例如，钨灯、氙灯、汞灯、金属卤化物灯)和滤光器，它们被选择为通过与应用到样本的每个色原或染料的吸光度对准的光带；和/或(2)发射带类似地与色原和染料吸光度对准的发光二极管(LED)，具有或不具有用于进一步定义LED光发射的滤光器。波长在相邻色原中间的附加光通道可以用于过采样。载玻片固定的样本被放置在显微镜载物台上，并用期望的的光通道或用来自连续光源的白光或模拟白光的LED的组合进行观察，并选择显微镜视场用于成像(步骤1)。在过程中，选择光通道强度和相机曝光时间以利用相机的动态范围(步骤2)。然后用期望的的光通道对样本进行顺序照射，同时针对每个光通道记录透射通过样本的光的单色图像(步骤3)。如果记录大于单个显微镜视场的区域，例如，整个样本或整个载玻片扫描，则将载物台移动到期望的区域内的相邻视场，并重复顺序照射和成像。载物台移动、照射和成像可以由计算机协调，以生成单个显微镜视场或较大的整个样本或整个载玻片区域的自动记录的多光谱图像(步骤4)。对于平场(校正显微镜视场内的照射强度差异)或对透射和吸光度图像的计算，在相同的光强度和曝光时间下针对载玻片的空白区域(无组织)或未染色组织样本重复成像程序(步骤5)。空白图像可以在样本成像之前或之后记录或者可以在对空白图像进行平均之前和之后执行。然后，如“图像处理和合成图像形成”流程图(图26E)中总结的那样处理图像(步骤6)。
图26B提供了利用单个单色相机的多光谱成像系统的示意图。
图26C提供了阐明用彩色和单色相机进行双相机观察和成像的流程图。为了使用双相机系统观察和记录图像，将样本载玻片放置在显微镜载物台上(步骤1)并打开白光和期望的的不可见照射通道(步骤2)。在计算机显示器上同时观察常规染色剂和单色生物标志物图像的实时彩色图像(步骤3)，并针对最佳曝光选择图像采集时间(步骤4)。可以叠加两个图像(可选的)并调整不透明度以识别单色和彩色图像中的相同细胞，在常规染色剂的完整背景内观察生物标志物表达(步骤5)。整个样本可以通过手动载物台移动进行评估，就像病理学家通常对临床样本执行的那样，在计算机显示器上观察常规染色剂和生物标志物，还可以选择直接通过目镜观察常规染色剂(步骤6)。可以记录单个样本视场的彩色和单色图像，用于存档目的、合成图像形成和/或用于定量分析(步骤7)。图像处理可以如“图像处理和合成图像形成”流程图(图26E)所示执行。
图26D提供了针对使用彩色和黑白相机进行双相机观察和成像的示意图。双相机系统利用两个相机(一个彩色和一个单色)来对吸收可见光谱内的光的常规染色剂和吸收可见光谱之外或在可见光谱边缘处的光的IHC沉积的色原同时进行观察和成像。据信，双相机方法的关键是能够在显微镜的照射端将宽带白光与不可见光带结合并且然后将透射通过样本的可见光和不可见光分开，从而将可见光引导至彩色相机并将不可见光引导至单色相机。在图26D所示的示意图中，白光由钨连续光源(A)产生，使用滤光器去除UV和远红外光并且仅透射可见光。包括经滤光以去除近IR光的钨灯发射光谱(参见图26D，曲线A)。不可见光带由LED(具有或不具有光学滤光以缩小光带)或与配备有单带通滤光器(B)的滤光轮相结合的钨灯产生。可见白光和不可见光束与部分反射光学元件(分光器，C)结合。图中包括深蓝/UV和远红外/近IR发射二极管的光谱(参见图26D，曲线B)。部分反射光学元件的实例是具有中性密度涂层(基本上与波长无关)的玻璃板，该涂层反射约50％的以约45°入射的光并透射约50％的以约45°入射的光。另选地，反射元件可以具有二向色涂层(依赖于波长的透射/反射)，针对更大的光通量，该涂层被设计为透射约100％的以约45°入射的可见光并反射约100％的以约45°入射的UV和远红外/近IR光。图中包括了此类分光器的透射光谱(参见图26D，曲线C)。可以在反射器设计中控制在不同波长处的相对反射，以改变引导至样本的每个光带的相对量。在通过样本和物镜之后，使用另一部分反射光学元件将光分成两部分(每个部分被引导至不同的相机)，该另一部分反射光学元件可以具有与第一分光器相同的光谱特性。在约50％中性密度分光器的情况下，一半的光透射到彩色相机，并且一半反射到单色相机(基本上与波长无关)。在二向色分光器的情况下，可见光透射到彩色相机，而UV和远红外/近IR光反射到单色相机。中性密度分光器需要滤光器D和E，以确保仅可见光到达彩色相机并且仅UV和远红外/近IR光分别到达单色相机。图中提供了可能的滤光器透射光谱图(参见图26，曲线D和曲线E)，分别对应于彩色相机(D)滤光器和单色相机(E)滤光器。每个相机获取的显微镜视场图像呈现在计算机显示器上。可以以视频速率获取图像，因此可见光(如显微镜人员通过目镜观察时那样观察为彩色)和不可见光(观察为单色图像)并排或重叠呈现。也可以通过目镜进行肉眼观察，在目镜(F)处进行光学滤光以仅透射来自钨显微镜灯的可见光并阻挡不可见光(参见图26D，透射曲线F)，从而提供附加的眼睛保护。另选地，目镜可以用不允许用肉眼观察的镜筒透镜代替。注意，可以使用其他连续光源，例如，氙灯或汞弧灯或金属卤化物灯或可见LED的组合。可以使用其他不可见光源，包括用带通滤光器和激光二极管光学滤光的连续光源。此外，一些应用程序使用两个单色相机(每个显示不同的生物标志物表达图案)或具有不同光学滤光的两个彩色相机，而不是每种相机类型一个。与单个单色相机系统(见图26A)一样，多个单个显微镜视场的图像可以组合成更大的感兴趣区域，包括整个样本和整个载玻片扫描。可以通过只需使用具有中性密度分光器或去除分光器的单色相机或根据单色相机的安装位置使用100％反射镜来将双相机系统作为单个单色相机系统使用，以便提供对全光谱的访问。
图26E阐明了示出图像处理和将图像组合成合成图像的流程图。使用的照射通道(λ1，λ2，...λn)的数量(n)至少等于多重IHC中使用的不同染色剂(S1，S2，...Sn)的数量，其中染色剂包括色原和常规染色组分(例如，苏木精和伊红)。选择照射通道以强调每种染色剂，例如，以将照射通道定位在每种染色剂的峰吸光度附近。可以添加定位在吸收峰之间的附加通道以改善解混，称为过采样(图26E中未描绘)。第一步是通过在每个通道(样本图像λ1等)处透射通过样本的光的图像除以对应空白图像(无组织或未染色组织；空白图像λ1等)来针对每个照射通道生成透射(T)图像。样本图像的像素值表示在该位置(I)处透射通过样本的光的强度，并且空白图像的像素值表示在该位置(I0)处入射到样本上的光的强度。所有操作都在逐个像素的基础上执行。T图像的所得像素值应在0与1(I/I0)之间的范围，需要浮点像素值。取T图像像素的对数并将像素乘以-1以提供吸光度(A)图像(A＝-log[T])。吸光度(此处也称为光密度(OD))很有价值，因为根据比尔定律，它与浓度成正比，并且对于量化和光谱解混中使用的线性算法是必需的。光谱解混是通过去除具有重叠吸光度光谱的其他染色剂的光谱贡献(重叠吸光度通常称为光谱串扰)来生成仅包含由一种染色剂引起的吸光度的“纯”单个图像的过程。这些在串扰校正之后的纯染色剂图像在此处称为解混图像(U图像S1等)。如果多重测定中使用的各种染色剂的吸收峰按波长很好地间隔，则串扰可能太小而无需解混以提供表示单个染色剂浓度的值，然而，随着多重化阶数的增加和光谱分离减少，解混变得必要。与染色剂浓度成正比，U图像可以直接用于量化，类似于像素值也与荧光染色剂浓度成正比的荧光图像。光谱解混程序描述于Morrison LE，Lefever MR，Behman LJ，Leibold T，Roberts EA，Horchner UB，Bauer DR(2020)BrightfieldMultiplex Immunohistochemistry with Multispectral Imaging.Lab Invest.https://doi.org/10.1038/s41374-020-0429-0及其中的参考文献。U图像可以另外用于形成合成图像。如果串扰足够小以提供可接受的合成，则在解混之前的A图像可以用于合成图像形成，从而节省附加的计算时间和针对光谱解混所需的增加的复杂性(参见先前的评论)。与每种染色剂(S1，S2，...Sn)对应的U图像被复制两次，以形成每种染色剂对最终合成图像的R、G、B平面的贡献，在流程图中标记为R图像S1、R图像S2、......、G图像S1、G图像S2、......以及B图像S1、B图像S2、......。每个图像副本都乘以放大因子“a”和颜色加权因子“C”。小于1的放大因子降低染色剂对最终合成图像的贡献，并且大于1的放大因子增加染色剂对合成图像的贡献。颜色加权因子在合成图像中提供染色剂的伪彩色，并且每种染色剂颜色的红色、绿色和蓝色分量的范围从0到1。例如，如果染色剂1(S1)是伪彩色红色，则颜色加权因子在用于生成R图像、G图像和B图像的荧光样合成图像表示中分别为CR1＝1、CG1＝0和CB1＝0。对于明视场样的图像表示，红色由CR1＝0、CG1＝1和CB1＝1的加权因子或者1减去针对同一颜色的荧光样加权因子产生。为了创建合成图像的最终红色图像平面(R平面)，将对针对每种染色剂的R图像求和。最终的绿色和蓝色图像平面(G平面和B平面)类似地分别通过对每种染色剂的G图像和B图像求和来创建。对于荧光样颜色表示(与浓度和吸光度成正比的值或A合成图像)，可以通过将每个平面除以集合的三个颜色平面的最大值来缩放三个颜色平面。对于8位彩色图像平面，最终的图像乘以255。对于明视场颜色表示(透射或T合成图像)，对求和的R图像、G图像和B图像分别乘以-1并取反对数。对于8位彩色图像平面，最终的图像平面乘以255。
图27提供了用粘蛋白胭脂红特殊染色剂进行染色的FFPE肺组织上记录的吸光度光谱，显示虽然粘蛋白胭脂红染色剂吸光度可能干扰iIHC色原在深蓝/UV光谱区域中进行吸收，但粘蛋白胭脂红吸光度不应干扰iIHC色原在远红外/近IR光谱区中进行吸收。
图28描绘了用TTF-1(IR870 iCDC)加p40(Cy7 iCDC)双iIHC和粘蛋白胭脂红特殊染色剂同时进行染色的肺肿瘤FFPE组织的双相机系统上记录的图像。粘蛋白胭脂红特殊染色剂的可见吸光度(左图)用彩色相机记录，并且远红外/近IR图像(中图和右图)用单色相机记录。顶部图像记录在腺癌组织上并显示TTF-1(右图)和粘蛋白(TTF-1表达细胞中细胞质的粉红色染色，左图)的表达，证实了腺癌分布。下方图像记录在鳞状细胞癌组织上并显示p40阳性细胞和最少的粘蛋白产生，证实了鳞状细胞癌分布。
图29示出用于从邻近的显色染色剂和常规染色剂中去除背景信号的光谱解混。多重测定中使用的各种染料的吸光度光谱可能具有明显的重叠(例如，参见图10中的光谱)，致使它们的吸光度在旨在仅记录单个染色剂的吸光度的图像中可见。光谱解混用于校正这种重叠并减少或去除干扰信号。这可以通过比较HCCA和Cy7色原(分别为图的左侧和右侧)的在光谱解混之前(顶部图像)的吸光度图像与光谱解混之后的图像(下图)来看出。解混的HCCA图像显示来自苏木精染色的细胞核的信号的显著减少。解混的Cy7图像没有显示明显的变化，因为苏木精在Cy7吸收的光谱区域中吸收很少。
图30示出多光谱成像和图像处理：NSCLC ADC FFPE组织加p40/TTF-1双重IHC中的合成彩色图像和光谱解混。图A：由在510nm(其中伊红主要吸收光)和599nm(其中苏木精吸收光)处记录的光谱解混的单色透射光图像形成的彩色合成图像(单色图像未示出)。图B和图C：在769nm(其中Cy7 CDC主要吸收光，染色p40(B))和880nm(其中ir870CDC吸收光，染色TTF-1(C))处的透射光的单色相机图像。图E和图F：p40(图E)和TTF-1(图F)的光谱解混图像。图D：由光谱解混的苏木精(未示出)和TTF-1(图F)图像形成的双色合成图像。使用20X物镜记录图像。
具体实施方式
本发明公开了可检测部分和包含一个或多个可检测部分的可检测缀合物。在一些实施方案中，所公开的可检测部分具有窄波长并且适用于多重分析。
定义
如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一(a/an)”和“该/所述”包括复数个指代物。类似地，除非上下文另有明确指示，否则词语“或”旨在包括“和”。术语“包括”定义为包容性，如“包括A或B”是指包括A、B或A和B。
“包括”、“包含”、“具有”等术语可互换使用，且含义相同。类似地，“包括”、“包含”、“具有”等可互换使用并且具有相同的含义。具体而言，每个术语的定义都与普通美国专利法对“包括”的定义一致，因此每个术语都可理解为一个开放性术语，其含义为“至少以下”，并且也可理释为不排除额外的特征、限制、方面等。因此，例如“具有组件a、b和c的装置”是指所述装置至少包括组件a、b和c。同样，短语：“涉及步骤a、b和c的方法”是指所述方法至少包括步骤a、b和c。此外，尽管本文可以特定的顺序概述步骤和过程，但是本领域技术人员将认识到，所述顺序步骤和过程可能会有所不同。
如本文所用，碱性磷酸酶(AP)是一种通过破坏磷酸酯-氧键并且暂时形成中间酶-底物键来去除(通过水解)并且转移磷酸酯基团有机酯的酶。例如，AP将萘酚磷酸酯(底物)水解为酚类化合物和磷酸酯。酚类与无色重氮盐(色原)偶联，以产生不溶性有色偶氮染料。
如本文所用，术语“抗体”，有时缩写为“Ab”，是指免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，包括(例如)但不限于：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM及其组合；在任何脊椎动物(例如，在哺乳动物诸如人类、山羊、兔和小鼠等中)的免疫应答过程中产生的类似分子；以及特异性结合至感兴趣分子(或一组高度相似的感兴趣分子)并且基本上排除与其他分子的结合的抗体片段。“抗体”进一步是指至少包含轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体，其特异性识别并结合抗原的表位。抗体可由重链和轻链组成，每条重链和轻链均具有可变区，称为可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区。VH区和VL区共同负责结合由抗体识别的抗原。术语“抗体”还包括本领域中熟知的完整免疫球蛋白及其变体和部分。
如本文所用，术语“抗原”是指可以由特异性体液或细胞免疫的产物(诸如抗体分子或T细胞受体)特异性结合的化合物、组合物或物质。抗原可以是任何类型的分子，包括例如：半抗原、简单中间代谢物、糖(例如，寡糖)、脂质和激素以及大分子(诸如复合碳水化合物(例如，多糖)、磷脂、核酸和蛋白质)。
如本文所用，术语“生物学样本”可以为从包括但不限于单细胞生物体(诸如细菌、酵母、原生动物和变形虫等)、多细胞生物体(诸如植物或动物)的任何活生物体获得、由其排泄或分泌的任何固体或流体样品，包括来自健康或表观健康人类受试者或受待诊断或研究的病状或疾病诸如癌症影响的人类患者的样品。例如，生物学样本可以为从例如血液、血浆、血清、尿液、胆汁、腹水、唾液、脑脊液、房水或玻璃体获得的生物体液或任何身体分泌物、漏出液、渗出物(例如，从脓肿或任何其他感染或炎症部位获得的流体)或从关节(例如，正常关节或受疾病影响的关节)获得的流体。生物学样本也可以为从任何器官或组织获得的样品(包括活检或尸检样本，诸如肿瘤活检)，或者可包括细胞(无论是原代细胞还是培养细胞)或由任何细胞、组织或器官调节的培养基。在一些实例中，生物学样本为细胞核提取物。在某些实例中，样品为质量控制样品，诸如所公开的细胞沉淀切片样品中的一者。在其他实例中，样品为测试样品。样品可使用本领域普通技术人员已知的任何方法进行制备。样品可得自接受常规筛查的受试者，或得自疑似患有病症的受试者，诸如遗传异常、感染或瘤形成。本发明所公开的方法的所述实施例还可应用于无遗传异常、疾病、病症等的样品，这些样品称为“正常”样品。样品可包括可由一种或多种检测探针特异性结合的多个靶标。
如本文所用，术语“缀合物”是指共价连接至较大构建体的两个或更多个分子或部分(包括大分子或超分子)。在一些实施例中，缀合物包括共价连接至一个或多个其他分子部分的一种或多种生物分子(诸如肽、蛋白质、酶、糖、多糖、脂质、糖蛋白和脂蛋白)。
如本文所用，术语“偶联”是指一个分子或原子与另一分子或原子的结合、键合(例如，共价键合)或连接。
如本文所用，术语“可检测部分”可产生可检测(诸如视觉、电子或其他方式)信号的分子或材料，该可检测信号指示在样品中的标记的存在(即，定性分析)和/或浓度(即，定量分析)。
如本文所用，辣根过氧化物酶(HRP)是一种可以缀合至带标记分子的酶。当与适当的底物一起孵育时，其产生标记的分子的有色、荧光或发光衍生物，使其能够得到检测和定量。HRP在电子供体存在下发挥作用，首先形成酶底物复合物，然后作用以氧化电子供体。例如，HRP可作用于3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)以产生可检测的颜色。HRP也可以作用于带标记的酪酰胺缀合物或酪酰胺样反应性缀合物(即，阿魏酸盐、香豆酸、咖啡酸、肉桂酸盐、多巴胺等)，以沉积有色或荧光或无色报告部分，用于酪酰胺信号放大(TSA)。
如本文所用，术语“免疫组织化学”(IHC)是指通过检测抗原与特定结合剂或部分(诸如抗体)的相互作用来确定抗原在样品中的存在或分布的方法。在允许抗体-抗原结合的条件下，将包括抗原(诸如，靶抗原)的样品与抗体一起孵育。可以借助于与抗体缀合的可检测标记物(直接检测)或与针对一抗产生的二抗缀合的可检测标记物(例如，间接检测)来检测抗体-抗原结合。可检测标记物包括但不限于放射性同位素、荧光染料(诸如荧光素衍生物和罗丹明衍生物)、酶和显色分子。
如本文所用，术语“原位杂交”(ISH)类型的杂交使用标记的互补DNA或RNA链(即探针)将特定DNA或RNA序列定位在组织的一部分或切片(原位)中或者如果组织足够小(例如，植物种子、果蝇胚胎)，定位在整个组织(整装ISH)中。这与免疫组织化学不同，免疫组织化学将蛋白质定位在组织切片中。DNA ISH可以用于确定染色体的结构，诸如用于医学诊断以评估染色体完整性。RNA ISH(杂交组织化学)用于测量和定位组织切片或封片内的mRNA和其他转录本。对于杂交组织化学，样品细胞和组织通常经过处理以将靶转录本固定到位并增加探针对靶分子的访问。如上所述，探针为标记的互补DNA或互补RNA(核糖核酸探针)。探针在高温下与靶标序列杂交，并且然后洗掉多余的探针(在未杂交的过量RNA探针的情况下，任选地使用RNase水解)。可以操纵溶液参数(诸如温度、盐和/或洗涤剂浓度)，以去除任何不相同的相互作用(即只有精确的序列匹配将保持结合)。然后，已经被有效标记的标记探针(诸如用放射性、荧光或抗原标记的碱基(例如，地高辛)分别使用放射自显影、荧光显微镜或免疫组织化学在组织中进行定位和可能量化。
如本文所用，术语“多重”、“多重化的”或“多重化”是指同时、基本上同时或顺序检测样品中的多个靶标。多重化可以包括单独地和以任何和所有组合来鉴定和/或定量多种不同的核酸(例如，DNA、RNA、mRNA、miRNA)和多肽(例如，蛋白质)。
如本文所用，“醌甲基化物”是醌类似物，其中对应醌上的羰基氧中的一者被亚甲基基团(-CH2-)取代以形成烯烃。
如本文所用，术语“特异性结合实体”是指特异性结合对的成员。特异性结合对是特征在于彼此结合以实质性地排除与其他分子结合的分子对(例如，特异性结合对的结合常数可以比生物学样本中其他分子的结合对的两个成员中的任一者的结合常数大至少10- 3M、10-4M或10-5M)。特异性结合部分的特定实例包括特异性结合蛋白(例如，抗体、凝集素、抗生物素蛋白(诸如链霉抗生物素蛋白)和蛋白A)。特异性结合部分也可以包括由这种特异性结合蛋白特异性结合的分子(或其部分)。
如本文所用，术语“靶标”是指确定或可以确定存在、位置和/或浓度的任何分子。靶分子的实例包括蛋白质、核酸序列和半抗原，例如与蛋白质共价结合的半抗原。通常，使用一个或多个特异性结合分子的缀合物和一个可检测的标记来检测靶分子。
如本文所用，符号是指一个部分与另一部分键合的位置。
概述
申请人已经开发了一种用一种或多种常规染料对生物学样本进行染色(诸如“普通染色”或“特殊染色”)并用一个或多个可检测部分标记该生物学样本内的一种或多种生物标志物(在IHC或ISH测定中)的方法，其中用该常规染料进行染色和用该一个或多个可检测部分标记该生物标志物发生在同一生物学样本(诸如置于基底上的单个组织切片)上。结合常规染料使用本文所述的可检测部分有助于检测一种或多种标记的生物标志物，而不干扰对一种或多种常规染料的解释。
苏木精加伊红(H&E)是最常见的组织学染色剂，并提供最重要的癌症诊断之一。简单来说，H&E中的苏木精结合DNA内容物的区域，赋予所有细胞核呈现蓝色，而伊红将细胞质和结缔组织染成粉红色。实际上，H&E染色显著地更精细，提供复杂的染色模式和着色，使得可以区分许多细胞特征和细胞外特征。病理学家从支持诊断、预后和治疗反应预测的H&E染色组织中获得大量信息。
例如，一项研究使用接受免疫治疗的患者的H&E染色非小细胞肺癌(NSCLC)活检的10种不同组织学特征来制定新的病理反应标准(参见Cottrell TR，Thompson ED，FordePM，Stein JE，Duffield AS，Anagnostou V，等人Pathologic features of response toneoadjuvant anti-PD-1 in resected non-small-cell lung carcinoma：a proposalfor quantitative immune-related pathologic response criteria(irPRC).Ann Oncol2018；29：1853-1860)。在另一研究中，同一组评估来自免疫治疗患者的H&E染色黑色素瘤活检样本的14种组织学特征，并显示与客观反应和总生存期的显著相关(参见Stein JE，SoniA，Danilova L，Cottrell TR，Gajewski TF，Hodi FS，等人Major pathologic response onbiopsy(MPRbx)in patients with advanced melanoma treated with anti-PD-1：evidence for an early，on-therapy biomarker of response.Ann Oncol 2019；30；589-596)。病理学家被认为非常熟悉明视场显微镜和评估H&E染色组织，在病理学住院实习期间为此进行了大量培训。一个多世纪以来的实践证明了H&E染色的重要性。其他常规明视场染色剂(诸如宫颈样本的巴氏染色(PAP))和特殊染色剂(诸如giemsa、弹性、粘蛋白胭脂红和三色染色剂)具有很长的重要使用的历史(参见Chantziantoniou N，Donnelly A，Mukherjee M，Boon ME，Austin RM.Inception and Development of the Papanicolaoustain method.Acta Cytol 2017；61：266-280；和Wick MR.Histochemistry as a tool inmorphological analysis：a historical review.Ann Diagn Pathol 2012；16：71-78)。
免疫组织化学允许通过高度特异性抗体试剂对特定分子物种(通常是蛋白质)进行染色，并与H&E结合，极大地增强了病理学家的诊断能力(参见Jaffer S，BleiweissIJ.Beyond hematoxylin and eosin-the role of immunohistochemistry in surgicalpathology.Cancer Invest 2004；22：445-65)。抗体经由酶-抗体缀合物和酶催化的色原沉积反应来引导色原沉积。由于IHC可以染色特异性蛋白质，而不是伊红的相对非特异性蛋白质染色，因此可以识别重要蛋白质(诸如细胞周期和其他细胞信号蛋白质)的低表达和过度表达，并用于对肿瘤类型进行分类，建立预后并预测治疗反应，为H&E和其他常规染色剂提供的信息添加更多信息。
例如，H&E可以确定非小细胞肺癌(NSCLC)的存在，但通常需要p16、TTF-1、细胞角蛋白质5和6和/或天冬氨酸蛋白酶A的表达才能将癌症明确分类为鳞状细胞癌(SSC)或腺癌(Ad Ca)(参见Kerr KM，Bubendorf L，Edelman MJ，Marchetti A，Mok T，Novello S，等人Second ESMO consensus conference on lung cancer：pathology and molecularbiomarkers for non-small-cell lung cancer.AnB Oncol 2014；25：1681-1690；和Roberts EA，Morrison LE，Behman LJ，Draganova-Tacheva R，O′Neill R5，SolomidesCC.Chromogenic immunohistochemical quadruplex provides accurate diagnosticdifferentiation of non-small cell lung cancer.Ann Diagn Pathol 2019；45：151454)。在乳腺癌中，上皮生长因子受体II(HER2)的过度表达或基因扩增是预后的并预测HER2拮抗剂(诸如曲妥珠单抗)的有效性，而雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)蛋白质的过度表达是预后的并预测对雌激素拮抗剂(诸如他莫昔芬)的反应(参见Ross J，FletcherJA.The HER-2/neu oncogene in breast cancer：prognostic factor，predictivefactor，and target for therapy.Oncologist 1998；3；237-252；Vogel CL，Cobleigh MA，Tripathy D，Gutheil JC，Harris LN，Fehrenbacher L，等人Efficacy and safety oftrastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressingmetastatic breast cancer.J Clin Onc 2002；20；719-726；and Nasrazadani A，ThomasRA，Oesterreich S，Lee AV.Precision medicine in hormone receptor-positivebreast cancer Frontiers Onc 2018；8；article 144)。
不幸的是，通过H&E和IHC对特定肿瘤进行完整分析可能需要比从特定活检(特别是对于穿刺活检和细针抽吸)以及从具有低细胞性的细胞学样本(诸如宫颈刷检和尿液)获得更多的组织。这是因为根据常见的临床实践，H&E需要一个载玻片来进行癌症诊断，并且每种IHC染色剂都需要一个附加的载玻片。IHC多重化可以增加每个载玻片的IHC染色反应的数量，但除了H&E染色载玻片之外，仍然需要至少一个载玻片。对H&E载玻片进行脱色然后进行IHC是可能的，但完全去除伊红和苏木精可能证明是困难的，并且需要相当多的时间来依次对H&E和IHC进行染色和评估。另外，对两种染色方法之间相同精确区域的比较需要在H&E之后成像和在IHC之后再次成像，并定位和对准感兴趣区域。
即使当可获得用于多个载玻片制备的足够的样品时，协调对H&E染色模式和IHC蛋白质表达模式的评估也是有问题的。对于组织，最好的情况是在相邻(连续)肿瘤切片上进行H&E和IHC。然而，组织形态随穿过肿瘤样本的距离而变化，并且甚至连续切片显示出各种组织和细胞特征的形状和取向的显著变化。考虑到肿瘤随切片切割的变化，相同的区域必须位于每个载玻片上，并且在一个载玻片上放置具有信息蛋白质表达的细胞必须与另一载玻片上的H&E特征完全对准。由于一个切片上的细胞在连续切片上不存在或仅部分存在(切片机在细胞内切割)，因此几乎不可能准确对准H&E和IHC信息。细胞学样本的情况更糟，对于细胞学样本，两个不同的样本载玻片之间的信息对准是不可能的。
在同一个载玻片上用IHC进行多重H&E染色是上述有限样本和对从不同样本载玻片检索到的信息进行对准的问题的解决方案。然而，这已经是不可能的，因为H&E染色非常强烈并覆盖了光谱的整个可见光区域，使得色原染色剂将会变得模糊并难以或无法读取。图9示出H&E染色的福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)扁桃体组织切片的吸光度光谱。也绘制了人类视觉响应，显示H&E染色剂在可见范围内吸收。非常深的黑色或棕色色原(诸如DAB)将更明显，但然后DAB掩盖H&E染色剂，因此对H&E和IHC两者的评估都很差。
如上所述，申请人已经发现，即使当生物学样本内的一种或多种生物标志物用本文所述的一个或多个可检测部分标记(例如，用两个或更多个可检测部分标记、用三个或更多个可检测部分标记、用四个或更多个可检测部分标记、用五个或更多个可检测部分标记、用六个或更多个可检测部分标记等)时，引入到该生物学样本的一种或多种常规染料仍可以被解释。
电磁谱
电磁谱是电磁辐射的频率范围(光谱)及其各自的波长和光子能量。这个频率范围被分成单独的频带，并且每个频带内的电磁波被称为不同的名称；从光谱的低频(长波长)端开始，这些是：无线电波、微波、红外线、可见光、紫外线、X射线和高频(短波长)端处的伽马射线。
电磁谱频带之间没有精确定义的边界；而是电磁谱的频带相互“淡入”。因此，电磁谱的不同频带之间存在重叠。例如，可见光谱和紫外光谱之间以及可见光谱和红外光谱之间存在重叠。特别地，此类重叠发生在与“可见光谱”相邻和/或包含“可见光谱”的波长范围内，诸如在约370nm与约430nm之间的波长范围内以及在约670nm与约730nm之间的波长范围内。
鉴于前述，如本文所用，术语“可见光谱”是指波长范围为从约400nm至约700nm的光谱。如本文所用，术语“紫外光谱”包括小于约430nm的波长。因此，“紫外光谱”包括近紫外波长，即与“可见光谱”相邻的那些波长。如本文所用，术语“红外光谱”包括大于约670nm的波长。因此，“红外光谱”包括近红外波长，即与“可见光谱”相邻的那些波长。
在一些实施例中，吸收与波长的关系图称为光谱。光谱可以用于确定常规染料的颜色(即可见区域的光谱响应)或可检测部分的特征(例如，可检测部分的紫外、近紫外、红外或近红外特征)。物质以其吸收最大比例的光的波长称为λmax。因为该波长被最大程度地吸收，所以它通常被称为峰吸收波长。在一些实施例中，如果使用特定且离散波长的辐射来对样品进行照射，则可能存在对该辐射的吸收。在其他波长下，此类吸收将减少或不会发生。正是该吸收现象被用来表征材料，例如，本文所述的常规染料和可检测部分。
本公开的常规染色剂(“普通染色剂”或“特殊染色剂”)使用一种或多种常规染料，包括本文所述的任何染料。在一些实施例中，普通染色剂和特殊染色剂的常规染料具有“在可见光谱内”可检测的波长，诸如在约400nm与约700nm之间。例如，图9示出苏木精和伊红染色的扁桃体组织的吸光度，其中叠加了人类视觉响应。图9显示苏木精和伊红染色剂在可见范围内吸收。图9也显示苏木精和伊红的吸光度在视觉响应区域之外下降，并且在约450nm以下和约700nm以上大大降低。本文描述了合适的常规染料及其峰吸收波长(或两个峰吸收波长，如果适用)的其他非限制性实例。
本公开也涉及一个或多个可检测部分，该一个或多个可检测部分与一种或多种常规染料在对生物学样本进行染色中结合使用。在一些实施例中，本公开的可检测部分通常具有小于约430nm的峰吸收波长。在其他实施例中，本公开的可检测部分通常具有大于约670nm的峰吸收波长。因此，本公开的可检测部分具有在“紫外光谱”或“红外光谱”内的波长。总的来说，波长小于约430nm或大于约670nm的那些可检测部分在本文中称为“在可见光谱之外”可检测。
例如，图10示出紫外光谱内的“HCCA”可检测部分(具有365nm的峰吸收波长)和红外光谱内的“Cy7”和“IR804”可检测部分(分别具有774nm和828nm的峰吸收波长)。因此，HCCA、Cy7和IR804“在可见光谱之外”。
当选择“可见光谱之外”可检测的可检测部分与“可见光谱内”可检测的常规染料组合使用时，并不意味着可见光谱和紫外光谱之间(例如，在370nm与430nm之间的那些波长)或可见光谱与红外光谱之间(例如，在670nm与730nm之间的那些波长)不能重叠，如上所述。例如，可以选择具有约430nm的峰吸收波长的第一可检测部分并且可以选择具有约400nm的峰吸收波长的第一常规染料，前提是在该第一可检测部分的该峰吸收波长与该第一常规染料的该峰吸收波长之间存在足够的间隔(例如，20nm)，使得来自该第一可检测部分和该第一常规染料的信号可以被独立地检测。这也在图10中进一步示出，其也示出“NMethCou”和“DCC”可检测部分，该可检测部分具有与可见光谱相邻的峰吸收波长(诸如在410nm与420nm之间)并且因此“在可见光谱之外”。
在一些实施例中，本公开的不可见色原在光谱的其他可见部分(例如，在400nm至450nm之间)中具有弱的非零吸光度。当这些不可见色原以足够的量(例如，300μm)沉积时，它们可以提供可见(并且因此可检测)信号。例如，并且参考图10，当DCC沉积在样品上时，它在约420nm处具有最大吸收峰，但在450nm与500nm之间具有残余吸光度，这可能使色原可见，但只有当以高量(例如，300μm)沉积时。同样地，并且再次参考图10，当IR804沉积时，它在约770nm处具有最大吸收峰。然而，IR804在700nm以下(例如，在约650nm至约700nm之间)具有相对较低的吸光度，如果样品上沉积了足够高浓度的不可见色原，这可能是可见的。
常规染色剂
用一种或多种常规染色剂进行的染色被用于突出生物学样本(包括组织和细胞)的重要特征以及增强组织对比度。通过对原本透明的组织切片进行着色，这些常规染色剂允许病理学家和/或研究人员在显微镜下观察组织形态或寻找特定细胞类型、结构或甚至微生物(诸如细菌)的存在或流行情况。苏木精是常用于该过程的碱性染料，并将细胞核染色，使其呈现“蓝色”，而伊红将细胞的细胞质和结缔组织染色，使其呈现“粉红色染色”(参见本文“普通染色剂”)。存在几种其他染色技术用于特定细胞和组分(参见本文“特殊染色剂”)。
在组织病理学中，术语“普通染色”是指“通常”用于所有组织样本以揭示底层组织结构和状况的苏木精和伊红染色剂(H&E)。术语“特殊染色剂”长期以来一直用于指大量的替代染色技术，这些替代染色技术当用H&E染色不能提供病理学家或研究人员需要的所有信息时使用。
普通染色剂
苏木精和伊红(H&E)染色剂是在全世界已经使用了100多年的通用“普通”染色剂。简单地说，苏木精将细胞核染成蓝色，并且伊红将细胞质染成粉红色。H&E染色剂使病理学家能够将组织的一般形态可视化，从而可以对许多组织病理学状况进行诊断和预后。使用H&E染色的载玻片，病理学家可以看到大多数疾病、炎症(急性和慢性)、有丝分裂、细菌感染、坏死、纤维化、色素和蛋白质堆积。
在一些实施例中，常规染色剂为苏木精。在一些实施例中，常规染色剂为伊红。在其他实施例中，常规染色剂包括苏木精和伊红。在一些实施例中，常规他汀类药物为伊红B(C.I.45400)、伊红Y(C.I.45380)、赤藓红(C.I.45430)和/或乙基伊红(C.I.45386)。
在组织上，苏木精大约在600处显示宽最大值，但范围从约590至620nm，取决于诸如“蓝化”处理的条件并且在某种程度上可能取决于组织。在组织上，伊红具有约533nm的最大吸光度。记录在扁桃体组织上的H&E光谱在图9和图10中示出。
特殊染色剂
特殊染色剂属于基于载玻片的染色剂的不同家族，这些基于载玻片的染色剂依靠基本化学反应对各种组织、结构、细胞、细胞器、碳水化合物、矿物质和微生物进行显微可视化和一般识别。特殊染色剂之所以“特殊”，是因为它们不是普通的。“特殊染色剂”是指对组织学分析有用的任何基于化学的染色剂，它不是免疫组织化学染色剂、原位杂交染色剂或“普通染色剂”。特殊染色剂是基于化学的染色剂，该染色剂是为应对难以染色的组织类型、罕见疾病、传染病或影响组织的其他非典型情况而开发的。在一些实施例中，特殊染色剂用于识别和展示H&E染色剂无法可视化的特定结构和组织。
在一些实施例中，特殊染色剂的有用应用包括：(1)对DNA和DNA含量的测定；(2)药物、激素或可能毒性的食品添加剂的作用方式；(3)代谢生物化学；(4)疾病过程的生物化学；(5)许多转移性肿瘤的原发部位；(6)对非色素转移性黑色素瘤的识别；(7)对早期侵袭性肿瘤的检测；(8)对手术切除肿瘤边缘的定义；(9)对Barr体的识别；(10)以可以用作通过适当仪器(例如，荧光)进行细胞分离的基础的方式来染色细胞；和/或(11)对微生物(例如，新型隐球菌、幽门螺杆菌)的识别。
Van Gieson：van Gieson染色剂是用于突出胶原蛋白和其他结缔组织(诸如肌肉组织)之间的差异的染色剂。van Gieson染色剂通常用于识别不同类型肿瘤中纤维的特征排列。van Gieson染色剂使用苦味酸和酸性品红(三磺化副品红，最大吸光度大约544nm)的混合物来渗透组织样品，使胶原蛋白变成红色。周围的肌肉组织和血细胞被染成黄色。在一些实施例中，酸性品红的峰吸收波长为约520nm至约570nm。
甲苯胺蓝：甲苯胺蓝是一种对酸性组织进行染色的异染染料(最大吸光度大约628nm)。甲苯胺蓝特别容易被核酸吸引，并且因此用于对具有高浓度DNA和RNA的组织进行染色。当与甲苯胺蓝接触时，核酸变成蓝色。
阿尔新蓝：阿尔新蓝是酞菁染料，其为诸如糖胺聚糖和酸性粘蛋白之类的物质提供特异性(阿尔新蓝8G在水中的最大吸光度为615nm)并在使用复染中性红时使酸性粘蛋白和粘液物质呈蓝色并使细胞核呈红粉色。阿尔新蓝染料是水溶性的，并且由于含有铜而呈蓝色。阿尔新蓝染料附着在硫酸盐和羧酸化的酸性粘多糖和糖蛋白上，并且染料结合是纯静电的。执行这种染色以确定粘液退化并识别由各种结缔组织和上皮组织肿瘤释放的酸性粘蛋白。最大吸光度范围在505nm与535nm之间的核固红染色剂(C.I.60760)可以用作复染剂。核固红染色剂将核固红染料与硫酸铝媒染剂结合，以选择性地将核染色质染成红色并提供粉红色阴影的非特异性背景组织染色。
Giemsa：这是一种血液染色剂，其可以在组织病理学上用于对染色质和核膜进行染色。Giemsa对人体和致病细胞进行不同地染色，因此，它用于许多疾病的诊断，因为它将人体细胞染成紫色并且将细菌细胞染成粉红色，以便可以区分这些细胞。Giemsa也用于对血细胞进行染色，以便观察它们的组成和结构。细胞核被染成紫色并且细胞质被染成蓝色至淡粉色，取决于细胞类型。Giemsa染色剂通过将不同血细胞的颗粒染成不同的颜色来区分它们。嗜碱性粒细胞呈深蓝色颗粒，并且嗜酸性粒细胞呈橙黄色颗粒。通常应用亚甲蓝(具有范围在约656至约661nm之间的最大吸光度)、伊红Y(具有约516nm的最大吸光度)和Azure B(具有约639nm的最大吸光度)。
网硬蛋白：网硬蛋白染色采用银浸渍切片来突出网硬蛋白纤维(III型胶原蛋白)。网硬蛋白主要用于肝脏的组织病理学，但也可以用于评估脾脏、骨髓和肾脏的异常情况。在肝脏中，坏死和肝硬化两者均导致不规则的网硬蛋白模式。染色剂使纤维染成黑色，与浅灰色或粉红色背景形成对比度。在染色程序期间，组织必须首先被氧化，并且然后在加入银之前用铁明矾敏化。一旦已经添加银，就必须使用福尔马林将其还原以便其可见。细胞核也可以使用核固红复染成红色，使其可见。主要染色剂是银染剂，其将具有非常宽的吸光度，可能延伸到IR。
Nissl：Nissl染色用于使在神经元中发现的Nissl物质(粗面内质网团块和游离多核糖体)可视化。这种染色剂将神经元与神经胶质区分开来，并且借助这种染色剂可以很好地研究神经元的细胞结构。Nissl物质的丢失可以表示异常，诸如细胞损伤或退化，这反过来又可以指示疾病。这种染色剂中常用的染料称为醋酸甲酚紫(具有范围在约596至约601nm之间的最大吸光度)，它与蒸馏水混合在溶液中。这将Nissl物质染成深蓝色或深紫色。
地衣红：地衣红染色剂用于识别病毒的包涵体。这些包涵体是人类细胞内的病毒颗粒，并且与病毒本身不同，使用光学显微镜这些包涵体是可见的。Orcein染色剂常用于诊断乙型肝炎，乙型肝炎致使肝细胞中形成包涵体。Orcein(具有范围在约575nm之间的最大吸光度)由氨基和羟基吩恶嗪酮化合物的混合物组成。染色剂的结果是包涵体被染成深棕紫色。与铜相关联的蛋白质也变成深紫色。
苏丹黑B：苏丹黑B(具有约598nm的最大吸光度，其中肩峰约415nm)是用于识别脂质和脂褐素的非离子疏水性染料。脂褐素是老年人体内如神经元和心脏细胞等永久性细胞中出现的老化色素。脂褐素是由溶酶体的构建引起的，溶酶体吸收了细胞的不可消化部分。苏丹黑B将脂褐素染成黑色。苏丹黑B通常用于对脂质和脂肪进行染色，因此它对脂褐质进行染色的事实很重要。苏丹黑B也可以将红细胞染成黑色。
Masson三色：三色染色剂是三种染料的混合物，用于区分结缔组织中的肌肉、胶原纤维、纤维蛋白和红细胞。三种染料中的一种染料通常是核染色剂，并且另两种染料主要区分胶原蛋白和肌肉纤维。该染色剂中的三种不同染料具有不同大小的分子，这些分子以不同方式渗透组织。在较大的分子可以渗透的地方，较小的分子被置换。首先，使用酸性染料(诸如Biebrich猩红(具有约505nm的最大吸光度)，然后使用磷钨酸和磷钼酸，并且最后使用纤维染色剂(诸如浅绿色(具有约422nm和约630nm的最大吸光度))。也使用Weigert铁苏木精，但在程序开始时用作固定剂。在染色已经进行之后，细胞核呈黑色或蓝色，肌肉和纤维蛋白呈红色，并且胶原蛋白呈绿色。
Mallory三色：Mallory三色区分胶原蛋白和肌肉纤维。Mallory三色包括三种染料，第一种是稀释的酸性品红(具有约546nm的最大吸光度)，第二种是稀释的磷钼酸，以及第三种是橙黄G(具有约475nm的最大吸光度)，甲基蓝(苯胺蓝；具有约600nm的最大吸光度)、草酸和蒸馏水的混合物。在程序结束时，细胞核和肌肉细胞呈红色，胶原蛋白呈蓝色，并且红细胞呈橙黄色。
Azan三色：Azan三色染色剂用于对肌肉和胶原蛋白进行染色，并且可以用于区分肌肉组织和胶原蛋白组织以及识别疾病，诸如肝脏病症。Azan三色将细胞与细胞外组分区分开来，并将肌肉纤维染成红色，将软骨和骨基质染成蓝色。类似于使用Mallory磷钼酸橙黄G(具有约475nm的最大吸光度)和苯胺蓝(具有约600nm的最大吸光度)溶液，然而，不是使用酸性品红来对细胞核进行染色，而是使用叫做偶氮胭脂红(具有约516nm的最大吸光度B和约511nm的G)的染料，该染料与乙酸和蒸馏水结合。苯胺蓝用作偶氮胭脂红的复染剂来对细胞核进行染色。该程序导致红色细胞核、橙黄色肌肉细胞和蓝色胶原蛋白，从而允许在显微镜下区分它们。
Cason三色：这种染色剂用于区分胶原蛋白。因此，其应用涉及诊断与胶原蛋白异常有关的病症。这种染色剂将细胞核和细胞质染成红色，将胶原蛋白染成蓝色，并将红细胞染成橙黄色。使用的染色剂是染料的混合物，包括橙黄G(具有约475nm的最大吸光度)、酸性品红(具有约546nm的最大吸光度)、苯胺蓝(具有约600nm的最大吸光度)、磷钨酸和蒸馏水。
PAS(高碘酸Schiff)：这种染色剂使糖原着色，并且因此用于观察细胞膜、粘液物质以及真菌的存在。PAS染色的过程通常包括两个步骤，第一步是与高碘酸发生氧化反应，从而致使醛类的形成，第二步是借助Schiff试剂展示这些醛类。Schiff试剂中的品红染料产生从品红色到紫色的一系列颜色。染色过程使用高碘酸、苏木精和Schiff试剂(复合物，与DNA的反应产物，具有约628nm的最大吸光度)，其包括碱性品红(具有在约547至约552nm之间的最大吸光度)和焦亚硫酸钠，结合蒸馏水和盐酸。染色剂致使细胞核变成蓝色，并致使糖原和真菌变成品红色。PAS在许多诊断应用中很有用。例如，PAS可以用于诊断糖原贮积病、某些肉瘤和癌以及真菌感染。
Weigert间苯二酚品红(Weigert弹性)：这种类型的染色剂用于使弹性纤维着色。该染料致使这些纤维染成蓝黑色，致使细胞核变成浅蓝黑色，致使胶原蛋白变成粉色或红色，并致使其他组织变成黄色。溶液包括碱性品红(具有在约547至约552nm之间的最大吸光度)，该碱性品红产生附着到弹性纤维上致使它们被染色的复合物。Weigert染色剂溶液也由间苯二酚、氯化铁、乙醇、蒸馏水和盐酸组成。苏木精和van Gieson染色剂也用作复染剂。
Wright和Wright Giemsa染色剂：Wright和Wright Giemsa染色剂是多色染色剂，因为它们含有伊红和亚甲蓝。Giemsa染色剂另外含有亚甲蓝天青，并增强细胞核特征。然后使用伊红Y将细胞质染成橙黄色。两者均用于对外周血液涂片和骨髓涂片进行染色。它们用于观察细胞及其形态，帮助诊断感染和血液疾病，诸如白血病。
醛品红：这种染色剂对胰腺中的弹性纤维和β细胞颗粒进行染色。它对其他高亲和力嗜碱性位点(如肥大细胞颗粒和软骨基质)也具有高选择性。弹性组织纤维被染成蓝紫色，β细胞颗粒和硫酸化粘蛋白也是如此。醛品红溶液含有碱性品红(具有在约547至约552nm之间的最大吸光度)、约70％乙醇、浓盐酸和三聚乙醛的混合物。醛品红通常与阿尔新蓝结合使用。
耐酸：用于识别耐酸细菌有机体(诸如分枝杆菌属和诺卡氏菌属的成员)的鉴别染色剂。对于结核病的诊断特别重要(石炭酸品红作为主要染色剂且亚甲蓝作为复染剂)。
在一些实施例中，常规染料是酸性品红(C.I.42685；最大吸光度546nm)、阿尔新蓝8 GX(C.I.74240；最大吸光度615nm)、茜素红S(C.I.58005；最大吸光度556和596nm)、金胺O(C.I.41000；最大吸光度370和432nm)、偶氮胭脂红B(C.I.50090；最大吸光度516nm)、偶氮胭脂红G(C.I.50085；最大吸光度511nm)、天青A(C.I.52005；吸光度与天青B相似)、天青B(C.I.52010；最大吸光度639nm)、碱性品红(C.I.42510；最大吸光度547至552nm)、俾斯麦棕Y(C.I.21000；最大吸光度643nm)、亮甲酚蓝(C.I.51010；最大吸光度622nm)、胭脂红(C.I.75470；质子化最大吸光度490至495，在碱中以及与金属盐结合时增大)、氯唑黑E(C.I.30235；最大吸光度500至504nm以及574至602nm)、刚果红(C.I.22120；最大吸光度497nm)、甲酚紫(最大吸光度596至601nm)、结晶紫(C.I.42555；最大吸光度590nm)、达罗红(最大吸光度502nm)、乙基绿(C.I.42590；最大吸光度635nm、420nm)、固绿F C F(C.I.42053；最大吸光度624nm，取决于pH)、Giemsa染色剂(不纯的天青B、亚甲蓝和伊红Y的混合物)、靛蓝胭脂红(C.I.73015；最大吸光度608ni)、詹纳斯绿B(C.I.11050：最大吸光度630nm)、哲纳尔氏染色素1899、浅绿SF(C.I.42095；最大吸光度422和630nm)、孔雀石绿(C.I.42000；最大吸光度614和425nm)、马休黄(C.I.10315；最大吸光度420至432nm)、甲基橙(C.I.13025；最大吸光度507nm)，甲基紫2B(C.I.42535；最大吸光度583至587nm)、亚甲蓝(C.I.52015；最大吸光度656至661nm)、亚甲紫(Bernthsen)、(C.I.52041；最大吸光度580至601nm)、中性红(C.I.50040；最大吸光度454、529、541nm，取决于pH和溶剂)、苯胺黑(C.I.50420；最大吸光度570至580nm)、尼罗蓝A(C.I.51180；最大吸光度633至660nm)、核固红(C.I.60760；最大吸光度535和505nm)、油红O(C.I.26125；最大吸光度518和359nm)、橙黄G(C.I.16230；最大吸光度475nm)、橙黄II(C.I.15510；最大吸光度483nm)、地衣红(最大吸光度575至590，取决于pH)、副品红(C.I.42500；最大吸光度545nm)、根皮红B(C.1.45410；最大吸光度548和510nm)、派若宁B(C.I.45010；与派若宁Y密切相关)、派若宁Y(C.I.45005；最大吸光度546至549nm)、刃天青(水中最大吸光度598nm，甲醇中最大吸光度478)、玫瑰红(C.I.45435；最大吸光度546nm)、番红O(C.I.50240；最大吸光度530nm)、苏丹黑B(C.I.26150；最大吸光度598和415nm)、苏丹III(C.I.26100；最大吸光度503至507和503nm)、苏丹IV(C.I.26105；最大吸光度520nm)、四色染色剂(MacNeal)、硫堇(C.I.52000；最大吸光度598至602nm)、甲苯胺蓝(C.I.52040；最大吸光度626至630nm)、Weigert间苯二酚品红(最大吸光度508nm)、瑞氏色素及它们的任何组合。在这些实例中的每个实例中，“C.I.”是指Color IndexTM。Color IndexTM通过其公认的使用类别、其色调和序列号(其简单地反映相关着色剂类型已经在Color Index中注册的时间顺序)描述商业产品。该定义使特定产品能够与其基本着色剂具有相同的化学组成并且其中该基本着色剂来自单一化学反应或一系列反应的其他产品一起分类。
在一些实施例中，可见染料为刚果红、比布列希猩红酸品红、石炭酸品红、氯化金、孔雀石绿、甲基绿-派洛宁、磷钼酸、番红精O、银染剂及它们的任何组合。
生物标志物以及可以被标记的生物标志物的非限制性实例
在一些实施例中，生物学样本内的一种或多种靶标是生物标志物。如本文所用的术语“生物标志物”是指可以在生物学样本(例如，PD-L1)中检测到的指示物(例如，预测性的、诊断性的和/或预后性的)。生物标志物可以用作以一定的、分子的、病理的、组织学的和/或临床特征为特征的特定亚型的疾病或病症(例如，癌症)的指示物。在一些实施例中，生物标记物为基因。生物标志物包括但不限于多核苷酸(例如，DNA和/或RNA)、多核苷酸拷贝数改变(例如，DNA拷贝数)、多肽、多肽和多核苷酸修饰(例如，翻译后修饰)、碳水化合物和/或基于糖脂的分子标志物。作为说明性实施例包括的是抗原、表位、细胞蛋白质、跨膜蛋白质和DNA或RNA序列。Her-2/neu基因和蛋白质均为生物标志物的说明性实施例。
如上所述，生物标志物靶标可以是核酸序列或蛋白质。在整个本公开中，当提及靶生物标志物蛋白质时，应当理解，与该蛋白质相关联的核酸序列也可以用作靶标。在一些实施例中，生物标志物靶标为来自病原体(诸如病毒、细菌)或细胞内寄生物(诸如来自病毒基因组)的蛋白质或核酸分子。例如，生物标志物靶蛋白可以由与疾病相关联(例如，关联、存在因果关系等)的靶核酸序列产生。
生物标志物靶核酸序列的大小可以存在实质性差异。不受限制地，核酸序列可具有可变数量的核酸残基。例如，生物标志物靶核酸序列可以具有至少约10个核酸残基或至少约20、30、50、100、150、500、1000个残基。类似地，生物标志物靶多肽的大小可以存在实质性差异。不受限制地，生物标志物靶多肽将包括至少一个与肽特异性抗体或其片段结合的表位。在一些实施例中，该多肽可包括至少两个与肽特异性抗体或其片段结合的表位。
在具体的非限制性实施例中，生物标志物靶蛋白由与肿瘤(例如，癌症)相关联的靶核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生。在肿瘤细胞中，尤其是在癌细胞(诸如B细胞和T细胞白血病、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌、神经系统癌等)中，已经鉴定出许多染色体异常(包括易位及其他重排、扩增或缺失)。因此，在一些实施例中，生物标志物靶分子的至少一部分由样品中的至少细胞亚群中扩增或缺失的核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生。
已知癌基因是导致若干人恶性肿瘤的原因。例如，涉及位于染色体18q 11.2断点区的SYT基因的染色体重排常见于滑膜肉瘤软组织肿瘤中。可使用具有不同标记物的探针来鉴别t(18q11.2)易位：第一探针包括从SYT基因向远侧延伸的靶核酸序列所产生的FPC核酸分子，第二探针包括从延伸至SYT基因3′端或近侧的靶核酸序列所产生的FPC核酸。当与这些靶核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)对应的探针用于原位杂交程序时，在SYT基因区缺乏t(18q11.2)的正常细胞表现出两个融合(由非常接近的两个标记物产生)信号，反映SYT的两个完整拷贝。具有t(18q 11.2)的异常细胞表现出单一融合信号。
在其他实施例中，选择的由核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生的生物标志物靶蛋白为肿瘤细胞中缺失(丢失)的肿瘤抑制基因。例如，在某些膀胱癌中，位于染色体9p21上的p16区(包括D9S1749、D9S1747、p16(INK4A)、p14(ARF)、D9S1748、p15(INK4B)和D9S1752)缺失。涉及染色体1的短臂的远端区域(包括例如SHGC57243、TP73、EGFL3、ABL2、ANGPTL1和SHGC-1322)和19号染色体(包括MAN2B1、ZNF443、ZNF44、CRX、GLTSCR2和GLTSCR1)的着丝粒区域(例如，19p13-19q13)的染色体缺失是某些类型的中枢神经系统实体瘤的特征性分子特征。
上述实施例仅出于举例说明的目的提供，并非旨在进行限制。与致瘤性转化和/或生长相关的许多其他细胞遗传学异常是本领域的普通技术人员所知的。由核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生的与致瘤性转化相关并且可以用于本发明所公开的方法中的生物标志物靶蛋白也包括EGFR基因(7p12；例如，GENBANKTM登录号NC-000007，核苷酸55054219-55242525)、C-MYC基因(8q24.21；例如，GENBANKTM登录号NC-000008，核苷酸128817498-128822856)、D5S271(5p15.2)、脂蛋白脂酶(LPL)基因(8p22；例如，GENBANKTM登录号NC-000008，核苷酸19841058-19869049)、RB1(13q14；例如，GENBANKTM登录号NC-000013，核苷酸47775912-47954023)、p53(17p13.1；例如，GENBANKTM登录号NC-000017，补体，核苷酸7512464-7531642)、N-MYC(2p24；例如，GENBANKTM登录号NC-000002，补体，核苷酸151835231-151854620)、CHOP(12q13；例如，GENBANKTM登录号NC-000012，补体，核苷酸56196638-56200567)、FUS(16p11.2；例如，GENBANKTM登录号NC-000016，核苷酸31098954-31110601)、FKHR(13p14；例如，GENBANKTM登录号NC-000013，补体，核苷酸40027817-40138734)，以及例如：ALK(2p23；例如，GENBANKTM登录号NC-000002，补体，核苷酸29269144-29997936)、Ig重链、CCND1(11q13；例如，GENBANKTM登录号NC-000011，核苷酸69165054.69178423)、BCL2(18q21.3；例如，GENBANKTM登录号NC-000018，补体，核苷酸58941559-59137593)、BCL6(3q27；例如，GENBANKTM登录号NC-000003，补体，核苷酸188921859-188946169)、MALF1、AP1(1p32-p31；例如，GENBANKTM登录号NC-000001，补体，核苷酸59019051-59022373)、TOP2A(17q21-q22；例如，GENBANKTM登录号NC-000017，补体，核苷酸35798321-35827695)、TMPRSS(21q22.3；例如，GENBANKTM登录号NC-000021，补体，核苷酸41758351-41801948)、ERG(21q22.3；例如，GENBANKTM登录号NC-000021，补体，核苷酸38675671-38955488)；ETV1(7p21.3；例如，GENBANKTM登录号NC-000007，补体，核苷酸13897379-13995289)、EWS(22q12.2；例如，GENBANKTM登录号NC-000022，核苷酸27994271-28026505)；FLI1(11q24.1-q24.3；例如，GENBANKTM登录号NC-000011，核苷酸128069199-128187521)、PAX3(2q35-q37；例如，GENBANKTM登录号NC-000002，补体，核苷酸222772851-222871944)、PAX7(1p36.2-p36.12；例如，GENBANKTM登录号NC-000001，核苷酸18830087-18935219)、PTEN(10q23.3；例如，GENBANKTM登录号NC-000010，核苷酸89613175-89716382)、AKT2(19q13.1-q13.2；例如，GENBANKTM登录号NC-000019，补体，核苷酸45431556-45483036)、MYCL1(1p34.2；例如，GENBANKTM登录号NC-000001，补体，核苷酸40133685-40140274)、REL(2p13-p12；例如，GENBANKTM登录号NC-000002，核苷酸60962256-61003682)以及CSF1R(5q33-q35；例如，GENBANKTM登录号NC-000005，补体，核苷酸149413051-149473128)。
在其他实施例中，生物标志物靶蛋白选自与疾病或病症相关联的病毒或其他微生物。检测细胞或生物学样本中的病毒或微生物来源的靶核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)，指示该生物体的存在。例如，生物标志物靶肽、多肽或蛋白质可以选自致癌或病源病毒、细菌或细胞内寄生虫(诸如恶性疟原虫和其他疟原虫物种、利什曼原虫种、细小隐孢子虫、溶组织内阿米巴和蓝氏贾第鞭毛虫以及弓形虫、艾美耳球虫、秦勒氏虫和巴贝虫物种)。
在一些实施例中，生物标志物靶蛋白由来自病毒基因组的核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生。示例性病毒和相应的基因组序列(括号中为GENBANKTM RefSeq登录号)包括人腺病毒A型(NC-001460)、人腺病毒B型(NC-004001)、人腺病毒C型(NC-001405)、人腺病毒D型(NC-002067)、人腺病毒E型(NC-003266)、人腺病毒F型(NC-001454)、人星状病毒(NC-001943)、人BK多瘤病毒(V01109；GI：60851)、人博卡病毒(NC-007455)、人冠状病毒229E(NC-002645)、人冠状病毒HKU1(NC-006577)、人冠状病毒NL63(NC-005831)、人冠状病毒OC43(NC-005147)、人肠道病毒A型(NC-001612)、人肠道病毒B型(NC-001472)、人肠道病毒C型(NC-001428)、人肠道病毒D型(NC-001430)、人红病毒属V9(NC-004295)、人泡沫病毒(NC-001736)、人疱疹病毒1型(单纯疱疹病毒1型)(NC-001806)、人疱疹病毒2型(单纯疱疹病毒2型)(NC-001798)、人疱疹病毒3型(水痘-带状疱疹病毒)(NC-001348)、人疱疹病毒4型1(爱泼斯坦-巴尔病毒1型)(NC-007605)、人疱疹病毒4型2(爱泼斯坦-巴尔病毒2型)(NC-009334)、人疱疹病毒5型毒株AD 169(NC-001347)、人疱疹病毒5型毒株Merlin毒株(NC-006273)、人疱疹病毒6A型(NC-001664)、人疱疹病毒6B型(NC-000898)、人疱疹病毒7型(NC-001716)、人疱疹病毒8型M(NC-003409)、人疱疹病毒8型P(NC-009333)、人免疫缺陷病毒1型(NC-001802)、人免疫缺陷病毒2型(NC-001722)、人偏肺病毒(NC-004148)、人乳头瘤病毒-1(NC-001356)、人乳头瘤病毒-18(NC-001357)、人乳头瘤病毒-2(NC-001352)、人乳头瘤病毒-54(NC-001676)、人乳头瘤病毒-61(NC-001694)、人乳头瘤病毒-cand90(NC-004104)、人乳头瘤病毒RTRX7(NC-004761)、人乳头瘤病毒10型(NC-001576)、人乳头瘤病毒101型(NC-008189)、人乳头瘤病毒103型(NC-008188)、人乳头瘤病毒107型(NC-009239)、人乳头瘤病毒16型(NC-001526)、人乳头瘤病毒24型(NC-001683)、人乳头瘤病毒26型(NC-001583)、人乳头瘤病毒32型(NC-001586)、人乳头瘤病毒34型(NC-001587)、人乳头瘤病毒4型(NC-001457)、人乳头瘤病毒41型(NC-001354)、人乳头瘤病毒48型(NC-001690)、人乳头瘤病毒49型(NC-001591)、人乳头瘤病毒5型(NC-001531)、人乳头瘤病毒50型(NC-001691)、人乳头瘤病毒53型(NC-001593)、人乳头瘤病毒60型(NC-001693)、人乳头瘤病毒63型(NC-001458)、人乳头瘤病毒6b型(NC-001355)、人乳头瘤病毒7型(NC-001595)、人乳头瘤病毒71型(NC-002644)、人乳头瘤病毒9型(NC-001596)、人乳头瘤病毒92型(NC-004500)、人乳头瘤病毒96型(NC-005134)、人副流感病毒1型(NC-003461)、人副流感病毒2型(NC-003443)、人副流感病毒3型(NC-001796)、人副肠孤病毒(NC-001897)、人细小病毒4型(NC-007018)、人细小病毒B19型(NC-000883)、人呼吸道合胞病毒(NC-001781)、人鼻病毒A型(NC-001617)、人鼻病毒B型(NC-001490)、人泡沫反转录病毒(NC-001795)、人嗜T细胞病毒1型(NC-001436)、人嗜T细胞病毒2型(NC-001488)。
在某些实施例中，生物标志物靶蛋白由致癌病毒(例如，爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)或人乳头瘤病毒(HPV，例如，HPV16、HPV18)的核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生。在其他实施例中，由核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生的靶蛋白来自病源病毒，诸如呼吸道合胞病毒、肝炎病毒(例如，丙型肝炎病毒)、冠状病毒(例如，SARS病毒)、腺病毒、多瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)或单纯疱疹病毒(HSV)。
可检测部分
目前公开的方法利用一个或多个可检测部分。在一些实施例中，可检测部分是可检测缀合物的组分。在一些实施例中，可以用于目前公开的方法的可检测缀合物包含可检测部分以及酪酰胺部分(或其衍生物或类似物)、醌甲基化物部分(或其衍生物或类似物)或能够参与“点击化学”反应的官能团(另外参见美国专利第10,041,950号和美国公开第2019/0204330、2017/0089911和2019/0187130号，其公开内容全文通过引用并入本文)中的一者。在其他实施例中，可以用于目前公开的方法的可检测缀合物包含可检测部分以及半抗原、酶或抗体中的一者。
在一些实施例中，合适的可检测部分可以根据半最大吸光度处的吸收峰的全宽来表征，在本文中称为FWHM(“全宽半最大”)。FWHM由因变量等于其最大值的一半时的自变量的两个极值之差所给出的函数范围来表示。换句话说，它是在y轴上最大幅值的一半的那些点之间测量的光谱曲线的宽度。它由函数达到其最大值一半的曲线上的点之间的距离给出。本质上，FWHM是一个通常用于描述曲线上或函数“凹凸”宽度的参数。在一些实施例中，虽然吸光度最大值(λmax)可以描述可检测部分的最大吸收波长，但FWHM描述了光谱吸收的宽度。
在一些实施例中，本公开的可检测部分具有窄FWHM。在一些实施例中，可检测部分的FWHM比染料、色原或荧光团(例如，磺酰氯、苏木精)的FWHM小40％；比染料、色原或荧光团的FWHM小50％；比染料、色原或荧光团的FWHM小55％；比染料、色原或荧光团的FWHM小65％；比染料、色原或荧光团的FWHM小70％；比染料、色原或荧光团的FWHM小75％；比染料、色原或荧光团的FWHM小80％；比染料、色原或荧光团的FWHM小85％；比色原或荧光团的FWHM小90％；或比染料、色原或荧光团的FWHM小95％。
在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约15nm与约200nm之间的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约15nm与约150nm之间的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约15nm与约100nm之间的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约15nm与约70nm之间的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约15nm与约50nm之间的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约15nm与约40nm之间的吸收峰。
在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约20nm与约200nm之间的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约20nm与约150nm之间的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约20nm与约100nm之间的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约20nm与约70nm之间的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约20nm与约50nm之间的吸收峰。
在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约30nm与约200nm之间的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约30nm与约150nm之间的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约30nm与约100nm之间的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约30nm与70nm之间的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在30nm与50nm之间的吸收峰。
在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约40nm与约200nm之间的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约40nm与约150nm之间的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约40nm与约100nm之间的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约40nm与70nm之间的吸收峰。
在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约50nm与约200nm之间的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约50nm与约150nm之间的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约50nm与约100nm之间的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约50nm与70nm之间的吸收峰。
在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约60nm与约200nm之间的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约60nm与约150nm之间的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约60nm与约100nm之间的吸收峰。
在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约70nm与约200nm之间的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约70nm与约150nm之间的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM在约70nm与约100nm之间的吸收峰。
在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约200nm的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约190nm的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约180nm的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约170nm的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约160nm的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约150nm的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约140nm的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约130nm的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约120nm的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约110nm的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约100nm的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约90nm的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约80nm的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约70nm的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约60nm的吸收峰。在一些实施例中，可检测部分具有FWHM小于约50nm的吸收峰。
紫外光谱范围内的可检测部分
在一些实施例中，可检测部分具有在紫外光谱范围内的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有小于约430nm的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有小于约420nm的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有小于约415nm的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有小于约410nm的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有小于约400nm的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有小于约405nm的峰吸收波长。在一些实施例中，所公开的化合物的可检测部分具有小于约395nm的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有小于约390nm的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有小于约385nm的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有小于约380nm的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有小于约375nm的峰吸收波长。在一些实施例中，所公开的化合物的可检测部分具有小于约370nm的峰吸收波长。在一些实施例中，可检测部分具有在约100nm至约400nm之间、约100nm至约390nm之间、约100nm至约380nm之间或约100nm至约370nm之间范围内的峰吸收波长。
在一些实施例中，可检测部分具有小于约420nm的峰吸收波长以及小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约415nm的峰吸收波长以及小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约410nm的峰吸收波长以及小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约400nm的峰吸收波长以及小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约405nm的峰吸收波长以及小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，所公开的化合物的可检测部分具有小于约395nm的峰吸收波长以及小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约390nm的峰吸收波长以及小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约385nm的峰吸收波长以及小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约380nm的峰吸收波长以及小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约375nm的峰吸收波长以及小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，所公开的化合物的可检测部分具有小于约370nm的峰吸收波长以及小于约200nm的FWHM。
在一些实施例中，可检测部分具有小于约420nm的峰吸收波长以及小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约415nm的峰吸收波长以及小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约410nm的峰吸收波长以及小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约400nm的峰吸收波长以及小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约405nm的峰吸收波长以及小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，所公开的化合物的可检测部分具有小于约395nm的峰吸收波长以及小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约390nm的峰吸收波长以及小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约385nm的峰吸收波长以及小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约380nm的峰吸收波长以及小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约375nm的峰吸收波长以及小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，所公开的化合物的可检测部分具有小于约370nm的峰吸收波长以及小于约150nm的FWHM。
在一些实施例中，可检测部分具有小于约420nm的峰吸收波长以及小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约415nm的峰吸收波长以及小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约410nm的峰吸收波长以及小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约400nm的峰吸收波长以及小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约405nm的峰吸收波长以及小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，所公开的化合物的可检测部分具有小于约395nm的峰吸收波长以及小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约390nm的峰吸收波长以及小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约385nm的峰吸收波长以及小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约380nm的峰吸收波长以及小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约375nm的峰吸收波长以及小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，所公开的化合物的可检测部分具有小于约370nm的峰吸收波长以及小于约100nm的FWHM。
在一些实施例中，可检测部分具有小于约420nm的峰吸收波长以及小于约70nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约415nm的峰吸收波长以及小于约70nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约410nm的峰吸收波长以及小于约70nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约400nm的峰吸收波长以及小于约70nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约405nm的峰吸收波长以及小于约70nm的FWHM。在一些实施例中，所公开的化合物的可检测部分具有小于约395nm的峰吸收波长以及小于约70nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约390nm的峰吸收波长以及小于约70nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约385nm的峰吸收波长以及小于约70nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约380nm的峰吸收波长以及小于约70nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有小于约375nm的峰吸收波长以及小于约70nm的FWHM。在一些实施例中，所公开的化合物的可检测部分具有小于约370nm的峰吸收波长以及小于约70nm的FWHM。
在一些实施例中，可检测部分包含或衍生自香豆素(即，可检测部分包含香豆素核)。美国专利第10,041,950号中描述了具有香豆素的合适的可检测部分的实例，该美国专利的公开内容全文通过引用并入本文。在一些实施例中，香豆素核为氨基香豆素核。在一些实施例中，香豆素核为7-氨基香豆素核。在一些实施例中，香豆素核为羟基香豆素核。在一些实施例中，香豆素核为7-羟基香豆素核。
在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)一个或多个吸电子基团(其中各吸电子基团可以相同或不同)。在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)一个吸电子基团。在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)两个吸电子基团。在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)三个吸电子基团。在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)三个不同的吸电子基团。在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)四个吸电子基团。在一些实施例中，一个或多个吸电子基团各自具有在1.5至约3.5之间范围内的电负性。
在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)一个或多个供电子基团(其中各供电子基团可以相同或不同)。在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)一个供电子基团。在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)两个供电子基团。在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)三个供电子基团。在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)三个不同的供电子基团。在一些实施例中，香豆素核包含(或被修饰为包含)四个供电子基团。在一些实施例中，一个或多个供电子基团各自具有在1.5至约3.5之间范围内的电负性。在一些实施例中，掺入一个或多个吸电子和/或供电子基团以促进向“红色”光谱或“蓝色”光谱的移动。
在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有在约300nm至约460nm范围内的波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有在约320nm至约440nm范围内的波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有在约340nm至约430nm范围内的波长。这些范围可能随更多或更少电负性被引入香豆素核而改变或移动。
在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约460nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约455+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约450nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约445nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约440nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约435nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约430nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约425nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约420nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约415nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约410nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约405nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约400nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约395nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约390nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约385nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约380nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约375nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约370nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约365nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约360nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约355nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约350nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约345nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约340nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约335nm+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约330nm+/-10nm的峰吸收波长。
在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约460nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约455+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约450nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约445nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约440nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约435nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约430nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约425nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约420nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约415nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约410nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约405nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约400nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约395nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约390nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约385nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约380nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约375nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约370nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约365nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约360nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约355nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约350nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约345nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约340nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约335nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约330nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。
在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约460nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约455+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约450nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约445nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约440nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约435nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约430nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约425nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约420nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约415nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约410nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约405nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约400nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约395nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约390nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约385nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约380nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约375nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约370nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约365nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约360nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约355nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在-些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约350nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约345nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约340nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约335nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约330nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。
在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约460nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约455+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约450nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约445nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约440nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约435nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约430nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约425nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约420nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约415nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约410nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约405nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约400nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约395nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约390nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约385nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约380nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约375nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约370nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约365nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约360nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约355nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约350nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约345nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约340nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约335nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有香豆素核的可检测部分具有约330nm+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。
具有香豆素核的可检测部分的实例包括：
以及
其中符号是指可检测部分(此处为香豆素核)偶联到可检测缀合物的另一部分(例如，酪酰胺部分、醌甲基化物部分、能够或参与“点击化学”反应的官能团、抗体、酶、半抗原等)的位点。
美国专利第10,041,950号中描述了具有香豆素核的其他合适的可检测部分，其公开内容全文通过引用并入本文，前提条件是那些基于香豆素的化合物具有小于约20nm的FWHM。
红外光谱范围内的可检测部分
在一些实施例中，可检测部分具有在红外光谱范围内的波长。在一些实施例中，可检测部分具有大于约740nm的波长。在一些实施例中，可检测部分具有大于约750nm的波长。在一些实施例中，可检测部分具有大于约760nm的波长。在一些实施例中，可检测部分具有大于约765nm的波长。在一些实施例中，可检测部分具有大于约770nm的波长。在一些实施例中，可检测部分具有大于约775nm的波长。在一些实施例中，可检测部分具有大于约780nm的波长。在一些实施例中，可检测部分具有大于约785nm的波长。在一些实施例中，可检测部分具有大于约790nm的波长。在一些实施例中，可检测部分具有在约760nm至约1mm、约770nm至约1mm或约780nm至约1mm之间的波长。
在一些实施例中，可检测部分具有大于约740nm的波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约750nm的波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约760nm的波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约765nm的波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约770nm的波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约775nm的波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约780nm的波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约785nm的波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约790nm的波长以及小于200nm的FWHM。
在一些实施例中，可检测部分具有大于约740nm的波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约750nm的波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约760nm的波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约765nm的波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约770nm的波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约775nm的波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约780nm的波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约785nm的波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约790nm的波长以及小于150nm的FWHM。
在一些实施例中，可检测部分具有大于约740nm的波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约750nm的波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约760nm的波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约765nm的波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约770nm的波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约775nm的波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约780nm的波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约785nm的波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约790nm的波长以及小于100nm的FWHM。
在一些实施例中，可检测部分具有大于约740nm的波长以及小于70nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约750nm的波长以及小于70nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约760nm的波长以及小于70nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约765nm的波长以及小于70nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约770nm的波长以及小于70nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约775nm的波长以及小于70nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约780nm的波长以及小于70nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约785nm的波长以及小于70nm的FWHM。在一些实施例中，可检测部分具有大于约790nm的波长以及小于70nm的FWHM。
在一些实施例中，可检测部分包含或衍生自七甲川菁核(即，可检测部分包含七甲川菁核)。
在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)一个或多个吸电子基团(其中各吸电子基团可以相同或不同)。在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)一个吸电子基团。在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)两个吸电子基团。在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)三个吸电子基团。在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)三个不同的吸电子基团。在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)四个吸电子基团。
在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)一个或多个供电子基团(其中各吸电子基团可以相同或不同)。在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)一个供电子基团。在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)两个供电子基团。在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)三个供电子基团。在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)三个不同的供电子基团。在一些实施例中，七甲川菁核包含(或被修饰为包含)供个供电子基团。
在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有在约780nm至约950nm范围内的波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有在约810nm至约920nm范围内的波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有在约840nm至约880nm范围内的波长。
在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有范围为约780nm至约950nm的波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有范围为从约810nm至约920nm的波长和小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有范围为从约840nm至约880nm的波长以及小于约200nm的FWHM。
在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有范围为约780nm至约950nm的波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有范围为从约810nm至约920nm的波长和小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有范围为从约840nm至约880nm的波长以及小于约150nm的FWHM。
在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有范围为约780nm至约950nm的波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有范围为从约810nm至约920nm的波长和小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有范围为从约840nm至约880nm的波长以及小于约100nm的FWHM。
在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约950+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约945+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约940+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约935+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约930+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约925+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约920+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约915+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约910+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约905+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约900+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约895+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约890+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约885+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约880+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约870+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约865+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约860+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约855+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约850+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约845+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约840+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约835+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约830+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约825+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约820+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约815+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约800+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约795+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约790+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约785+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约780+/-10nm的峰吸收波长。
在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约950+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约945+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约940+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约935+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约930+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约925+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约920+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约915+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约910+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约905+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约900+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约895+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约890+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约885+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约880+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约870+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约865+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约860+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约855+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约850+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约845+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约840+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约835+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约830+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约825+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约820+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约815+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约800+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约795+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约790+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约785+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约780+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。
在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约950+/-150nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约945+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约940+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约935+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约930+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约925+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约920+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约915+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约910+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约905+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约900+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约895+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约890+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约885+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约880+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约870+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约865+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约860+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约855+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约850+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约845+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约840+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约835+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约830+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约825+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约820+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约815+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约800+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约795+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约790+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约785+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约780+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。
在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约950+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约945+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约940+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约935+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约930+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约925+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约920+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约915+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约910+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约905+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约900+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约895+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约890+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约885+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约880+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约870+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约865+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约860+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约855+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约850+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约845+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约840+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约835+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约830+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约825+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约820+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约815+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约800+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约795+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约790+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约785+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有七甲川菁核的可检测部分具有约780+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。
在一些实施例中，可检测部分包含或衍生自克酮酸盐核(即，可检测部分包含克酮酸盐核)。在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)一个或多个吸电子基团(其中各吸电子基团可以相同或不同)。在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)一个吸电子基团。在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)两个吸电子基团。在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)三个吸电子基团。在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)三个不同的吸电子基团。在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)四个吸电子基团。
在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)一个或多个供电子基团(其中各吸电子基团可以相同或不同)。在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)一个供电子基团。在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)两个供电子基团。在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)三个供电子基团。在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)三个不同的供电子基团。在一些实施例中，克酮酸盐核包含(或被修饰为包含)四个供电子基团。
在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有在约780nm至约900nm范围内的波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有在约800nm至约880nm范围内的波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有在约820nm至约860nm范围内的波长。
在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有范围为约780nm至约900nm的波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有范围为约800nm至约880nm的波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有范围为约820nm至约860nm的波长以及小于200nm的FWHM。
在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约900+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约895+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约890+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约885+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约880+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约870+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约865+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约860+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约855+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约850+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约845+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约840+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约835+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约830+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约825+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约820+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约815+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约800+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约795+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约790+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约785+/-10nm的峰吸收波长。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约780+/-10nm的峰吸收波长。
在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约900+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约895+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约890+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约885+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约880+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约870+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约865+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约860+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约855+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约850+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约845+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约840+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约835+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约830+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约825+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约820+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约815+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约800+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约795+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约790+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约785+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约780+/-10nm的峰吸收波长以及小于200nm的FWHM。
在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约900+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约895+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约890+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约885+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约880+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约870+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约865+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约860+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约855+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约850+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约845+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约840+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约835+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约830+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约825+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约820+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约815+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约800+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约795+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约790+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约785+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约780+/-10nm的峰吸收波长以及小于150nm的FWHM。
在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约900+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约895+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约890+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约885+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约880+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约870+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约865+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约860+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约855+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约850+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约845+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约840+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约835+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约830+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约825+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约820+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约815+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约800+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约795+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约790+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约785+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。在一些实施例中，具有克酮酸盐核的可检测部分具有约780+/-10nm的峰吸收波长以及小于100nm的FWHM。
包括七甲川菁核或克酮酸盐核的可检测部分的非限制性实例包括：
其中符号是指可检测部分(此处包括七甲川菁核或克酮酸盐核)偶联(直接或间接)到可检测缀合物的另一部分(例如，酪酰胺部分、醌甲基化物部分、能够或参与“点击化学”反应的官能团、抗体、酶、半抗原等)的位点。本文公开了其他实例。
适用于与目前公开的方法一起使用的其他可检测部分包含任何具有重氮核的那些，诸如美国专利第10,041,950号中公开的那些，该专利的公开内容全文通过引用并入本文。
美国专利第10,041,950号中公开了具有在紫外光谱或红外光谱内的波长并且合适的其他可检测部分，该专利的公开内容全文通过引用并入本文。
包括偶联到(ii)可检测部分的(i)酪酰胺或醌甲基化物部分的可检测缀合物的非限制性实例包括以下：
可见
可见
可见
不可见(N-甲基香豆素)
IR804(不可见)
可见(亚甲蓝衍生物)
可见，罗丹明(Rh614)
可见亚甲蓝衍生物
N-甲基香豆素作为亚磷酰胺(不可见)。
包括偶联到(ii)可检测部分的(i)能够参与点击化学反应的官能团的可检测缀合物的非限制性实例包括以下：
最大波长＝410，
380至390nm
390至400nm
380至390nm
甲氧基香豆素，360nm
390至400nm
不可见380nm
不可见，c.a.410至430nm
蓝色，在615nm附近可见
可见，蓝色
可见，蓝色
可见，蓝色
不可见，IR804，828nm
850nm815nmIR870、869nm900-920nm850nm860-870nm
870至900nm
900+nm
880至900nm900-910nm
最大波长＝804nm
855nm(克酮酸盐)
865nm克酮酸盐以及
875nm克酮酸盐
本领域技术人员将认识到，虽然每个示例性化合物均包括叠氮化物基团(即，N3)，但能够参与“点击化学”反应的另一官能团可以取代叠氮化物基团，包括下表1中列出的任何点击官能团：
表1：能够参与点击化学反应的反应性光能团。
能够参与点击化学反应的反应性官能团
炔烃
叠氮化物
二芳基环辛炔(“DBCO”)
烯烃
反式环辛烯(“TCO”)
马来酰亚胺
DBCO
醛或酮
四嗪
硫醇
1，3-硝酮
肼
羟基胺
四嗪
在一些实施例中，可检测缀合物选自以下：
羟基香豆素
方法
本公开也涉及用一种或多种常规染料(“普通染色剂”或“特殊染色剂”)对生物学样本进行染色并且用一个或多个可检测部分进一步标记该生物学样本内的一种或多种生物标志物的方法。在一些实施例中，一种或多种常规染料在可见光谱内可检测。例如，一种或多种常规染料具有范围为从约400nm至约700nm之间的峰吸收波长。在一些实施例中，一个或多个可检测部分在可见光谱之外可检测，例如，在紫外光谱内或红外光谱内。在一些实施例中，至少两种生物标志物用两个不同的可检测部分标记。在其他实施例中，至少三种生物标志物用三个不同的可检测部分标记。在其他实施例中，至少四种生物标志物用四种不同的可检测部分标记。在另外的实施例中，五种或更多种生物标志物用五个或更多个不同的可检测部分标记。
参考图1A，在一些实施例中，生物学样本用第一常规染料进行染色(步骤101)。在一些实施例中，第一常规染料选自苏木精、伊红、酸性品红、阿尔新蓝8GX、茜素红S、金胺O、偶氮胭脂红B、偶氮胭脂红G、天青A、天青B、天青C、碱性品红、俾斯麦棕Y、亮甲酚蓝、亮绿、胭脂红、氯唑黑E、刚果红、甲酚紫、结晶紫、达罗红、乙基绿、固绿FCF、异硫氟酸荧光素、姬姆萨染色剂、靛蓝胭脂红、詹纳斯绿B、哲纳尔氏染色素1899、浅绿SF、孔雀石绿、马休黄、甲基橙、甲基紫2B、亚甲蓝、亚甲蓝、亚甲紫(Bernthsen)、中性红、苯胺黑、尼罗蓝A、核固红、油红O、橙黄G、橙黄II、地衣红、副品红、根皮红B、蛋白银S、派洛宁B、派洛宁Y、刃天青、玫瑰红、番红O、苏丹黑B、苏丹III、苏丹IV、四铬染色(MacNeal)、硫堇、甲苯胺蓝、Weigert 1878、瑞氏色素(1908)及它们的任何组合。
在一些实施例中，可以用不同的常规染料重复步骤101多次(步骤102)。以这种方式，生物学样本可以用一种或多种常规染料进行染色。例如，生物学样本可以用苏木精和伊红染色。在一些实施例中，一种或多种常规染料在可见光谱内可检测。例如，一种或多种常规染料具有范围在约400nm至约700nm之间的峰吸收波长。
接下来，第一生物标志物用第一可检测部分标记(步骤103)，其中该第一可检测部分产生在可见光谱之外可检测的信号。在一些实施例中，第二可检测部分在紫外光谱内或红外光谱内可检测。在一些实施例中，第一可检测部分包含具有香豆素核、七甲川菁核或克酮酸盐核的可检测部分。
在一些实施例中，重复步骤103多次(步骤104)以用一个或多个可检测部分标记一种或多种生物标志物，其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分彼此不同，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分在可见光谱之外。在一些实施例中，也可以根据需要重复步骤103和104(步骤105)。随后，检测一种或多种常规染料和一个或多个可检测部分的信号(步骤106)。图26A至图26E示出检测和解混信号的方法。在一些实施例中，通过组合来自一种或多种常规染料的一个或多个信号与来自一个或多个可检测部分的一个或多个信号生成生物学样本的合成图像。在一些实施例中，来自所生成的图像内的一个或多个可检测部分的一个或多个信号包括假色。
在一些实施例中，先执行步骤103或104；随后执行步骤101和102(参见，例如，图1B)。在其他实施例中，顺序执行步骤101和103，并且然后重复步骤101和103一次或多次。在又一些实施例中，同时执行步骤101和103。
在其中一种或多种生物标志物用一个或多个可检测部分(例如，在可见光谱之外可检测的可检测部分)标记的那些实施例中，选择该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分，使得可检测部分中的每个可检测部分具有(i)不同的峰吸收波长，(ii)具有在可见光谱之外的峰吸收波长(例如，具有小于约430nm的峰吸收波长或具有大于670nm的峰吸收波长)和/或(iii)具有不基本上重叠的峰吸收波长(例如，不同的峰吸收波长相差至少20nm、至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少110nm、至少120nm、至少130nm、至少140nm、至少150nm、至少170nm、至少190nm、至少210nm、至少230nm、至少250nm、至少270nm、至少290nm、至少310nm等)。在一些实施例中，进一步选择可检测部分，使得它们的峰吸收波长不与应用于生物学样本的常规染料的峰吸收波长重叠(无论峰吸收波长出现在光谱中的何处)。例如，第一生物标志物和第二生物标志物可以用第一可检测部分和第二可检测部分标记，其中该第一可检测部分和该第二可检测部分是不同的，均在可见光谱之外，并且其峰吸收波长基本上不重叠。在一些实施例中，第一生物标志物和第二生物标志物可以用第一可检测部分和第二可检测部分标记，其中该第一可检测部分和该第二可检测部分是不同的，均在可见光谱之外，并且其峰吸收波长相差至少20nm、30nm、40nm、50nm、60nm等。
在一些实施例中，一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少20nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少30nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于200nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少40nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少50nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少70nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约200nm的FWHM。
在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少20nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少30nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少40nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少50nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少70nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约150nm的FWHM。
在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少20nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少30nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少40nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少50nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少70nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约100nm的FWHM。
在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少20nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约70nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少30nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约70nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少40nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约70nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少50nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约70nm的FWHM。
在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少20nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约50nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少30nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约50nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少40nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约50nm的FWHM。
本文描述了标记生物学样本(诸如用常规染料进行预染色或随后用常规染料进行染色的生物学样本)中的一种或多种生物标志物的两种方法。第一种方法利用缀合至酪酰胺或醌甲基化物部分(直接缀合或通过一个或多个接头间接缀合)的可检测部分(包括本文所述的那些中的任一者)。第二种方法利用缀合(直接缀合或通过一个或多个接头间接缀合)至能够参与点击化学反应的反应性官能团的可检测部分(包括本文所述的那些中的任意一者)。美国专利第10,041,950号以及美国专利公开第2019/0204330、2017/0089911和2019/0187130号中描述了使用酪酰胺化学、醌甲基化物化学和点击化学检测生物学样本中的靶标的方法和试剂，其公开内容据此全文通过引用并入本文。
在两种方法中，首先用酶标记生物学样本中的一种或多种生物标志物。换句话说，这两种方法的第一步都是形成一种或多种生物标志物-酶复合物。在一些实施例中，一种或多种生物标志物-酶复合物用作本文所述的两种方法中的任一种方法中的进一步反应的中间体。用于标记一种或多种生物标志物的合适的酶包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶或β-内酰胺酶。在一些实施例中，一种或多种生物标志物用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记。在一些实施例中，一种或多种生物标志物各自用相同的酶标记。在其他实施例中，一种或多种生物标志物用不同的酶标记。
为了促进用酶标记一种或多种生物标志物，在一些实施例中，将对一种或多种生物标志物具有特异性的一种或多种特异性结合实体引入生物学样本。参考图2A和图2B，在一些实施例中，对一种或多种生物标志物具有特异性的一种或多种特异性结合实体为一抗(步骤201、211)。在引入一抗之后，可以引入各自缀合至标记物(直接缀合或通过接头间接缀合)的一种或多种二抗，其中该二抗对该一抗具有特异性(例如，该二抗为抗一抗抗体)(步骤202、212)。在一些实施例中，二抗中的每种二抗的标记物为酶，包括上述那些中的任一者(参见图2B的步骤212)。
在其他实施例中，一种或多种二抗的标记物为半抗原(参见图2A的步骤202)。半抗原的非限制性实例包括噁唑、吡唑、噻唑、苯并呋咱、三萜烯、脲、除罗丹明硫脲外的硫脲、除二硝基苯基或三硝基苯基外的硝基芳基、类鱼藤酮、环木脂体、杂联芳基、偶氮芳基、苯二氮2，3，6，7-四氢-11-氧代-1H，5H，11H-[1]苯并吡喃酮[6，7，8-ij]喹嗪-10-甲酸或7-二乙基氨基-3-羧基香豆素。其他合适的半抗原公开于美国专利第8,846,320号中，该美国专利的公开内容通过引用全文并入本文。在其中二抗缀合至半抗原的那些实施例中，可以将缀合至酶(包括上述那些中的任一者)的抗半抗原抗体引入生物学样本中，以用一种或多种酶标记靶标(步骤203)。随后，可以将合适的检测试剂引入生物学样本中，以促进用一个或多个可检测部分(包含本文所述的可检测部分中的任一可检测部分)标记一种或多种生物标志物(现在间接偶联至酶)(步骤204、214)。图2A和2B中的步骤可重复任意多次(参见步骤205和215)。
在一些实施例中，一种或多种特异性结合实体为一抗缀合物和/或核酸探针缀合物。在一些实施例中，一种或多种特异性结合实体为与酶偶联的一抗缀合物。在一些实施例中，一抗缀合物缀合至辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。在其他实施例中，一种或多种特异性结合实体为缀合至酶(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的核酸探针。对缀合至酶的一种或多种特异性结合实体的引入促进一种或多种生物标志物-酶复合物的形成。
在一些实施例中，一种或多种特异性结合实体为偶联至半抗原的一抗缀合物和/或缀合至半抗原(包括美国专利第8,846,320号中所述的那些半抗原中的任一者，该美国专利的公开内容全文通过引用并入本文)的一种或多种核酸探针。在这些实施例中，对缀合至半抗原的一种或多种特异性结合实体的引入促进一种或多种半抗原标记的生物标志物的形成。在这些实施例中，将对一种或多种半抗原标记的生物标志物的半抗原具有特异性的一种或多种抗半抗原抗体-酶缀合物引入生物学样本中，以便用酶标记该一种或多种半抗原标记的生物标志物，以提供一种或多种生物标志物-酶复合物。一抗缀合物、二抗和/或核酸探针可以根据本领域普通技术人员已知的程序引入样品中，以实现用酶并且如本文所示那样对生物学样本中的一种或多种靶标进行标记。
在本文中更详细地描述了上述方法中的每种方法，包括用一种或多种常规染料对生物学样本进行染色的步骤(其中用常规染料进行的染色可以发生在用一个或多个可检测部分标记一种或多种生物标志物之前或之后)。
使用酪酰胺和/或醌甲基化物缀合物检测生物学样本中的一种或多种标记的生物 标志物的方法，其中该生物学样本用一种或多种常规染料进行染色
本公开也涉及以下方法：(i)用在可见光谱内可检测的一种或多种常规染料(包括本文所述的“普通染色剂”或“特殊染色剂”中的任一者)对生物学样本进行染色；以及(ii)用一种或多种可检测缀合物标记该生物学样本内的一种或多种生物标志物，其中该可检测缀合物中的每种可检测缀合物包含(i)酪酰胺和/或醌甲基化物部分和(ii)具有在可见光谱之外的峰吸收波长的可检测部分。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有在紫外光谱或红外光谱内的峰吸收波长。在一些实施例中，一个或多个可检测部分各自具有小于约430nm或大于约670nm的峰吸收波长。
在一些实施例中，并参考图3，生物学样本首先用第一常规染料进行染色(步骤301)。可以重复步骤301一次或多次以提供用一种或多种常规染料进行染色的生物学样本。例如，生物学样本可以同时被苏木精和伊红染色。在一些实施例中，一种或多种常规染料为普通染色剂。在一些实施例中，一种或多种常规染料为特殊染色剂。在一些实施例中，一种或多种常规染料选自苏木精、伊红、酸性品红、阿尔新蓝8GX、茜素红S、金胺O、偶氮胭脂红B、偶氮胭脂红G、天青A、天青B、天青C、碱性品红、俾斯麦棕Y、亮甲酚蓝、亮绿、胭脂红、氯唑黑E、刚果红、甲酚紫、结晶紫、达罗红、乙基绿、固绿FCF、异硫氰酸荧光素、姬姆萨染色剂、靛蓝胭脂红、詹纳斯绿B、哲纳尔氏染色素1899、浅绿SF、孔雀石绿、马休黄、甲基橙、甲基紫2B、亚甲蓝、亚甲蓝、亚甲紫(Bemthsen)、中性红、苯胺黑、尼罗蓝A、核固红、油红O、橙黄G、橙黄II、地衣红、副品红、根皮红B、蛋白银S、派洛宁B、派洛宁Y、刃天青、玫瑰红、番红O、苏丹黑B、苏丹III、苏丹IV、四铬染色(MacNeal)、硫堇、甲苯胺蓝、Weigert 1878和瑞氏色素(1908)。在一些实施例中，一种或多种常规染料为苏木精和伊红。
接下来，生物学样本内的第一生物标志物用第一酶标记(步骤303)以形成第一生物标志物-酶复合物。用第一酶标记第一生物标志物的方法如上所述，并且也在图2A和图2B中示出。然后使包括第一生物标志物-酶复合物的生物学样本与第一可检测缀合物接触(步骤304)，该第一可检测缀合物包含具有在可见光谱(包括本文所述的那些中的任一者)之外的峰吸收波长的第一可检测部分以及酪酰胺、醌甲基化物或它们的衍生物或类似物。在第一生物标志物-酶复合物的第一酶与第一可检测缀合物的酪酰胺醌甲基化物部分相互作用时，该第一可检测缀合物的至少第一可检测部分沉积在第一生物标志物靶标的近端或其上(另外参见图4和图5，其示出可检测部分在生物学样本内的靶分子的近端或其上的沉积，其中靶分子5或50可以为生物标志物)。
用酶(步骤303)并且随后用可检测部分(步骤304)标记生物标志物的步骤可以任何次数并针对生物标记物内的任何不同类型的生物标志物(例如，蛋白质、核酸)重复(步骤305)。在一些实施例中，生物学样本内的每种生物标志物用不同的可检测部分标记。例如，Ki-67生物标志物可以用具有小于50nm的FWHM和在330nm与390nm之间的峰吸收波长的可检测部分标记：并且PD-L1生物标志物可以用具有小于50nm的FWHM和在760nm与820nm之间的峰吸收波长的可检测部分标记。
最后，检测一种或多种常规染料和一个或多个可检测部分的信号(步骤106)。图26A至图26E示出检测和解混信号的方法。在一些实施例中，通过用特定于可检测部分的波长下的光照射生物学样本来检测一个或多个可检测部分。PCT申请第WO/2014/143155号中描述了检测来自一个或多个可检测部分的一个或多个信号的方法，该申请的公开内容据此全文通过引用并入本文。在一些实施例中，通过组合来自一种或多种常规染料的一个或多个信号与来自一个或多个可检测部分的一个或多个信号生成生物学样本的合成图像。在一些实施例中，来自所生成的图像内的一个或多个可检测部分的一个或多个信号包括假色(参见，例如，图26E)。
在其中一种或多种生物标志物用一个或多个可检测部分(例如，在可见光谱之外可检测的可检测部分)标记的那些实施例中，选择该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分，使得可检测部分中的每个可检测部分具有(i)不同的峰吸收波长，(ii)具有在可见光谱之外的峰吸收波长(例如，具有小于约430nm的峰吸收波长或具有大于670nm的峰吸收波长)和/或(iii)具有不基本上重叠的峰吸收波长(例如，不同的峰吸收波长相差至少20nm、至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少110nm、至少120nm、至少130nm、至少140nm、至少150nm、至少170nm、至少190nm、至少210nm、至少230nm、至少250nm、至少270nm、至少290nm、至少310nm等)。在一些实施例中，进一步选择可检测部分，使得它们的峰吸收波长不与应用于生物学样本的常规染料的峰吸收波长重叠(无论峰吸收波长出现在光谱中的何处)。例如，第一生物标志物和第二生物标志物可以用第一可检测部分和第二可检测部分标记，其中该第一可检测部分和该第二可检测部分是不同的，均在可见光谱之外，并且其峰吸收波长基本上不重叠。在一些实施例中，第一生物标志物和第二生物标志物可以用第一可检测部分和第二可检测部分标记，其中该第一可检测部分和该第二可检测部分是不同的，均在可见光谱之外，并且其峰吸收波长相差至少20nm、30nm、40nm、50nm、60nm等。
在一些实施例中，一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少20nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少30nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于200nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少40nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少50nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少70nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约200nm的FWHM。
在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少20nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少30nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少40nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少50nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少70nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约150nm的FWHM。
在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少20nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少30nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少40nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少50nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少70nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约100nm的FWHM。
在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少20nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于70nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少30nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于70nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少40nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于70nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少50nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于70nm的FWHM。
图4和图5进一步示出在引入生物学样本中的各种组分之间发生的反应。参考图4，首先将特异性结合实体15引入具有靶标5的生物学样本中，以形成靶标-检测探针复合物。在一些实施例中，靶标5为生物标志物，并且所形成的靶标-检测探针复合物为生物标志物-检测探针复合物。在一些实施例中，特异性结合实体15为一抗。随后，将标记缀合物25引入生物学样本中，该标记缀合物25包括至少一种与其缀合的酶。在所示实施例中，标记缀合物25为二抗，其中该二抗为缀合至酶的抗物种抗体。接下来，引入可检测缀合物10，诸如包括本文所述的直接或间接偶联至醌甲基化物部分或其衍生物或类似物的可检测部分中的任何可检测部分的可检测缀合物。在酶(例如，AP或β-Gal)与可检测缀合物10相互作用时，该可检测缀合物10经历结构、构象或电子变化20，以形成组织反应性中间体30。在该特定实施例中，可检测缀合物包含醌甲基化物前体部分，该醌甲基化物前体部分在与(标记缀合物25的)碱性磷酸酶相互作用时，导致氟离去基团放出，得到相应的醌甲基化物中间体30。然后醌甲基化物中间体30与组织近端或直接在组织上形成共价键，以形成可检测部分复合物40。然后，来自可检测部分复合物40的信号可以根据本领域普通技术人员已知的方法进行检测，诸如美国专利第10,041,950号以及美国专利公开第2019/0204330、2017/0089911和2019/0187130号以及PCT公开第WO/2014/143155号中所述的那些，其公开内容据此全文通过引用并入本文。图4的步骤可以针对靶标内的一种或多种生物标志物重复。
参考图5，首先将特异性结合实体55引入具有靶标50的生物学样本中，以形成靶标-检测探针复合物，并且所形成的靶标-检测探针复合物为生物标志物标志物-检测探针复合物。在一些实施例中，特异性结合实体55为一抗。随后，将标记缀合物60引入生物学样本中，该标记缀合物60包括至少一种与其缀合的酶。在所示实施例中，标记缀合物为二抗，其中该二抗为缀合至酶的抗物种抗体。接下来，引入可检测缀合物70，诸如包括本文所述的直接或间接偶联至酪酰胺部分或其衍生物或类似物的任何可检测部分的可检测缀合物。在酶与可检测缀合物70相互作用时，形成组织反应性中间体80。在该特定实施例中，可检测缀合物70包含酪酰胺部分，该酪酰胺部分在与辣根过氧化物酶相互作用时，引起自由基物种80的形成。然后自由基物质80与组织近端或直接在组织上形成共价键，以形成可检测部分复合物90。然后，来自可检测部分复合物90的信号可以根据本领域普通技术人员已知的方法进行检测，诸如美国专利第10,041,950号以及美国专利公开第2019/0204330、2017/0089911和2019/0187130号以及PCT公开第WO/2014/143155号中所述的那些，其公开内容据此全文通过引用并入本文。图5的步骤可以针对靶标内的一种或多种生物标志物重复。
在一些实施例中，将生物学样本用酶灭活组合物预处理，以基本上或完全灭活内源性过氧化物酶活性。例如，一些细胞或组织含有内源性过氧化物酶。使用HRP缀合的抗体可能导致高的、非特异性背景染色。该非特异性背景可通过用本文所公开的酶灭活组合物对样品进行预处理来减小。在一些实施例中，将样品仅用过氧化氢(约1重量％至约3重量％的适当的预处理溶液)进行预处理，以降低内源性过氧化物酶活性。一旦内源性过氧化物酶活性降低或失活，即可加入检测试剂盒，然后灭活检测试剂盒中存在的酶(如上所述)。所公开的酶失活组合物和方法也可用作灭活内源性酶过氧化物酶活性的方法。另外的灭活组合物描述于美国专利公开第2018/0120202号中，其公开内容据此通过引用全文并入本文。
在一些实施例中，如果样本是嵌入石蜡中的样品，则可使用一种或多种适当的去石蜡液对该样品进行脱蜡。在废物清除器去除去石蜡流体后，可连续地将任意数量的物质施加至样本上。这些物质可以用于预处理(例如，蛋白质交联、暴露核酸等)、变性、杂交、洗涤(例如，严格洗涤)、检测(例如，将显示或标志物分子与探针连接)、扩增(例如，扩增蛋白质、基因等)、复染、盖片等。
美国专利第8,658,389和8,686,122号中列出用于本公开的方法的其他缀合物，这些专利的公开内容全文通过引用并入本文。例如，美国专利第8,658,389号公开了包括共价连接到信号生成部分的抗体的缀合物。
使用一对点击缀合物检测样品中的靶标的方法
本公开也涉及以下方法：(i)用可见光谱内可检测的一种或多种常规染色剂(包括本文所述的任何“普通染色剂”或“特殊染色剂”中的任一者)对生物学样本进行染色；以及(ii)用一对点击缀合物标记该生物学样本中的一个或多个生物标志物。在这些测定中，点击缀合物对的一个成员包含可检测缀合物，该可检测缀合物包含：(i)能够参与点击化学反应的第一官能团，以及(ii)可检测部分，包括本文所述的任何可检测部分。合适的可检测缀合物的非限制性实例如本文所述。点击缀合物对(以下称为“组织反应性缀合物”)的另一成员包含缀合物，该缀合物包含：(i)酪酰胺部分、醌甲基化物部分或者酪酰胺部分或醌甲基化物部分的衍生物类似物；以及(ii)能够与可检测缀合物的第一官能团反应的第二官能团。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有在紫外光谱或红外光谱内的峰吸收波长。在一些实施例中，一个或多个可检测部分各自具有小于约430nm或大于约670nm的峰吸收波长。与可检测缀合物和组织反应性缀合物偶联并且能够彼此反应的合适的第一官能团和第二官能团在表2中列出：
表2：能够在“点击化学”反应中相互反应的第一官能团和第二官能团。
合适的组织反应性缀合物的非限制性实例如下所示：
美国专利公开第2019/0204330、2017/0089911和2019/0187130号中描述了其他合适的“组织反应性缀合物”，这些专利的公开内容据此全文通过引用并入本文。
在一些实施例中，并参考图6，生物学样本首先用第一常规染料进行染色(步骤601)。可以重复步骤601一次或多次以提供用一种或多种常规染料进行染色的生物学样本(步骤602)。在一些实施例中，一种或多种常规染料为普通染色剂。在一些实施例中，一种或多种常规染料为特殊染色剂。在一些实施例中，一种或多种常规染料选自苏木精、伊红、酸性品红、阿尔新蓝8GX、茜素红S、金胺O、偶氮胭脂红B、偶氮胭脂红G、天青A、天青B、天青C、碱性品红、俾斯麦棕Y、亮甲酚蓝、亮绿、胭脂红、氯唑黑E、刚果红、甲酚紫、结晶紫、达罗红、乙基绿、固绿FCF、异硫氰酸荧光素、姬姆萨染色剂、靛蓝胭脂红、詹纳斯绿B、哲纳尔氏染色素1899、浅绿SF、孔雀石绿、马休黄、甲基橙、甲基紫2B、亚甲蓝、亚甲蓝、亚甲紫(Bernthsen)、中性红、苯胺黑、尼罗蓝A、核固红、油红O、橙黄G、橙黄II、地衣红、副品红、根皮红B、蛋白银S、派洛宁B、派洛宁Y、刃天青、玫瑰红、番红O、苏丹黑B、苏丹III、苏丹IV、四铬染色(MacNeal)、硫堇、甲苯胺蓝、Weigert 1878、瑞氏色素(1908)及它们的组合。在一些实施例中，一种或多种常规染料为苏木精和伊红。
随后，生物学样本内的第一生物标志物用第一酶标记(步骤603)以形成第一生物标志物-酶复合物。用第一酶标记第一生物标志物的方法如上所述，并且也在图2A和图2B中示出。然后使生物学样本与第一组织反应性缀合物接触(步骤604)，该第一组织反应性缀合物包含酪酰胺、醌甲基化物或它们的衍生物或类似物和能够参与点击化学反应的第一官能团(包括本文表1和表2中所述的那些中的任一者)。组织反应性缀合物的非限制性实例如本文所提供。在第一生物标志物-酶复合物的第一酶与第一组织反应性缀合物的酪酰胺或醌甲基化物部分相互作用时，至少第一固定化组织-点击缀合物复合物沉积在第一生物标志物靶标的近端或其上(另外参见图8和图9，其进一步示出可能发生的“点击化学”反应以及所得“第一固定化组织-点击缀合物复合物”和“第一固定化组织-点击加合物复合物”的形成)。在形成第一固定化组织-点击缀合物复合物之后，然后使生物学样本与第一可检测缀合物接触，该第一可检测缀合物包含：(i)能够与第一固定化组织-点击缀合物复合物的第一反应性官能团反应的第二官能团和(ii)第一可检测部分(步骤605)，包括本文所述的可检测部分中的任一者。第一固定化组织-点击缀合物复合物与第一可检测缀合物的反应产物产生可检测的第一固定化组织-点击加合物复合物。
可以针对生物学样本内的任何数量的生物标志物重复上述过程(步骤603、604和605)(步骤606)。在一些实施例中，每个生物标志物用不同的可检测部分标记。例如，Ki-67生物标志物可以用具有小于50nm的FWHM和在330nm与390nm之间的峰吸收波长的可检测部分标记；并且PD-L1生物标志物可以用具有小于50nm的FWHM和在760nm与820nm之间的峰吸收波长的可检测部分标记。
最后，检测一种或多种常规染料和一个或多个可检测部分的信号(步骤607)。图26A至图26E示出检测和解混信号的方法。在一些实施例中，通过用特定于可检测部分的波长下的光照射生物学样本来检测一个或多个可检测部分。PCT申请第WO/2014/143155号中描述了检测来自一个或多个可检测部分的一个或多个信号的方法，该申请的公开内容据此全文通过引用并入本文。在一些实施例中，通过组合来自一种或多种常规染料的一个或多个信号与来自一个或多个可检测部分的一个或多个信号生成生物学样本的合成图像。在一些实施例中，来自所生成的图像内的一个或多个可检测部分的一个或多个信号包括假色(参见，例如，图26E)。
在其中一种或多种生物标志物用一个或多个可检测部分(例如，在可见光谱之外可检测的可检测部分)标记的那些实施例中，选择该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分，使得可检测部分中的每个可检测部分具有(i)不同的峰吸收波长，(ii)具有在可见光谱之外的峰吸收波长(例如，具有小于约430nm的峰吸收波长或具有大于670nm的峰吸收波长)和/或(iii)具有不基本上重叠的峰吸收波长(例如，不同的峰吸收波长相差至少20nm、至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少110nm、至少120nm、至少130nm、至少140nm、至少150nm、至少170nm、至少190nm、至少210nm、至少230nm、至少250nm、至少270nm、至少290nm、至少310nm等)。在一些实施例中，进一步选择可检测部分，使得它们的峰吸收波长不与应用于生物学样本的常规染料的峰吸收波长重叠(无论峰吸收波长出现在光谱中的何处)。例如，第一生物标志物和第二生物标志物可以用第一可检测部分和第二可检测部分标记，其中该第一可检测部分和该第二可检测部分是不同的，均在可见光谱之外，并且其峰吸收波长基本上不重叠。在一些实施例中，第一生物标志物和第二生物标志物可以用第一可检测部分和第二可检测部分标记，其中该第一可检测部分和该第二可检测部分是不同的，均在可见光谱之外，并且其峰吸收波长相差至少20nm、30nm、40nm、50nm、60nm等。
在一些实施例中，一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少20nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中该一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少30nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于200nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少40nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少50nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约200nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少70nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约200nm的FWHM。
在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少20nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少30nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少40nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少50nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约150nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少70nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约150nm的FWHM。
在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少20nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少30nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少40nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少50nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约100nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少70nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于约100nm的FWHM。
在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少20nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于70nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少30nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于70nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少40nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于30nm的FWHM。在一些实施例中，一个或多个可检测部分具有不同的峰吸收波长，其中一个或多个可检测部分的不同峰吸收波长相隔至少50nm，并且其中该一个或多个可检测部分中的每个可检测部分具有小于70nm的FWHM。
图7和图8进一步示出具有组织反应性部分的一对点击缀合物的第一成员(10，20)与靶标结合酶(11，21)之间的反应，以形成固定化组织-点击缀合物复合物(13，23)。该扩大方法的第一部分类似于QMSA和TSA扩大方法中所用的部分。图8和图9示出固定化组织-点击缀合物(13，23)复合物与一对点击缀合物的第二成员(14，24)之间的后续反应，该后续反应用于提供包含可检测报告部分的固定化组织-点击加合物复合物(15，25)。
参考图7，使包括反应性官能团的组织反应性缀合物(10)与靶标结合酶(11)接触，以产生反应性中间体(12)。在一些实施例中，靶标结合酶(11)为生物标志物结合酶。在该实例中，反应性中间体、醌甲基化物与生物学样本上或该生物学样本内的亲核试剂形成共价键，从而提供固定化组织点击-缀合物复合物(13)。然后，固定化组织-点击缀合物复合物可以与具有本文所述的任何可检测部分的可检测缀合物14反应，前提条件是该组织反应性缀合物10和可检测缀合物14具有可以彼此反应以形成共价键的反应性官能团。固定化组织-点击缀合物复合物13与点击缀合物14的反应产物产生固定化组织-点击加合物复合物15。组织-点击加合物15可借助由连接的可检测部分所发射的信号来检测。在一些实施例中，图7的步骤可以针对任何数量的生物标志物重复。
类似地并且参照图8，使包含反应性官能团的组织反应性缀合物20与靶标结合酶21接触，以产生反应性中间体22，即酪酰胺自由基物种(或其衍生物)。在一些实施例中，靶标结合酶(21)为生物标志物结合酶。然后，酪酰胺自由基中间体可以与生物学样本形成共价键，从而提供固定化组织-点击缀合物复合物(23)。然后，固定化组织-点击缀合物复合物可以与包含本文所述的任何可检测部分的可检测缀合物24反应，前提条件是组织反应性缀合物与可检测缀合物20和24分别具有可以彼此反应以形成共价键的反应性官能团。固定化组织-点击缀合物复合物23与点击缀合物24的反应产物产生组织-点击加合物复合物25。在一些实施例中，图8的步骤可以针对任何数量的生物标志物重复。
自动化
本公开的测定和方法可以是自动化的，并且可以与样本处理设备组合。样本处理设备可以是自动化设备，例如Ventana Medical Systems，Inc.销售的BENCHMARK XT仪器和DISCOVERY XT仪器。Ventana Medical Systems，Inc.是多项美国专利的代理人，这些专利公开了执行自动分析的系统和方法，包括美国专利第5,650,327号、第5,654,200号、第6,296,809号、第6,352,861号、第6,827,901号和第6,943,029号，以及美国已公布的专利申请第20030211630号和第20040052685号，其各自据此通过引用全文并入本文。替代地，还可以人工处理样本。
该样本处理设备可以将固定剂涂在样本上。固定剂可以包括交联剂(诸如醛类，例如，甲醛、聚甲醛和戊二醛，以及非醛类交联剂)、氧化剂(例如，金属离子和络合物，诸如四氧化二锇和铬酸)、蛋白质变性剂(例如，乙酸、甲醇和乙醇)、机理不明的固定剂(例如，氯化汞、丙酮和苦味酸)、组合试剂(例如，Carnoy固定剂、Methacarn、Bouin液、B5固定剂、Rossman液和Gendre液)、微波以及其他固定剂(例如，排除体积固定和蒸汽固定)。
如果样本为嵌入石蜡中的样品，可通过样本处理设备使用相应的去石蜡流体对样品进行去石蜡。在废物清除器去除去石蜡流体后，可连续地将任意数量的物质施加至样本上。这些物质可以用于预处理(例如，蛋白质交联、暴露核酸等)、变性、杂交、洗涤(例如，严格洗涤)、检测(例如，将显示或标志物分子与探针连接)、扩增(例如，扩增蛋白质、基因等)、复染、盖片等。
样本处理设备可以将各种不同的化学物质应用到样本。这些化学物质包括但不限于染色剂、探针、试剂、漂洗剂和/或调节剂。这些化学物质可以是流体(例如，气体、液体或气体/液体混合物)或类似物质。流体可以是溶剂(例如，极性溶剂、非极性溶剂等)、溶液(例如，水溶液或其他类型的溶液)或类似物质。试剂可以包括但不限于染色剂、润湿剂、抗体(例如，单克隆抗体、多克隆抗体等)、抗原回收液(例如，水基或非水基抗原修复液、抗原回收缓冲液等)或类似物质。探针可为分离的核酸或分离的合成寡核苷酸，其连接至可检测标记。标记可以包括放射性同位素、酶底物、辅助因子、配体、化学发光或荧光剂、半抗原和酶。
检测和/或成像
本发明所公开的实施例的某些方面或全部可实现自动化，并且由计算机分析和/或图像分析系统带来便利。在一些应用中，测量精确的颜色或荧光比率。在一些实施例中，利用光学显微镜进行图像分析。某些公开的实施例涉及采集数字图像。这可以通过将数码相机耦接至显微镜来完成。使用图像分析软件对获得的染色样品的数字图像进行分析。可以通过多种不同的方法来测量颜色或荧光。例如，颜色可以用红色、蓝色和绿色值以及色相、饱和度和强度值来衡量；和/或通过使用光谱成像相机测量特定的波长或波长范围。还可对样品进行定性和半定量评估。定性评估包括评估染色强度、鉴定阳性染色细胞和参与染色的细胞内结构以及评估总体样品或载玻片质量。对检测样品进行单独评估，并且该分析可包括与已知平均值的比较，以确定样品是否代表异常状态。
PCT申请第WO/2014/143155号中描述了合适的检测方法，该申请的公开内容全文通过引用并入本文。在一些实施例中，合适的检测系统包括成像设备、一个或多个镜头以及与成像设备通信的显示器。成像设备包括用于顺序发射能量的装置和用于捕获图像/视频的装置。在一些实施例中，定位用于捕获的装置以捕获样本图像，这些图像各自对应于暴露于能量的样本。在一些实施例中，用于捕获的装置可以包括定位在带有生物学样本的显微镜载玻片的正面和/或背面的一个或多个相机。在一些实施例中，显示装置包括显示器或屏幕。在一些实施例中，用于顺序发射能量的装置包括多个能量发射器。每个能量发射器可包括一个或多个IR能量发射器、UV能量发射器、LED光发射器、它们的组合或其他类型的能量发射装置。成像系统可进一步包括用于基于通过用于捕获的装置所捕获的样本图像来产生对比度增强的彩色图像数据的装置。显示装置显示基于对比度增强的彩色图像数据来显示样本。
附加的检测方法在图26A至图26E中示出，并在本文中进一步描述。
实例
实例1.一般单个和多重IHC程序。
与可检测部分一起使用的酶抗体缀合物为OmniMap抗Ms HRP(RUO)、DISCOVERY(VMSI目录号760-4310)、OmniMap抗Rb HRP(RUO)、DISCOVERY(VMSI目录号760-4311)、UltraMap抗Ms Alk Phos、DISCOVERY(VMSI目录号760-4312)和UltraMap抗Rb Alk Phos、DISCOVERY(VMSI目录号760-4314)。使用上述一抗和检测试剂在DISCOVERY Ultra系统上执行全自动多重化检测。使用Discovery Universal Procedure通用程序创建用于单个生物标志物IHC和多重IHC的方案。通常，除非另有说明，否则IHC在37℃执行，并且反应缓冲液洗涤溶液从10x浓缩物(目录号950-300)稀释。通过将载玻片温热至70℃进行3次循环(各8min长)，对载玻片固定的石蜡切片进行脱蜡。通过应用细胞前处理清洗1(VMSI目录号950-124)并温热载玻片至94℃达64min来执行抗原修复。对每种生物标志物的染色在连续步骤中执行，包括：与靶向该生物标志物的一抗一起孵育，在反应缓冲液中洗涤以去除未结合抗体，与缀合至过氧化物酶或碱性磷酸酶(具体取决于色原是酪酰胺还是醌甲基化物衍生物)靶向一抗(抗小鼠或抗兔抗体)的抗物种抗体一起孵育，用反应缓冲液洗涤，与酪酰胺修饰的DBCO或酪酰胺修饰的显色试剂或醌甲基化物前体修饰的显色试剂孵育，以及用反应缓冲液洗涤。对于酪酰胺，在加入酪酰胺之后加入稀H2O2以启动沉积。所有沉积步骤之后均在反应缓冲液中洗涤。如果使用酪酰胺修饰的DBCO，则将载玻片进一步与叠氮化物修饰的色原一起孵育，并洗涤。在多重IHC情况下，在依次对下一生物标志物进行染色之前，将载玻片与细胞前处理清洗2(VMSI目录号950-123)在100℃孵育8min，然后在反应缓冲液中洗涤。最后，载玻片可以在环境温度下通过乙醇系列(2x80％乙醇，每个1min；2x90％乙醇，每个1min；3x100％乙醇，每个1min；3x二甲苯，每个1min)进行手动脱水。一抗和酶-抗体缀合物按照制造商推荐的浓度、体积和孵育时间使用。在VMSI Discovery TSA稀释剂(目录号000060900)中，将酪酰胺修饰的可检测缀合物(诸如本文所述的那些)、酪酰胺-色原或酪酰胺-DBCO在25与1,200μM之间的浓度范围以100μL体积添加到载玻片中。将叠氮化物修饰的可检测缀合物以100μL的体积添加到TSA稀释剂中，通常浓度与用于酪酰胺-DBCO的浓度相同。可检测缀合物(包括本文所述的可检测部分)的溶液浓度反映了它们的峰吸收消光系数和生物标志物表达水平，并且对于7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酰(AMCA)，通常为1,200μM，对于7-羟基香豆素-3-羧基(HCCA)通常为400μM，对于7-二乙基氨基香豆素-3-羧基(DCC)，通常为600至800μM，以及对于Cy7可检测部分，通常为50至300μM。在TSA稀释剂中，将醌甲基化物前体修饰的Cy5添加到在100μL 400μM Cy5可检测部分中的载玻片。
实例2.常规组织学染色和可检测部分染色的显微镜和单相机单色成像。
对H&E加IHC样本的多光谱成像在Olympus BX-51显微镜(Olympus，Waltham，MA)上执行，该显微镜配备有CoolSNAP ES2 CCD相机和12位分辨率的1392x1040像素传感器(Teledyne Photometrics，Tucson，AZ)和LED照射，如前所述[Morrison LE，Lefever MR，Behman LJ，Leibold T，Roberts EA，Horchner UB，Bauer DR.Brightfield MultiplexImmunohistochemistry with Multispectral Imaging.Lab Invest(2020)https://doi.org/10.1038/s41374-020-0429-0]。显微镜物镜最初为Olympus UPlanSApo 20x(NA0.75)和10x(NA 0.40)空气物镜，但后来更新为具有改善的色差校正的UPLXAPO 20X(NA0.80)和UPLXAPO 10X(NA 0.4)物镜。照射由光学滤光的连续光源和LED照明器的组合提供。对于前者，Sutter Lambda 10-3 10位滤光轮(Sutter Instruments，Novato，CA)与Olympus100W卤钨灯一起使用以定义多达九个波长通道。LED照射设置有CoolLED(Andover，UK)pE-4000 16通道照明器和2个Lumencor Spectra X光引擎(Lumencor，Inc.，Beaverton，OR)，每个引擎包含6个定制选择的LED。照明器输出聚焦到3mm液体光导上，并且光导与一个或两个Lumencor组合器组合成单个直径为3mm的液体光导。最终光导通过CoolLED pE准直器/显微镜适配器连接到显微镜的照射端。为了进一步降低照射带宽，每个Lumencor LED都用单个带通滤光器进行滤光。使用手动控制与计算机控制的选项一起来实现滤光轮上的滤光器选择和LED选择。对透射通过显微镜的光的各个显微镜视场在CCD相机上的成像由Micro-Manager软件[Edelstein AD，Tsuchida MA，Amodaj N，Pinkard H，Wale RD，StuumanN.Advanced methods of microscope control using μManager software.J BiolMethods 2014；1：e10]控制。图像处理(包括透射图像和吸收图像之间的转换、光谱解混和彩色合成图像的形成)用ImageJ软件[Schneider CA，Rasband WS，Eliceiri KW.NIH Imageto ImageJ：25 years of image analysis.Nat Methods 2012；9：671-675]或MATLAB软件(Mathworks，Natick，MA，USA)来执行。
通常，多色样本用滤光轮和/或LED上的多个滤光器成像，其中每个滤光器和/或LED提供波长接近用于对样本染色的染料中的一种染料的最大吸光度的光带(例如，伊红和HTX或其他应用于样本的常规染色剂，加上每个可检测的部分)。使用的不同光通道的数量至少等于染料的数量。为了计算透射和吸光度图像，在用染色样本内期望的感兴趣区域处的相同系列的光通道记录图像之前和/或之后，使用载玻片未染色区域(例如，组织/细胞样本的一侧)上的每个光通道来记录图像。将染色区域的透射光图像除以未染色区域的图像(100％透射)来提供透射率(T)图像。对数转换提供吸光度(A)图像(A＝-log10T)，根据比尔定律，A与染料浓度成正比。彩色合成图像通过添加单色A图像来产生，对期望的的伪着色具有适当的权重以形成合成图像的红色、绿色和蓝色平面。这些合成图像提供了“荧光样”的表示，并且可以通过对A图像到T图像的反对数转换来转换为明视场表示。注意，多光谱成像不需要目镜，并且目镜可以用不带目镜的镜筒代替，以避免意外暴露在可能用于成像的强光下。如果使用目镜，可以在目镜中放置滤光器以减少透射光，诸如阻挡不可见光并且仅透射可见光(参见本文的实例3)。
实例3.常规组织学染色和可检测部分染色的显微镜和双相机彩色/单色成像。
图26D提供双相机显微镜系统的示意图，该双相机显微镜系统允许在计算机显示器上同时观察可见常规染色剂和不可见IHC色原。Olympus BX-51和BX-63显微镜(Olympus，Waltham，MA)与UPLXAPO 20X(NA 0.80)和UPLXAPO 10X(NA 0.4)物镜一起使用。再次参考图26D，可见光照射由Olympus 100W卤钨灯(A；Olympus U-LH100)提供，其中热镜透射在420nm与690nm之间的光(Newport Corp.，Irvine，CA；cat.no.10HMR-0)，安装在Sutter Lambda10-3 10位滤光轮(Sutter Instruments，Novato，CA)中。色彩平衡滤光器(FGT165滤光器，Thorlabs，Newton NJ USA)也可以安装在热镜之后，以增强光谱的蓝色端，从而改善直接观察和彩色相机白平衡。远蓝/UV和远红/近IR由第二照射源(B)提供，该第二照射源包括pE-4000 16通道LED照明器(CoolLED(Andover，UK))和Lumencor Spectra X LED光引擎(Lumencor，Inc.，Beaverton，OR)或附加的Olympus 100W卤钨灯，移除了集成IR阻挡滤光器，与包含一组单个带通滤光器组的滤光轮组合。为了进一步降低照射带宽，每个LumencorLED都使用单个带通滤光器进行滤光。下表提供了一些LED和滤光器特性。可见照射(A)和不可见照射(B)在包含反射元件(C)的pE组合器(CoolLED，Andover，UK)中组合，该反射元件包括50-50中性密度分光器或带有定制涂层的二向色镜，该定制涂层以对每个照射源取向为45°透射在420与700nm之间的光并反射低于420nm和高于700nm的光(Chroma TechnologyCorp.，Bellows Falls，VT USA)。使用LED时，可以通过在pE-Combiner之前使用3mm液体光导和一个或多个光导组合器(Lumencor，Inc.，Beaverton，OR USA)组合多个LED源来扩展不可见照射源(B)。进入显微镜的明视场照射端之后，组合的可见和不可见光通过样本载玻片和显微镜物镜到达相机端和双相机支架(2SCM1-DC；Thorlabs)。双相机支架内的反射元件具有与组合器反射元件(C)相同的反射涂层，将不可见光与可见光分开(当使用二向色元件时)，经由可见光透射滤光器(D；集成到相机)(其也可以包括435nm长通滤光器(Newport，10CGA-435))(当使用二乙基香豆素CDC抑制黄色着色时)将可见光透射至彩色相机(Kiralux CS505CU，Thorlabs)。当使用50-50中性密度镜作为反射元件(在每个相机处接收所有波长)时，420nm长通滤光器与集成彩色相机滤光器一起使用。不可见光(当使用二向色元件时)经由透射420nm以下和700nm以上的光的滤光器E(custom ET560/280陷波滤光器，Chroma Technology Corp；当使用二向色反射元件时)或透射400nm以下和690nm以上的光的Newport FSR-UG5彩色玻璃滤光器(当使用50-50中性密度发射元件)在分光器处反射到单色相机(Kiralux CS505MU，Thorlabs)。两个相机均使用相同的底层2448x2048像素CMOS传感器，允许使用2相机支架内的平移和旋转调整来精确对准两个相机。Thorcam软件(Thorlabs)提供对来自每个相机的实时视频、图像叠加和单帧图像采集的控制。除了近UV通过显微镜光学器件的不良透射外，还通过插入显微镜目镜内的标片空间中的定制屏障滤光器(F；ET560/280m，Chroma Technology Corp)来保护眼睛免受不可见光。在双相机模式下，不可见光源的波长被限制在420nm以下或700nm以上，以便只有来自标准钨显微镜灯的可见宽带光才能到达眼睛。另选地，目镜可以用镜筒代替，该镜筒限制观察计算机显示器(Olympus part U-TLU)上的视频图像。
双相机显微镜系统也可以用作实例2所述的单个单色相机多光谱成像系统。对于可见光通道和不可见光通道的多光谱成像，双相机支架中的二向色分光器被100％反射镜代替，以将所有光引导至单色相机，并移除单色相机滤光器(E)。针对每个光通道透射的光的图像在单色相机处顺序采集并且图像处理用于定量分析、彩色合成图像的创建和执行光谱解混，如实例2所述。在多光谱模式下，样本并非通过目镜来观察，但无意观察通过目镜中的仅可见光透射滤光器或目镜由仅镜筒部件(Olympus U-TLU)代替来保护。
使用其他光源和滤光可以获得类似的照射和成像结果。例如，可以与适当的滤光结合使用发射可见光用于照射H&E和发射不可见光用于照射一个或多个可检测部分的单个光源，诸如卤钨显微镜灯(去除IR滤光器)、氙灯或金属卤化物灯。白光可以通过LED组合而不是连续光源产生，并与不可见LED组合以同时照射传统染色剂和不可见色原。
实例4.载玻片上光谱测量。
在钨灯照明下，记录放置在Olympus BX-63显微镜载物台上的载玻片固定的样本的沉积色原和常规染色剂的吸收光谱。使用Pryor Scientific Inc.(Rockland，MA)Lumaspec 800功率计测量在350nm与800nm之间(增量为大约0.5nm)的透射光。将该功率计升级为Ocean HDX UV至NIR光谱仪，其允许测量在200nm与1100nm之间的光谱。将通过载玻片染色区透射的光谱除以通过未染色区域透射的光谱以得到透射率(T)光谱，使用关系A＝log10(1/T)将其转换为色原吸光度(A)光谱。
在靶向扁桃体组织上的Ki67的IHC中单独使用几个可检测部分，且所得染色组织的吸收光谱绘制在图10中。也绘制了扁桃体组织上的H&E吸光度光谱，且可见范围(显微镜下舒适的可见光照射水平约为420nm至700nm)呈浅蓝色。虽然所指示的可检测部分的部分在可见区域内，但其吸光度的大部分在可见区域之外，并且视觉敏感度在大部分可检测部分吸光度范围内仍然很低。此外，H&E和可检测部分光谱被归一化为图10中的相同峰值，而在实践中，H&E吸光度比可检测部分大得多，并且因此在显微镜下观察时，可检测部分着色可忽略不计。
实例5.用苏木精和伊红(H&E)和突触素不可见IHC(iIHC)染色的胰腺福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织。
来自匿名患者的正常(相对于癌症)胰腺组织的福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)载玻片固定的切片由Ventana Medical Systems，Inc.(VMSI)组织学人员从VMSI样本库获得的块制备。在DISCOVERY Ultra系统(VMSI，Tucson AZ)上执行半自动免疫组织化学。使用Discovery Universal Procedute创建用于控制染色步骤的方案。该程序使用商业染色剂试剂自动执行所有步骤，并暂停染色器以手动添加定制色原试剂，如下面的程序所指示。除非另有说明，否则每个步骤均在37℃执行，其中混合和自动洗涤步骤使用反应缓冲液(从10x浓缩物稀释；VMSI目录号950-300)。载玻片固定的石蜡切片(每次运行最多30个)在仪器上进行处理，从脱石蜡开始，将载玻片温热至70℃进行3个循环，每个循环8min。通过应用细胞前处理清洗1(VMSI目录号950-124)并将载玻片温热至94℃达64min来进行抗原修复。加入0.1mL抗突触素一抗(兔；目录号790-4407)并孵育16至32min，然后洗涤以去除未结合抗体。添加0.1mL OmniMap抗Rb HRP(RUO)，DISCOVERY(VMSI目录号760-4311)，并孵育8min，然后洗涤。通过手动移液添加0.1mL 400μM酪酰胺修饰的DBCO的pH 8.5硼酸盐缓冲液，孵育4min，然后添加0.1mL 0.01％H2O2的pH 8.5硼酸盐缓冲液。孵育32min，然后洗涤，并手动移液0.1mL 400μM叠氮化物修饰的Cy7，并孵育32min。在洗涤之后，将载玻片从染色器中取出并在数百毫升反应缓冲液中洗涤。然后立即在环境温度下用H&E对载玻片进行染色或首先通过乙醇和二甲苯脱水(2x80％乙醇，每个1min；2x90％乙醇，每个1min；3x100％乙醇，每个1min；3x二甲苯，每个1min)。如果脱水，载玻片首先通过浸泡在100％乙醇中1min、90％乙醇中1min、80％乙醇中1min和水中1min来再水化，然后在环境温度下进行H&E染色。H&E染色在环境温度下在一系列Coplin罐中执行，其中在罐之间手动转移载玻片。首先将载玻片浸泡在苏木精溶液(Ventana HE 600苏木精；订购代码07024282001)中2min，然后水中2min，定义溶液(Leica Surgipath SelectTech Define MX-aq，目录号3803595)中1min，水中1min，发蓝溶液(VWR发蓝试剂；目录号95057-852)中1min，水中1min，95％乙醇中30s，伊红溶液(Ventana HE 600伊红；订购代码06544304001)中1min，70％乙醇中1min，100％乙醇中两次，每次1min，以及二甲苯中三次，每次1min。然后允许干燥载玻片并通过应用RichardAllan Scientific Cytoseal XYL(ThermoFisher Scientifc，Kalamazoo，MI)并用1.5型盖玻片覆盖来进行封片或在Sakura FineteK USA(Torrance，CA)Tissue-Tek Film自动封片机上进行封片。
为了测试不可见IHC与H&E染色相结合的能力，对FFPE正常胰腺组织执行靶向蛋白质突触素的IHC，然后进行常规H&E染色。IHC使用包括染料C7的可检测部分，该染料吸收光谱的远红/近IR区域中的光(参见图10)。在白光照射(钨卤素灯)下通过显微镜的目视检查显示样本的正常H&E染色。图11提供使用在伊红吸收光的513nm、苏木精吸收光的620nm和Cy7吸收光的770nm处的LED照射的单色相机记录的透射光的图像。这三个图像被组合成彩色合成图像，如图12所示。左侧的彩色图像是513nm和620nm图像与伪着色相结合的结果，其准确地再现了白光照射显微镜下的可视化效果。右侧的彩色图像将770nm图像(伪彩色黑色)与513和620nm图像结合，并显示如H&E显示的胰腺组织背景内存在突触素。
实例6.用H&E和CD20+CD8多重iIHC染色的FFPE扁桃体组织(相对于癌症而言正常)。
来自匿名患者的正常(相对于癌症)扁桃体组织的福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)载玻片固定的切片由Ventana Medical Systems，Inc.(VMSI)组织学人员从VMSI样本库获得的块制备。在DISCOVERY Ultra系统(VMSI，Tucson AZ)上执行半自动免疫组织化学。使用Discovery Universal Procedure创建用于控制染色步骤的方案。该程序使用商业染色剂试剂自动执行所有步骤，并暂停染色器以手动添加定制色原试剂，如下面的程序所指示。除非另有说明，否则每个步骤均在37℃执行，其中混合和自动洗涤步骤使用反应缓冲液(从10x浓缩物稀释；VMSI目录号950-300)。载玻片固定的石蜡切片(每次运行最多30个)在仪器上进行处理，从脱石蜡开始，将载玻片温热至70℃进行3个循环，每个循环8min。通过应用细胞前处理清洗1(VMSI目录号950-124)并将载玻片温热至94℃达64min来进行抗原修复。加入0.1mL抗CD20一抗(小鼠；VMSI目录号760-2531)并孵育16至32min，然后洗涤以去除未结合抗体。添加0.1mL OmniMap抗Rb HRP(RUO)，DISCOVERY(VMSI目录号760-4311)，并孵育8min，然后洗涤。通过手动移液添加0.1mL 600μM酪酰胺修饰的DBCO的pH 8.5硼酸盐缓冲液，孵育4min，然后添加0.1mL 0.01％H2O2的pH 8.5硼酸盐缓冲液。孵育32min，然后洗涤，并手动移液0.1mL 600μM叠氮化物修饰的DCC并孵育32min。在洗涤之后，将载玻片与细胞前处理清洗2(VMSI目录号950-123)在100℃孵育8min，然后在反应缓冲液中洗涤。加入0.1mL抗CD8一抗(兔；VMSI目录号790-4460)并孵育16至32min，然后洗涤以去除未结合抗体。添加0.1mL OmniMap抗Rb HRP(RUO)，DISCOVERY(VMSI目录号760-4311)，并孵育8min，然后洗涤。通过手动移液添加0.1mL 400μM酪酰胺修饰的DBCO，并孵育4min。添加0.1mL 0.01％H2O2的pH 8.5硼酸盐缓冲液并孵育32min，然后洗涤，并手动移液0.1mL 400μM叠氮化物修饰的Cy7到载玻片上，孵育32min。在洗涤之后，将载玻片从染色器中取出并在数百毫升反应缓冲液中洗涤，然后将载玻片用H&E染色、封片并盖片，如实例5所述。
通过对FFPE扁桃体组织(相对于癌症而言正常)执行靶向CD20和CD8的连续IHC，然后进行H&E染色，展示了具有H&E染色的多重不可见IHC。CD20用衍生自二乙基氨基香豆素羧酸酯(DCC)的可检测部分(远蓝色吸收染料)染色，并且CD8用Cy7可检测部分染色。DCC吸收视觉感知边缘附近的远蓝，在严重染色的情况下肉眼可见淡黄色，但在H&E染色剂存在的情况下几乎无法感知。图13显示用来自胰腺实例的513、620和770nm LED以及DCC吸收光的415nm LED记录的四张单色图像。整个扁桃体的CD20特征性B细胞膜染色在415nm图像中很明显，而CD8的特征性活化t细胞膜染色主要在生发中心之外，在770nm图像中也很明显。图14中描绘了彩色合成图像，其中左侧的H&E图像由513和620nm图像构成，准确地再现了目视观察。中心图像显示将415nm(CD20)图像添加到H&E复合中，并且右侧图像显示将770nm(CD8)图像添加到H&E复合中，两个IHC均靶向伪彩色黑色，以将它们与H&E染色分开。图15示出该组织的吸光度光谱，其中两个可检测部分吸收峰与伊红和苏木精吸光度明显分开。
实例7.用H&E和CD3+CD8多重iIHC染色的FFPE结肠肿瘤组织。
来自匿名患者的结肠肿瘤组织的福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)载玻片固定的切片由Ventana Medical Systems，Inc.(VMSI)组织学人员从VMSI样本库获得的块制备。在DISCOVERY Ultra系统(VMSI，Tucson AZ)上执行半自动免疫组织化学。使用DiscoveryUniversal Procedure创建用于控制染色步骤的方案。该程序使用商业染色剂试剂自动执行所有步骤，并暂停染色器以手动添加定制色原试剂，如下面的程序所指示。除非另有说明，否则每个步骤均在37℃执行，其中混合和自动洗涤步骤使用反应缓冲液(从10x浓缩物稀释；VMSI目录号950-300)。载玻片固定的石蜡切片(每次运行最多30个)在仪器上进行处理，从脱石蜡开始，将载玻片温热至70℃进行3个循环，每个循环8min。通过应用细胞前处理清洗1(VMSI目录号950-124)并将载玻片温热至94℃达64min来进行抗原修复。加入0.1mL抗CD3一抗(VMSI目录号790-4341)并孵育16至32min，然后洗涤以去除未结合抗体。添加0.1mLOmniMap抗Rb HRP(RUO)，DISCOVERY(VMSI目录号760-4311)，并孵育8min，然后洗涤。通过手动移液添加0.1mL 400μM酪酰胺修饰的DBCO的pH 8.5硼酸盐缓冲液，孵育4min，然后添加0.1mL 0.01％H2O2的pH 8.5硼酸盐缓冲液。孵育32min，然后洗涤，并手动移液0.1mL 400μM叠氮化物修饰的HCCA并孵育32min。在洗涤之后，将载玻片与细胞前处理清洗2(VMSI目录号950-123)在100℃孵育8min，然后在反应缓冲液中洗涤。加入0.1mL抗CD8一抗(目录号790-4460)并孵育16至32min，然后洗涤以去除未结合抗体。添加0.1mL OmniMap抗Rb HRP(RUO)，DISCOVERY(VMSI目录号760-4311)，并孵育8min，然后洗涤。通过手动移液添加0.1mL 200μM酪酰胺修饰的DBCO，并孵育4min。添加0.1mL 0.01％H2O2的pH 8.5硼酸盐缓冲液并孵育32min，然后洗涤，并手动移液0.1mL 200μM叠氮化物修饰的Cy7到载玻片上，孵育32min。在洗涤之后，将载玻片从染色器中取出并在数百毫升反应缓冲液中洗涤，然后将载玻片用H&E染色、封片并封片/盖片，如实例5所述。
将用H&E染色的多重IHC应用于FFPE结肠肿瘤组织，靶向一般t细胞标志物CD3和t细胞活化标志物CD8。CD3用HCCA可检测部分染色，且CD8用Cy7可检测部分染色。图16呈现了使用390nm、770nm、513nm和620nm四种LED光通道记录的单色透射光图像，分别强调了HCCA和Cy7以及伊红和苏木精吸光度，清楚地识别了t细胞群。图16呈现由四个图像的组合构成的彩色合成图像。图17左上方的彩色合成图再现了视觉H&E染色图案，并且右上方和左下方图像分别添加了不可见的CD3和CD8染色，伪彩色为黑色。在CD3和CD8合成图像中，H&E染色已经减少，以便更好地使生物标志物可视化。右下方图像仅组合了CD8图像(伪彩色青色)和CD3图像(伪彩色品红色)。与CD3共表达CD8的激活t细胞呈现蓝色(品红色+青色＝蓝色)，而非激活t细胞呈现品红色。
这个结肠肿瘤实例证明了在单个载玻片上同时执行H&E和IHC的重要优势。已经在结肠癌中证明，CD3和CD8细胞在核心肿瘤和浸润边缘的分布是结直肠癌中对无病生存和总生存的有力预后标志物(参见Galon J，Mlecnik B，Bindea G，Angell HK，Berger A，Lagorce，AL，等人Towards the introduction of the′immunoscore′in theclassification of malignant tumors.J Pathol 2014；232：199-209)。通常，分析需要三个FFPE切片：用于H&E的一个，以及CD3和CD8各一个。浸润边缘的位置在H&E载玻片上进行识别，并且然后转移到在其上测量相对于边缘的相应细胞密度的CD3染色和CD8染色的载玻片。然而，由于CD3和CD8细胞在顺序(连续)FFPE切片上计数，由于三个切片在应用于载玻片时的不同取向以及因为每个切片穿过肿瘤的较深部分以及大小、形状和取向将随深度和切割数量而变化，因此每个载玻片上的肿瘤边缘都有所改变。这需要基于使用每种单个IHC染色剂和苏木精核染色剂识别的肿瘤形态，针对CD3和CD8载玻片上出现的任何取向和肿瘤改变来调整H&E载玻片上测量的肿瘤边缘。虽然IHC载玻片上肿瘤边缘的这种近似已经被证明提供具有临床意义的结果，但是对同一张载玻片执行H&E和双重IHC消除了转移边缘位置的不确定性，以及因此应提供更准确的结果。这可能增加相对于肿瘤边缘的CD3/CD8细胞密度与结果之间的关联，并进一步改善测定的预后强度。
实例8.用H&E和HER2 iIHC染色并使用双相机彩色/单色成像系统评估的FFPE乳腺肿瘤异种移植组织。
来自乳腺肿瘤异种移植物(VMSI Ventana HER2双ISH 3合1异种移植物载玻片，REF 783-4422)的福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)载玻片固定的切片在DISCOVERY Ultra系统(VMSI，Tucson AZ)上使用半自动免疫组织化学通过IHC染色，类似于实例5。除非另有说明，否则每个步骤均在37℃执行，其中混合和自动洗涤步骤使用反应缓冲液(从10x浓缩物稀释；VMSI目录号950-300)。载玻片固定的石蜡切片(每次运行最多30个)在仪器上进行处理，从脱石蜡开始，将载玻片温热至70℃进行3个循环，每个循环8min。通过应用细胞前处理清洗1(VMSI目录号950-124)并将载玻片温热至94℃达64min来进行抗原修复。加入0.1mL抗HER2/neu一抗(VMSI目录号790-2991)并孵育16至32min，然后洗涤以去除未结合抗体。添加0.1mL OmniMap抗Rb HRP(RUO)，DISCOVERY(VMSI目录号760-4311)，并孵育8min，然后洗涤。通过手动移液添加0.1mL 300μM酪酰胺修饰的DBCO的pH 8.5硼酸盐缓冲液，孵育4min，然后添加0.1mL 0.01％H2O2的pH 8.5硼酸盐缓冲液。孵育32min，然后洗涤，并手动移液0.1mL 300μM叠氮化物修饰的Cy7，并孵育32min。在洗涤之后，将载玻片从染色器中取出并在数百毫升反应缓冲液中洗涤。H&E染色和封片/盖片如实例5中所述执行。
在实例5、实例6和实例7中，苏木精、伊红和不可见色原用每种染料或色原的峰吸光度附近的光带进行顺序照射，每个都用单色相机成像，并且所得图像单独观察或组合成合成图像(参见see Morrison LE，Lefever MR，Behman LJ，Leibold T，Roberts EA，Horchner UB，Bauer DR.Brightfield Multiplex Immunohistochemistry withMultispectral Imaging.Lab Invest 2020)。另一种方法是同时用白光和不可见光照射，并将透射光在彩色相机和单色相机之间分开。通过适当的滤光，H&E图像可以在彩色相机上与单色相机上的可检测部分图像同时观察，并排显示和/或叠加为计算机显示器上的单个图像。两个图像均可以视频速率呈现，以便在观察实时图像时可以改变显微镜载物台位置、焦点和叠加图像(两个图像的相对贡献)。如果需要，操作员也可以通过显微镜目镜观察。
使用Cy7可检测部分然后进行H&E染色对乳腺肿瘤异种移植物执行HER2 IHC，并且用双相机系统记录的图像在图18中示出。用彩色相机记录的H&E图像显示在图的最左侧，并且Cy7可检测部分染色的单色图像显示在最右侧。两者之间是两个重叠图像，H&E图像相对于Cy7(HER2)图像具有更大和更小的贡献(不透明度)。分割图像方法的价值在于，病理学家可以实时交互地观察H&E和IHC染色图案，如常规载玻片评估中那样遍历整个载玻片。根据需要，可以通过用两个相机对单个视场进行停止和成像来记录诊断目标区域。与早期实例中使用合成图像的顺序图像方法一样，H&E和IHC染色可以通过对覆盖层的视觉评估进行关联，直至单细胞水平，从而提供与连续组织切片或多细胞学载玻片上的单独的H&E和IHC染色相比明显的优势。
图18中的分割图像方法允许同时观察H&E染色图案和一种生物标志物。当采用多重IHC时，分割图像方法可以通过改变不可见照射通道以光匹配每个可检测部分的吸光度来依次在每个生物标志物图像旁边连续显示H&E图像。为了同时观察H&E和多种生物标志物，对显微镜透射光的分割可以扩展超过两倍分割。与HER2/H&E实例(图18)中使用的商用Thorlabs 2相机分光器一样，Cairn Research(Kent，UK；也由Teledyne Photometrics，Tucson，AZ分销)已经商业化了2相机和4相机分光器以及将相同显微镜视场的多达四个不同偏移图像(单独滤光)传递到单个相机传感器的分光器。后一种分光器将四个分割图像中的每个分割图像显示在所得单个相机图像的单独的象限中。4相机分光器和具有偏移图像的单个相机均允许同时观察最多三个多重化生物标志物的H&E染色和可检测部分染色。
实例9.用PAP常规染色剂和Ki-67+p16多重不可见免疫细胞化学(iICC)染色的宫颈细胞学样本。
使用ThinPrep(Hologic，Mississauga，ON)程序将从多个匿名患者收集的宫颈细胞的样本应用于显微镜载玻片。根据VMSI CINtec PLUS Cytology方案(药品说明书)对制剂执行ICC。使用CINtec PLUS Cytology混合(p16/Ki-67)一抗和检测试剂在BenchMarkUltra系统上执行CINtec PLUS Cytology检测。通常，除非另有说明，否则ICC在36℃执行，并且反应缓冲液洗涤溶液从10x浓缩物稀释。通过应用细胞前处理清洗1并将载玻片温热至75℃达4min然后将温度增加至100℃达24min来执行针对宫颈样本池的抗原修复。由于CINtec PLUS Cytology抗体混合在一起，因此与两种一抗同时孵育，然后在反应缓冲液中洗涤以去除未结合抗体。依次与缀合到过氧化物酶靶向一抗(抗小鼠或抗兔)的抗物种抗体一起孵育。DCC和Cy7iCDC取代常规DAB和固红色原，使用酪酰胺DBCO和叠氮化物修饰的DCC和Cy7，如上针对多重IHC所述。在染色运行结束时，用稀释的洗涤剂溶液(1滴200mL水中的Dawn洗碗液(Proctor&Gamble，Cincinnati，OH))清洗载玻片。当载玻片仍然湿润时立即进行常规PAP染色，如下。将潮湿的载玻片浸泡在蒸馏水中1分钟，Richard-AllanHematoxylin I(ThermoFisher)中30秒，蒸馏水中两次，每次15秒，Richard-AllanClarifier 1中30秒，蒸馏水中30秒，Richard-Allan蓝化试剂中30秒，50％乙醇中30秒，95％乙醇中30秒，Richard-Allan ScientificTM Cyto-StainTM(ThermoFisher)中1分钟，95％乙醇中两次，每次30秒，然后三次通过三个100％乙醇清洁浴，每次30秒，三次通过二甲苯，两次每次1分钟和最后一次3分钟。然后将PAP染色的载玻片进行盖片，如实例5针对H&E染色所述。
在这个实例中，通过将多重iICC与对靶向肿瘤抑制因子p16和针对细胞增殖的标志物Ki67的宫颈细胞学样本的PAP染色相结合，H&E加不可见色原概念扩展到另一常规病理染色剂和另一制剂类型。图19示出PAP染色的宫颈细胞学样本的吸光度光谱，表明与H&E类似，PAP染色剂在可见光谱中吸收强烈，在深蓝/UV中吸收较少，且在远红/近IR中吸收最少。图20示出一组宫颈细胞的图像，其中左上方图像记录在双相机系统的彩色相机上。图像下部的细胞簇出现异常，并且这分别通过中上方和右侧单色图像中示出的用DCC色原(405nmLED)的p16染色和用Cy7色原(770nm LED)的Ki67染色来确认，并用单色相机记录。下方两幅图像结合了具有不同伪着色的DCC和Cy 7图像，以更好地显示同时染色。右下方图像表示红色的Ki-67和棕色的p16，以模仿在没有PAP染色的情况下执行的针对这两种蛋白质的表达的CINtech商业测定。左下方图像将Ki-67表示为品红色并将p16表示为青色以改善清晰度。图21示出另一组宫颈细胞，其中PAP染色在左侧图像中，用彩色相机记录，且Ki67(DCC)和p16(Cy7)染色在中间和右侧图像中，用单色相机记录。三幅图像中位于中心左侧的4种细胞的分组清楚地显示出异常，其中两种生物标志物都具有强染色。
宫颈细胞学实例证明，除H&E外的常见常规染色剂可以用于促进不可见IHC，并且细胞学制剂也是合适的样本。PAP染色用于在刷涂样本中发现异常的宫颈细胞，以识别可能患上宫颈癌的女性。样本是分散的宫颈细胞和细胞团，作为涂片或通过商业液体细胞学方法(诸如ThinPrep(Hologic，Mississauga，ON)和Surepath(Becton Dickinson andCompany，NJ))应用于载玻片。在过去，宫颈细胞的细胞形态(如PAP染色所揭示的)用作筛查宫颈癌和可能导致宫颈癌的发育异常患者的主要方法。最近，通过IHC识别的过表达p16和Ki-67两者的宫颈细胞已经被证明在识别异常细胞方面增加了额外的益处(参见Wright JrTC，等人Triaging HPV-Positive Women with p16/Ki-67 Dual-stained Cytology：Results from a Sub-study Nested into the ATHENA Trial.Gynecol Oncol 2017；144：51-56.Gynecol Oncol)。通过结合PAP和双重IHC来评估每个细胞中的PAP染色图案、p16表达和Ki-67表达的能力如文本所证明的很可能有望提供甚至更高的诊断准确性。
实例10.与iIHC一起使用特殊染色剂。
按照制造商建议的方案，使用Ventana特殊染色试剂盒在Ventana SpecialStains Automated Slide Stainer上执行以下特殊染色剂：三色绿(订购代码06521916001)、三色蓝(订购代码06521908001)、琼斯浅绿(订购代码05279356001)、琼斯H&E(订购代码05279348001)和耐酸细菌(AFB；订购代码08432503001)。
除H&E和PAP外，许多常规组织学和细胞染色剂通常用于解剖病理学，以帮助识别异常和疾病，并且通常称为特殊染色剂。应用于载玻片固定的细胞样本的几种特殊染色剂的吸收光谱绘制在图22中，并表明虽然它们在可见光谱内具有很强的吸光度，但在深蓝/UV或远红/近IR光谱区域或两者中吸光度大大降低。因此，与H&E和PAP染色剂一样，许多特殊染色剂也允许同时应用iIHC和iICC。
实例11.用H&E和MART-1/melan A iIHC染色的黑色素瘤FFPE组织。
与实例5类似，在DISCOVERY Ultra系统(VMSI，Tucson AZ)上使用半自动免疫组织化学通过IHC对黑色素瘤FFPE组织进行染色。除非另有说明，否则每个步骤均在37℃执行，其中混合和自动洗涤步骤使用反应缓冲液(从10x浓缩物稀释；VMSI目录号950-300)。载玻片固定的石蜡切片在仪器上进行处理，从脱石蜡开始，将载玻片温热至70℃进行3个循环，每个循环8min。通过应用细胞前处理清洗1(VMSI目录号950-124)并将载玻片温热至94℃达64min来进行抗原修复。加入0.1mL抗MART1/melanA一抗(VMSI目录号790-2990)并孵育16至32min，然后洗涤以去除未结合抗体。添加0.1mL OmniMap抗Rb HRP(RUO)，DISCOVERY(VMSI目录号760-4311)，并孵育8min，然后洗涤。通过手动移液添加0.1mL 400μM酪酰胺修饰的DBCO的pH 8.5硼酸盐缓冲液，孵育4min，然后添加0.1mL 0.01％H2O2的pH 8.5硼酸盐缓冲液。孵育32min，然后洗涤，并手动移液0.1mL 400μM叠氮化物修饰的Cy7，并孵育32min。在洗涤之后，将载玻片从染色器中取出并在数百毫升反应缓冲液中洗涤。H&E染色和封片/盖片如实例5中所述执行。
可检测部分的另一应用是用于在含有内源性或外源性色素的组织上进行IHC，这些色素在可见光谱中强烈吸收并干扰对IHC染色的可视化或成像。内源性色素的实例是黑色素(皮肤黑素细胞中发现的聚合物)，它可以保护身体免受有害的紫外线辐射。皮肤中黑色素的吸光度光谱(由反射光谱确定)示出在UV中的强吸光度，通过光谱的可见光部分降低到其在远红和近IR中大大降低的程度。用H&E和靶向用Cy7可检测部分染色的MART-1/melanA的IHC两者染色的黑素瘤FFPE组织的17个图像在图23中显示。用双相机系统记录的彩色图像显示H&E染色内存在棕色黑色素，而单色图像显示Cy7可检测部分对770nm LED光的吸光度，其清楚地定义了MART1/melanA，基本上没有黑色素干扰。在具有黑色素沉积较重的组织中，黑色素吸光度和/或光散射在770nm处明显，但明显减弱。
黑色素实例证明，不可见IHC不仅有利于应用所应用的染色剂(诸如H&E、PAP和特殊染色剂)，而且对于与强吸收的内源性色素或甚至由于通过吸入、摄入或接触的工业或环境暴露引起的外源性色素的结合使用也很有价值，包括纹身颜料。在含有黑色素的样本中，使用常规色原解释IHC可能很困难。对黑色素的化学漂白通常用于将黑色素吸光度降低到允许对IHC进行评估的水平。然而，漂白有时可能改变靶向抗原，降低其检测效率，并且也可能漂白IHC色原。据信，使用不可见色原(诸如本文所述)允许完全避免漂白。
实例11.通过kappa mRNA原位杂交(ISH)和H&E染色的扁桃体FFPE组织。
如先前所述，执行mRNA ISH，代替100μL 50或100μM Cy7可检测部分的TSA稀释剂。H&E染色和封片/盖片如实例5中所述执行。
在扁桃体FFPE组织上也证明了与不可见原位杂交(ISH)组合的H&E，如图24所示。左侧图像用双相机系统中的彩色相机记录，并且右侧图像用单色相机记录，观察被Cy7可检测部分吸收的770nm LED光。与IHC中使用的一抗试剂不同，与kappa mRNA序列杂交的半抗原化核酸探针经由酶偶联的抗半抗原抗体引导酶促共价沉积和用Cy7可检测部分进行的染色。如预期，扁桃体中的kappa表达从非常强烈的表达细胞到非常弱的表达细胞不等，每个弱表达细胞只有一个到几个点。ISH经常因其缺乏组织和细胞形态而受到批评，然而，这个实例证明ISH可以在H&E染色剂的背景下存在，尽管由于更严格的样本预处理(包括蛋白水解)以改善核酸靶标对探针的访问而导致H&E质量有所下降。
实例12.色原沉积化学。
来自匿名患者的正常(相对于癌症)扁桃体组织的福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)载玻片固定的切片由Ventana Medical Systems，Inc.(VMSI)组织学人员从VMSI样本库获得的块制备。样本载玻片在DISCOVERY Ultra系统(VMSI，Tucson AZ)上使用半自动免疫组织化学通过IHC进行染色，类似于实例5，除了如下所述的色原沉积。除非另有说明，否则每个步骤均在37℃执行，其中混合和自动洗涤步骤使用反应缓冲液(从10x浓缩物稀释；VMSI目录号950-300)。载玻片固定的石蜡切片(每次运行最多30个)在仪器上进行处理，从脱石蜡开始，将载玻片温热至70℃进行3个循环，每个循环8min。通过应用细胞前处理清洗1(VMSI目录号950-124)并将载玻片温热至94℃达64min来进行抗原修复。加入0.1mL抗CD8一抗(目录号790-4460)并孵育16至32min，然后洗涤以去除未结合抗体。添加0.1mL针对酪酰胺色原的OmniMap抗Rb HRP(RUO)，DISCOVERY(VMSI目录号760-4311)或针对醌甲基化物前体色原的UltraMap抗Rb Alk Phos，DISCOVERY(VMSI目录号760-4314)，并孵育8min，然后洗涤。通过手动移液添加0.1mL 1200μM 7-氨基-4-甲基香豆素-3-醋酸盐的酪酰胺衍生物的pH 8.5硼酸盐缓冲液或400uM醌甲基化物前体修饰的Cy7的pH 8.5硼酸盐缓冲液。将酪酰胺色原孵育4min，然后添加0.1mL 0.01％H2O2的pH 8.5硼酸盐缓冲液，并孵育32min，然后洗涤。将醌甲基化物前体修饰的色原孵育32min，然后洗涤。然后将载玻片从染色器中取出并在数百毫升反应缓冲液中洗涤。H&E染色和封片/盖片如实例5中所述执行。
在先前的实例中，使用DBCO-酪酰胺衍生物的过氧化物酶催化的共价沉积然后与叠氮化物衍生染料偶联，可检测部分经由“点击化学”中间体进行共价沉积。通过过氧化物酶催化的自由基形成而沉积的染料酪酰胺衍生物，以及通过碱性磷酸酶水解以形成反应性醌甲基化物而沉积的醌甲基化物前体染料衍生物，对于生物标记物的不可见染色也是有效的。这在图25中示出，其中扁桃体FFPE组织用使用醌甲基化物-Cy7可检测部分(顶部)和酪酰胺-AMCA UV吸收可检测部分(底部)的CD8不可见IHC进行染色。使用双相机系统，其中彩色相机图像在图的左侧示出，并且单色图像在图的右侧示出。这证明了，无论沉积化学如何，主要在光谱的不可见区域具有吸光度的任何色原都可以考虑与常规可见光吸收染色剂(诸如H&E)一起使用。需要注意的是，在IHC之后应用时，色原体必须抵抗被常规染色中使用的试剂和条件去除。在这方面，可检测缀合物(包括可检测部分)特别有用，因为它们共价连接到细胞和组织组分，并且不会被有机或水性试剂溶解，这与常规色原体(诸如固红)相反。
实例13.肺部肿瘤组织上的粘蛋白胭脂红特殊染色加不可见TTF-1和p40双重IHC
来自匿名患者的肺肿瘤组织的FFPE载玻片固定的切片由Ventana MedicalSystems、Inc.(VMSI)组织学人员根据从VMSI样本库获得的块制备。在DISCOVERY Ultra系统(VMSI，Tucson AZ)上执行半自动免疫组织化学。使用Discovery Universal Procedure创建用于控制染色步骤的方案。该程序使用商业染色剂试剂自动执行所有步骤，并暂停染色器以手动添加定制色原试剂，如下面的程序所指示。除非另有说明，否则每个步骤均在37℃执行，其中混合和自动洗涤步骤使用反应缓冲液(从10x浓缩物稀释；VMSI目录号950-300)。载玻片固定的石蜡切片(每次运行最多30个)在仪器上进行处理，从脱石蜡开始，将载玻片温热至70℃进行3个循环，每个循环8min。通过应用细胞前处理清洗1(VMSI目录号950-124)并将载玻片温热至94℃达64min来进行抗原修复。加入0.1mL抗甲状腺转录因子-1(TTF-1；SP141)兔单克隆一抗(目录号790-4756)并孵育16至32min，然后洗涤以去除未结合抗体。添加0.1mL OmniMap抗Rb HRP(RUO)，DISCOVERY(VMSI目录号760-4311)，并孵育8min，然后洗涤。通过手动移液添加0.1mL 100至400μM酪酰胺修饰的DBCO的pH 8.5硼酸盐缓冲液，孵育4min，然后添加0.1mL 0.01％H2O2的pH8.5硼酸盐缓冲液。孵育32min，然后洗涤，并手动移液0.1mL 100至400μM叠氮化物修饰的IR870并孵育32min。在洗涤之后，将载玻片与细胞前处理清洗2(VMSI目录号950-123)在100℃孵育8min，然后在反应缓冲液中洗涤。加入0.1mL抗p40(BC28)小鼠单克隆一抗(VMSI目录号790-4950)并孵育16至32min，然后洗涤以去除未结合抗体。添加0.1mL OmniMap抗MS HRP(RUO)，DISCOVERY(VMSI目录号760-4310)，并孵育8min，然后洗涤。通过手动移液添加0.1mL 200至400μM酪酰胺修饰的DBCO，并孵育4min。添加0.1mL 0.01％H2O2的pH 8.5硼酸盐缓冲液并孵育32min，然后洗涤，并手动移液0.1mL 200至400μM叠氮化物修饰的Cy7到载玻片上，孵育32min。在洗涤之后，将载玻片从染色器中取出并在以下中的一者或多者中洗涤：250mL反应缓冲液载玻片、250ml含有0.2gDawn餐具洗涤剂的水、250ml水。然后立即在环境温度下用H&E对载玻片进行染色或首先通过乙醇和二甲苯脱水(2x80％乙醇，每个1min；2x90％乙醇，每个1min；3x100％乙醇，每个1min；3x二甲苯，每个1min)。如果脱水，载玻片首先通过浸泡在100％乙醇中1min、90％乙醇中1min、80％乙醇中1min和水中1min来再水化，然后在环境温度进行粘蛋白胭脂红染色。在环境温度下，在一系列Coplin罐中进行粘蛋白胭脂红染色，其中按照制造商的说明使用粘蛋白胭脂红染色试剂盒(目录号ab150677；Abcam，Cambridge，MA)在罐子之间手动转移载玻片。这包括在苏木精溶液中浸泡载玻片3min，在水中洗涤，在发蓝试剂中浸泡载玻片30秒，在水中洗涤，在粘蛋白胭脂红溶液中浸泡载玻片10min，在水中洗涤载玻片，在酒石黄溶液中浸泡载玻片1min，在多次更换的乙醇中冲洗载玻片，并在二甲苯中浸泡载玻片。然后通过应用Richard Allan Scientific Cytoseal XYL(ThermoFisher Scientifc，Kalamazoo，MI)并用1.5型盖玻片覆盖来对载玻片进行排水和封片。
病理学家经常使用粘蛋白胭脂红特殊染色剂来帮助对肺部肿瘤组织进行分类。经脱石蜡的肺肿瘤组织、一种鳞状细胞癌和一种腺癌根据上述程序(无IHC)进行染色，且记录吸收光谱，并绘制在图27中。IHC可以提供更强的区分鳞状细胞癌和腺癌的能力，并且因此可以很好地补充粘蛋白胭脂红特殊染色剂。TTF-1 IHC特异性地染色腺癌细胞，且p40 IHC特异性地染色鳞状细胞癌细胞。光谱表明，粘蛋白胭脂红染色剂吸光度可能会干扰深蓝和UV吸收HC色原的使用，但不应干扰远红/近IR吸收色原的使用。为了证明粘蛋白胭脂特殊染色剂与IHC的结合使用，鳞状细胞癌和腺癌肺肿瘤组织通过双重iIHC染色，以识别p40和TTF-1表达细胞，分别使用Cy7(最大吸光度774nm)和IR870(最大吸光度869nm)色原，然后按照上述程序进行粘蛋白胭脂红染色。使用双相机显微镜系统记录每个染色组织的图像，使用具有Semrock 769nm中心波长、49.3nm FWHM带通滤光器(目录号FF01-769/41；IDEXHealth&Science，LLC，Rochester，NY)和Chroma 880nm中心波长、40nm FWHM带通滤光器(目录号MV880/40；Chroma Technology Corp，Bellows Falls，VT)来分别创建Cy7和IR870照射通道。这些图像在图28中显示，并示出了腺癌组织中存在TTF-1表达细胞(右上图像)，且鳞状细胞癌图像中存在p40表达细胞(中下图像)，如预期。另注意，在用彩色相机记录的粘蛋白胭脂红染色剂的图像(左上图像)中，TTF-1表达细胞的细胞质中呈粉红色，表明粘蛋白表达，这也与腺癌有关。对肺腺癌的分类因此通过在单个组织切片上同时进行的特殊染色剂和IHC之间的一致性来确认。
不可见IHC也可以与非染色技术相结合，诸如相衬和微分干涉对比度(DIC)显微镜。正如通常执行的那样，可见光谱将用于对比度增强成像，并且不受不可见色原吸光度存在的影响。
可以注意到，在本文呈现的实例中，H&E或PAP染色剂与不可见色原中的每种色原之间的光谱分离足够大，以至于用可见白光或不可见LED照射观察或记录的图像足以有效地分离每种染料与其他染料，几乎没有光谱串扰的证据。然而，可以通过应用光谱解混算法来去除残余串扰量，例如，以去除H&E染色剂的一些深蓝/UV吸光度，从而为深蓝/UV吸收色原(诸如DCC、HCCA和AMCA.15，20，21)提供更高的染色剂对比度。此外，光谱串扰将允许在多重IHC中使用更多不可见染料，因为添加更多染料将增加光谱重叠并需要校正。通过光谱解混，可以使用吸光度更接近H&E或PAP吸光度的色原，并且苏木精和伊红的参考光谱可以分别与针对每个色原的参考光谱一起包括在解混中，以从H&E染色剂中去除不可见色原吸光度。此外，通过光谱解混，可以减少H&E的苏木精和伊红组分，以允许使用吸光度更接近苏木精或伊红的色原。然后将H&E图像重建为双染料合成图像，无色原吸光度，可分别调节苏木精和伊红组分的强度以匹配病理学家的偏好。苏木精和伊红染色的减少可能会改变众所周知的H&E染色的一般外观和可解释性，因此这将与提高IHC多重化水平的能力进行权衡而执行。
实例13和图28描述了与粘蛋白胭脂红特殊染色剂一起使用的双重不可见IHC，由于在UV中的强粘蛋白胭脂特殊染色剂吸光度，这需要两种不可见色原吸收光谱的近IR部分中的光。这导致IR870色原在监测Cy7吸光度的波长处有显著的吸光度(在769nm光通道中观察到880nm光通道处约45％的IR870吸光度)。图28(中上图)中的IR870进入Cy7通道的光谱串扰不那么明显；然而，更深染色的TTF-1阳性细胞的串扰是明显的，如图30的中上图所示。该载玻片来自图28所示的同一NSCLC腺癌样本，通过相同的双重IHC程序进行染色，但使用H&E而不是粘蛋白胭脂红特殊染色剂进行手动染色。多光谱图像用单色相机记录，该相机用四个滤光钨灯通道照射：510nm(主要是伊红)、599nm(苏木精)、769nm(主要是Cy7)和880nm(IR870)。彩色H&E图像(图30，图A)从解混的510nm和599nm图像制备，再现了通过目镜的视图。处理使用769nm光通道(主要是C7吸光度；图30，图B)和880nm光通道(IR870吸光度；图30，图C)记录的图像以提供解混的p40和TTF-1图像(分别是图30，图E和图F)。如图30图B所证实，针对该实例选择的染色特别深的IR870细胞(可能是正常TTF-1阳性细胞)在769nm光通道中有明显的串扰，在解混之后该串扰消除(图30，图E)。解混的IR870(图30，图F)由于其他染料在880nm处的吸光度极小示出很小的解混效果。图30图D示出从通过仅组合解混的苏木精和TTF-1图像生成的彩色合成图，模拟了使用苏木精复染的常规单一IHC。如预期，腺癌组织中不存在p40染色。
实例14.图像处理以减少相邻染色剂吸光度之间的干扰：光谱解混。
图像处理可以应用于色原和常规染色剂的记录的图像，以减少光谱串扰并提供单个色原和染色剂的图像，这些图像具有减少或消除的来自多重测定中使用的其他色原和染色剂的干扰。例如，在图16的左上方透射光图像中，CD3表达的区域的HCCA色原染色清楚地进行了区分。然而，由于苏木精常规染色剂的宽吸光度延伸到用于对HCCA成像的390nm光通道，所以所有细胞核的染色也隐约可见。当透射转换为吸光度时，这被更清楚地看到，如图29的左上图所示，正如执行定量分析时通常所做的那样。解混使用每个单独染料在每个光通道中的相对吸光度来校正重叠的染料吸光度。该过程详细描述于Morrison LE，LefeverMR，Behman LJ，Leibold T，Roberts EA，Horchner UB，Bauer DR(2020)BrightfieldMultiplex Immunohistochemistry with Multispectral Imaging.Lab Invest.https://doi.org/10.1038/s41374-020-0429-0及其中的参考文献。从每种染料的IHC分别确定的每种染料的相对吸光度形成矩阵的串扰系数，其在反转时提供校正系数。校正系数乘以多色染色的显微镜视场的各种吸光度图像，然后将它们加在一起以创建去除串扰的纯染色剂的图像。HCCA和Cy7图像的结果在图29中示出，其中上两行为串扰校正之前的图像(参见图16中对应的透射光图像)，并且下两行为串扰校正之后的图像。解混的HCCA通过抑制苏木精染色细胞核示出相当大的背景降低。Cy7图像确实示出很大的不同，因为苏木精在Cy7吸收的光谱的远红/近IR部分几乎没有或没有吸光度。
尽管光谱串扰可能小到不会干扰对通过显微镜的透射光的视觉解释，例如，图16中所描绘，但对吸光度图像的定量分析可能会受益，例如，通过应用阈值来更有效地区分不同蛋白质表达的区域。这提高了计算不同细胞群、测量细胞内距离、测量蛋白质表达水平等的准确性。在多重测定中应用光谱解混允许在数字评估的测定中进行更高水平的多重化，因为随着使用更多染料而增加的光谱串扰可以得到校正。
本说明书中提到的和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、国外专利、国外专利申请以及非专利公开均全文通过引用并入本文。如有必要，可对实施例的各个方面进行修改，从而采用各类专利、应用和公开的概念来提供其他进一步的实施例。
尽管本文已参考具体实施方案描述本公开，但应当理解，这些实施例仅说明性地表示本公开的原理和应用。因此，应当理解，可以对说明性实施例进行许多修改，并且可以在不脱离所附权利要求所限定本公开的精神和范围的情况下设计其他布置方式。

Claims (117)

1.一种使置于基底上的生物学样本内的一种或多种靶标可视化的方法，所述方法包括：
(a)用第一可检测部分标记第一生物标志物，其中所述第一可检测部分具有小于约200nm的FWHM和小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)；以及
(b)用具有在约400nm与约700nm之间的一个或多个峰吸收波长的至少一种常规染料对置于所述基底上的所述生物学样本进行染色，其中所述第一可检测部分的峰吸收波长和一种或多种常规染料的所述一个或多个峰吸收波长相隔至少20nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一可检测部分的所述FWHM小于约150nm。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一可检测部分的所述FWHM小于约100nm。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一可检测部分的所述FWHM小于约70nm。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种常规染料包括苏木精。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种常规染料包括伊红。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种常规染料包括苏木精和伊红。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述一种或多种常规染料选自由以下项组成的组：酸性品红、阿尔新蓝8GX、茜素红S、金胺O、偶氮胭脂红B、偶氮胭脂红G、天青A、天青B、天青C、碱性品红、俾斯麦棕Y、亮甲酚蓝、亮绿、胭脂红、氯唑黑E、刚果红、甲酚紫、结晶紫、达罗红、乙基绿、固绿F C F、异硫氰酸荧光素、姬姆萨染色剂、靛蓝胭脂红、詹纳斯绿B、哲纳尔氏染色素1899、浅绿SF、孔雀石绿、马休黄、甲基橙、甲基紫2B、亚甲蓝、亚甲蓝、亚甲紫fBernthsen)、中性红、苯胺黑、尼罗蓝A、核固红、油红O、橙黄G、橙黄II、地衣红、副品红、根皮红B、蛋白银S、派洛宁B、派洛宁Y、刃天青、玫瑰红、番红O、苏丹黑B、苏丹III、苏丹IV、四铬染色(MacNeal)、硫堇、甲苯胺蓝、Weigert 1878、瑞氏色素及它们的组合。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中用所述第一可检测部分标记所述第一生物标志物包括：(a)使所述生物学样本与抗生物标志物一抗接触；(b)使所述生物学样本与对所述抗生物标志物一抗具有特异性的抗特异性二抗接触，其中抗物种抗体直接或间接与至少一种酶缀合；以及(c)使所述生物学样本与第一可检测缀合物接触，所述第一可检测缀合物包含：(i)所述第一可检测部分和(ii)酪酰胺部分、醌甲基化物部分、或者酪酰胺部分或醌甲基化物部分的衍生物或类似物。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中用所述第一可检测部分标记所述第一生物标志物包括：(a)使所述生物学样本与抗生物标志物一抗接触；(b)使所述生物学样本与对抗生物标志物抗体具有特异性的抗特异性二抗接触，其中抗物种抗体直接或间接与至少一种酶缀合；(c)使所述生物学样本与第一组织反应性缀合物接触，所述第一组织反应性缀合物包含：(i)能够参与点击化学反应的一对反应性官能团的第一成员和(ii)酪酰胺部分、醌甲基化物部分、或者酪酰胺部分或醌甲基化物部分的衍生物或类似物；以及(d)使所述生物学样本与可检测缀合物接触，所述可检测缀合物包含：(i)所述第一可检测部分和(ii)所述一对反应性官能团的第二成员。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述第一生物标志物为蛋白质生物标志物。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述第一生物标志物选自由以下项组成的组：PD-L1、PD-1、Ki-67、CD3、CD8、Ki67、CD5、CD20、泛细胞角蛋白、HER2、ER、PR、p16、p63、p40、TTF-1、天冬氨酸蛋白酶A、突触素和MART-1/MelanA。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述第一生物标志物为核酸生物标志物。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述第一可检测部分选自由香豆素核、七甲川菁核和克酮酸盐核组成的组。
15.根据权利要求14所述的方法，其进一步包括：用第二可检测部分标记第二生物标志物，其中所述第二可检测部分具有小于约70nm的FWHM和小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)，并且其中所述第一可检测部分和所述第二可检测部分是不同的。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第二可检测部分在紫外光谱内或红外光谱内。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述第二可检测部分在紫外光谱内。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一可检测部分和所述第二可检测部分具有相隔至少20nm的最大吸光度(λmax)。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一可检测部分和所述第二可检测部分具有相隔至少30nm的最大吸光度(λmax)。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述一种或多种常规染料选自由以下项组成的组：苏木精、伊红、酸性品红、阿尔新蓝8GX、茜素红S、金胺O、偶氮胭脂红B、偶氮胭脂红G、天青A、天青B、天青C、碱性品红、俾斯麦棕Y、亮甲酚蓝、亮绿、胭脂红、氯唑黑E、刚果红、甲酚紫、结晶紫、达罗红、乙基绿、固绿F C F、异硫氰酸荧光素、姬姆萨染色剂、靛蓝胭脂红、詹纳斯绿B、哲纳尔氏染色素1899、浅绿SF、孔雀石绿、马休黄、甲基橙、甲基紫2B、亚甲蓝、亚甲蓝、亚甲紫(Bernthsen)、中性红、苯胺黑、尼罗蓝A、核固红、油红O、橙黄G、橙黄II、地衣红、副品红、根皮红B、蛋白银S、派洛宁B、派洛宁Y、刃天青、玫瑰红、番红O、苏丹黑B、苏丹III、苏丹IV、四铬染色(MacNeal)、硫堇、甲苯胺蓝、Weigert 1878、瑞氏色素及它们的组合。
21.一种检测置于基底上的生物学样本内的一种或多种靶标的方法，所述方法包括：
(a)用第一可检测部分标记第一生物标志物标志物，其中所述第一可检测部分选自由香豆素核、七甲川菁核和克酮酸盐核组成的组；以及
(b)用具有在约400nm与约700nm之间的一个或多个峰吸收波长的至少一种常规染料对置于所述基底上的所述生物学样本进行染色，其中所述第一可检测部分的峰吸收波长和一种或多种常规染料的所述一个或多个峰吸收波长相隔至少20nm。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一可检测部分在紫外光谱内。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一可检测部分在红外光谱内。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一可检测部分具有小于约430nm的峰吸收波长。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一可检测部分具有小于约400nm的峰吸收波长。
26.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一可检测部分具有大于约670nm的峰吸收波长。
27.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一可检测部分具有大于约700nm的峰吸收波长。
28.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一可检测部分具有小于约430nm但大于约400nm的峰吸收波长，并且其中所述一种或多种常规染料的所述一个或多个峰吸收波长大于约430nm。
29.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一可检测部分具有大于约670nm但小于约400nm的峰吸收波长，并且其中所述一种或多种常规染料的所述一个或多个峰吸收波长小于约670nm。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其进一步包括：用第二可检测部分标记第二生物标志物，其中所述第二可检测部分具有小于约200nm的FWHM和小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)，并且其中所述第一可检测部分和所述第二可检测部分是不同的。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述第二可检测部分在红外光谱内。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述第二可检测部分在紫外光谱内。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述第一可检测部分和所述第二可检测部分具有相隔至少20nm的最大吸光度(λmax)。
34.根据权利要求30所述的方法，其中所述第一可检测部分和所述第二可检测部分具有相隔至少30nm的最大吸光度(λmax)。
35.根据权利要求30所述的方法，其中所述一种或多种常规染料选自由以下项组成的组：苏木精、伊红、酸性品红、阿尔新蓝8GX、茜素红S、金胺O、偶氮胭脂红B、偶氮胭脂红G、天青A、天青B、天青C、碱性品红、俾斯麦棕Y、亮甲酚蓝、亮绿、胭脂红、氯唑黑E、刚果红、甲酚紫、结晶紫、达罗红、乙基绿、固绿F C F、异硫氰酸荧光素、姬姆萨染色剂、靛蓝胭脂红、詹纳斯绿B、哲纳尔氏染色素1899、浅绿SF、孔雀石绿、马休黄、甲基橙、甲基紫2B、亚甲蓝、亚甲蓝、亚甲紫(Bernthsen)、中性红、苯胺黑、尼罗蓝A、核固红、油红O、橙黄G、橙黄II、地衣红、副品红、根皮红B、蛋白银S、派洛宁B、派洛宁Y、刃天青、玫瑰红、番红O、苏丹黑B、苏丹III、苏丹IV、四铬染色(MacNeal)、硫堇、甲苯胺蓝、Weigert 1878、瑞氏色素及它们的组合。
36.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一可检测部分选自由以下项组成的组：
其中符号是指所述可检测部分与可检测缀合物的另一部分缀合的位点。
37.一种置于基底上的染色生物学样本，所述染色生物学样本包含用第一可检测部分标记的第一生物标志物；其中所述第一可检测部分具有小于约200nm的FWHM和小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)；其中所述染色生物学样本用至少一种常规染料进行染色，其中所述至少一种常规染料具有在可见光谱内的一个或多个峰吸收波长。
38.根据权利要求37所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分的所述FWHM小于约150nm。
39.根据权利要求37所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分的所述FWHM小于约100nm。
40.根据权利要求37所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分的所述FWHM小于约70nm。
41.根据权利要求37所述的染色生物学样本，其中所述至少一种常规染料包括苏木精。
42.根据权利要求37所述的染色生物学样本，其中所述至少一种常规染料包括伊红。
43.根据权利要求37所述的染色生物学样本，其中所述至少一种常规染料包括苏木精和伊红。
44.根据权利要求37至43中任一项所述的染色生物学样本，其中所述至少一种常规染料选自由以下项组成的组：酸性品红、阿尔新蓝8GX、茜素红S、金胺O、偶氮胭脂红B、偶氮胭脂红G、天青A、天青B、天青C、碱性品红、俾斯麦棕Y、亮甲酚蓝、亮绿、胭脂红、氯唑黑E、刚果红、甲酚紫、结晶紫、达罗红、乙基绿、固绿F C F、异硫氰酸荧光素、姬姆萨染色剂、靛蓝胭脂红、詹纳斯绿B、哲纳尔氏染色素1899、浅绿SF、孔雀石绿、马休黄、甲基橙、甲基紫2B、亚甲蓝、亚甲蓝、亚甲紫(Bernthsen)、中性红、苯胺黑、尼罗蓝A、核固红、油红O、橙黄G、橙黄II、地衣红、副品红、根皮红B、蛋白银S、派洛宁B、派洛宁Y、刃天青、玫瑰红、番红O、苏丹黑B、苏丹III、苏丹IV、四铬染色(MacNeal)、硫堇、甲苯胺蓝、Weigert 1878、瑞氏色素及它们的组合。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的染色生物学样本，其中所述染色生物学样本进一步包含用第二可检测部分标记的第二生物标志物，其中所述第二可检测部分具有小于约200nm的FWHM和小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)，并且其中所述第一可检测部分和所述第二可检测部分是不同的。
46.根据权利要求45所述的染色生物学样本，其中所述第二可检测部分在红外光谱内。
47.根据权利要求45所述的染色生物学样本，其中所述第二可检测部分在紫外光谱内。
48.根据权利要求45所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分和所述第二可检测部分具有相隔至少20nm的最大吸光度(λmax)。
49.根据权利要求45所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分和所述第二可检测部分具有相隔至少30nm的最大吸光度(λmax)。
50.根据权利要求45所述的染色生物学样本，其中一种或多种常规染料选自由以下项组成的组：苏木精、伊红、酸性品红、阿尔新蓝8GX、茜素红S、金胺O、偶氮胭脂红B、偶氮胭脂红G、天青A、天青B、天青C、碱性品红、俾斯麦棕Y、亮甲酚蓝、亮绿、胭脂红、氯唑黑E、刚果红、甲酚紫、结晶紫、达罗红、乙基绿、固绿F C F、异硫氰酸荧光素、姬姆萨染色剂、靛蓝胭脂红、詹纳斯绿B、哲纳尔氏染色素1899、浅绿SF、孔雀石绿、马休黄、甲基橙、甲基紫2B、亚甲蓝、亚甲蓝、亚甲紫(Bernthsen)、中性红、苯胺黑、尼罗蓝A、核固红、油红O、橙黄G、橙黄II、地衣红、副品红、根皮红B、蛋白银S、派洛宁B、派洛宁Y、刃天青、玫瑰红、番红O、苏丹黑B、苏丹III、苏丹IV、四铬染色(MacNeal)、硫堇、甲苯胺蓝、Weigert 1878、瑞氏色素及它们的组合。
51.根据权利要求45所述的染色生物学样本，其中所述染色生物学样本进一步包含用第三可检测部分标记的第三生物标志物，其中所述第三可检测部分具有小于约200nm的FWHM和小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)，并且其中所述第一可检测部分、所述第二可检测部分和所述第三可检测部分是不同的。
52.根据权利要求51所述的染色生物学样本，其中所述第三可检测部分在红外光谱内。
53.根据权利要求51所述的染色生物学样本，其中所述第三可检测部分在紫外光谱内。
54.根据权利要求51所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分、所述第二可检测部分和所述第三可检测部分具有相隔至少20nm的最大吸光度(λmax)。
55.根据权利要求51所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分、所述第二可检测部分和所述第三可检测部分具有相隔至少30nm的最大吸光度(λmax)。
56.一种置于基底上的染色生物学样本，所述染色生物学样本包含用第一可检测部分标记的第一生物标志物；其中所述第一可检测部分具有小于约200nm的FWHM和小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)；其中所述染色生物学样本至少用苏木精进行染色。
57.根据权利要求56所述的染色生物学样本，其中所述染色生物学样本进一步用伊红进行染色。
58.根据权利要求57所述的染色生物学样本，其中所述染色生物学样本进一步用除苏木精和伊红外的第三常规染料进行染色。
59.根据权利要求56所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分的所述FWHM小于约150nm。
60.根据权利要求56所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分的所述FWHM小于约100nm。
61.根据权利要求56所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分的所述FWHM小于约70nm。
62.根据权利要求56至61中任一项所述的染色生物学样本，其中至少一种常规染料包括苏木精。
63.根据权利要求56至61中任一项所述的染色生物学样本，其中所述至少一种常规染料选自由以下项组成的组：苏木精、伊红、酸性品红、阿尔新蓝8GX、茜素红S、金胺O、偶氮胭脂红B、偶氮胭脂红G、天青A、天青B、天青C、碱性品红、俾斯麦棕Y、亮甲酚蓝、亮绿、胭脂红、氯唑黑E、刚果红、甲酚紫、结晶紫、达罗红、乙基绿、固绿F C F、异硫氰酸荧光素、姬姆萨染色剂、靛蓝胭脂红、詹纳斯绿B、哲纳尔氏染色素1899、浅绿SF、孔雀石绿、马休黄、甲基橙、甲基紫2B、亚甲蓝、亚甲蓝、亚甲紫fBernthsen)、中性红、苯胺黑、尼罗蓝A、核固红、油红O、橙黄G、橙黄II、地衣红、副品红、根皮红B、蛋白银S、派洛宁B、派洛宁Y、刃天青、玫瑰红、番红O、苏丹黑B、苏丹III、苏丹IV、四铬染色(MacNeal)、硫堇、甲苯胺蓝、Weigert 1878、瑞氏色素及它们的组合。
64.根据权利要求56至63中任一项所述的染色生物学样本，其中所述染色生物学样本进一步包含用第二可检测部分标记的第二生物标志物，其中所述第二可检测部分具有小于约200nm的FWHM和小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)，并且其中所述第一可检测部分和所述第二可检测部分是不同的。
65.根据权利要求64所述的染色生物学样本，其中所述第二可检测部分在红外光谱内。
66.根据权利要求64所述的染色生物学样本，其中所述第二可检测部分在紫外光谱内。
67.根据权利要求64所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分和所述第二可检测部分具有相隔至少20nm的最大吸光度(λmax)。
68.根据权利要求64所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分和所述第二可检测部分具有相隔至少30nm的最大吸光度(λmax)。
69.一种置于基底上的染色生物学样本，所述染色生物学样本包含用第一可检测部分标记的第一生物标志物；其中所述第一可检测部分具有小于约200nm的FWHM和小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)；其中所述染色生物学样本用至少一种特殊染色剂进行染色，所述至少一种特殊染色剂包含在可见光谱内可检测的一种或多种组分。
70.根据权利要求69所述的染色生物学样本，其中所述特殊染色剂包括Van Gieson染色剂。
71.根据权利要求69所述的染色生物学样本，其中所述特殊染色剂包括甲苯胺蓝。
72.根据权利要求69所述的染色生物学样本，其中所述特殊染色剂包括阿尔新蓝。
73.根据权利要求69所述的染色生物学样本，其中所述特殊染色剂包括Masson三色。
74.根据权利要求69所述的染色生物学样本，其中所述特殊染色剂包括Azan三色。
75.根据权利要求69所述的染色生物学样本，其中所述特殊染色剂包括抗酸。
76.根据权利要求69至75中任一项所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分选自由香豆素核、七甲川菁核和克酮酸盐核组成的组。
77.根据权利要求69至75中任一项所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分的所述FWHM小于约150nm。
78.根据权利要求69至75中任一项所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分的所述FWHM小于约100nm。
79.根据权利要求69至75中任一项所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分的所述FWHM小于约70nm。
80.根据权利要求69至79中任一项所述的染色生物学样本，其中所述染色生物学样本进一步包含用第二可检测部分标记的第二生物标志物，其中所述第二可检测部分具有小于约200nm的FWHM和小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)，并且其中所述第一可检测部分和所述第二可检测部分是不同的。
81.根据权利要求80所述的染色生物学样本，其中所述第二可检测部分在红外光谱内。
82.根据权利要求80所述的染色生物学样本，其中所述第二可检测部分在紫外光谱内。
83.根据权利要求80所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分选自由香豆素核、七甲川菁核和克酮酸盐核组成的组。
84.一种置于基底上的染色生物学样本，所述染色生物学样本包含用第一可检测部分标记的第一生物标志物；其中所述第一可检测部分具有小于约200nm的FWHM和小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)；其中所述染色生物学样本用至少一种常规染料进行染色，其中所述至少一种常规染料具有在可见光谱内的一个或多个峰吸收波长，其中生物学样本通过以下来制备：
(i)使所述生物学样本与对所述第一生物标志物具有特异性的第一一抗接触；
(ii)使所述生物学样本与对所述第一一抗具有特异性的第一二抗接触，其中所述第一二抗与酶缀合；以及
(iii)使所述生物学样本与第一可检测缀合物接触，所述第一可检测缀合物包含：(a)酪酰胺部分、醌甲基化物部分、或者酪酰胺部分或醌甲基化物部分的衍生物或类似物；和(b)所述第一可检测部分。
85.根据权利要求84所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分的所述FWHM小于约150nm。
86.根据权利要求84所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分的所述FWHM小于约100nm。
87.根据权利要求84所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分的所述FWHM小于约70nm。
88.根据权利要求84至87中任一项所述的染色生物学样本，其中一种或多种常规染料包括苏木精。
89.根据权利要求84至87中任一项所述的染色生物学样本，其中一种或多种常规染料包括伊红。
90.根据权利要求84至87中任一项所述的染色生物学样本，其中一种或多种常规染料包括苏木精和伊红。
91.根据权利要求84至87中任一项所述的染色生物学样本，其中一种或多种常规染料选自由以下项组成的组：酸性品红、阿尔新蓝8GX、茜素红S、金胺O、偶氮胭脂红B、偶氮胭脂红G、天青A、天青B、天青C、碱性品红、俾斯麦棕Y、亮甲酚蓝、亮绿、胭脂红、氯唑黑E、刚果红、甲酚紫、结晶紫、达罗红、乙基绿、固绿F C F、异硫氰酸荧光素、姬姆萨染色剂、靛蓝胭脂红、詹纳斯绿B、哲纳尔氏染色素1899、浅绿SF、孔雀石绿、马休黄、甲基橙、甲基紫2B、亚甲蓝、亚甲蓝、亚甲紫(Bernthsen)、中性红、苯胺黑、尼罗蓝A、核固红、油红O、橙黄G、橙黄II、地衣红、副品红、根皮红B、蛋白银S、派洛宁B、派洛宁Y、刃天青、玫瑰红、番红O、苏丹黑B、苏丹III、苏丹IV、四铬染色(MacNeal)、硫堇、甲苯胺蓝、Weigert 1878、瑞氏色素及它们的组合。
92.根据权利要求84至91中任一项所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分在紫外光谱内。
93.根据权利要求84至91中任一项所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分在红外光谱内。
94.根据权利要求84至91中任一项所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分具有小于约430nm的峰吸收波长。
95.根据权利要求84至91中任一项所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分具有小于约400nm的峰吸收波长。
96.根据权利要求84至91中任一项所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分具有大于约670nm的峰吸收波长。
97.根据权利要求84至91中任一项所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分具有大于约700nm的峰吸收波长。
98.根据权利要求84至91中任一项所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分具有小于约430nm但大于约400nm的峰吸收波长，并且其中所述一种或多种常规染料的所述一个或多个峰吸收波长大于约430nm。
99.根据权利要求84至98中任一项所述的染色生物学样本，其进一步包含用第二可检测部分标记的第二生物标志物；其中所述第二可检测部分具有小于约200nm的FWHM和小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)。
100.根据权利要求99所述的染色生物学样本，其中所述染色生物学样本通过以下来进一步制备：使所述生物学样本与对所述第二生物标志物具有特异性的第二一抗接触；使所述生物学样本与对所述第二一抗具有特异性的第二二抗接触，其中所述第二二抗与酶缀合；以及使所述生物学样本与第二可检测缀合物接触，所述第二可检测缀合物包含：(a)酪酰胺部分、醌甲基化物部分、或者酪酰胺部分或醌甲基化物部分的衍生物或类似物；和(b)所述第二可检测部分。
101.一种置于基底上的染色生物学样本，所述染色生物学样本包含用第一可检测部分标记的第一生物标志物；其中所述第一可检测部分具有小于约200nm的FWHM和小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)；其中所述染色生物学样本用至少一种常规染料进行染色，其中所述至少一种常规染料具有在可见光谱内的一个或多个峰吸收波长，其中生物学样本通过以下来制备：
(i)使所述生物学样本与对所述第一生物标志物具有特异性的第一一抗接触；
(ii)使所述生物学样本与对第二一抗具有特异性的第一二抗接触，其中所述第一二抗与酶缀合；
(iii)使所述生物学样本与第一组织反应性部分接触，所述第一组织反应性部分包含：(a)酪酰胺部分、醌甲基化物部分、或者酪酰胺部分或醌甲基化物部分的衍生物或类似物；和(b)能够参与点击化学反应的第一反应性官能团；
(iv)使所述生物学样本与第一可检测缀合物接触，所述第一可检测缀合物包含：(a)第二可检测部分；和(b)第二反应性官能团。
102.根据权利要求101所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分的所述FWHM小于约150nm。
103.根据权利要求101所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分的所述FWHM小于约100nm。
104.根据权利要求101所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分的所述FWHM小于约70nm。
105.根据权利要求101至104中任一项所述的染色生物学样本，其中一种或多种常规染料包括苏木精。
106.根据权利要求101至104中任一项所述的染色生物学样本，其中一种或多种常规染料包括伊红。
107.根据权利要求101至104中任一项所述的染色生物学样本，其中一种或多种常规染料包括苏木精和伊红。
108.根据权利要求101至104中任一项所述的染色生物学样本，其中一种或多种常规染料选自由以下项组成的组：酸性品红、阿尔新蓝8GX、茜素红S、金胺O、偶氮胭脂红B、偶氮胭脂红G、天青A、天青B、天青C、碱性品红、俾斯麦棕Y、亮甲酚蓝、亮绿、胭脂红、氯唑黑E、刚果红、甲酚紫、结晶紫、达罗红、乙基绿、固绿F C F、异硫氰酸荧光素、姬姆萨染色剂、靛蓝胭脂红、詹纳斯绿B、哲纳尔氏染色素1899、浅绿SF、孔雀石绿、马休黄、甲基橙、甲基紫2B、亚甲蓝、亚甲蓝、亚甲紫(Bernthsen)、中性红、苯胺黑、尼罗蓝A、核固红、油红O、橙黄G、橙黄II、地衣红、副品红、根皮红B、蛋白银S、派洛宁B、派洛宁Y、刃天青、玫瑰红、番红O、苏丹黑B、苏丹III、苏丹IV、四铬染色(MacNeal)、硫堇、甲苯胺蓝、Weigert 1878、瑞氏色素及它们的组合。
109.根据权利要求101至108中任一项所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分在紫外光谱内。
110.根据权利要求101至108中任一项所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分在红外光谱内。
111.根据权利要求101至110中任一项所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分具有小于约430nm的峰吸收波长。
112.根据权利要求101至110中任一项所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分具有小于约400nm的峰吸收波长。
113.根据权利要求101至110中任一项所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分具有大于约670nm的峰吸收波长。
114.根据权利要求101至110中任一项所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分具有大于约700nm的峰吸收波长。
115.根据权利要求101至110中任一项所述的染色生物学样本，其中所述第一可检测部分具有小于约430nm但大于约400nm的峰吸收波长，并且其中所述一种或多种常规染料的所述一个或多个峰吸收波长大于约430nm。
116.根据权利要求101至115中任一项所述的染色生物学样本，其进一步包含用第二可检测部分标记的第二生物标志物；其中所述第二可检测部分具有小于约200nm的FWHM和小于约430nm或大于约670nm的最大吸光度(λmax)。
117.根据权利要求116所述的染色生物学样本，其中所述染色生物学样本通过以下来进一步制备：使所述生物学样本与对所述第一生物标志物具有特异性的第二一抗接触；使所述生物学样本与对所述第二一抗具有特异性的第二二抗接触，其中所述第二二抗与酶缀合；使所述生物学样本与第二组织反应性部分接触，所述第二组织反应性部分包含：(a)酪酰胺部分、醌甲基化物部分、或者酪酰胺部分或醌甲基化物部分的衍生物或类似物；和(b)能够参与点击化学反应的第一反应性官能团；使所述生物学样本与第二可检测缀合物接触，所述第二可检测缀合物包含：(a)所述第二可检测部分；和(b)第二反应性官能团。
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